CN106568755A - 一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统 - Google Patents

一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统。本发明选择奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜不具备的近红外激光作为光源，激发生物标本中的近红外荧光探针，近红外荧光通过光纤引出，由对近红外光有响应的PMT进行接收并成像。这一套近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，相较于在可见光波段进行激发和接收的传统激光扫描共聚焦显微成像系统，具有生物组织损伤更小和成像深度更深等优点，且工作稳定，性能可靠。

Description

一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统
技术领域
本发明属于应用光学的显微成像领域，是在奥林巴斯商用激光扫描共聚焦显微镜基础上改造的近红外激光扫描共聚焦显微成像系统。
背景技术
激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope简称LSCM）是光学显微镜、激光光源、扫描单元、光电探测器、数据采集单元和计算机单元相结合的新型高精度显微成像系统。它是在传统荧光显微成像系统的基础上，采用激光作为光源，激光束经过物镜会聚在标本上，在焦平面形成一个小光点，该聚焦点及其附近样品区域激发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路返回至二向色镜构成的分光器。分光器将激发光和荧光分离，并将荧光送到光电探测器(如光电倍增管)。光源和探测器前方各有一个针孔，相对于物方焦平面和像方焦平面上的光点，二者在空间上共轭，这样只有点光源激发处发出的荧光可以通过探测器前面的针孔，而点激发处空间以外的杂散光都被挡在探测针孔以外不被探测器接收。激光扫描共聚焦显微镜中的振镜单元，通过对激发光X向和Y方向的细微偏转，可以实现对焦平面X-Y平面的扫描，探测针孔后的光电探测器逐点获得对应光点的信号强度，并转为数字信号输至计算机，最终在屏幕上还原成整个焦平面的清晰共聚焦图像。通过改变物镜与标本的相对距离，即沿Z轴进行扫描，可以获得标本不同深度的成像信息，实现光学断层扫描。将X-Y平面扫描与Z轴扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，结合计算机软件处理，可以获得标本的三维成像信息。
奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜是一款工作稳定、可靠性高、应用广泛的共聚焦成像系统。该系统配有5个可见光波段的激光光源，波长分别为405nm、488nm、515nm、543nm和635nm。除此之外，该系统还配有三只在可见光波段有较好响应的光电倍增管(R3896），可实现400nm-800nm波段信号的选择性接收范围。奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微成像系统已经广泛应用于生物医学领域荧光成像的研究。
近红外荧光成像是一种新型的成像方法。它采用近红外激光作为光源，激发荧光探针得到近红外荧光，荧光信号进而通过能响应近红外光的设备接收，实现成像。通常称780nm-2500nm波段的光为近红外光，在生物成像中，相较于可见光而言，生物组织对近红外光具有较小的散射，有利于提高生物成像的成像深度，且近红外光相比可见光具有更低的能量，因此在生物成像中，采用近红外光激发能有效地减小对生物组织的损伤。目前，已有一些商用的近红外宏观活体成像系统，但尚未有商用的近红外激光扫描共聚焦显微成像系统。
在现有的奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微成像系统中，一束可见光波段的激光作为激发光，经过一块长通（短反）二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再经过扫描透镜（Scan lens）和镜筒透镜（Tube lens）组成的扩束系统，出射的光经过一块反射镜反射，由物镜会聚对标本中的荧光探针进行激发，激发出的荧光信号沿着原光路返回并通过长通二向色镜，再经过大小可调节的针孔（pinhole），最后到达系统中的PMT，并被转换成电信号进行后续的处理。利用振镜的X轴和Y轴扫描功能，可以得到标本的二维荧光成像。通过改变物镜与标本的相对距离，可以得到标本不同深度的二维荧光成像，经过一定的图像数据处理，可以将这些不同深度的二维荧光成像重构成一幅三维荧光成像。这种基于可见光波段激发和可见光波段荧光接收并成像的激光扫描共聚焦显微成像系统，可选择的激发光波长有限，且都处于可见光波段，对生物组织的散射和吸收较大且对生物组织有较大损伤，此外，系统内接收荧光信号的PMT响应波段有限，只能响应400nm-800nm波段的光信号，在生物组织或活体成像中，不利于成像深度的提高。
发明内容
本发明是在奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微成像系统基础上改造的一种新型近红外激光扫描共聚焦显微成像系统。本发明引入了近红外激光作为光源，激发生物标本中的近红外荧光探针得到近红外荧光信号，然后荧光信号再由光纤引出，并由对近红外光响应灵敏的PMT接收，实现对标本的扫描并成像。
本发明采用的技术方案是：
基于奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜的近红外激光扫描共聚焦显微成像系统包括近红外激光光源、光路爬高系统、奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜、二向色镜、光纤耦合器、近红外响应PMT、信号放大器、采集卡、计算机等。
该近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，不受奥林巴斯FV1000系统内置光源的限制，可以针对所激发的近红外荧光探针特性，选择合适波段的近红外激光光源引入，并选择合适的近红外响应PMT接收荧光信号。相较于奥林巴斯FV1000，该系统的操作更加灵活，具有更大的生物组织成像深度、更小的生物组织损伤，且系统工作稳定，性能可靠。
本发明具有的有益效果是：一方面基于奥林巴斯FV1000系统的外置激光光源和外置PMT的引入，使得共聚焦荧光成像系统中激发光源和信号接收器件两大重要环节的选择变得更加灵活，摆脱了原系统激发光源选择有限和响应PMT单一的限制；另一方面，该近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，相较于可见光激发和可见光波段荧光信号接收的传统激光扫描共聚焦显微系统，具有生物组织损伤更小和成像深度更深等优点。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，基于奥林巴斯FV1000的近红外激光扫描共聚焦显微成像系统包括近红外激光光源、光路爬高系统、奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦正置显微镜、二向色镜、光纤耦合器、近红外响应PMT、信号放大器、采集卡、计算机等。
首先，外置的近红外激光通过一个光路爬高系统引入奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微成像系统，光路经过一块长通（短反）二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再通过由扫描透镜（Scan lens）和镜筒透镜（Tube lens）组成的扩束系统，出射的光经过一块反射镜反射，由物镜会聚，对标本中的近红外荧光探针激发，激发出的近红外荧光信号沿原光路返回并通过长通（短反）二向色镜，然后经过可调节大小的针孔，再经过一块拉曼长通（短反）二向色镜进一步滤除激发光，滤光后的荧光信号经光纤耦合器由空间光转为光纤光引出，由对近红外荧光信号响应灵敏的PMT接收，PMT将模拟信号转换为数字信号，经过信号放大器放大，再连接到数据采集卡，数据采集卡与计算机连接，系统内的振镜扫描单元也与计算机连接以实现信号扫描的同步。通过这样一套系统，可以实现近红外激光扫描共聚焦显微成像。
本实例中采用的近红外激光光源为半导体单纵模激光器，发射波长为785nm；光路爬高系统由两块反射镜组成；DM 1是截止波长为800nm的长通二向色镜；物镜是奥林巴斯型号为XLPLN25XWMP2的25倍浸水镜，工作距离为2mm，且在400nm-1600nm光波段具有良好的透过率；DM 2是截止波长为785nm的长通拉曼二向色镜，M1-M6为全反镜；外置近红外响应PMT是滨松公司（Hamamatsu）生产的型号为H7422-50光电倍增管，可以响应380nm-890nm波段的光信号；信号放大器由滨松公司生产，型号为C7319；数据采集卡由National Instrument公司生产，型号为NBC-2110；近红外荧光探针为用mPEG-DSPE-5000双极性分子包覆吲哚菁绿（ICG）后形成的近红外有机染料掺杂纳米颗粒，其吸收峰在800nm左右，荧光峰在850nm左右。
本发明陈述了一种基于奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜的近红外激光扫描共聚焦显微成像系统。本发明选择奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜不具备的近红外激光作为光源，激发生物标本中的近红外荧光探针，近红外荧光通过光纤引出，由对近红外光有响应的PMT进行接收并成像。这一套近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，相较于在可见光波段进行激发和接收的传统激光扫描共聚焦显微成像系统，具有生物组织损伤更小和成像深度更深等优点，且工作稳定，性能可靠。

Claims (10)

1.一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，包括近红外激光光源、光路爬高系统、奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜、光纤耦合器、近红外响应PMT、信号放大器、采集卡和计算机，其特征在于：
外置的近红外激光通过一个光路爬高系统引入奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微成像系统，光路经过一块长通二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再通过由扫描透镜和镜筒透镜组成的扩束系统；出射的光经过一块反射镜反射，由物镜会聚，对标本中的近红外荧光探针激发，激发出的近红外荧光信号沿原光路返回并通过长通二向色镜，然后经过可调节大小的针孔，再经过一块拉曼长通二向色镜进一步滤除激发光，滤光后的荧光信号经光纤耦合器由空间光转为光纤光引出，由对近红外荧光信号响应灵敏的近红外响应PMT接收，近红外响应PMT将模拟信号转换为数字信号，经过信号放大器放大，再连接到数据采集卡，数据采集卡与计算机连接。
2.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜内的振镜扫描单元与计算机连接以实现信号扫描的同步。
3.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的近红外激光光源为半导体单纵模激光器，发射波长为785nm。
4.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的光路爬高系统由两块反射镜组成。
5.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的长通二向色镜截止波长为800nm；所述长通拉曼二向色镜截止波长为785nm。
6.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的物镜是奥林巴斯型号为XLPLN25XWMP2的25倍浸水镜，工作距离为2mm。
7.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的近红外响应PMT是滨松公司生产的型号为H7422-50光电倍增管，响应380nm-890nm波段的光信号。
8.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的信号放大器由滨松公司生产，型号为C7319。
9.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的数据采集卡由National Instrument公司生产，型号为NBC-2110。
10.根据权利要求1所述的一种近红外激光扫描共聚焦显微成像系统，其特征在于：所述的近红外荧光探针为用mPEG-DSPE-5000双极性分子包覆吲哚菁绿后形成的近红外有机染料掺杂纳米颗粒，其吸收峰在800nm附近，荧光峰在850nm附近。
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