WO2004106903A1 - 受光ユニットおよびそれを含む測定装置 - Google Patents

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WO2004106903A1
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light
receiving unit
unit
fluorescence
light receiving
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WO2004106903A8 (ja
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Akihiro Namba
Ryuji Sawada
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Olympus Corporation
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • Light receiving unit and measuring device including it
  • the present invention relates to a measuring device for measuring light emitted from a sample.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-250608 discloses a laser based on a confocal optical microscope, The sample is irradiated with light through a microscope objective lens to analyze the fluorescence intensity fluctuations caused by the fluorescent molecules in the sample (perform fluorescence correlation spectroscopy) to obtain statistical properties such as the translational diffusion coefficient of the fluorescent molecules.
  • a method and an apparatus for determining an interaction between molecules and the like are disclosed.
  • proteins and carrier particles labeled with a fluorescent substance are suspended in a solution in the field of view of a confocal scanning laser microscope, and the fluorescence intensity based on the Brownian motion of these fine particles By analyzing the fluctuations of, the autocorrelation function is obtained, and the number of target microparticles and the translational diffusion speed are estimated.
  • a laser-scanning confocal point optical microscope is used to guide light from a laser light source to an optical fiber, guide the light to the microscope body, and apply light to the lit surface. Irradiate.
  • the optical signal from the sample is guided to the optical fiber again through the microscope main body, and is received by the optical detector utj connected to the optical fiber. That is, the light source and the photodetector are configured such that the microscope main body and the optical fin are optically connected to each other.
  • US Pat. No. 5,161,053 discloses a confocal optical microscope.
  • the light from the light source is guided to the main body of the microscope with an optical fiber, the optical signal from the sample is branched, and then guided to another optical fiber. Received by the photodetector.
  • a detachable unit for performing FCS measurements A light source input / output port and an optical signal output port are provided in this unit, and the signal light output from the output port is received by a photodetector to perform FCS measurement.
  • Japanese Patent Publication No. 2003-5202 is connected to a microscope.
  • the cut-out for the FCS measurement is not open.
  • Light is emitted from this unit, guided to a microscope, and the sample is irradiated with light.
  • the optical signal emitted from the sample is received in this unit via a microscope and FCS measurement is performed.
  • Each unit has a light source input / output port inside the unit, and the light beam emitted from the light source passes through the unit.o
  • the light beam emitted from the light source is inside the unit.
  • the light is incident on an optical element such as a lens mirror, and reflection, refraction, transmission, and the like are repeated. At this time, reflected light or scattered light is generated due to transmission loss or reflection loss in the optical element, and a part of the generated reflected light or scattered light becomes noise light.
  • a normal aluminum flat mirror In this case, there is a reflection loss of about 10% .
  • at least one of the eighty-one mirrors is required to pass the light beam from the light source into the microscope and guide it into the microscope body.
  • the mirror is required, and there is a return loss at the eighty first mirror (or the dich-mouth mirror).
  • an optical system such as a fiber that couples the unit to the microscope main body is required, and the optical system, for example, has a reflection loss even at the entrance and exit of the fiber. After all, the intensity of the light from the light source is 10 to 2
  • the light to be detected is, for example, fluorescence emitted from a fluorescent substance in the sample, and the light intensity is weak. For this reason, in order to reliably detect the light to be detected, the light from the light source must be prevented from attenuating in the optical path.o In addition, the optical element in the middle of the optical path is expected to attenuate.
  • the light source Light output must be increased.
  • the present invention has been made in consideration of such a situation, and its main purpose is to provide a confocal optical microscope to configure a measuring device for measuring light emitted from a sample.
  • the purpose is to provide a connected light receiving device.
  • the present invention is directed, in part, to a light receiving unit connected to a pel point optical microscope for receiving light emitted from a sample.
  • the light receiving unit of the present invention is output from a confocal optical microscope.
  • a light extraction unit that extracts specific light to be detected from the signal light received via the input unit.
  • the present invention is also directed, in part, to a measuring device for measuring light emitted from a sample.
  • the measuring device of the present invention comprises a light source section for emitting light for generating light from a sample, an optical input port for taking in light for generating light from the sample, and an output port for outputting signal light.
  • a confocal optical microscope having a unit and a light receiving unit connected to the confocal optical microscope are provided.
  • the light receiving unit is an input for taking in signal light output from the confocal optical microscope. And via the input unit And a light extraction unit for extracting a specific light to be detected from the received signal light.
  • FIG. 1 shows an overall configuration of a measurement apparatus for performing correlation spectroscopy analysis of fluorescence intensity fluctuations using a confocal optical ail microscope according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 schematically shows the appearance of the measuring apparatus shown in FIG.
  • FIG. 3 shows the configuration of the light receiving unit shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 shows the measuring device shown in FIG. 1 and its signal processing system.
  • FIG. 5 schematically shows a configuration of a measuring apparatus for performing correlation spectroscopic analysis of fluorescence intensity fluctuation according to the second embodiment of the present invention.
  • O FIG. 6 shows fluorescence intensity fluctuation according to the third embodiment of the present invention.
  • O Fig. 7 shows a phase spectroscopic analysis of fluorescence intensity fluctuations using a confocal scanning laser microscope according to a fourth embodiment of the present invention.
  • O shows the overall configuration of the measuring device that performs
  • FIG. 8 schematically shows the configuration of a measurement apparatus for performing time-resolved measurement of fluorescence according to the fifth embodiment of the present invention.
  • Fig. 9A shows the measurement results of a sample with a long fluorescence lifetime using the measurement device shown in Fig. 8, and shows the time change of the fluorescence intensity emitted from the photomolecules in the sample.
  • Fig. 9B shows the measurement results of a sample with a short light lifetime using the measurement device shown in Fig. 8, and shows the fluorescence emitted from the fluorescent molecules in the sample. The time change of intensity is shown.
  • FIG. 10 schematically shows the configuration of a measuring apparatus for measuring the polarization of fluorescence according to the sixth embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 schematically shows the configuration of a measuring apparatus for measuring the polarization of fluorescence according to the seventh embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows a laser apparatus according to a first embodiment of the present invention.
  • the overall configuration of a measuring device that performs correlation spectroscopy analysis of fluorescence intensity fluctuations using a hup point optical microscope is shown.
  • Fig. 2 schematically shows the external appearance of the measuring device shown in Fig. 1.
  • FIG. 3 shows the configuration of the light receiving unit shown in FIG. Fig. 4 shows the measuring device shown in Fig. 1 and its signal processing system.
  • Numeral 0 has an optical microscope 110, an excitation light source section 130 for emitting excitation light for generating fluorescence from a fluorescent substance, and a light receiving unit 140.
  • Stepping Modes 1 2 3 have two Stepping Modes-1 2 3 to move 2 2
  • the sample axes are arranged so that the axes of movement are orthogonal to each other.
  • a stepping motor 123 that can move 122 in one direction orthogonal to each other, so-called X direction and y direction, is controlled by a control port (not shown).
  • the measuring apparatus 100 further includes an illumination light source 125 for emitting illumination light for ordinary optical observation, and a confocal optical microscope 1
  • Reference numeral 10 denotes an illumination light input port 1 11 for taking in illumination light from the illumination light source 125, and an excitation light input port 1 for taking in excitation light from the excitation light source section 130.
  • the illumination light source 125 includes an output port 113 for outputting the fluorescence generated by the excitation light, and the illumination light source 125 is not limited thereto. Consists of Drump • ⁇ .
  • the confocal optical microscope 110 uses the objective lens ⁇ ⁇ 4 arranged below the type 5 stage 122 and the * sho *** bright light taken from the illumination light input port 111. It has a dichroic mirror 115 that directs the lens 114 and an eyepiece 126 that allows the observer to visually observe the sample 121
  • the measuring device 100 further includes a CCD force camera 127 for acquiring an optical image of the sample 121 and a TV monitor for extracting (displaying) the optical image acquired by the CCD camera 127.
  • a CCD force camera 127 for acquiring an optical image of the sample 121
  • a TV monitor for extracting (displaying) the optical image acquired by the CCD camera 127.
  • the excitation light source section 130 is composed of two laser light sources 13 1 and 13 2 and two lenses 13 3 and 13 4 that collimate the respective light beams from the laser light sources 13 1 and 13 2 And the lens 1 3 3 That directs the light beam from the pump to the excitation light input port 1 1 2
  • a dichroic mirror 36 for directing to the light beam excitation light input port 112 from the lens 134.
  • the laser light sources 13 1 and 13 2 of the excitation light source section 130 emit light of a wavelength suitable for the type of the fluorescent substance to be excited.
  • fluorescent substances include rhodamine ⁇ Rhodine green (RhG) and cyfive (Cy5).
  • Reference numeral 131 denotes an argon laser that emits light having a wavelength of 488 nm in order to excite Rhodamin's green (RhG), and a laser light source 132 denotes a cyfive (Cy 5) It is a He-Ne laser that emits light with a wavelength of 632.2.8 nm to excite.
  • the dichroic mirror 13 6 has a characteristic of transmitting the excitation light emitted from the laser light source 13 1 and reflecting the excitation light emitted from the laser ilk 13 2.
  • the excitation light from 1 and the excitation light from the laser light source 132 are combined and guided to the excitation light input port 112.
  • the confocal optical microscope 110 reflects the excitation light introduced from the excitation light input port 112 and directs it to the objective lens 114, and transmits the fluorescence generated from the sample 122 ⁇ .
  • the receiving unit 144 has an input section 141 for taking in signal light including fluorescence from the confocal optical microscope 110 and an input section 141.
  • a lens 146 for converging the beam, a photodetector 480 for detecting its fluorescence, and a pinhole hood 147 disposed in front of the light emission 148 are also one of the two. It has a lens 150 for converging the fluorescent beam, a photodetector 152 for detecting the fluorescence, and a pinhole unit 1501, which is arranged at the side of the photodetector 152.
  • the input unit 14 1 of the receiving unit 14 0 is connected to the optical fiber 15
  • the optical fiber 15 3 is optically connected to the output port 113 of the ⁇ "T-spectroscopic T" microscope 110 via the 3. Is composed of a multi-mode and an optical fiber to guide the light containing two kinds of fluorescent light to the light receiving unit 140.
  • the optical fiber 153 is not limited to this, but includes, for example, For multimode optical fiber with diameter of 100 m NA 0.22.
  • the output port 113 is a port for connecting, for example, a camera for photographing, and is provided with an optical fiber connection terminal (not shown).
  • the optical fiber connector is, for example, but not limited to, an FC connector, an SC connector, or an ST connector.
  • the light extraction unit 1443 transmits light in the wavelength band including the fluorescent light, and reflects the light in the wavelength band including the worm light on the other side. It has a filter 145 having a property of selectively transmitting fluorescence and a filter 149 having a property of selectively transmitting one of the fluorescence.
  • the pinhole unit 147 has a pinhole that is in a positional relationship of ⁇ h SUP to the convergence point of the excitation light that generates the fluorescence detected by the photodetector 148 behind it. .
  • the pinhole unit 15 1 detects a pinhole that has a positional relationship of ⁇ t PRI to the convergence point of the excitation light that generates the fluorescence detected by the photodetector 15 2 behind it. -O) o
  • the photodetectors 148 and 152 output electrical signals that reflect the intensity of the incident light.
  • the photodetectors 148 and 152 are not limited to this, but may be, for example, both avalanche photodiodes. It is a gift (APD: Avalanche Photo Diode). Alternatively, it may be a photomultiplier tube.
  • the pinholes in the pinhole units 1471 and 151 have, for example, but are not limited to, a diameter of 200 m.
  • the objective lens 114 has an NA (numerical aperture) of about 1.0, for example, but not limited to, for forming a minute confocal region. As a result, an approximately cylindrical confocal region having a diameter of about 0.6 ⁇ 6 ⁇ and a length of about 2 ⁇ can be obtained.
  • the measuring device 100 further shapes and shapes the electrical signals output from the photodetectors 148 and 152 of the light receiving unit 140 and turns them on and off.
  • Signal processing unit 161 that converts the binary pulse into a binary pulse, and correlation analysis that calculates the white-white correlation function by performing a correlation operation on the binarized pulse output from the signal processing unit 161
  • a computer for calculating the translational diffusion rate of the fluorescent substance and the change in the number of fluorescent molecules in the measurement area from the autocorrelation function obtained by the apparatus 162 and the correlation analyzer 162 16
  • ⁇ V monitor 164 that displays the results obtained by the correlation analyzer 162
  • the fluorescence correlation spectroscopy is performed as follows.
  • the excitation light beam emitted from the laser light source 3 ⁇ is converted into a parallel light beam having an appropriate diameter by the lens 13 3, reflected by the mirror 13 5, and then reflected by the mirror 1. 3 through the excitation light input port 112 and enter the inside of the confocal optical microscope 110 by spatial propagation.
  • the portion may be configured to be optically connected by a Nunguru mode fiber.
  • the excitation light beam emitted from the laser light source 13 2 is converted into a parallel light beam having a diameter equivalent to M by the lens 13 4, and a dich mirror 13 6 Excitation light input port 1
  • the excitation light beam that entered the ⁇ 10 optical microscope 110 was irradiated by the JK at the dichroic laser 1116, and the dichroic laser 1
  • the objective lens 1 14 has a large numerical aperture of about 10 as described above, so that the objective lens 1 1 4 has a large numerical aperture of about 10. 0 to 6 m in diameter, approximately cylindrical focal area of about 2 tm in length o
  • the luminous substance existing in the region is excited by the excitation light and generates a fluorescence signal (flight pulse).
  • a part of the fluorescence signal generated from the fluorescent substance enters the objective lens 114 together with a part of the excitation light reflected by the sample 121, and becomes a signal light.
  • the light incident on the objective lens 1 1 4 is converted to a dichroic mirror.
  • the light is reflected by 7 and converged by the lens 1 18.
  • the signal light converged by the lens 118 enters the optical fiber 153 from the optical fiber connector attached to the output port 113.
  • Optical fiber ' ⁇ 1 5 3 The first light entering the optical fiber is the optical fiber 1
  • the signal emitted from the input unit 141 is The beam is a parallel lens of appropriate diameter with lens 1 4 2 ⁇
  • the light is converted into three light beams, and separated by Dichroic mirror 144 by type of fluorescent light. That is, the fluorescence generated from the cyfive (Cy5) passes through the dichroic mirror 144, and the fluorescence generated from the rhodamine green (RhG) is dichroic. Reflected by Tsukumi 1 4 4.
  • the light transmitted through the dichroic mirror 144 is filtered by a filter ⁇ 45 to remove undesired components, converged by a lens 146, and passed through a pinhole unit 147 to a photodetector 1 147. It is incident on 4 8 and is photoelectrically converted.
  • the light reflected by the dichroic mirror 144 is filtered by a filter 149 to remove undesired components, converged by a lens 150, and passed through a pinhole unit 151. Incident on the photodetector 15 2 and is photoelectrically converted.
  • the signal photoelectrically converted by the photodetectors 148 and 152 is sent to a signal processor 161 and converted into a binary pulse signal.
  • the binarized pulse signal is sent to the correlation analyzer 16 2, where the autocorrelation function is calculated, for example.
  • the autocorrelation function is sent to the computer 16 3, and the fluorescent substance is translated and diffused. It is used to calculate speed and changes in the number of fluorescent molecules in the measurement area.
  • the correlation analyzer 16 2 may calculate the cross-correlation function of the fluorescence intensity fluctuations caused by two types of fluorescent molecules (rhodamine green, safive). Alternatively, without using the correlation analyzer 16 2, the binarized pulse signal output from the fine processing unit 16 1 is directly input to the computer 16 3, and the computer 16 ⁇
  • step 3 Perform the il correlation analysis in step 3 to find the autocorrelation function of the fluorescence intensity fluctuation, or; the cross-correlation function.
  • the autocorrelation function R ( ⁇ ) of the fluctuation of the fluorescence intensity from the fluorescent substance received by the photodetector is expressed by the following equation.
  • 1 is the fluorescent substance received by the photodetector Is the intensity of the fluorescence from
  • t is the time, and is the lag time.
  • ⁇ > Represents the unsampled average.
  • the incident light is a light having a Gaussian distribution (such as an Argon laser or a Helium neon laser)
  • the light intensity fluctuation is a Gaussian distribution (such as an Argon laser or a Helium neon laser).
  • D is the translational diffusion factor of the fluorescent molecule, ⁇ ! Is ⁇ ⁇ 1/2 ⁇ 2 when the confocal region is approximated to a cylinder, and is the radius.
  • the light receiving unit 140 has a separate unit structure that is independent of the uru point optical microscope 110, and is provided with a confocal optical system via an optical fiber. Optically connected to microscope 110.
  • the light receiving unit is provided with at least a condenser lens and a finolector.
  • the filter is composed of a filter having a spectral characteristic of selectively transmitting only the fluorescence wavelength from the sample.
  • the light receiving ZL unit may include a photodetector in addition to the condenser lens and the filter. This light intensity fluctuation unit is an optical connection
  • the excitation light source unit 130 and the light receiving unit 1 are identical to the excitation light source unit 130 and the light receiving unit 1
  • Each of the pumps 40 has a separate unit structure independent of the Philips optical microscope 110, and the excitation light source 130 has a ⁇ V- ⁇ h pr / ⁇ point via the excitation light input port 112.
  • the optical microscope 110 is optically connected to the optical microscope 110, and the light receiving unit 140 is optically connected to the confocal point optical microscope 110 via the output port 113.
  • the excitation light emitted from the V excitation light source section 130 is Do not jM inside the unit 140, and use the confocal optical microscope 1 through the excitation light input port 112 placed near the objective lens.
  • the number of optical elements through which the excitation light passes is small, and the decrease in the intensity of the excitation light is slightly suppressed. This allows the excitation light to be efficiently irradiated onto the sample. Further, the light passing through the light receiving unit 140 is substantially only the signal light emitted from the sample. As a result, a high measurement of the sZN ratio of the signal can be performed.
  • the measurement device of the present embodiment which is directed to At. 3RB, is related to the measurement device of the first embodiment in terms of the layout of the photodetector.
  • FIG. 5 schematically shows a configuration of a measuring apparatus for performing correlation spectroscopic analysis of fluorescence intensity fluctuation according to the first embodiment of the present invention.
  • the members indicated by the same reference numerals as the members not shown in FIG. 3 are the same members, and the detailed description thereof is omitted.
  • the light receiving unit 140 is connected to an input section 141 for receiving the signal light from the ⁇ point optical microscope 110 and a beam of light.
  • a fluorescent light output section 54 for outputting the fluorescent light, a lens 50 for converging a beam of the other fluorescent light, and a fluorescent light output for detecting the fluorescent light.
  • the input unit 14 of the light receiving unit 14 0 In the first embodiment and one port j, the input unit 14 of the light receiving unit 14 0
  • the light extraction section 1443 has a characteristic of transmitting light in a wavelength band including one fluorescent light and reflecting light in a wavelength band including the other fluorescent light. It has a filter 145 having the property of selectively transmitting one fluorescent light and a filter 149 having a property of selectively transmitting the other fluorescent light.
  • the fluorescent light output section 154 is optically connected to the photodetector 148 via, for example, but not limited to, a sinal mode optical fiber 156.
  • the fluorescent output unit 155 is optically connected to the photodetector 148 via, for example, but not limited to, a single-mode optical pho- to-no-157.
  • the fluorescent light output section 154 has a pinhole that has a positional relationship of ⁇ t PRI from the convergence point of the excitation light that generates fluorescence detected by the photodetector 148.
  • the fluorescent light output unit 1555 has a pinhole that is in a confocal position with respect to the convergence point of the excitation light that generates the fluorescent light detected by the photodetector 152.
  • the fluorescent output sections 154 and 155 are optical fiber connection terminals, and the pinholes are optical fiber optics attached to them.
  • the measuring operation of the measuring device 100 A of the present embodiment is completely the same as that of the measuring device 100 of the first embodiment, and the description thereof is omitted.
  • light detection # ⁇ ⁇ 48 and 1 In the measuring apparatus 100 A of the present embodiment, light detection # ⁇ ⁇ 48 and 1
  • Since 52 is placed outside of the light receiving unit 140 A, it can be installed in accordance with the arrangement of the downstream processing unit or computer L-connector, etc. to be connected to the subsequent stage.
  • the present embodiment is directed to another measuring apparatus that performs correlation spectroscopy analysis of the intensity fluctuation of fluorescence using a confocal optical microscope and a measuring apparatus of the present embodiment. This is different from the measuring device of the first embodiment in the occupation of the optical connection with one source.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing the configuration of a measuring apparatus for performing correlation spectroscopy analysis of the intensity of fluorescence according to the fourth embodiment of the present invention.
  • the members indicated by the same reference numerals as the members shown in FIG. 2 are the same members, and detailed description thereof will be omitted.
  • the measurement device of the present embodiment In 100B, the confocal optical microscope 110 and the light receiving unit 140 are in contact with each other simply through a space, rather than through an optical fiber. In other words, although not visible in Fig. 6,
  • the input port 14 1 (see FIGS. 1 and 3) of the light receiving unit 140 is directly attached to the output port 1 ⁇ 3 of 10 (see FIGS. 1 and 3).
  • the input unit 41 of the light receiving unit 140 may be connected via a member such as a cylinder.
  • the measuring operation of the measuring device 100 B of the present embodiment is exactly the same as that of the measuring device 100 of the first embodiment, and a description thereof will be omitted.
  • the present embodiment is directed to a measurement device that performs correlation spectroscopy analysis of fluorescence intensity fluctuations using a confocal scanning laser microscope.
  • FIG. 7 shows an overall configuration of a measuring apparatus for performing correlation spectroscopy analysis of fluorescence intensity fluctuations using a ⁇ , focus scanning laser-microscope according to a fourth embodiment of the present invention.
  • the measuring device 200 of the present embodiment has:
  • the sample stage 218 on which the sample 219 is placed is placed above the objective lens 217 and the objective lens 217, and emits excitation light for generating fluorescence from the fluorescent substance.
  • the mil fine Is main body 2 ⁇ 2 is an excitation light input port 2 1 for taking in excitation light from the two scanning light source sections 230 and 240, respectively.
  • the scanning light source section 230 includes a laser light source 23 and a lens 23 that collimates the light beam from the laser-light source 231, and a mirror that reflects the light beam from the lens 2332. Scans the light beam and the optical beam in two directions (X direction and ⁇ direction) orthogonal to each other. It has a Y scanner 234 and a scanner driving device 235 for driving the XY scanner 234.
  • the scanning light source section 240 includes a laser light source 241, a lens 242 for collimating the light beam from the laser light source 233, and two directions orthogonal to each other. It has an X ⁇ scanner 244 that scans in the (X and Y directions), and a scanner-drive device 245 that drives the XY scanner 244.
  • the X ⁇ scanners 2 3 4 and 2 4 4 are, for example, composed of two galvanometer mirrors, each of which can scan a light beam along one axis, and one galvanometer mirror is preferably
  • the scanning axes are arranged so as to be orthogonal to each other. Alternatively, it may be constituted by a polygonal lens, a hologram scanner, or the like.
  • the light beam from the X ⁇ scanner 1 2 3 4 is taken into the microscope body 2 1 2 from the excitation light input port 2 1 3.
  • the light beam from the X-ray scanner 2 4 4 is taken into the microscope body 2 1 2 from the excitation light input port 2 1 3.
  • the light beam from the X-ray scanner 2 4 4 is taken into the microscope body 2 1 2 from the excitation light input port 2 1 3.
  • the laser-light sources 231 and 241 which emit light having a suitable wavelength according to the type of the fluorescent substance to be excited, are used.
  • the fluorescent substances are Rhodine green (Rhodamine Green: RhG) and cyfive (cy5), and correspondingly, the laser light source 231 is An argon laser that emits light at a wavelength of 488 nm is used to excite Damin-Dalline (RhG), and a laser light source 241 excites a cyfive (Cy5).
  • a He—Ne laser that emits light with a wavelength of 632 • 8 nm is used.
  • the microscope main body 2 12 reflects the excitation light introduced from the excitation light input port 2 13 and directs it to the objective lens 2 17, and transmits the fluorescence generated from the sample 2 19.
  • Measuring device 200 is one more light receiving unit V 25 1 and 2
  • the light receiving units 25 1 and 25 2 are respectively connected to the microscope body 21 1 through the optical fibers 25 3 and 25 4.
  • output ports 215 and 2 16 are ports for connecting a camera for photo shadowing, and optical fibers 253 and 254 are connected via optical fiber connectors.
  • output ports 2 15 and 2 16 are ports for connecting a camera for photo shadowing, and optical fibers 253 and 254 are connected via optical fiber connectors.
  • the light receiving units 25 1 and 25 2 detect the fluorescence emitted from the sample 219 for each type.
  • Light receiving unit 2 5
  • the light receiving units 25 1 and 25 2 are the same as the light receiving unit 14 0 shown in FIG. 3, but from the dichroic mirror 144, the filter 149, the lens 150, and the pinhole unit.
  • the configuration may be such that 15 1 and the photodetector ⁇ 52 are omitted.
  • filters 145 having characteristics suitable for the type of fluorescence to be detected are applied.
  • the photodetector 148 may be an avalanche-gate diode or a photomultiplier as in the first embodiment.
  • the dichroic mirror 224 transmits light in a wavelength band including fluorescence emitted from the cyfive (Cy5), and transmits light from rhodamine and green (RhG). Reflects light in the wavelength band including the generated fluorescence.
  • the light receiving unit 252 detects the fluorescence generated from the cyfive (Cy5), and the light receiving unit 251 detects the rhodamine green (RhG). The fluorescence generated from this is detected.
  • the measuring device 200 further performs signal processing for shaping the waveform of the electrical signal output from the photodetector in the light receiving units 25 1 and 25 2 and converting it into an on-off binarized pulse.
  • the laser-light source 2 3 In the measuring apparatus 200 of the present embodiment, the laser-light source 2 3
  • the excitation light beam emitted from 1 is converted into a parallel light beam having an appropriate diameter by the lens 2332, reflected by the mirror 2333, passes through the XY scanner 134, and then enters the excitation light input port.
  • This light spot is an X-ray scanner
  • a part of the reflected light and fluorescence from the sample ie, la light enters the objective lens 217, passes through the two dichroic lasers 221 and 222, and becomes a dichroic mirror 222) Is reflected and directed to the output port 2 15.
  • the 1S light passes through the optical fiber 25 3 attached to the output port 2 15 and enters the light receiving unit 25 1. .
  • the light receiving unit 251 removes undesired components from the signal light and receives the target fluorescence with a photodetector.
  • the light detection 5 ⁇ outputs an electric signal reflecting the intensity of the received light.
  • the electric power 5 l " ⁇ S" output from the photodetector in the light receiving unit 25 1 is obtained after image processing such as contrast enhancement and contour enhancement is performed by the image processing device 2 64. , Generated on the TV monitor 265 as a two-dimensional or three-dimensional microscope image of the sample.
  • the excitation light beam emitted from the laser source 241 is converted into a parallel light beam of an appropriate diameter by the lens 242, passes through the X-ray scanner 244, and then enters the excitation light input port.
  • This optical spot is formed at a position different from the optical spot of the excitation light from the laser-light source 231.
  • the light spot can be scanned in the X-direction by the X-scanner-244.
  • the light enters the light receiving unit 252 through the optical fiber 25 4 attached to 6.
  • the light receiving unit 255 removes undesired components from the signal light and receives the target fluorescence with a photodetector.
  • the light detector outputs an electric signal reflecting the intensity of the received light ⁇
  • the first signal output from the photodetector in the light receiving unit 25 2 is processed by the image processing unit 26 4 after performing image processing such as contrast enhancement and contour enhancement.
  • E-Guided to 263, and generated as a two-dimensional or three-dimensional microscope image of the sample on the ⁇ V monitor In the measurement 200 of the present embodiment, not only the autocorrelation function of the fluorescence intensity fluctuation, but also the cross-correlation function of the fluorescence intensity fluctuation can be measured. From the cross-correlation function of the fluorescence intensity fluctuation, m
  • the cross-correlation function of the fluorescence intensity fluctuation is divided by the product of the time-averaged values of the fluorescence intensity fluctuations received by the respective photodetectors, and carp fitting is performed to obtain the value of the Y-axis intercept. That is, the number of conjugates of the two types of fluorescent substance molecules is obtained using equation (6). ( ⁇ i uo r escence Cor re I at i on Spectroscopy, R. Rigl er and t. S. E I son eds. 15, Springer, Berlin)
  • N b r are two types of confocal region N r is the number of fluorescent substance R molecules
  • N b is the number of fluorescent substance B molecules
  • the present embodiment is directed to a measuring apparatus for performing time-resolved measurement of fluorescence using an ituru point optical microscope.
  • the configuration of the measuring apparatus of the present embodiment is almost the same as the measuring apparatus of the second embodiment. It is.
  • FIG. 8 schematically shows a configuration of a measuring apparatus for performing time-resolved measurement of light according to a fifth embodiment of the present invention.
  • the same reference numerals as those shown in FIG. The members indicated by are similar members, and detailed description is omitted.
  • the measuring apparatus 100 C of the present embodiment is a pulse excitation light source section 130 A instead of the excitation light source section 130 of the measuring apparatus 100 A of al-5b 7 ⁇ state.
  • O The other configuration is the same as that of the second embodiment.
  • the pulse excitation light source 13 0 A is a pulse laser light source 1 3 1
  • a and lens 1 3 3 are provided. Pulse laser light source 1 3
  • 1 A is, but not limited to, for example, a wavelength of 54.5 nm, an average output of 100 mW, and a noise.
  • FIG. 8 shows a typical set of pulse lasers—light source 13 1 A and lens 13 3.
  • the pulsed excitation light source section 130A includes a plurality of sets of parylene laser light sources and lenses, and is cfc o
  • the photodetector 148 has a time-to-amplitude converter (Time-to-Amp I tude Converter) 171, followed by a wave height analyzer (MLH t i- channe I analyzer) 17 2 is connected, and a computer 17 2 is connected to the pulse height analyzer 17 2.
  • a time-to-voltage conversion circuit 173 and a pulse height analyzer 174 are connected to the photodetector 152, and a computer 175 is connected to the pulse height analyzer 174.
  • Samples include cells, DNA labeled with a fluorescent substance as a base, and a medium containing a carrier substance.
  • Pulsed light emitted from the pulsed laser light source 131 A is taken into the confocal optical microscope 110 through the excitation light input port 112, and irradiates the sample containing the fluorescent substance on the sample stage .
  • the signal light emitted from the fluorescent substance in the sample reaches the light receiving unit 14OA through the optical fiber 153 coupled to the confocal optical microscope 110.
  • the light receiving unit 14OA extracts specific fluorescent light from the signal light and outputs it.
  • the fluorescent light output from the light receiving unit 14OA is detected by the photodetectors 148 and 152 connected via the optical fibers 156 and 157, respectively. Photodetectors 148 and 152 detect fluorescence photons and generate photon pulses.
  • the detected MJ pulse signal is guided to the time-to-voltage conversion circuits 17 1 and 17 3 and becomes the stop signal of the time-to-voltage conversion circuits 1 and 17 3. circuit
  • a pulse laser light source 13 1 A synchronized to the light emission of 13 A is sent to 17 1 and 17 3 •
  • the signal of 0 0 «— is converted to a time-voltage conversion circuit 1 7
  • the output pulse signal is guided to the wave analyzers 172 and 174, converted into the output pulse height, sent to the computer 175, and stored in the memory of the computer. Stored in the memory (not shown). By plotting the ⁇ c of the output fine pulse stored in the memory as a function of time, the fluorescence lifetime of the fluorescent molecules in the sample is obtained. Can seek life o
  • FIG. 9A and 9B show the measurement results obtained by the measuring apparatus shown in FIG. 8, and show the time change of the fluorescence intensity emitted from the fluorescent molecules in the sample.o FIG. 9A shows a long fluorescence lifetime. Figure 9B shows the measurement results of the sample with a short fluorescence lifetime.
  • the configuration of the measuring device of the present embodiment may be changed as needed.
  • the pulse laser light source 13 1 A may be changed to a CW mode synchronous dye laser-light source to perform measurement by changing the wavelength of the pulsed light, as in the first embodiment.
  • the photodetectors 148 and 152 may be arranged in the light receiving unit. In other words, the light receiving unit 140 A and the optical fibers 156 and 15
  • the photodetectors 148 and 152 may be changed to the light receiving unit 140 shown in the first embodiment.
  • the polarization characteristics of the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the sample such as the depolarization of the fluorescence using the uru optical microscope, are described. It is directed to a measuring device for measuring a change or a degree of polarization.
  • the configuration of the measuring device of the present embodiment is similar to the measuring device of the second embodiment.
  • FIG. 10 schematically shows a configuration of a measurement apparatus for performing measurement relating to the polarization of fluorescence according to the sixth embodiment of the present invention.
  • the members indicated by the same reference numerals as the members shown in FIG. 5 are the same members, and detailed description thereof will be omitted.
  • the confocal optical microscope 110 sets a specific polarization component on the optical path of the excitation light from the excitation light source section 130.
  • a polarizing element 18 1 that selectively transmits light is provided.
  • the light receiving unit 140D is supplied to the light receiving unit 140A of the measuring device 100A of the second embodiment by the polarizing elements 182 and 18 which selectively transmit a specific polarized light component. 3 has been added. Other configurations are the same as in the first embodiment.
  • the light receiving unit 140D is composed of a polarizing element 182 and a finoletter placed between the filter 45 and the lens 146, in addition to the structure of the light receiving unit 140A.
  • the transmission axis of the polarizing element 18 2 and the polarizing element 18 3 is relative to the transmission axis of the polarizing element 18 1. That is, the polarization direction of the light passing through the polarizing element 18 2 and the polarizing element 18 3 is orthogonal to the polarizing direction of the light passing through the polarizing element 18 1.
  • the polarizing element 18 ⁇ , the polarizing element 18 2, and the polarizing element 18 3 are both constituted by, but not limited to, for example, a polarizing plate, and more preferably, a grandson. It is preferable to use a polarizer with a high extinction ratio, such as a prism (Glan Thompson Prism).
  • the excitation light source section 130 has a continuous oscillation laser light source 13 1 o
  • the laser single light source 13 1 is not limited to this, for example, a wavelength of 488 nm and an output of 10 mW Argon of .composed of laser o
  • FIG. 10 typically shows one laser light source 131, but the excitation light source section 130 may have a plurality of laser light sources.
  • Excitation light emitted from the laser light source 1 3 1 passes through the excitation light input port 1 1 2 ⁇ h, and is taken into the Philips Ophthalmic Microscope 1 10 by the polarizing element 18 1.
  • a specific polarized component is extracted and irradiated on a sample containing a fluorescent substance on the sample stage.
  • the one-port light emitted from the fluorescent substance in the sample reaches the light receiving unit 140 ⁇ ⁇ through the confocal optical microscope 110 1 ⁇ -irradiated optical fiber-153.
  • the light-receiving unit 140D extracts specific fluorescence from the signal light by the light extraction unit 144, and irradiates the sample with the polarizing element 182 and the polarizing element 183.
  • a polarization component orthogonal to the polarization component of the excitation light to be extracted is extracted and output.
  • the fluorescence of a specific polarization component output from the photodetector unit 140 A is converted to photodetectors 148 and 15 connected via optical fibers 156 and 157, respectively.
  • linearly polarized excitation light is applied to a sample containing fluorescent molecules.
  • two linearly polarized light orthogonal to the excitation light is detected by the two photodetectors 148 and ⁇ 52 out of the fluorescence emitted from the sample.
  • This makes it possible to measure the anisotropy of fluorescence and the degree of polarization of fluorescent molecules in the sample. For example, it is possible to obtain a rotational diffusion coefficient or the like that reflects the rotational speed of the fluorescent molecule.
  • a high numerical aperture objective lens NA 0.9
  • the polarization of tissues such as intracellular DNA and cell membranes labeled with fluorescent dye molecules is used. Sex can also be examined.
  • the swinging motion of the LB (Langmuir-Blodgett) film can be measured.
  • the antigen-antibody reaction can be measured by detecting the intensity of the scattered light emitted from the sample.
  • a latex particle suspension (0.005% by weight) sensitized with 0.2 micron diameter alpha-fat protein (AFP) antibody was used as the sample.
  • a sample such as blood is injected into this to cause an antigen-antibody reaction.
  • AFP micron diameter alpha-fat protein
  • latex particles will aggregate due to the antigen-antibody reaction.
  • the scattered light has no anisotropy and emits light having the same polarization component as the polarization direction of the incident light as scattered light.
  • the aggregation of latex particles causes the scattered light to have anisotropy. This makes it possible to clearly distinguish the unreacted dispersion state. Therefore, the antigen-antibody reaction can be measured with high sensitivity.
  • the excitation light emitted from the excitation light source section 130 does not pass through the light receiving unit 140D, and the The excitation light is taken into the optical microscope 110 via the excitation light input port 112 located near the lens, so that the number of optical elements through which the excitation light passes is small and the intensity of the excitation light is reduced. Slightly suppressed ⁇ The excitation light is efficiently illuminated on the sample. Further, the light passing through the light receiving unit 140D is substantially only the signal light emitted from the sample. The measurement with a high S ⁇ ratio of in 3 ⁇ 4 1 can be performed.
  • the configuration of the measuring apparatus according to the present embodiment may be changed to M as needed.
  • all or a part of the outer shape of the ia photons 181, 182, and 183 may be circular and may be rotatably arranged around the vehicle.
  • the rotation of the polarization element may be controlled manually, or a stepping motor may be connected to the rotation axis of the polarization element, and the rotation of the stepping motor may be performed by the as operation.
  • Ha light like this? By making the element rotatable, the polarization direction of the incident light is changed to white according to the sample, and the two polarizing elements 18 2 and 18 in the light receiving unit 140 D are correspondingly changed.
  • the laser light source 13 1 may be composed of a laser light source that emits linearly polarized light, in which case the polarizing element 18 1 in the it focusing optical microscope 110 may be omitted.
  • the present embodiment is directed to another measurement in which a measurement regarding the polarization of fluorescence is performed by using a ⁇ t PLUS optical microscope.
  • the configuration of the measuring device of the present embodiment is almost the same as that of the measuring device of the sixth treasure embodiment. It is the same.
  • FIG. 11 schematically shows the configuration of a measuring apparatus for measuring the polarization of fluorescence according to the seventh embodiment of the present invention.o
  • the same members as those shown in FIG. The members indicated by the reference signs are replaced with similar members.
  • the measurement apparatus 100 E of the present embodiment is different from the pulse excitation light source section 13 described in the fifth embodiment in place of the excitation light source section 130 of the sixth embodiment. 0 A is provided.
  • the measuring apparatus 100 E of the present embodiment is provided with the excitation light source section 130 of the measuring apparatus 100 D of the sixth embodiment and the pulse excitation light source of the measuring apparatus 100 C of the fifth embodiment. This is the configuration changed to Part 1 3 0 A 0
  • the ultrashort pulse light emitted from the pulse laser one light source 1311 A is taken into the confocal optical microscope 110 and it is linearly irradiated by the polarizing element 18 1 in the focal optical microscope 110.
  • the sample containing the fluorescent substance on the sample stage is irradiated.
  • the fluorescent substance in the sample is the radiated / ⁇ ° Luster light, the direction of the transition moment of the fluorescent substance. It absorbs and excites only the polarized light component in the direction that coincides with, and the fluorescent substance emits fluorescence.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent substance has a polarization component in the direction corresponding to the direction of the transition module of the fluorescent substance, and excites the fluorescent substance with ultrashort pulsed light fcj emitted from the fluorescent substance. If time-resolved measurement is performed on the polarization component of the emitted fluorescence, it is possible to find the temporal change in the molecular orientation of the V-fluorescent substance.o
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • calmodulin (Ca 2+) binds to calmodulin (Ca 2+) in cells and is activated when calmodulin (Ca 2+) binds, causing calmodulin to undergo a structural change. Bt using different fluorescent substances, excite one fluorescent substance, and measure the fluorescence from the other fluorescent substance obtained by the fluorescence resonance energy transfer. O In addition, two types of fluorescent proteins that are different for both proteins, such as cyan fluorescent protein (CFP), can be obtained.
  • CFP cyan fluorescent protein
  • the measuring device of FIG. 8 may be applied to the measurement of the fluorescent light in addition to the measurement of the fluorescence. Its mouth and light extraction part 1 4 3 Applies to phosphorescence extraction
  • the measurement device of FIG. 8 may be applied to measurement of luminescence phenomena such as chemiluminescence and bioluminescence.
  • 143 applies to the extraction of chemiluminescent or bioluminescent light. Also, since no light source is required, either remove the light source or turn off the power source of the light source. For example, the following describes the case where enzyme immunoassay of Pfal 'protein (AFP), which is one of the major cancer markers, is measured by chemiluminescence using the measurement device shown in Fig. 8 (excluding the light source). . First, the diameter 1
  • Anti-AFP antibody was sensitized to glass particles of about 10 Hm, and this was shown with the enzyme alkaline enzyme, suspended in a buffer solution, and stored in a sample container. A sample such as the above is added, and the antigen-antibody reaction is caused at room temperature. Glass particles that are not involved in the reaction are removed by washing, and the remaining solution is added to the chemiluminescent substrate AMPPD (2-dioxane 2 sodium salt). When AMPPD is added, the AMPPD reacts with the enzyme lipase, and the chemiluminescence is generated. The luminescence intensity of the chemiluminescence is measured with a photodetector and guided to a computer. Performs strength analysis. Quantifies AFP concentration in sample.
  • the multi-mode optical fiber 15 3 shown in Figure 5 can be replaced with- May be a simple configuration directly connected to 15 2.
  • the present invention may be applied to measurements other than the above-described embodiments. For example, measurement of various optical properties (specific scattering, electric 50. Chemiluminescence, resonance energy transfer, plasmon resonance, etc.) limited to a specific site or specific region of the sample to be measured. It may be applied to measurement.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment. It includes a measurement signal processing unit and a measurement device system described in the following sections.
  • a connection unit that can be connected to a measurement device that has an external output unit that outputs a measurement signal to the outside.
  • a signal propagation mechanism having a propagation means according to the output of the measuring device 1 light (light, sound wave, electricity, etc.),
  • a measurement signal processing unit comprising: an element that receives a signal propagated by a signal propagation mechanism and obtains a specific parameter included in the first signal.
  • the post-processing data is output to an external m unit that has visualization means that allows visualization of the post-processing data (numerical values, graphs, images, characters, etc.)
  • a measurement signal processing unit having an external output unit for performing the measurement.
  • the external output part of the post-computation data is a measurement signal processor characterized by r including propagation means and connection parts. The unity.
  • connection unit includes a multimode waveguide unit.
  • a measurement device system having a measurement signal processing unit, characterized in that the measurement device has data visualization means for visualizing the data after calculation in an expression format that allows visual recognition.
  • the signal source required by the measurement equipment for the measurement (optical, say / J3 ⁇ 4, Etc.) and an external input unit that can input a propagation signal from outside the device to the propagation means.
  • Connection processing that can be connected to the external input unit and measurement processing through the connection
  • the measurement system includes a single-mode waveguide means at the junction of the signal source introduction unit.
  • the contact of the measurement processing unit shall be a measuring instrument system including multi-mode waveguide means.
  • the measuring device is any one of a microscope, an endoscope, and an analyzer.
  • the measuring instrument as defined in any one of Items 7 to 10 wherein the measuring instrument has a measuring means based on optical techniques.
  • the present invention can be a measurement processing unit that can be applied to a measurement device using another signal source such as an ultrasonic microscope or a tunnel microscope. It can be a measuring instrument system to which a source can be separately connected. O 0 In addition, the present invention can be a system that can be connected to an endoscope and an analyzer in addition to a microscope.

Abstract

測定装置１００は、共焦点光学顕微鏡１１０と、蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を発する励起光源部１３０と、受光ユニット１４０とを有している。共焦点光学顕微鏡１１０は、励起光源部１３０からの励起光を取り込むための励起光入力ポート１１２と、励起光により発生された蛍光を出力するための出力ポート１１３とを有している。受光ユニット１４０は、共焦点光学顕微鏡１１０からの蛍光を含む信号光を取り込むための入力部１４１を有している。受光ユニット１４０の入力部１４１は、光ファイバー１５３を介して、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３と光学的に接続される。

Description

明 細 書
受光ュニッ 卜およびそれを含む測定装置
技術分野
本発明は、 試料から発せられる光を測定するための測定装 置に関する。
背景技術
試料中の特定部位から統計的な性質や分子レベルの機能を 解析する測定装置と して、 例えば特表 1 1 一 5 0 2 6 0 8号 公報では、 共焦点光学顕微鏡をベースと し、 レーザー光を顕 微鏡対物レンズを通して蛍光標識された試料に照射し、 試料 内の蛍光分子による蛍光強度ゆらぎを解析し （蛍光相関分光 を行ない） 、 蛍光分子の並進拡散係数などの統計的な性質や 分子間の相互作用などを求める方法と装置を開示している。
共 焦 点 光 学 顕 微 鏡 に 関 し て は 、 例 え ば 、 "Con foca l Mi croscopy" T. W i I son (ed. ) Academi c ress (London)、 主 に 生 物 試 料 を 対 象 と し た 解 説 と し て 、 "Handbook of Bi ologi ca l con f oca I Mi croscopy" J. B. Paw I ey (ed. ) Pl enum Press (New York)などがある。 蛍光相関分光法に関 し て は 、 例 え ば 、 "Fl uorescence corre l at ion spectroscopy" R. Rigl er, E. S. E I son (eds. ) S r i nger (Ber l i n) や金城政孝 「蛋 白 質 核酸 酵素 j (1999) Vol. 44, No. 9, p 1431-1437などの解説がある。
蛍光相関分光法では共焦点走査型レーザー顕微鏡の視野の 中で蛍光物質で標識されたタ ンパク質や担体粒子を溶液中に 浮遊させ、 これらの微粒子のブラウ ン運動に基づく蛍光強度 のゆらぎを解析して自己相関関数を求め、 対象とする微 ¾iナ の数や並進拡散速度などを推測する。
―方、 蛍光標識された標本試不'斗にレーザ ―光を走査しなが 昭射し、 試料の蛍光 !lkl微鏡画像を生成する i 隹 占走査型レ 一ザ一顕微鏡がある ±h隹 占击杳型レーザ ―顕微鏡に関して は、 例えば特開平 1 0 一 2 0 6 7 4 2号公報に目！：述されてい ある いは、 大出孝博ら による解説 （ 「光学」 Voに 1 8 8, p . p. 392 - 398 ) や、 河田聡によ る解説 （ 「光学」
Vo l . 1 8, Vo l . 8 p - . 380 391 ) などがある。
米国特許第 5 1 2 0 9 5 3 号ではレーザ一走査型共焦 点光学顕微鏡にねいて、 レ —ザ一光源からの光を光ファイバ 一に導光し 顕微鏡本体に導き、 lit料面に照射する。 試料か らの光信号を顕微鏡本体を介して再び光フ ァィバ一に導き、 光ファイバ一に接 した光検 utj で受光する 。 すなわち、 光 源と光検出器が顕微 ί¾本体と光フ ァイノ、一で光接続された装 置構成となつている 、 米国特許第 5 1 6 1 , 0 5 3 号では共焦占光学顕微鏡の光源からの光を光フ ァイバーで顕 微鏡本体に導さ、 試料からの光信号を光分岐して別の光フ ァ ィバーに導光し、 れに光 ¾あ！ された光検出器で受光する。
特表 2 0 0 1 - 5 0 5 9 9 7号公報は、 顕微鏡に接続して
F C S測定を行なうための着脱自在のュニッ 卜を開示してい る。 このュ一 V 卜内には光源入出力ポー 卜と光信号の出力ポ 一 卜が設置されており、 出力ポー 卜から出力された信号光を 光検出器で受光して F C S測定を行なう。
また特表 2 0 0 3 - 5 2 4 Ί 8 0号公報は顕微鏡に接続し た F C S測定を行なうためのュ―ッ 卜を開不されている o のュ二ッ 卜では光源本体が組み込まれている。 このュ一 V 卜 から光を射出し、 顕微鏡に導き 、 試料を光照射する。 試料か ら発せられた光信号を顕微鏡を介してこのュニッ 卜内で受光 し F C S測定を行なつ。
いずれのュ二ッ 卜も、 ュニッ 卜内に光源入出力ポー 卜を備 えており 、 光源から発せられた光ビームがュニッ 卜内を通過 する o 光源から発せられた光ビ一厶はュニッ 卜内のレンズゃ ラ一などの光学素子に入射して反射や屈折や透過などを繰 y返す。 このとさ 、 光学素子での透過損失や反射損失によつ て反射光や散乱光が生じ 、 生じた反射光や散乱光の一部はノ ィズ光となる o 例えば 、 通常のアルミ平面ミラーでは 1 0 % 程度の反射損失がある o また、 光源からの光ビー厶をュ二ソ 卜内に通過させて顕微鏡本体内に導くために少なく とも一個 の八一フミ ラ一 (またはダイク ロイ ツク ミラ一） が必要であ り 、 その八一フミラー (またはダイク 口イ ツク ミ ラー） で 反射損失がある 。 さ らに 、 ュニッ 卜と顕微鏡本体を結合する ファイバ一などの光学系が必要であ り 、 その光学系でも例え ばフアイバ一の入射 ¾と射出端でも反射損失がある。 結局 光源からの光の強度は 試料面上において、 全体で 1 0 ~ 2
0 %低下する o 検出対象の光は、 例えば試料内の蛍光物質か ら発せられる蛍光であ 、 その光強度が微弱である。 このた め、 検出対象の光を確実に検出するためには、 光源からの光 が光路内でなるベく減衰しないよう にしなければならない o また、 光路の途中にある光学素子での減衰を見越して、 光源 の光出力を高く しなければな ない。
しかち ユニッ ト内には光検出器が設置されており 、 光源 からの光ビー厶が通過する経路に距離的に近いため、 光学素 子で生じた反射光や散乱光が光検出器に入射しやすい。 この ようなノィズ光は、 試料から発せられる検出対象の光が微弱 なため 、 信号の S / N比の低下を引き起こす危険性が高い。 発明の開示
本発明は 、 このような実状を考慮して成されたものであ り 、 その主な S的は、 試料から発せられる光を測定するための測 定装置を構成するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光 ュ二ソ 卜を提供することである。
本発明は 、 ひとつには、 試料から発せられる光を受光する ために 隹点光学顕微鏡に接続される受光ュニッ 卜に向けら れている 本発明の受光ュニッ 卜は、 共焦点光学顕微鏡から 出力される信号光を取り込むための入力部と、 入力部を介し て取 込まれた信号光から検出すべき特定の光を抽出する光 抽出部とを有している。
また本発明は、 ひとつには、 試料から発せられる光を測定 するための測定装置に向けられている 。 本発明の測定装置は、 試料から光を発生させるための光を発する光源部と、 試料か ら光を発生させるための光を取り込むための光入力ポー 卜と 信号光を出力するための出力ポー 卜とを有する共焦点光学顕 微鏡と、 共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニッ トとを備 えておリ、 受光ュニッ 卜は、 共焦点光学顕微鏡から出力され る信号光を取り込むための入力部と、 入力部を介して取り込 まれた信号光から検出すベき特定の光を抽出する光抽出部と を有している。
図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の第一実施形態に従う共焦点光学 ail微鏡を 利用 して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装 の全体構成を示している。
図 2 は、 図 1 に示される測定装置の外観を概略的に示して いる。
図 3 は、 図 1 に示される受光ュニッ 卜の構成 示している 図 4 は、 図 1 に示される測定装置とその信号処理系とを示 している。
図 5 は、 本発明の第二実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関 分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している o 図 6 は、 本発明の第三実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関 分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している o 図 7 は、 本発明の第四実施形態に従う共焦点走査 レ ―ザ 一顕微鏡を利用 して蛍光の強度ゆらぎの相 分光解析を行な う測定装置の全体構成を示している o
図 8 は、 本発明の第五実施形態の蛍光の時間分解測定を行 なう測定装置の構成を概略的に示している o
図 9 Aは、 図 8 に示した測定 置による蛍光寿命の長い試 料の測定結果であ り、 試料内の 光分子から発せられた蛍光 強度の時間変化を表わしている o
図 9 B は、 図 8 に示した測定装置による虽光寿命の短い試 料の測定結果であり、 試料内の蛍光分子から発せられた蛍光 強度の時間変化を表わしている。
図 1 0 は、 本発明の第六実施形態の蛍光の偏光に関する測 定を行なう測定装置の構成を概略的に示している o
図 1 1 は、 本発明の第七実施形態の蛍光の偏光に関する測 定を行なう測定装置の構成を概略的に示している o
発明を実施するための最良の形態
以下 図面を参照しながら本発明の実施形態に いて説明 する。
第一実施形態
本実施形態は tt隹 占光学顕微鏡を利用 して蛍光の強度ゆ らぎの相関分光解析 （ F C S ) を行なう測定装 に向けられ ている 0 図 1 は 、 本発明の第一実施形態に従ラ ±h隹点光学顕 微鏡を利用 して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測 定装置の全体構成 <ar示している。 図 2 は、 図 1 に示される測 定装置の外観を概略的に示している。 図 3 は 図 1 に示され る受光ュ二ッ 卜の構成を示している。 図 4 は 図 1 に示され る測定装置とその信号処理系とを示している o
図 1 と図 2 に示されるよう に、 本実施形態の測定装置 1 0
0 は、 , 隹 占光学顕微鏡 1 1 0 と、 蛍光物質から蛍光を発生 させるための励起光を発する励起光源部 1 3 0 と 受光ュ二 ッ 卜 1 4 0 とを有している 0
図 1 に示されるよう に 、 ±h隹 /T * 占光学顕微鏡 1 1 0 は、 1¾料
1 2 1 が載せられる ¾ ステージ 1 2 2 と 試料ステ一ジ 1
2 2 を移動させるための二つのステツ ピングモ一夕 - 1 2 3 とを有している 0 二つのステッ ピングモ一夕一 1 2 3 は 駆 動軸が互いに直交するよう に配置されており 、 試料ステージ
1 2 2 を互いに直交する一方向、 いわゆる X方向と y方向に 移動させ得る ステッ ピングモーター 1 2 3 は （図示 しな い） コ ン 卜口 ―ラーによつて制御される。
測定装置 1 0 0 は、 通常の光学観察のための照明光を発す るための照明光源 1 2 5 をさ らに有し、 共焦点光学顕微鏡 1
1 0 は、 照明光源 1 2 5 からの照明光を取り込むための照明 光入力ポー 卜 1 1 1 と、 励起光源部 1 3 0 からの励起光を取 リ込むための励起光入力ポ一 卜 1 1 2 と、 励起光により発生 された蛍光を出力するための出力ポー 卜 1 1 3 とを有してい 照明光源 1 2 5 は、 < れに限定されないが、 例えば 、 ハ P ゲンランプあるいはメタル八ライ ドランプで構成され •ό。
共焦点光学顕微鏡 1 1 0 は 、 5式料ステージ 1 2 2の下方に 配置された対物レンズ Ί Ί 4 と、 照明光入力ポー 卜 1 1 1 か ら取り込まれた *昭***明光を対物レンズ 1 1 4 に方向付けるダイ ク ロイ ツクミ ラ一 1 1 5 と、 観察者による試料 1 2 1 の目視 観察を可能にする接眼レンズ 1 2 6 とを有している
測定装置 1 0 0 はさ らに、 試料 1 2 1 の光学像を取得する ための C C D力メラ 1 2 7 と 、 C C Dカメラ 1 2 7で取得さ れた光学像を抽出 (表示 ) する T Vモ二夕一 1 2 8 とを有し ている。
励起光源部 1 3 0 は 二 のレーザ一光源 1 3 1 と 1 3 2 と、 レーザー光源 1 3 1 と 1 3 2 からのそれぞれの光ビーム を平行化する二つのレンズ 1 3 3 と 1 3 4 と、 レンズ 1 3 3 からの光ビームを励起光入力ポー 卜 1 1 2 へ方向付けるミラ
- 1 3 5 と、 レンズ 1 3 4からの光ビーム 励起光入力ポー 卜 1 1 2 へ方向付けるダイク ロイ ツク ミ ラ一 Ί 3 6 とを有し ている。
励起光源部 1 3 0 のレーザー光源 1 3 1 と 1 3 2 は、 励起 する蛍光物質の種類に >、して、 適した波長の光を発するもの が使用される。 これに限定されないが、 例えば 蛍光物質は ローダミ ン ■ グリ ー ン ( R h o d am i n e G r e e n ： R h G ) とサイ ファイヴ （ C y 5 ) であ り、 これに対応して、 レ一ザ一光源
1 3 1 は、 ローダミ ン ' グリ ーン （ R h G ) を励起するため に、 波長 4 8 8 n mの光を発するァルゴンレ一ザ一であり、 レーザ一光源 1 3 2 は、 サイフアイヴ （ C y 5 ) を励起する ために、 波長 6 3 2 . 8 n mの光を発する H e ― N e レーザ 一である。
ダイク ロイ ツクミラー 1 3 6 は、 レーザ一光源 1 3 1 から 射出される励起光を透過し、 レーザ一允 ilk 1 3 2 から射出さ れる励起光を反射する特性を有し、 レーザ一光源 1 3 1 から の励起光と レーザー光源 1 3 2 からの励起光とを結合して励 起光入力ポー 卜 1 1 2 に導く。
共焦点光学顕微鏡 1 1 0 は、 励起光入力ポー 卜 1 1 2 から 導入された励起光を反射して対物レンズ 1 1 4 に方向付ける と共に、 試料 1 2 Ί から発生した蛍光を透過するダイク ロイ ック ミラー 1 1 6 と 、 ダイク ロイ ツクミラ一 1 1 6 からの蛍 光のビームを反射して出力ポー 卜 1 1 3 に方向付けるミラー
1 1 7 と、 ミラー 1 1 7 からの蛍光のビー厶を収束させる レ ンズ 1 1 8 とを有している 0
受光ュ一ッ 卜 1 4 0 は 図 3 に詳しく 示されるよう に、 共 焦点光学顕微鏡 1 1 0 からの蛍光を含む信号光を取り込むた めの入力部 1 4 1 と、 入力部 1 4 1 を介して取 U込まれた信 号光のビ一厶を平行化するためのレンズ 1 4 2 と 、 信号光か ら蛍光をその種類毎に抽出する光抽出部 1 4 3 と 方の蛍 光のビー厶を収束させるためのレンズ 1 4 6 と その蛍光を 検出するための光検出器 4 8 と、 光 出 1 4 8の手前に 配置されたピンホールュ一ッ 卜 1 4 7 と、 もラ一方の蛍光の ビームを収束させるためのレンズ 1 5 0 と、 その蛍光を検出 するための光検出器 1 5 2 と、 光検出器 1 5 2 の手刖に配置 されたピンホールュニッ 卜 1 5 1 とを有している o
受光ュ ―ッ 卜 1 4 0 の入力部 1 4 1 は、 光フ ァィバ一 1 5
3 を介して ±t隹 占光学 T"顕微鏡 1 1 0 の出力ポ一 卜 1 1 3 と 光学的に接続される。 光フ ァィバ ー 1 5 3 は ±t隹 占光学顕 微鏡 1 1 0 から二種類の蛍光を含む光を受光ュ一ッ 卜 1 4 0 に導くため 、 マルチモー ト、光フ アイバーで構成される 。 光フ アイバー 1 5 3 は、 これに限定されないが、 例えば、 コア直 径 1 0 0 m N A 0 . 2 2 のマルチモー ド光フ ァィバ一で め 。
よ り詳しく は、 出力ポ一 卜 1 1 3 は、 例えば写真撮影用の カメラを接続するためのポ一 卜であ り 、 （図示しない ) 光フ アイバー接続端子が取り付けられる。 光ファィ 一接 fe¾ ¾子 は、 これに限定されないが 、 例えば F C コネク夕や S C コネ クタや S T コネクタなどである 。 受光ュニッ 卜 1 4 0の入力 Ί 0
* 部 1 4 1 にも 1口]様の (図不しない） 光フ ァィバ 俊！ ί¾牺チ が取り付けられる ο 光フ ァィバ' 1 5 3 は 、 これらの光ファ ィバー接 子に接 される o
光抽出部 1 4 3 は 方の蛍光を含む波長帯域の光を透過 し、 もラ一方の虫光を含む波長帯域の光を反射する特性を有 するダイク ロイ ツク ミラー 1 4 4 と 、 一方の蛍光を選択的に 透過する特性を有するフィルター 1 4 5 と、 ちう一方の蛍光 を選択的に透過する特性を有するフィ ルター 1 4 9 とを有し ている。
例えば、 前述の蛍光物質に対応して、 ダイク 口ィ ック ミラ
1 4 4 は、 サイフ ァイヴ （ C y 5 ) から発生する蛍光を含 む波長帯域の光を透過し、 ローダ ン · グリ ーン ( R h G ) から発生する蛍光を含む波長帯域の光 反射し、 フィル夕
1 4 5 は、 サイファイヴ （ C y 5 ) から発生する蛍光を選択 的に透過 し、 フ ィ ルタ一 1 4 9 は、 ロ ーダミ ン ■ グ ン
( R h G ) から発生する蛍光を選択的に透過する o
ピンホールユニッ ト 1 4 7 は、 その後ろの光検出器 1 4 8 で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して ±h 隹 占の位置関係にある ピンホールを有している。 同様に ピン ホ —ルユニッ ト 1 5 1 は、 その後ろの光検出器 1 5 2で検 t-U される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して ±t 隹 占の位 関係にある ピンホールを有してい -o) o
光検出器 1 4 8 と 1 5 2 は、 入射した光の強度を反映した 電気信号を出力する。 光検出器 1 4 8 と 1 5 2 は、 これに限 定されないが、 例えば、 いずれもアバランシェ · フォ トダイ 才一 ド （ A P D ： Avalanche Photo Diode) である。 あるい は、 光電子増倍管であってもよい。 ピンホールユニッ ト 1 4 7 と 1 5 1 内のピンホールは、 これに限定されないが、 例え ば、 いずれも 2 0 0 mの直径を有している。 また、 対物レ ンズ 1 1 4 は、 微小な共焦点領域の形成のために、 これに限 定されないが、 例えば、 1 . 0程度の N A (開口数） を有し ている。 これによ り、 直径 0 . 6 Α6 ΠΊ程度、 長さ 2 μ ιτι程度 の略円柱状の共焦点領域が得られる。
図 4 に示されるよう に、 測定装置 1 0 0 はさ らに、 受光ュ ニッ ト 1 4 0 の光検出器 1 4 8 と 1 5 2 から出力される電気 信号を波形整形してオン · オフの二値化パルスに変換する信 号処理装置 1 6 1 と、 信号処理装 1 6 1 から出力されるニ 値化パルスに対して相関演算を行な Όて白己相関関数を求め る相関解析装置 1 6 2 と、 相関解析装置 1 6 2 で得られた自 己相関関数から蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光 分子の数の変化などを求めるためのコ ンピュ一夕一 1 6 3 と を有し、 さ らには、 相関解析装 1 6 2 で得られた結果を表 示する Τ Vモ二ター 1 6 4 を有している ο
本実施形態の測定装置 1 0 0 において 蛍光相関分光測定 は次のよう にして行なわれる。
図 1 において、 レーザ一光源 3 Ί から発せられた励起光 ビームは、 レンズ 1 3 3で適当な径の平行光ビームに変えら れ、 ミラー 1 3 5 で反射され、 ダィク □ィ Vク ミラー 1 3 6 を透過し、 励起光入力ポー 卜 1 1 2 を通つて空間伝播によ り 共焦点光学顕微鏡 1 1 0の内部に入る ο なお 、 この空間伝播 の部分はンングルモ ド'ファィバーによ り光学的に接続した 構成と して よい。
また レ ザ一光源 1 3 2 から発せられた励起光ビ ―厶は レンズ 1 3 4 によ り M当な径の平行光ビー厶に変えられ 、 ダ ィク □ィ ック ミ ラー 1 3 6 で反射され 励起光入力ポ 卜 1
1 2 を通 て ±t隹 占光学顕微鏡 1 1 0 の内部に入る o
±h隹 占光学顕微鏡 1 1 0 に入った励起光ビームは ダィク 口ィ ソク ラ 1 1 6で JK.射され、 ダィク ロイ ツク ラ - 1
1 5 を透過し 、 対物レンズ 1 1 4 によつて収束される o 前述 したよラ に 対物レンズ 1 1 4 は、 1 0程度の大さい開口 数を有しておリ 、 これによ り 、 直径 0 • 6 m程度 長さ 2 t m程度の略円柱状の 焦点領域が られ o
の領域に存在する虫光物質は、 励起光によ り励起され、 蛍光信号 （フ才 卜ンパルス ) を発生する 。 蛍光物質から発生 された蛍光信号の一部は 試料 1 2 1 で反射された励起光の 一部と共に 対物レンズ 1 1 4 に入射して信号光となる。 対 物レンズ 1 1 4 に入射した信 光は、 ダイク 口ィ ックミラー
1 1 5 とダィク 口イ ツク ラ 1 1 6 を 過し ラ 1 1
7 で反射され 、 レンズ 1 1 8で収束される。 レンズ 1 1 8 で 収束された信号光は、 出力ポー 卜 1 1 3 に取リ付けられた光 ファイバー接 子から光フ ァィバ一 1 5 3 内に入る o
光フアイパ' ― 1 5 3 内に入つた 1目 光は、 光フ ァィバ 1
5 3 の内部を伝搬して、 受光ュニッ 卜 1 4 0 の入力部 1 4 1 から射出される o 図 3 に示されるよう に 、 入力部 1 4 1 から 射出された信
Figure imgf000014_0001
ビームは 、 レンズ 1 4 2 で適当な径の平行 Ί 3 光ビームに変えられ、 ダイク ロイ ツク ミ ラー 1 4 4 によ り蛍 光の種類毎に分離される。 すなわち、 サイ フ ァ イ ヴ （ C y 5 ) から発生した蛍光は、 ダイク ロイ ツク ミ ラ一 1 4 4 を透 過し、 ローダミ ン · グリ ーン （ R h G ) から発生する蛍光は、 ダイクロイ ツク ミ ラー 1 4 4 で反射される。
ダイク ロイ ツクミ ラー 1 4 4 を透過した光は、 フィルター Ί 4 5 により不所望な成分が取り 除かれ、 レンズ 1 4 6 で収 束され、 ピンホールユニッ ト 1 4 7 を介して光検出器 1 4 8 に入射して、 光電変換される。 同様に、 ダイク ロイ ツク ミラ 一 1 4 4 で反射された光は、 フィ ルター 1 4 9 により不所望 な成分が取り 除かれ、 レンズ 1 5 0で収束され、 ピンホール ユニッ ト 1 5 1 を介して光検出器 1 5 2 に入射して、 光電変 換される。
図 4 において、 光検出器 1 4 8 と 1 5 2 で光電変換された 電 信 は 、 信号処理装置 1 6 1 に送られて二値化パルス信 号に変換される。 二値化パルス信号は相関解析装置 1 6 2 に 送られ、 相関解析装置 1 6 2 において例えば自己相関関数が 求められる 自己相関関数はコ ンピュー夕一 1 6 3 に送られ、 蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化 などの算出に利用される。
相関解析装置 1 6 2 は、 二種類の蛍光分子 （ローダミ ン · グリ ーン、 サィフ ァイヴ） による蛍光強度ゆらぎの相互相関 関数を求めてもよい。 あるいは 相関解析装置 1 6 2 を用い ずに、 信巧処理装置 1 6 1 から出力される二値化パルス信号 を直接コ ンピユ ーター 1 6 3 に入力し、 コ ンピユ ーター 1 6 ϋ
3 でl il相関解析を行なって、 蛍光強度ゆらぎの自己相関関数、 あるいは; ¾相互相関関数を求めてちょい。
以下、 蛍光強度ゆらぎの自 己相関関数について説明する。 光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光強度ゆらぎの自 己相関関数 R ( τ ) は次式で表される。
R(T) = J0 I(t)I(t + x)dt =〈I(t)I(t + τ)〉 ■■■( 1 ) ただし、 1 は光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光の強 度、 t は時間、 て は遅れ時間である。 < >はアンサンプル平 均を表わす。
蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を規格化すると、 次のよう になる
Figure imgf000016_0001
.■ " ( 3 ) ただし、 G ( τ ) は規格化した蛍光強度ゆらぎの自己相関関 数、 Νは共焦点領域内に存在する平均分子数であ り i 隹 占 領域内に存在する分子の存在確率がポァソン分布に従う と仮 定している。
入射光がガウス分布を有する光 （ァルゴンレーザ一やヘリ ゥ厶ネオンレーザーなど） であるとすると 、 光強度ゆらぎの 自己相関関数 G ( r ) は次のよ なる
Figure imgf000017_0001
ただし 、 Dは蛍光分子の並進拡散係 、 ω！ は共焦点領域を 円柱と近似したときの问 <±の 1 / 2 ω 2 は半径である。
このとき 、 て Dを蛍光物質の分子の拡散時間とすると、 次 のよう にな
て D (5)
Figure imgf000017_0002
蛍光強度ゆらぎの自己相関関数の ロ フアイノレから 光分 子の大きさなどを推定する場合は、
Figure imgf000017_0003
光強度ゆらぎの 己相 関関数を蛍光強度ゆらぎの時間 均値の二乗で割って 力一 ブフィ ッティ ングを行なって拡散時間とと、、 丫丫軸軸切切片片 （（自己相 関関数が y幸 i由と交差する点の y座標） を求める。 力一 フィ ッティ ング法 しては最小二乗法などを用いればよい 例え ぱ、 非線形最 /J 自乗法の一つである レーベンバーグ · マーカ — 卜 し evenberg Marquard) 法を用 いて最適化 してもよい ( "Numer i ca l Rec i pes i n C"， Wi l l i am H. Press ら著、 丹 慶勝市ら訳、 技術評論社、 1 9 9 4 ) 。
なお、 蛍光強度ゆ らぎの 自 己相関関数の Y軸切片の値は ( 3 ) 式からわかるよう に、 共焦点領域内に存在する平均の 蛍光分子の数に対応する。 （参考文献 ： S i ngl e Mo l ecu l e Detection in Solution, Ch. Zander, J. Ende r I e i n, R. A. Kel I er (eds. ) WILEY-VCH, Germany)
本実施形態において、 受光ュニッ 卜 1 4 0 は、 図 2 に示さ れるよう に 隹点光学顕微鏡 1 1 0から独立 した分離ュニ ッ 卜構造とな ており 、 光フ ァイバ を介して共焦点光学顕 微鏡 1 1 0 と光学的に接続される。 受光ュ ッ 卜は少なく と も集光レンズとフイノレタ —を備えている。 フィ ルターは、 試 料からの蛍光波長だけを選択的に透過させるスぺク 卜ル特性 を持つフィル夕 で構成される。 また受光 ZLニッ 卜は、 図 3 に示されるよラ に 、 集光レンズとフィルタ に加えて光検出 器を備えていて よい。 この光強度ゆらぎ ニッ 卜は光接続
¾5子によ り容易に着脱できる。 光強度ゆらぎの測定を行なわ ないときは 光接 In:端ナ部分で顕微鏡本体から切り離してお いても い o
本実施形 において、 励起光源部 1 3 0 と受光ュニッ 卜 1
4 0 はそれぞれ 隹 占光学顕微鏡 1 1 0から独立した分離ュ ニッ 卜構造とな ており 、 励起光源部 1 3 0 は励起光入力ポ 卜 1 1 2 を介し τ V- ±h隹 /ϊϊϊ点光学顕微鏡 1 1 0 と光学的に接続 され、 受光ュ ソ 卜 1 4 0 は出力ポー 卜 1 1 3 を介して共焦 点光学顕微 1 1 0 と光学的に接続される o
このため 通常の共焦点光学顕微鏡 1 1 0 に励起光源部 1
3 0 と受光ュ ッ 卜 1 4 0 ほかを接続する とによ り 、 容易 に蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なラ装置を構成する ことが可能となる o
また V 励起光源部 1 3 0から射出された励起光は、 受光ュ 二ッ 卜 1 4 0 内を jMることな < 、 対物レンズの近く に配置さ れた励起光入力ポ — 卜 1 1 2 を介して共焦点光学顕微鏡 1 Ί
0 に取り込まれる 。 このため 、 励起光が途中に経由する光学 素子が少な < 、 励起光の強度の低下がわずかに抑えられる o これによ 、 励起光が試料に効率良く 照射される。 また 、 受 光ュ二ッ 卜 1 4 0 内を通る光は 、 実質的に試料から発せられ た信号光だけとなる。 その 果 、 信号の s Z N比の ¾い測定 を行なう .— とができる。
第二実施形態
本実施形態は it隹 占光学顕微 を利用 して蛍光の強 /スゆ らぎの相関分光解析を行なう別の測中 壮 要
At. 3R Bに向けられている 本実施形態の測定装置は 、 光検出器のレイァゥ 卜の点におい て、 第一実施形態の測定装置と相理している o
図 5 は、 本発明の第一実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関 分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している o 図
5 において、 図 3 に不された部材と同一の参照符号で指示さ れた部材は同様の部材であ り、 その詳しい説明は省略する o 図 5 に示されるよう に 、 本実施形態の測定装 Λ Ί 0 0 Aで は、 受光ュ二ソ 卜 1 4 0 Αは、 共隹点光学顕微 Ί 1 0 から の信号光を取 込むための入力部 1 4 1 と 、 信 光のビ一厶 を平行化するための レンズ 1 4 2 と 、 In ^3光から蛍光をその 種類母 1 抽 ιϋする光抽出部 1 4 3 と 、 一方の蛍光のビ一厶を 収束させるためのレンズ 1 4 6 と その蛍光を出力するため の蛍光出力部 5 4 と もう一方の蛍光の ビー厶を収束させ るためのレンズ Ί 5 0 と 、 その蛍光を検出するための蛍光出 力部 1 5 5 とを有している
第一実施形態と 1口 j に、 受光ュ二ッ 卜 1 4 0 の入力部 1 4
1 は、 マルチモ一ド光フ ァィ 一 1 5 3 を介して、 共焦点光 学顕微鏡 1 1 0 の出力ポー 卜 1 1 3 と光学的に接続される。 また、 光抽出部 1 4 3 は、 一方の蛍光を含む波長帯域の光を 透過し、 もう一方の蛍光を含む波長帯域の光を反射する特性 を有するダイク □イ ツク ミラ ― 1 4 4 と、 一方の蛍光を選択 的に透過する特性を有するフィ ル夕一 1 4 5 と、 もう一方の 蛍光を選択的に透過する特性を有するフィ ル夕一 1 4 9 とを 有している。
蛍光出力部 1 5 4 は、 これに限定されないが、 例えばシン ダルモー ド光フ ァィバー 1 5 6 を介して、 光検出器 1 4 8 と 光学的に接続される。 ま ス 蛍光出力部 1 5 5 は、 これに限 定されないが 、 例えぱシングルモ一ド光フ ァイ ノ 一 1 5 7 を 介して光検出器 1 4 8 と光学的に接続される
蛍光出力部 1 5 4 は、 光検出器 1 4 8 で検出される蛍光を 発生させる励起光の収束点に対して ±t 隹 占の位置関係にある ピンホールを有している。 様に、 蛍光出力部 1 5 5 は、 光 検出器 1 5 2 で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点 に対して共焦占の位置関係にある ピンホールを有している。 例えば、 蛍光出力部 1 5 4 と 1 5 5 は光フ アイバー接続端子 であり 、 ピンホ一ルはそれらに取リ付けられた光ファイバ一
1 5 6 と 1 5 7 の ¾5 Hであ てもよい。
本実施形態の測定装置 1 0 0 Aの測定動作は、 第一実施形 態の測定装置 1 0 0 と全く じであ り 、 その説明は省略する 本実施形態の測定装置 1 0 0 Aでは 光検出 #δ Ί 4 8 と 1
5 2が受光ュニッ 卜 1 4 0 Aの外に配 Λされているため そ の後段に接続される信巧処理装置やコ ンピ L一タ ―などの配 置に合わせた設置を行なう ことが可能となる o
第三実施形態
本実施形態は、 共焦、占光学顕微鏡を利用 して蛍光の強度ゆ らぎの相関分光解析を行なう別の測定装置に向けられている 本実施形態の測定装置は 、 共焦点光学顕微鏡と受光 ZL一ソ 卜 との間の光学的接続の占において、 第一実施形態の測定装 と相違している。
図 6 は、 本発明の第 ―実施形態の蛍光の強度 らぎの相関 分光解析を行なう測中装置の構成を概略的に示している 図
6 において、 図 2 に示された部材と同一の参照符 で指示さ れた部材は同様の部材であり 、 その詳しい説明は 略する o 図 6 に示されるよラ に 、 本実施形態の測定装置 1 0 0 Bで は、 共焦点光学顕微鏡 1 1 0 と受光ュ一ソ 卜 1 4 0 とが 光 フ ァイバーを介する ,となく 、 単に空間を介して接 されて いる。 すなわち、 図 6 には見えないが 隹 占光学顕微 la 1
1 0 の出力ポー 卜 1 Ί 3 (図 1 や図 3 を参照） に受光 一ソ 卜 1 4 0の入力部 1 4 1 (図 1 や図 3 を参照） が直接取 付 けられている。 勿論 ±t焦点光学顕微鏡 1 1 0 の出力ポ一 卜
1 1 3 と受光ュニッ 卜 1 4 0 の入力部 Ί 4 1 とは 筒などの 部材を介して接続されてもよい。
本実施形態の測定装眞 1 0 0 Bの測中動作は 第一実施形 態の測定装置 1 0 0 と全く 同 じであ り その説明は省略する 本 施形態の測定装置 1 0 0 Βでけ ： tt佳 占光学顕微鏡 1
1 0 と受光ュ一ッ 卜 1 4 0 とが単に空間を介して接続されて いるので、 蛍光の損失が少ない。
第四実施形態
本実施形態は 共焦点走査型レーザ一顕微鏡を利用して蛍 光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装 Λに向けられ ている 。 図 7 は 本発明の第四実施形態に従う ± ✓±、焦占走査型 レ一ザ ―顕微鏡を利用 して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析 を行なう測定装置の全体構成を示している。
図 7 に示されるよう に、 本実施形態の測定装置 2 0 0 は、
±h隹 占走査型レ一ザ一顕微鏡 2 1 0 を含んでいる ±h隹 占走 査型レ一ザ一顕微鏡 2 1 0 は、 顕微鏡本体 2 1 2 と 顕微鏡 本体 2 1 2 に取 付けられた対物レンズ 2 1 7 と 対物レン ズ 2 1 7 の上方に配置された、 試料 2 1 9が載せられる試料 ステ ―ジ 2 1 8 と 、 蛍光物質から蛍光を発生させるための励 起光を発する一 の走査光源部 2 3 0 と 2 4 0 とを有してい
¾J
mil微 Is本体 2 Ί 2 は、 二つの走査光源部 2 3 0 と 2 4 0か らの励起光をそれぞれ取り込むための励起光入力ポ一卜 2 1
3 と 2 1 4 と 、 励起光によ り発生された蛍光を出力するため の二 の出力ポ 卜 2 1 5 と 2 1 6 とを有している
走査光源部 2 3 0 は、 レーザー光源 2 3 Ί と 、 レ一ザ一光 源 2 3 1 からの光ビームを平行化する レンズ 2 3 2 と レン ズ 2 3 2 からの光ビームを反射するミ ラー 2 3 3 と 光ビ一 厶を互いに直交する二方向 （ X方向と 丫方向） に走査する X Yスキヤナ一 2 3 4 と、 X Yスキャナー 2 3 4 を駆動するス キヤナー駆動装 Λ 2 3 5 とを有している。
同様に 、 走査光源部 2 4 0 は、 レーザー光源 2 4 1 と、 レ 一ザ一光源 2 3 Ί からの光ビームを平行化する レンズ 2 4 2 と、 光ビ ―厶を互いに直交する二方向 （ X方向と Y方向） に 走査する X Υスキャナ一 2 4 4 と 、 X Yスキャナー 2 4 4 を 駆動するスキャナ ―駆動装置 2 4 5 とを有している。
X Υスキャナ一 2 3 4 と 2 4 4 は、 例えば、 その各々が光 ビームを一本の軸に沿って走査し得る二つのガルバノ ミ ラー で構成され 、 一つのガルバノ ミ ラ一は好ま しく はそれぞれの 走査軸が互いに直交するよう に配置されている。 あるいは、 ポリ ゴン ラ一やホログラムスキャナ一などで構成されても よい。
X 丫スキャナ一 2 3 4 からの光ビームは、 励起光入力ポー 卜 2 1 3 から顕微鏡本体 2 1 2 内に取り込まれる。 また、 X 丫スキヤナ一 2 4 4 からの光ビー厶は、 励起光入力ポ一 卜 2
1 4 から顕微鏡本体 2 1 2 内に取リ込まれる。
レーザ ―光源 2 3 1 と 2 4 1 は 、 第一実施形態と同様に、 励起する蛍光物質の種類に応じて 、 適した波長の光を発する ものが使用される これに限定されないが、 例えば、 蛍光物 質はローダ 5 ン • グリ ーン ( Rhodam i ne Green ： R h G ) と サイフ ァイヴ （ c y 5 ) であ リ、 これに対応して、 レ一ザ一 光源 2 3 1 は、 □一ダミ ン · ダリ ーン （ R h G ) を励起する ために、 波長 4 8 8 n mの光を発するアルゴンレーザ —であ リ 、 レーザー光源 2 4 1 は、 サイフ ァイヴ （ C y 5 ) を励起 するために、 波長 6 3 2 • 8 n mの光を発する H e — N e レ 一ザ一でめ 。
顕微鏡本体 2 1 2 は、 励起光入力ポー 卜 2 1 3 から導入さ れた励起光を反射して対物レンズ 2 1 7 に方向付けると共に 試料 2 1 9 から発生した蛍光を透過するダィク ロイ ック ミラ
- 2 2 1 と、 励起光入力ポ一 卜 2 1 4 から導入された励起光 を反射して対物レンズ 2 1 7 に方向付けると it、に、 試料 2 1
9 から発生した蛍光を透過するダイクロイ Vク ミ ラ一 2 2 2 と、 ダイク ロイ ツク ミラ ― 2 2 2 を透過した光を収束させる レンズ 2 3 2 と、 一方の蛍光を含 ¾_)波： "Π7域の光を透過し、 もう一方の蛍光を含む波長帯域の光 ¾：反射して出力ポ一 卜 2
1 5 に方向付けるダイク □ィ ック ミ ラー 2 2 4 と、 ダイク 口 イ ツクミ ラー 2 2 4 を透過した光を出力ポ一 卜 2 1 6 に方向 付けるミ ラー 2 2 5 とを有している o
測定装置 2 0 0 はさ らに 一 の受光ュ一 V 卜 2 5 1 と 2
5 2 を有している o 受光 二ッ 卜 2 5 1 と 2 5 2 は、 それぞ れ、 光フ アイバー 2 5 3 と 2 5 4 を介して 、 顕微鏡本体 2 1
2 の出力ポー 卜 2 1 5 と 2 1 6 と光学的に接続されている。 例えば、 出力ポー 卜 2 1 5 と 2 1 6 は写真 影用のカメ ラを 接続するためのポ一 卜であ リ、 光ファイバ ― 2 5 3 と 2 5 4 は光ファィバ—接 ¾子を介して出力ポー 卜 2 1 5 と 2 1 6 に取り付けられる o
受光ュニッ 卜 2 5 1 と 2 5 2 は 、 それぞれ 、 試料 2 1 9 か ら発生する蛍光をその種類毎に検出する。 受光ュニッ 卜 2 5
1 と 2 5 2 は、 第一実施形態の受光ュニッ 卜 Ί 4 0 と同 じ構 成であってもよいが、 その各々が検出する蛍光の種類が一種 類であることに対応して、 一系統のフィルターと光検出器を 有していればよい。
例えば、 受光ユニッ ト 2 5 1 と 2 5 2 は、 図 3 に示される 受光ュニッ 卜 1 4 0から、 ダイク ロイ ツクミ ラー 1 4 4 とフ ィルター 1 4 9 と レンズ 1 5 0 と ピンホールユニッ ト 1 5 1 と光検出器 〗 5 2 が省かれた構成であってよい。 勿論、 フ ィ ルター 1 4 5 は、 検出する蛍光の種類に適した特性のものが 適用される。 また、 光検出器 1 4 8 は、 第一実施形態と同様 に、 アバランシェ · フ才 卜ダイオー ドや光電子増倍管であつ てよい。
例えば、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 2 2 4 は、 サイ フ ァ イ ヴ ( C y 5 ) から発生する蛍光を含む波長帯域の光を透過し、 ローダミ ン ， グリ ーン （ R h G ) から発生する蛍光を含む波 長帯域の光を反射する。 これに対応して、 受光ユニッ ト 2 5 2 は、 サイフ ァイ ヴ （ C y 5 ) から発生する蛍光を検出し、 受光ユニッ ト 2 5 1 は、 ローダミ ン ' グリ ーン （ R h G ) か ら発生する蛍光を検出する。
測定装置 2 0 0 はさ らに、 受光ユニッ ト 2 5 1 と 2 5 2 内 の光検出器から出力される電気信号を波形整形してオン · 才 フのニ値化パルスに変換する信号処理装置 2 6 1 と、 信号処 理装置 2 6 1 から出力される二値化パルスに対して相関演算 を行なって自己相関関数を求める相関解析装置 2 6 2 と、 相 関解析装置 2 6 2で得られた自己相関関数から蛍光物質の並 進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などを求める ためのコ ンビユ ー夕— 2 6 3 とを有し、 さ bに、 信号処理装 置 2 6 1 で得られた結果に対してコ ン 卜ラス 卜向上や輪郭強 調などの画像処理を行なう画像処理装置 2 6 4 と、 画像処理 装置 2 6 4で得られた画像を表示する T Vモ二ター 2 6 5 を 有している。
本実施形態の測定装置 2 0 0 において、 レ一ザ一光源 2 3
1 から発せられた励起光ビームは、 レンズ 2 3 2で適当な径 の平行光ビームに変えられ、 ミラー 2 3 3 で反射され 、 X Y スキヤナ一 2 3 4 を経た後、 励起光入力ポ一卜 2 1 3 を介し て顕微 本体 2 1 2 内に入り 、 ダイク ロイ ソク ミラー 2 2 1 で反射され、 対物レンズ 2 1 7で収束され 、 試料 2 1 9 内で 光スポ 卜を形成する。 この光スポッ 卜は X 丫スキャナー
2 3 4 により X Y方向に走査され る。
試料からの反射光と蛍光の一部 （すなわち la 光ノ は、 対 物レンズ 2 1 7 に入り、 二つのダイク ロイ ソ 2 2 1 と 2 2 2 を透過し、 ダイク ロイ ック ミラー 2 2 4で反射され て出力ポ一 卜 2 1 5 に方向付け t>れる。 1S 光は、 出力ポー 卜 2 1 5 に取り付けられた光フアイバ一 2 5 3 を、 受光ュニ ッ 卜 2 5 1 に入る。
受光 ニッ ト 2 5 1 は、 信号光から不所望な成分を除去し 目的の蛍光を光検出器で受光す 光検出 5§は、 受光した光 の強度を反映した電気信号を出力する。
受光 ニッ 卜 2 5 1 内の光検出器から出力される電 5 l "^S" は、 画像処理装置 2 6 4 によ り コ ン 卜ラス 卜向上や輪郭強調 などの画像処理を行なった後、 れ、 T Vモ二ター 2 6 5 上に試料の二次元顕微鏡画像あるい は三次元顕微鏡画像と して生成される
また、 レ一ザ一光源 2 4 1 から発せられた励起光ビームは レンズ 2 4 2 で適当な径の平行光ビー厶に変えられ、 X Υス キヤナー 2 4 4 を経た後、 励起光入力ポ一 卜 2 1 4 を介して 顕微鏡本体 2 1 2 内に入り、 ダイク 口ィ ック ミ ラー 2 2 2で 反射され、 ダイク □ィ ックミラー 2 2 1 を透過し、 対物レン ズ 2 1 7 で収束され 、 試料 2 1 9 内で光スポッ 卜を形成する この光スポッ 卜は レ一ザ一光源 2 3 1 からの励起光の光ス ポッ 卜とは異なる位置に形成される。 また、 この光スポッ 卜 は、 X Υスキヤナ ― 2 4 4 によ り X Υ方向に走査され得る。
試料からの反射光と蛍光の一部 （すなわち信号光） 物レンズ 2 1 7 に入り、 二つのダイク ロイ ツク ミラー 2 2 1 と 2 2 2 と 2 2 4 を透過し 、 ミ ラ— 2 2 5 で反射されて出力 ポー 卜 2 1 6 に方向付けら ηΤ* 'ο o Ίί=ι 光は、 出力ポー 卜 2 1
6 に取 y付けられた光フ ァィバー 2 5 4 を通つて、 受光ュニ ッ 卜 2 5 2 に入る。
受光ュニッ 卜 2 5 2 は 信号光から不所望な成分を除去し 目的の蛍光を光検出器で受光^ る。 光検出器は、 受光した光 の強度を反映した電気信 を出力する ο
受光ュニッ 卜 2 5 2 内の光検出器から出力される電 1目 は、 画像処理装置 2 6 4 によ り コ ン 卜ラス 卜向上や輪郭強調 などの画像処理を行なつた後、 コ ンピュー夕 - 2 6 3 に導か れ、 τ Vモニター 2 6 5 上に試料の二次元顕微鏡画像あるい は三次元顕微鏡画像と して生成され •S ο 本実施形態の測定 2 0 0 においては、 蛍光の強度ゆら ぎの自己相関関数に限らず、 蛍光の強度ゆらぎの相互相関関 数についても測定を行なう ことがでさる。 蛍光の強度ゆらぎ の相互相関関数から、 異なる二種 の蛍光物質の分子に対し m
て、 以下の情報が得られる。
蛍光の強度ゆらぎの相互相関関数をそれぞれの光検出器で 受光された蛍光強度ゆらぎの時間平均値の積で割って、 カー プフィ ッテイ ングを行ない、 Y軸切片の値を求める。 すなわ ち、 （ 6 ) 式を用いて二種類の蛍光物質の分子の結合体の数 が求められる。 （Π i uo r esce nce Cor re I at i on Spectroscopy, R. Rigl er and t. S. E I son eds. 15, Spr inger, Ber l i n)
G(0) = Nbr
(6)
(Nr + Nbr)(Nb+Nbr)
ただし G ( 0 ) は二 類の蛍光物質 （ B と R ) の分子の結合 体による ¾光 5虽度ゆらぎの相互相関関数の Y軸切片の値、 N b r は共焦点領域内の二種類の蛍光物 ( B と R ) の分子の 結合体の数、 N r は蛍光物質 Rの分子の数 N b は蛍光物質 Bの分子の数である
第五実施形態
本実施形態は it隹点光学顕微鏡を利用 して蛍光の時間分 解測定を行なう測定装置に向けられている ο 本実施形態の測 定装置の構成は 、 第二実施形態の測定装置とほとんど同じで ある。 図 8 は、 本発明の第五実施形態の 光の時間分解測定を行 なう測定装置の構成を概略的に示している o 図 8 において、 図 5 に示された部材と同一の参照符巧で指示された部材は同 様の部材であ り、 その詳しい説明は 略する 0
図 8 に示されるよう に、 本実施形 の測定装置 1 0 0 Cは al一 5b 7^態の測定装置 1 0 0 Aの励起光源部 1 3 0 に代え てパルス励起光源部 1 3 0 Aを備えている o 他の構成は、 第 二実施形態と同じである。
パルス励起光源部 1 3 0 Aは、 パルスレ一ザ一光源 1 3 1
A と レンズ 1 3 3 とを備えている。 パルス レ一ザ一光源 1 3
1 Aは、 これに限らないが、 例えば 波長 5 1 4 . 5 n m 平均出力 1 0 0 m W、 ノヽ。ルス幅 2 0 0 ピコ秒の C Wモー ド同 期アルゴンイオン · レーザーで構成される o
図 8 には 、 代表的に一組のパルスレ一ザ ―光源 1 3 1 Aと レンズ 1 3 3 が描かれているが、 図 1 に示される励起光源部
1 3 0 と同様に、 パルス励起光源部 1 3 0 Aは 、 複数の組の パリレスレーザ一光源とレンズとを備えていてち cfcい o
本実施形態の測定装置 1 0 0 Cでは 、 光検出器 1 4 8 には 時間一電圧変換回路 （ Time- to-Amp I i tude Converter) 1 7 1 、 続いて波高分析器 （MLH t i- channe I analyzer) 1 7 2が 接続されており、 さ らに波高分析器 1 7 2 にはコ ンピュータ - 1 7 5 が接続されている。 また光検出器 1 5 2 には時間一 電圧変換回路 1 7 3 と.波高分析器 1 7 4が接続されており、 波高分析器 1 7 4 にはコ ンピューター 1 7 5が接続されてい 試料は、 細胞や、 蛍光物質を塩基にラベルされた D N Aや、 担体物質を含む媒質などである。
パルス レーザー光源 1 3 1 Aから発せられたパルス光は、 励起光入力ポー 卜 1 1 2 を通って共焦点光学顕微鏡 1 1 0 に 取り込まれ、 試料ステージ上の蛍光物質を含む試料に照射さ れる。 試料内の蛍光物質から発せられた信号光は、 共焦点光 学顕微鏡 1 1 0 に結合された光フ ァイバ一 1 5 3 を通って受 光ユニッ ト 1 4 O Aに達する。 受光ユニッ ト 1 4 O Aは、 信 号光から特定の蛍光を抽出して出力する。 受光ユニッ ト 1 4 O Aから出力された蛍光は、 光フ ァイバ一 1 5 6 と 1 5 7 を 介してそれぞれ接続された光検出器 1 4 8 と 1 5 2で検出さ れる。 光検出器 1 4 8 と 1 5 2 は蛍光の光子を検出して光電 子パルスを発生する 。 この検 MJパルス信号は時間一電圧変換 回路 1 7 1 と 1 7 3 に導かれて 時間一電圧変換回路 1 マ 1 と 1 7 3 のス 卜 ップ信号となる ο —方、 時間一電圧変換回路
1 7 1 と 1 7 3 へはパルスレ ―ザ一光源 1 3 1 Aの発光に同 期した が送られ •0 0 «—の信 を時間 圧変換回路 1 7
1 と 1 7 3 のスター 卜信号とする ο 時 1日] 圧変換回路 1 7
1 と 1 7 3 はスター 卜信号とス 卜ップ信号の二つの出力信号 の間の時間差に比例した電圧パルス 1目 を出力する。 この出 カパルス信 は波问分析器 1 7 2 と 1 7 4 に導かれて、 出力 パルスの高さ に変換されてコ ンピユ ー夕一 1 7 5 に送られ、 コ ンビ ―夕一内のメモ リ一 (図示しない） に記憶される。 メモ リ一に記憶された出力信巧パルスの问 cを時間との関係 にしてグラフ化することによ リ 、 試料内の蛍光分子の蛍光寿 命を求めることができる o
図 9 Aと図 9 Bは 、 図 8 に示した測定装置による測定結果 であり、 試料内の蛍光分子から発せられた蛍光強度の時間変 化を表わしている o 図 9 Aは蛍光寿命の長い試料の測定結果、 図 9 Bは蛍光寿命の短い試料の測定結果である ο
本実施形態では パルス励起光源部 1 3 0 Aから射出され たパルス光は 受光 =L一ッ 卜 1 4 0 Α内を通ることなく 、 対 物レンズの近 < に配置された励起光入力ポー 卜 1 1 2 を介し て. ：✓ tt
Figure imgf000031_0001
顕微鏡 1 1 0 に取り込まれる。 のため、 パル ス光が途中に経由する光学素子が少なく 、 パルス光の強度の 低下がわずかに抑えられる 0 これによ り 、 パルス光が試料に 効率良く 照射される o また、 受光ュニッ 卜 1 4 0 Α内を通る 光は、 実質的に試料から発せられた信号光だけとなる。 その 結果、 信号の S / N比の向い測定を行なう ことができる。
本実施形態の測定装置の構成は必要に応じて 当に変更さ れてもよい。 例えば パルス レーザー光源 1 3 1 Aを C Wモ 一ド同期色素レ一ザ ―光源に変更してパルス光の波長を変え て測定を行なつて よい o σ·^た、 第一実施形態と同 1 光 検出器 1 4 8 と 1 5 2 を受光ュニッ 卜内に配 してもよい。 つま り、 受光ュ一ソ 卜 1 4 0 Aと光フ ァイバ一 1 5 6 と 1 5
7 と光検出器 1 4 8 と 1 5 2 を、 第一実施形態に示した受光 ユニッ ト 1 4 0 に変更してもよい。
第六実施形態
本実施形態は 、 隹 占光学顕微鏡を利用して 蛍光偏光解 消など、 試料内の蛍光物質から発せられる蛍光の偏光特性の 変化や偏光度などの測定を行なう測定装置に向けられている。 本実施形態の測定装置の構成は、 第二実施形態の測定装置に 似ている。
図 1 0 、 本発明の第六実施形態の蛍光の偏光に関する測 定を行なう測定装置の構成を概略的に示している 。 図 1 0 に おいて、 図 5 に示された部材と同一の参照符 で指示された 部材は同様の部材であ リ 、 その詳しい説明は 略する。
図 1 0 に示されるよう に、 本実施形態の測定装置 1 0 0 D では、 共焦点光学顕微鏡 1 1 0 は、 励起光源部 1 3 0 からの 励起光の光路上に 、 特定の偏光成分を選択的に透過する偏光 素子 1 8 1 を備えている 。 また受光ュニッ 卜 1 4 0 Dは、 第 二実施形態の測定衣置 1 0 0 Aの受光ュニッ 卜 1 4 0 A に、 特定の偏光成分を 択的に透過する偏光素子 1 8 2 と 1 8 3 を追加した構成になつている。 他の構成は、 第一実施形態と 同じである
よ り詳しく は、 ✓、 隹 占光学顕微鏡 1 1 0 は 励起光入力ポ 一卜 1 1 2 とダイク 口ィ ック ミラー 1 1 6 との間の光路上に 偏光素子 1 8 1 を備えている。 受光ュニッ 卜 1 4 0 Dは、 受 光ュニッ 卜 1 4 0 Aの構成に加えて、 フィル夕一 Ί 4 5 と レ ンズ 1 4 6 の間に配置された偏光素子 1 8 2 と フイノレター
1 4 9 と レンズ 1 5 0の間に配置された偏光素子 1 8 3 とを 備えてい 偏光素子 1 8 2 と偏光素子 1 8 3 の透過軸は、 偏光素子 1 8 1 の透過軸に対して直交している つま り 、 偏 光素子 1 8 2 と偏光素子 1 8 3 を透過する光の偏光方向は、 偏光素子 1 8 1 を透過 ~i る光の偏光方向と直交している。 偏光素子 1 8 〗 と偏光素子 1 8 2 と偏光素子 1 8 3 は共に、 これに限らないが、 例えば偏光板で構成されるが、 よ り好ま し く は 、 グ ラ ン ト 厶 ソ ン · プ リ ズ ム （ Gl an Thompson Prism) など、 消光比の高い偏光素子で構成されるとよい。
励起光源部 1 3 0 は 、 逢続発振のレーザ一光源 1 3 1 を有 している o レーザ一光源 1 3 1 は、 これに限らないが、 例え ば波長 4 8 8 n m 出力 1 0 m Wのァルゴン . レーザ一で構 成される o
図 1 0 には、 代表的に一つのレーザー光源 1 3 1 が描かれ ているが 励起光源部 1 3 0 は、 複数の レ一ザ一光源を有し ていて よい。
レ一ザ一光源 1 3 1 から発せられた励起光は、 励起光入力 ポー 卜 1 1 2 を通 て ±h、隹 占光学顕微鏡 1 1 0 に取リ込まれ、 偏光素子 1 8 1 によ 特定の偏光成分が抽出され、 試料ステ ージ上の蛍光物質を含む試料に照射される 。 試料内の蛍光物 質から発せられた 1口 光は、 共焦点光学顕微鏡 1 1 0 ίρπ された光フ ァィバ ― 1 5 3 を通って受光ュニッ 卜 1 4 0 Αに 達する 。 受光ュ二 V 卜 1 4 0 Dは、 光抽出部 1 4 3 によ リ信 号光から特定の蛍光を抽出し さ らに偏光素子 1 8 2 と偏光 素子 1 8 3 によ り試料に照射される励起光の偏光成分と直交 する偏光成分を抽出して出力する。 受光ュ二 V 卜 1 4 0 Aか ら出力された特定の偏光成分の蛍光は、 光フ ァィバ ― 1 5 6 と 1 5 7 を介してそれぞれ接続された光検出器 1 4 8 と 1 5
2 で検出される。
本実施形態では、 蛍光分子を含む試料に直線偏光の励起光 を照射し、 試料から発せられる蛍光のう ち、 励起光に直交す る直線偏光を二つの光検出器 1 4 8 と 〗 5 2 によ り検出する。 これによ り試料内の蛍光分子の蛍光の異方性や偏光度などを 測定することができる。 例えば、 蛍光分子の回転ブラウ ン運 動の速度を反映する回転拡散係数などを求める ことができる。 本実施形態の測定装置 1 0 0 Dでは、 高い開口数の対物レン ズ （ N A 0 . 9 ) を用いており 、 このため、 蛍光色素分子で 標識された細胞内 D N A、 細胞膜などの組織の偏光性も調べ る こ とができる。 また L B ( Langmu i r-Blodgett) 膜の揺動 運動などについても測定することができる。
さ らに、 試料から発せられる散乱光の強度を検出すること によ り、 抗原抗体反応の測定を行なう こともできる。 例えば、 試料と して直径 0 . 2 ミク ロ ンのアルファ · フエ 卜 · プロテ イ ン （ A F P ) 抗体を感作させたラテックス粒子懸濁液 （重 量濃度 0 . 0 0 5 % ) を用い、 これに血液などの検体を注入 して抗原抗体反応を起こさせる。 このとき検体に A F P抗原 が含まれていると、 抗原抗体反応によリ ラテックス粒子が凝 集する。 ラテックス粒子が単分散している場合は、 その散乱 光は異方性を持たず、 入射光の偏光方向と同一の偏光成分を 持った光を散乱光と して発する。 ところが、 ラテックス粒子 の凝集によ り 、 散乱光が異方性を持つよう になる。 これによ リ未反応の分散状態と明瞭な区別を行なう ことができる。 従 つて、 高感度に抗原抗体反応を測定することができる。
本実施形態においても、 励起光源部 1 3 0 から射出された 励起光は、 受光ユニッ ト 1 4 0 D内を通るこ となく 、 対物レ ンズの近く に配置された励起光入力ポ一 卜 1 1 2 を介して共 隹 占光学顕微鏡 1 1 0 に取り込まれる のため 励起光が 途中に経由する光学素子が少なく 励起光の強度の低下がわ ずかに抑えられる ί I ょ y 励起光が試料に効率良く照 射される。 また 、 受光ュニッ 卜 1 4 0 D内を通る光は、 実質 的に試料から発せられた信号光だけとなる 。 その in ¾ 1 の S Ν比の高い測定を行なう ことができ -a
本実施形態の測定装置の構成は必要に Ιί、じて M当に変更さ れてもよい。 例えば i a光 子 1 8 1 と 1 8 2 と 1 8 3 のす ベてまたは一部の外形を円形と し 中 'し、車由の周 に回転可能 に配置してもよい。 偏光素子の回転の制御は手動で行なって ちよいし、 偏光素子の回転軸にステソ ピングモ一タ一を接続 して 、 ステツ ピングモータ一の回転に合わせて ■as動で行なつ てちよい。 このよう に Ha光？^子を回転可能にする とにより 、 試料に応じて入射光の偏光方向を白在に変化させ それに応 じて受光ュニッ 卜 1 4 0 D内の二枚の偏 C素子 1 8 2 と 1 8
3 の偏光方向を変化させて、 s式不 4によつて取適な条件で測定 を行なう ことができる
レ一ザ一光源 1 3 1 は、 直線偏光を発する レ ―ザ一光源で 構成されてもよく 、 その場合には it焦点光学 微鏡 1 1 0 内の偏光素子 1 8 1 は省略されてよい
第七実施形態
本実施形態は ±t 隹 占光学 i 顕微鏡を利用 して蛍光の偏光に 関する測定を行なう別の測定 に向けられて る 。 本実施 形態の測定装置の構成は、 第六宝施形態の測定装置とほとん ど同じである。
図 1 1 は、 本発明の第七実施形態の蛍光の偏光に関する測 定を行なう測定装置の構成を概略的に示している o 図 1 1 に おいて、 図 〗 0 に示された部材と同一の参照符 で指示され た部材は同様の部材でめる。
図 1 1 に示されるよう に、 本実施形態の測 ¾装置 1 0 0 E は、 第六実施形態の励起光源部 1 3 0 に代えて 第五実施形 態で述べたパルス励起光源部 1 3 0 Aを備えている o 他の構 成は、 第六実施形態と同じである。 つま 、 本実施形 の測 定装置 1 0 0 E は、 第六実施形態の測定装置 1 0 0 Dの励起 光源部 1 3 0 を、 第五実施形態の測定装置 1 0 0 Cのパルス 励起光源部 1 3 0 Aに変更した構成である 0
本実施形態では、 パルスレーザ一光源 1 3 1 Aから発せら れた超短パルス光は共焦点光学顕微鏡 1 1 0 に取 込み it 焦点光学顕微鏡 1 1 0 内の偏光素子 1 8 1 によ 直線偏光と し、 試料ステージ上の蛍光物質を含む試料に照射される o のとき試料内の蛍光物質は、 照射された /\°ルス光のラ ち 、 蛍 光物質の持つ遷移モーメ ン 卜の方向と一致した方向の偏光成 分だけを吸収して励起され、 蛍光物質から蛍光が発せ れる。 蛍光物質から発せられる蛍光は蛍光物質の持つ遷移モ ―メ ン 卜の方向と一致した方向の偏光成分を持 o のよラ に fcj光 した超短パルス光で蛍光物質を励起し、 蛍光物質から発せら れる蛍光の偏光成分について時間分解測定を行なえば V 蛍光 物質の分子配向の時間的な変化を求める とがでさる o
他の実施形態 例えば図 8 の測定装置を用いて、 蛍光共鳴ェネルギ一移動 ( F luorescence Resonance Energy Transf er ： FRET) を求め たんぱく質の結合や解離を知ることがでさる。 例えば細胞内 カルシゥ厶ィ才ン濃度の定量測定を行なう ことができる。 ま た、 生体高分子のさまさ まな部位間の距離や、 生体高分子の 三次元構造、 四次元構造、 その動的変化 測定することがで さ 。
また、 細胞内でカルモジュ リ ン （Ca 1 mod u 1 i n にカノレシゥ 厶イオン ( Ca 2 + ) が結合すると活性化されて、 カルモジュ リ ンは構造変化を起こす 。 力ルモジユ リ ンの異なる部位にそれ ぞれ異なる蛍光物質を用いて Ί Bt¾し、 ―方の蛍光物質を励起 して、 蛍光共鳴ェネルギー移動によつて得られる、 他方の蛍 光物質からの蛍光を測定することによ U 、 細胞内でのカルモ ジュ リ ンの構造変化を知るこ とができる o またタンパク質の 両 に異なる二種類の蛍光夕 ンパク質 例えば藍色蛍光夕ン パク質 （ C F P ： cyan f 1 uorescent p Γ0 te i n) と黄色蛍光夕 ンパク質 ( Y F P ： ye 1 1 ow f 1 uo rescen t P rote i n) を標識し、 タ ンパク質の リ ン酸化を測定することができる。 タンパク質 がリ ン酸化することによってタンパク質の構造に変化が起こ る。 この構造変化によ リ双方の蛍光夕ンパク質が極めて接近 する （ 1 0 ナノ メー 卜ル程度以下） と F R E Tが起こる。 こ の F R E τを測定することによ り タ ンパク質の リ ン酸化を明 らかにする とができる 0
また、 例えぱ図 8 の測定装置は、 蛍光の測定のほかに、 y ん光の測定に適用されてもよい。 その 口 、 光抽出部 1 4 3 は りん光の抽出に適用される
また、 例えば図 8 の測定装置は 化学発光や生物発光など の発光現象の測定に適用されてちよい。 その場合、 光抽出部
1 4 3 は、 化学発光や生物発光の光の抽出に適用される。 ま た 光源は必要ないので、 光源を取り 除く か、 光源の電源ス ィ ソチを切っておけばよい 。 例えば主要な癌マーカ一である ァルフ ァ ■ フエ 卜 ' プロティ ン ( A F P ) の酵素免疫測定を 図 8の測定装置 （ただし光源は取 y 除く ) を用いて化学発光 により測定を行なう場合について説明する。 まず、 直径 1
1 0 H m程度のガラス微粒子に抗 A F P抗体を感作し、 これ を酵素アルカ リ フ才スファ夕一ゼで 示 mし、 緩衝液中に懸濁 して試料容器内に収容する れに血液などの検体を加え、 室温で抗原抗体反応を起こさせる で反応に関与しない ガラス微粒子を洗浄によ り除去し 残りの溶液に化学発光基 質 A M P P D ( 2 一ジォキセ夕ン 2 ナ 卜 リ ウ厶塩） を加える のとき A M P P Dが酵素ァル力 リ フ才スファタ一ゼと反応 し 化学発光が生レる の化学発光の発光強度を光検出器 によ リ測定し、 コ ンピュー夕一に導いて光強度の解析を行な い 検体中の A F P濃度を定量することができる。
これまで、 図面を参照しながら本発明の実施形態を述べた が 本発明は、 これらの実施形態に限定されるものではなく その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施さ れてもよい。
例えば、 一種類の蛍光物質による測定であれば、 図 5 のマ ルチモー ド光フ ァィバー 1 5 3 を ―個の光検出器 1 4 8 また は 1 5 2 に対して直接接続させた単純な構成にしてもよい。 また、 本発明は、 上述した実施形態以外の測定に適用され てもよい。 例えぱ、 測定対象と しての試料の特定部位または 特定領域に限定して種々の光学特性 ( 允 散乱、 電 50.化学 発光、 共鳴エネルギ一転移 、 ブラズモン共鳴等） を測定する 任意の微小光学測定に適用されてもよい。 本発明は 上述 した実施形態に限定されるものではな 以下の各項に記す 測定信号処理ュニッ 卜と測定機器システムち含んでいる
1 . 測定信号を外部に出力する外部出力部を有する測定 機器に接続可能な接続部と
測定機器からの出力 1§号 (光、 音波 、 電 等） に応じた伝 播手段を有する信号伝播機構と、
信号伝播機構によ り伝播された信 を受信してその 1 号に 含まれる特定のパラメータを取得する素子とを有することを 特徴とする測定信号処理ュニッ 卜。
2 第 1 項において、 パラメ一夕を取得する素子が、 演 算可台 B な電 5¾ に変換するデ ―夕変換手段を有する測定信 号処理ュニッ 卜。
3 - 第 2項において、 演算後データを視 心可能な表現形 式 （数値、 グラフ 、 画像、 文字 sし よ リ可視化する テ一夕可視化手段を有する外部 m器に対して演算後データを 出力する外部出力部を有することを特徴とする測定信号処理 ュ二ッ 卜。
4 • 第 3項において、 演算後データの外部出力部は伝播 手段および接続部を含んでいる r とを特徴とする測定信号処 理ュニッ 卜。
5 . 第 1 項において 、 接続部はマルチモー な導波手段 を含んでいる測定処理ュニッ 卜。
6 . 第 1 項〜第 5 項のいずれかひとつにおいて 、 演算部 が光強度ゆらぎを解析するァルゴリズ厶を有するソフ 卜ゥェ ァによ り機能する構成である測定処理ュニッ 卜 ο
7 . 第 3 項に記載の測定処理ュニッ 卜と、
測定処理ュニッ 卜と接続した測定機器とを備え
測定機器が 、 演算後デ一夕を視認可能な表現形式によ り可 視化するデー夕可視化手段を有することを特徴とする測定信 号処理ュニッ 卜を有する測定機器システ厶。
8 . 第 1 項に記載の測定処理ュニッ 卜と、
測定処理ュニッ 卜と接続した測定機器とを備え
測定機器が測定に必要な信号源 （光、 曰 / J¾ 、
Figure imgf000040_0001
等 ) を伝 播する伝播手段を有するとともに伝播手段に対して機器の外 部から伝播信号を入力可能な外部入力部を有し
外部入力部に接続可能な接続部と接続部を通じて測定処理
1=3 ュニッ 卜による演算に必要な 1 播信号^導入する信 源導入 ュニッ 卜とを有する測定機器システム。
9 . 第 8項において 、 信号源導入ュニッ 卜の接 部はシ ングルモー ドな導波手段を含んでいる測 Λ£ ^ ¾§システ厶。
1 0 . 第 9 項において、 測定処理ュニッ 卜の接 部はマ ルチモー ドな導波手段を含んでいる測定機器システ厶 o
1 1 · 第 7 項〜第 1 0項のいずれかひとつにおいて、 測 定機器が顕微鏡、 内視鏡 、 分析機の何れかである ·— とを特徴 、
とする測定機器ンステ厶 O
1 2 . 第 7項 〜第 1 0項のいずれかひと において、 測 定機器が光信巧による測定手段を有する測定機器ンステ厶。
1 3 . 第 1 2 項において、 演算部が光強度ゆらぎを解析 するァルゴリズ厶を有するソフ 卜ウェアによ m能する構成 である測定機器システ厶 o
以上のよう に 本発明は 、 超音波顕微鏡や 卜ンネル顕微鏡 等の他の信号源による測定機器にも応用可能な測定処理ュニ ソ 卜であ り得る o ま 7こ本発明は 、 特異な信号源を別途接続可 能な測定機器システムであ リ得 O 0 また本 明は 顕微鏡以 外にも、 内視鏡や分析機とも接続可能なシステ厶であ り得る。

Claims

S m 求 の 範 囲
1 . 試料から発せられる光を受光するために共焦占光学 顕微鏡に接続される受光ュニッ 卜であ り 、
±h焦点光学顕微鏡から出力される信号光を取リ込むための 入力部と、
入力部を介して取 込まれた信号光から検出すべき特定の 光を抽出する光抽出部とを有している、 受光ュニッ 卜 o
2 . 請求項 1 において、 受光ュニッ 卜は、 蛍光の強度ゆ らぎの相関分光解析のために ±t 隹 ****点光学顕微鏡に接続され
±t 隹点光学顕微鏡から出力される信号光は蛍光を含んでお リ 光抽出部は、 入力部を介して取 込まれた信号光から検 ιΔす べき特定の蛍光を抽出 ^ 、 受光ュニッ 卜。
3 . 請求項 2 において、 虫光を検出するための光検出器 と、 光検出器の手前に配置されたピンホールとを有し 、 ピン ホールはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共隹 点の位置関係にある 受光ュ ソ 卜。
4 . 請求項 3 において、 隹点光学顕微鏡から出力され る信号光は複数種類の蛍光を含んでおリ 、 光抽出部は蛍光を 種類毎に分離して抽出し、 受光ュニッ 卜は、 使用する複数色 の蛍光色素に対応する吸収波長毎の検出器を有している、 受 光ュニッ 卜。
5 . 請求項 2 において、 蛍光を出力するための蛍光出力 部をさ らに有し、 蛍光出力部はピンホールを含み、 ピンホー ルはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して 焦点の 位置関係にあ り 、 蛍光出力部は蛍光を検出するための光検出 器と光学的に接続される、 受光ュ一ッ 卜。
6 . 請求項 5 において、 共焦占光学顕微鏡から出力され る信号光は複数種類の蛍光を含んでおり、 光抽出部は蛍光を 種類毎に分離して抽出し、 受光ュ一ッ 卜は 蛍光の種類に対 応した数の蛍光出力部を有している 、 受光ュ ―ソ 卜
7 . 請求項 5 または請求項 6 において 、 蛍光出力部と光 検出器とが光導体を介して光学的に接続される 、 受光ュニッ し
圍
8 . 請求項 3 請求項 5 のいずれかひとつにおいて、 共 焦点光学顕微鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポ一 卜を 有し、 共焦点光学 微鏡の出力ポ一 卜に受光ュ一 V 卜の入力 部が直接取り付けられる、 受光ュ一ッ 卜。
9 . 請求項 3 または請求項 5 において i ✓t、隹 占光学顕微 鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポー 卜を有し ±h隹 占 光学顕微鏡の出力ポ一 卜と受光ュ ―ッ 卜の入力部とが光導体 を介して光学的に接 される、 受光ュニッ 卜
1 0 . 請求項 4 または請求項 6 において it、隹 /占"、光学顕 微鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポ ― 卜を有し ±t隹 点光学顕微鏡の出力ポー 卜と受光ュニッ トの入力部とがマル チモー ド光導体を介して光学的に接続される 受光 3.ニッ 卜
1 1 . 請求項 1 において、 共焦点光学 at頁微 は 試料に 対向される対物レンズと、 試料から光を発生させるための光 を取り込むための光入力ポー 卜と 、 信号光を出力するための 出力ポー 卜とを有し 、 受光ュニッ 卜の入力部は 、隹 占光学顕 微鏡の出力ポー 卜と光学的に接続され、 入力部と光学的に接 4 続される出力ポー 卜は光入力ポ一 卜よ り ち対物レンズから遠 く に位置している、 受光ュこッ 卜 。
Ί 2 . 請求項 1 1 において 、 試料から光を発生させるた めの光は対物レンズによつて一点に収束され、 受光ュニッ 卜 は、 試料から光を発生させるための光の収束点に対して共焦 点の位置関係にある ピンホールを有している、 受光ュニッ 卜。
1 3 . 請求項 1 2 において 、 ピンホ一ルを通過した光を 検出するための光検出器をさ らに有している、 受光ュニッ 卜。
1 4 . 請求項 1 2 において 、 ピンホ ―ルを通過した光を 出力するための光出力部をさ ら に有しており、 光出力部は光 検出器と光学的に接続される、 受光ュ二 ソ 卜 。
求項 1 2 において 、 入力部と ピンホールの間に 配置された、 特定の偏光成分を選択的に透過する偏光素子を さ らに有している、 受光ュニッ 卜。
1 6 . 求項 1 1 において 、 試料から光を発生させるた めの光は対物レンズによつて一点に収束され、 共焦点光学顕 微鏡から出力される信 光は複数の波長の光を含んでおり 、 光抽出部は光を種類毎に分離して抽出し 受光ュニッ 卜は、 光抽出部で抽出される光の波長の種類に対応した数のピンホ ールを有し、 それらのピンホールは共に 、 試料から光を発生 させるための光の収束 /占"、に対して共焦点の位置関係にある、 受光ュニッ 卜 o
1 7 . 請求項 1 6 において 、 ピンホ ―ルをそれぞれ通過 した光を検出するための複数の光検出器をさ らに有している、 受光ュニッ 卜 o Ί 8 . 請求項 1 6 において、 ピンホールをそれぞれ通過 した光を出力するための複数の光出力部をさ らに有しており 、 光出力部はそれぞれ複数の光検出器と光学的に接続される 、 受光ュニッ ト。
1 9 . 請求項 1 6 において、 光抽出部と ピンホ ―ルの間 にそれぞれ配置された 、 特定の偏光成分を選択的に透過する 複数の偏光素子をさ らに有している、 受光ユニッ ト
2 0 . 請求項 1 1 請求項 1 9 のいずれかひと におい て、 試料から光を発生させるための光が光パルスである、 受 光ュニッ 卜。
2 1 - 請求項 1 1 請求項 1 9 のいずれかひとつにおい て、 信号光が試料から発せられた散乱光を含み、 受光 ZL二ソ 卜は 、 散乱光強度の測定と散乱光強度ゆらぎの相関解析と散 乱光強度の偏光成分の測定との少なく とも一つに適用される、 受光ュニッ 卜。
2 2 . 請求項 1 1 請求項 1 9 のいずれかひとつにおい て、 信号光が試料から発せられた蛍光を含み、 受光 二ッ 卜 は、 蛍光強度の測定と蛍光強度ゆらぎの相関解析と虫光強度 の偏光成分の測定との少なく とも一つに適用される 受光ュ 二ッ 卜。
2 3 . 請求項 1 1 請求項 1 9 のいずれかひとつにおい て、 化学発光と生物発光と りん光の測定のいずれか一つに M 用される、 受光ュニッ 卜
2 4 . 試料から発せられる光を測定するための測定装 であり、 試料から光を発生させるための光を発する光源部と 試料から光を発生させるための光を取り込むための光入力 ポ一 卜と信号光を出力するための出力ポ一 卜とを有する共焦 点光学顕微鏡と、
±hゝ隹ハ、 占、光学顕微鏡に接 される受光ュニッ 卜とを備えてお
、 受光ュニ ッ 卜は 、 it隹 "»、 占光学顕微 から出力され « IS 光を取り込むための入力部と 、 入力部を介して取り込まれた 信号光から検出すベさ特定の光を抽出する光抽出部とを有し ている、 測定装置 o
2 5 . 請求項 2 4 において、 受光ュニッ 卜は、 蛍光の強
'又ゆらぎの相関分光解析のために ±t隹 占"、光学顕微鏡に接続さ れ ±h隹点光学顕微鏡から出力される 号光は蛍光を含んで おリ、 光抽出部は 入力部を介して取リ ； ^ れた 15号光から 検出すべき特定の蛍光を抽出する、 測中 壮 要
/E 3sz m 0
2 6 . 請求項 2 において、 受光ュニッ 卜は 、 蛍光を検 出するための光検出器をさ らに有し、 光検出器はその受光面 の手前に配置された ピンホ —ルを有し 、 ピンホ ―ルはその蛍 光を発生させる励起光の収束点に対して； tt隹 占の位置関係に ある ピンホールを有している、 測定装 is o
2 7 . 請求項 2 6 において、 光源部は複数種類の励起光 を発し ±t隹 占 寄学顕微鏡は複数種類の蛍光を含む信号光を 出力 し 、 受光ュニッ 卜は蛍光の種類に対応した数の検出器を 有し、 光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し 検出器は それぞれ対応する種類の蛍光を検出する、 測定装 id 0
2 8 . 請求項 2 5 において、 受光ュニッ 卜は 蛍光を出 力するための蛍光出力部をさ らに有し、 蛍光出力部はピンホ ールを含み、 ピンホ ルはその蛍光を発生させる励起光の収 束点に対して 、 隹 占、の位置関係にあり 、 測定装置はさ らに、 蛍光出力部と光学的に接続された、 蛍光を検出するための光 検出器を備えている 測定装置。
2 9 . 請求項 2 8 において、 光源部は複数種類の励起光 を発し、 共焦点光学顕微鏡は複数種類の蛍光を含む信巧光を 出力 し、 受光ュニッ 卜は蛍光の種類に対応した数の蛍光出力 部を有し、 光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し 、 蛍光 出力部はそれぞれ対応する種類の蛍光を出力する 、 測定 。
3 0 . 請求項 2 6 gtf 求項 2 8のいずれかひとつにおい て、 受光ュ二ッ 卜の入力部が共焦点光学顕微鏡の出力ポ 卜 に直接取り付けられている、 測定装置。
3 1 . 請求項 2 6 または請求項 2 8 において 、 it、焦占光 学顕微鏡の出力ポー 卜と受光ュニッ 卜の入力部とが光導体を 介して光学的に接続される、 測定装置。
3 2 . as求項 2 7 または請求項 2 9 において 、 共焦占 学顕微鏡の出力ポー 卜と受光ュニッ 卜の入力部とがマルチモ ド光導体を介して光学的に接続される、 測定装 Λ o
3 . 求項 2 4 において、 共焦点光学顕微鏡は 、 試料 に対向される対物レンズを含み、 受光ュニッ 卜の入力部は共 焦点光学顕微鏡の出力ポ 卜と光学的に接続され 、 出力ポー 卜は光入力ポ 卜よ リ ち対物レンズから遠く に位置している、 測定装置。
3 4 . 請求項 3 3 において、 試料から光を発生させるた めの光は対物レンズによつて一点に収束され、 受光ュニッ 卜 は、 試料から光を発生させるための光の収束点に対して共隹 点の位置関係にある ピンホールを有している、 測中 壮
£ 衣直。
3 α · m求項 3 4 において、 受光ュニッ 卜は 、 ピンホ一 ルを通過した光を検出するための光検出器をさ らに有してい る、 測定装置 o
3 o · 求項 3 4 において、 受光ュニッ 卜は 、 ピン木一 ルを通過した光を出力するための光出力部をさ らに有してお y 、 光出力部は光検出器と光学的に接続される 測定装置 o
3 71 , ≡^求項 3 4 において、 受光ュニッ 卜は 、 入力部と ピンホールの間に配置された、 特定の偏光成分を選択的に透 τήす 光 子をさ らに有している、 測定装置 o
3 o · m求項 3 3 において、 試料から光を発生させるた めの光は対物レンズによつて一点に収束され、 ノ、隹 占光学顕 微鏡から出力される信巧光は複数の波長の光を含んでおリ 、 光抽出部は光を種類毎に分離して抽出し、 受光 ZLニッ トは 光抽出部で抽出される光の波長の種類に対応した数のピンホ ールを有し、 それらの ピンホールは共に、 試料から光を発生 させるための光の収束占に対して共焦点の位置関係にある 測定壮 宇
3 9 . 請求項 3 8 において、 受光ュニッ 卜は 、 ピンホ一 ルをそれぞれ通過した光を検出するための複数の光検出器を さ らに有している、 測定壮 as a. o
4 0 . 請求項 3 8 において、 受光ュニッ 卜は 、 ピンホ一 ルをそれぞれ通過した光を出力するための複数の光出力部を 4 さ に有してお り、 光出力部はそれぞれ複数の光検出器と光 学的に接続される、 測定壮 手
衣直。
4 1 - 請求項 3 8 において、 受光ュニッ 卜は、 光抽出部 と ピンホールの間にそれぞれ配置された、 特定の偏光成分を 択的に透過する複数の偏光素子をさ らに有している、 測定 衣置 o
4 2 . 請求項 3 3 請求項 4 1 のいずれかひとつにおい て 光源が光パルスの試料から光を発生させるための光を発 する 測 ¾. ¾ε o
4 3 . 請求項 3 3 請求項 4 1 のいずれかひとつにおい て 信号光が試料から発せられた散乱光を含み、 散乱光強度 の測定と散乱光強度ゆらぎの相関解析と散乱光強度の偏光成 分の測定との少なく とち一 つを行なう、 測定装置。
4 4 . 請求項 3 3 請求項 4 1 のいずれかひとつにおい て 、 信号光が試料から発せられた蛍光を含み、 受光ュニッ 卜 は 蛍光強度の測定と蛍光強度ゆらぎの相関解析と蛍光強度 の偏光成分の測定との少なく とも一 つを行なう、 測定装置。
4 5 . 請求項 3 3 請求項 4 1 のいずれかひとつにおい て 化学発光と生物発光と りん光の測定のいずれか — つを行 なう、 測定装置。
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