JP2007183425A

JP2007183425A - 観察装置

Info

Publication number: JP2007183425A
Application number: JP2006001670A
Authority: JP
Inventors: Susumu Kikuchi; 奨菊地; Yoshihiro Kono; 芳弘河野; Masahiro Oba; 雅宏大場
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-01-06
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2007-07-19
Also published as: EP1806575A1; EP1806575B1; DE602006014927D1; US20070247523A1; US7616292B2

Abstract

【課題】試料内部の発光部位の鮮明な３次元画像を取得する。
【解決手段】ステージ２に搭載された試料Ａ内部に焦点を配置する対物光学系４と、試料Ａ内部の焦点近傍から異なる光軸方向に発せられた光を、対物光学系４により集光して検出し、複数の画像情報を取得する画像取得装置６と、該画像取得装置６により取得された複数の画像情報に基づいて、焦点位置Ｐ近傍の発光部位の３次元画像を構成する３次元画像構成部８とを備える観察装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料の３次元画像を取得する観察装置に関するものである。

従来、実験小動物等の試料の内部に配置された発光点から発せられ、試料表面に現れる発光領域を表面画像として複数方向から撮像して、３次元表現された試料の表面に発光領域を重ね合わせて、３次元表示する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
しかしながら、特許文献１の技術では、試料内部の発光部位の画像を観察することができない。

試料内部の発光部位の画像を観察する装置として、共焦点蛍光顕微鏡装置が知られている。共焦点蛍光顕微鏡装置は、対物レンズの焦点位置に対し共役な位置に配置された共焦点ピンホールを通過した光のみを撮影するため、光軸方向に極めて高い分解能で試料内部の発光部位の画像を取得することができる。そして、焦点位置を光軸方向にずらして撮像した複数の画像に基づいて試料内部の発光部位の３次元画像を構成することも原理的には可能である。
米国特許出願公開第２００４／００２１７７１号公報

しかしながら、実際には、実験小動物等の試料が散乱物質によって構成されているため、試料の深部に配されている発光部位から発せられる光は、試料表面に到達するまでの間に散乱する。このため、共焦点蛍光顕微鏡装置により実験小動物等の試料の深部を試料外部から観察しようとする場合、発光部位からの光が散乱してしまい、共焦点ピンホールを通過する光が減少し、場合によっては、ほとんど画像を形成することができないという問題がある。

逆に、ピンホール径を大きく構成することにすれば、被写界震度が大きくなるため、試料内部の発光部位近傍からの光をピンホールに多く通過させることが可能となり、明るい画像を得ることができる。
しかしながら、被写界震度が大きくなる場合、焦点位置におけるピントのあった画像と、該焦点位置の光軸方向に両側にずれた配置される位置におけるピントのずれた画像とが重ね合わせられて、画像取得装置により取得されることとなり、鮮明な画像を得ることができない。したがって、光軸方向に焦点位置をずらして撮像された複数の不鮮明な画像を用いても鮮明な３次元画像を得ることができないという問題がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料内部の発光部位の鮮明な３次元画像を取得することができる観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、ステージに搭載された試料内部に焦点を配置する対物光学系と、試料内部の焦点近傍から異なる光軸方向に発せられた光を、前記対物光学系により集光して検出し、複数の画像情報を取得する画像取得装置と、該画像取得装置により取得された複数の画像情報に基づいて、焦点位置近傍の発光部位の３次元画像を構成する３次元画像構成部とを備える観察装置を提供する。

本発明によれば、試料内部の発光部位に対物光学系の焦点を配置し、画像取得装置を作動させることにより該焦点近傍から発せられた光が対物光学系により集光されて、焦点近傍を異なる複数の光軸方向から撮像した複数の画像情報が取得される。そして、取得された複数の画像情報に基づいて３次元画像構成部の作動により、焦点位置近傍の発光部位の３次元画像が構成される。

この場合において、共焦点観察よりも深い被写界震度を有する光学系により各光軸方向に取得される画像は、焦点位置の画像および焦点位置から光軸方向にずれた画像が重ね合わせられて取得されるため不鮮明な画像であるが、焦点位置近傍においては、光軸に直交する方向に高い分解能を有する画像情報を含んでいる。したがって、不鮮明な画像部分を除去することにより鮮明な３次元画像を取得することが可能となる。

本発明によれば、焦点位置近傍の発光部位を異なる光軸方向から撮像した複数の画像情報を用いることにより、焦点位置近傍の発光部位の鮮明な３次元画像を取得することができる。

上記発明においては、前記画像取得装置が、前記試料と前記対物光学系とを、前記焦点位置近傍の光軸に交差する軸線回りに相対的に回転させる回転装置を備えることとしてもよい。
このようにすることで、回転装置の作動により、試料と対物光学系とを相対的に回転させ、焦点位置近傍の発光部位を異なる複数の光軸に沿う方向から撮像して、複数の画像情報を取得し、鮮明な３次元画像を取得することができる。
この場合に、前記回転装置が、固定されたステージに対して対物光学系を回転させることとしてもよく、前記回転装置が、固定された対物光学系に対して、ステージを回転させることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記画像取得装置が、試料内部の焦点近傍から複数方向に発せられた光を、試料に対して一方向に配置された対物光学系に指向させる偏向部材を備えることとしてもよい。
このようにすることで、一方向に向けて配置された対物光学系を移動させることなく、あるいは、並進移動させるだけで、複数の方向から試料内部の焦点近傍を観察した画像を取得することができ、より簡易に３次元画像を取得することができる。

本発明によれば、試料内部の発光部位の鮮明な３次元画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る観察装置１について、図１〜図８を参照して説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、蛍光物質を注入したマウスのような実験小動物等の試料Ａを載置するステージ２と、該ステージ２に載置された試料Ａに励起光Ｅを照射する励起光源３と、該励起光源３から発せられた励起光Ｅによって、試料Ａ内部の蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ４と、該対物レンズ４により集光された蛍光Ｆを結像させる結像レンズ５と、該結像レンズ５より結像された蛍光Ｆを撮像する撮像素子６と、試料Ａを通過する水平軸線回りに対物レンズ４、結像レンズ５および撮像素子６を揺動させる回転装置７と、これら回転装置７、ステージ２、励起光源３および撮像素子６を制御する制御装置８とを備えている。図中、符号９は干渉フィルタであり、図示しないターレットにより切替可能となっている。

前記ステージ２は、例えば、載置した試料Ａを上下方向および水平方向に移動させることができるようになっている。
前記対物レンズ４の焦点位置は、前記ステージ２の上方に配置されていて、ステージ２に試料Ａが載置されると、該試料Ａの内部に焦点位置が配置されるようになっている。
前記撮像素子６は、例えば、ディジタルカメラ１０に備えられたＣＣＤであって、その撮像面６ａが、前記結像レンズ５の後側焦点位置に配置されている。これにより、対物レンズ４の焦点位置Ｐ近傍から発せられた蛍光Ｆが、結像レンズ５により撮像素子６の撮像面６ａに結像され、撮像素子６により画像情報として取得されるようになっている。

この場合において、蛍光物質から発せられる蛍光Ｆは、全方向に発せられるが、対物レンズ４の光軸に沿う方向に発せられた光の一部が対物レンズ４により集光されるようになっている。この場合、図２に示されるように、試料Ａ内部の発光部位に配置された焦点位置Ｐから発せられた蛍光Ｆは、対物レンズ４の開口数に従う広がりの範囲内の蛍光Ｆが対物レンズにより集光される。

このため、撮像素子６により撮像する場合には、焦点位置Ｐ近傍のピントの合った範囲Ｒ_１からの蛍光Ｆのみならず、光軸方向にずれた位置に配されるピントのずれた範囲Ｒ_２からの蛍光Ｆも同時に取得されるようになっている。この焦点位置Ｐ近傍のピントの合った範囲Ｒ_１からの蛍光Ｆのみを光軸方向に焦点位置Ｐをずらしながら撮像することにより得られた複数の画像に基づけば、鮮明な３次元画像を構築することができるが、実際にはピントのずれた範囲Ｒ_２からの蛍光Ｆも含んだ画像しか取得されないので、そのまま光軸方向にずらしながら撮像するだけでは、鮮明な３次元画像を構築することはできない。

前記回転装置７は、公知のモータおよび減速機（図示略）を備え、制御装置８からの指令信号に応じて、例えば、対物レンズ４の焦点位置Ｐを通過する水平軸線回りに、対物レンズ４、結像レンズ５および撮像素子６を固定したアーム１１を揺動させるようになっている。

前記制御装置８は、ステージ２を作動させて試料Ａの観察部位に対物レンズ４の焦点位置Ｐが一致するように位置決めするとともに、ステージ２を作動させて、対物レンズ４の光軸方向に試料Ａを移動させつつ撮像素子６を制御して各位置における画像を取得させるようになっている。
また、制御装置８は、回転装置７を制御して試料Ａに対する対物レンズ４、結像レンズ５および撮像素子６の角度を変更するようになっている。そして、異なる角度において上記工程を繰り返すことにより、同一の観察部位を異なる複数方向からみた画像を撮像素子６に取得させるようになっている。さらに、制御装置８は、得られた複数の画像情報に基づいて、３次元画像を構築するようになっている。

３次元画像構築方法は、例えば、ラドン変換法あるいは３次元フーリエ変換法による。
ラドン変換法および３次元フーリエ変換法については、例えば、Susumu Kikuchi, et al.,
"Three-dimensional image reconstruction for biological micro-specimens
using a double-axis fluorescence microscope", Optics
Communications, vol. 138, issues 1-3, 15 May 1997, pp. 21-26、あるいは、Susumu Kikuchi, et al.,
"Three-dimensional microscopic computed tomography based on generalized
Radon transform for optical imaging systems", Optics
Communications, vol. 123, issues 4-6, 1 February 1996, pp. 725-733に開示されている。

このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について、以下に説明する。
ここでは、例えば、図３に示されるように、試料Ａに対して鉛直方向Ｄ_１および水平方向Ｄ_２の２方向から取得した画像情報に基づいて試料Ａ内部の観察部位の３次元画像を構築する方法について説明する。図４〜図６に、３次元画像構築方法のフローチャートを示す。

３次元画像を取得するには、図４に示されるように、複数の画像情報を取得し（ステップＳ１）、取得された複数の画像情報に基づいて３次元画像を構築し（ステップＳ２）、構築された３次元画像を表示する（ステップＳ３）。

画像取得工程（ステップＳ１）は、図５に示されるように、まず、ステージ２に搭載された試料Ａに対して、回転装置７の作動により、その光軸が第１の方向（鉛直方向Ｄ_１）に配されるように、対物レンズ４、結像レンズ５および撮像素子６を揺動させて位置決めする（ステップＳ１１）。次いで、ステージ２の作動により、試料Ａを光軸方向に移動させ、試料Ａ内部の観察部位に対物レンズ４の焦点位置Ｐが配置されるように設定する（ステップＳ１２）。

この状態で、撮像素子６を作動させ、観察部位の画像を取得する（ステップＳ１３）。そして、ステージ２を光軸方向に所定距離だけ作動させ（ステップＳ１４）、撮像素子６により画像を取得する工程（ステップＳ１３）を所定回数だけ繰り返す（ステップＳ１５）。これにより、試料Ａ内部において第１の方向に所定間隔をあけた複数の焦点位置Ｐ近傍のスライス画像が取得される。

次いで、全ての方向からのスライス画像の取得が終了したか否かが判断され（ステップＳ１６）、終了していない場合には、第２の方向（水平方向Ｄ_２）に沿うスライス画像の取得が行われる（ステップＳ１１〜Ｓ１５）。全ての方向からのスライス画像の取得が終了した場合には、３次元画像構築工程（ステップＳ２）に進行する。

３次元画像構築工程（ステップＳ２）は、図６に示されるように、画像取得工程（ステップＳ１）において取得された複数のスライス画像の画像情報から、３次元空間上の同一の観察部位に対して異なる方向から取得された画像情報を抽出する（ステップＳ２１）。
そして、抽出された画像情報に基づいて、３次元フーリエ変換法等により、３次元画像を構築する（ステップＳ２２）。

具体的には、図３に示されるように、観察部位が３次元空間内において複数のブロックに区分され、各ブロックＡ，Ｂ，…について、第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ_２に沿って取得された画像情報が、順次抽出され、３次元画像が構成されていく。
そして、全てのブロックＡ，Ｂ，…について３次元画像の構築が終了したか否かが判断され（ステップＳ２３）、終了した場合には、３次元画像表示ステップＳ３に進行し、終了しない場合には、上記ステップＳ２１〜Ｓ２２が繰り返される。

上述したように、撮像素子６の各画素により取得される画像情報は、図２（ａ）に示されるように、対物レンズ４の焦点位置Ｐ近傍の薄い範囲Ｒ_１に限られず、その範囲の光軸方向の前後の比較的厚い範囲Ｒ_２からの画像情報となる。したがって、焦点位置Ｐ近傍以外に蛍光物質が存在する場合には、図２（ｂ）に示されるように、対物レンズ４の焦点位置Ｐ近傍のピントの合った画像情報Ｇ_１と、それ以外のピントのずれた画像情報Ｇ_２とが重なり合って取得される。

そこで、図７に示されるように、回転装置７を作動させて、試料Ａに対してアーム１１を揺動させる。これにより、同一の観察部位に対し、異なる光軸方向から複数の画像情報を取得することができる。例えば、アーム１１を鉛直方向から±３０°揺動させることにより、図８に示されるように、異なる３方向から同一観察部位の画像情報を取得することができる。各画像情報には、図２（ｂ）と同様に、焦点位置Ｐ近傍以外の画像情報も含まれているが、図８に斜線で示されるように、これらの画像情報には、相互に交差する比較的狭い領域の画像情報が含まれている。

本実施形態によれば、図３〜図６のフローチャートに示される３次元画像構築方法により、複数方向から取得した画像情報の相互に交差するこの狭い領域の画像情報を、試料Ａ内部の観察部位の３次元空間上の各点において抽出するので、鮮明な３次元画像を取得することができる。

なお、本実施形態に係る観察装置１においては、対物レンズ４、結像レンズ５および撮像素子６を固定したアーム１１を試料Ａを通過する水平軸線回りに揺動させることにより試料Ａに対して観察光軸を複数方向に配置することとしたが、これに代えて、例えば、図９に示されるように、試料Ａの側方にミラー１２を配置し、試料Ａ内部の観察部位から水平方向に発せられる蛍光Ｆを撮像素子６の方向に偏向させることとしてもよい。このようにすることで、試料Ａを３方向から観察した蛍光画像を同時に同一の撮像素子６により取得することができ、得られた画像情報を処理することにより、焦点位置Ｐ近傍のピントの合った画像情報を抽出することができる。

また、図１０に示されるように、ステージ２の作動により、試料Ａを移動させ、対物レンズ４の光軸が鉛直方向に配される同図（ａ）の状態と、ミラー１２により偏向されて斜め下方に向けられる同図（ｂ），（ｃ）の状態とに変化させることとしてもよい。なお、ミラー１２による光軸の偏向方向は斜め下方に限られず、他の任意の方向に設定してもよい。また、ミラー１２を複数枚使用することにより、試料Ａ内部の発光部位から鉛直下方に発せられる光を偏向して対物レンズ４により集光させるようにしてもよい。
また、図１１に示されるように、いわゆるゴニオステージのように、ステージ２′を傾斜させることにより、光軸に対して試料Ａを傾斜させることにしてもよい。

さらに、本実施形態においては、対物レンズ４により集光した蛍光ＦをＣＣＤからなる撮像素子６により撮像する場合を例に挙げて説明したが、これに代えて、図１２に示されるように、走査型の観察装置１′に適用することとしてもよい。

すなわち、図１２の観察装置１′は、レーザ光源２０から発せられ、カップリングレンズ２１，２２により光ファイバ２３の端面２３ａに集光されたレーザ光Ｌを、光ファイバ２３により顕微鏡本体２４に導く。顕微鏡本体２４に導かれたレーザ光Ｌは、コリメートレンズ２５により略平行光とされた後に、例えば、近接ガルバノミラーのようなスキャナ２６により２次元的に走査され、瞳投影レンズ２７、結像レンズ２８および対物レンズ２９によりリレーされて試料Ａに照射される。

レーザ光Ｌが試料Ａに照射されることにより、試料Ａ内部の蛍光物質が励起され、蛍光Ｆが発せられる。発せられた蛍光Ｆは、対物レンズ２９により集められ、結像レンズ２８、瞳投影レンズ２７およびスキャナ２６を介して戻る途中で、ダイクロイックミラー３０によりレーザ光Ｌから分岐されて、カップリングレンズ３１により光ファイバ３２の端面３２ａに集光される。光ファイバ３２の端面３２ａは、実質的にピンホールとして機能する。光ファイバ３２により伝播された蛍光Ｆは、コリメートレンズ３３、バリアフィルタ３４および集光レンズ３５を介して光電子増倍管のような光検出器３６により検出される。

この場合においても、光ファイバ３２の端面３２ａが実質的にピンホールとして機能するので、光検出器３６に到達する蛍光Ｆは、対物レンズ２９の焦点位置Ｐ近傍から発せられる蛍光に制限されるが、光ファイバ３２のコア径を大きくすることにより被写界深度が増加して上記と同様の問題が生ずる。図１２に示されるように、ゴニオステージ２′等により、試料Ａと対物レンズ２９の光軸との相対角度を変化させて、試料Ａの同一部位を異なる光軸方向から観察して画像情報を取得する。これにより、上記各実施形態と同様に鮮明な３次元画像を取得することができるという利点がある。なお、同一部位を異なる光軸方向から観察する方法としてはゴニオステージ２′以外にも他の任意の方法を用いることができる。

また、上述したように、本実施形態においては、試料Ａの外部から励起光Ｅを照射して試料Ａ内部の蛍光物質が発生する蛍光Ｆを検出する場合について説明したが、これに代えて、自家発光物質から発せられる光を検出する場合に適用することとしてもよい。

本発明の一実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。図１の観察装置により観察される試料内部の蛍光を説明する模式図である。図１の観察装置による３次元画像構築方法を説明するためのモデルを示す図である。図３の３次元画像構築方法を説明するフローチャートである。図４のフローチャートの画像取得工程を説明するフローチャートである。図４のフローチャートの３次元画像構築工程を説明するフローチャートである。図１の観察装置により異なる光軸方向から同一の試料を観察する場合を説明する図である。図７の観察により抽出される画像情報を説明する模式図である。図１の観察装置の第１の変形例を示す図である。図１の観察装置の第２の変形例を示す図である。図１の観察装置の第３の変形例を示す図である。図１の観察装置の第４の変形例を示す図である。

符号の説明

Ａ試料
Ｐ焦点位置
１観察装置
２，２′ ステージ
４対物レンズ（対物光学系）
６撮像素子（画像取得装置）
７回転装置
８制御装置（画像取得装置、３次元画像構成部）
１２ミラー（偏向部材）

Claims

ステージに搭載された試料内部に焦点を配置する対物光学系と、
試料内部の焦点近傍から異なる光軸方向に発せられた光を、前記対物光学系により集光して検出し、複数の画像情報を取得する画像取得装置と、
該画像取得装置により取得された複数の画像情報に基づいて、焦点位置近傍の発光部位の３次元画像を構成する３次元画像構成部とを備える観察装置。
前記画像取得装置が、前記試料と前記対物光学系とを、前記焦点位置近傍の光軸に交差する軸線回りに相対的に回転させる回転装置を備える請求項１に記載の観察装置。
前記回転装置が、固定されたステージに対して対物光学系を回転させる請求項２に記載の観察装置。
前記回転装置が、固定された対物光学系に対して、ステージを回転させる請求項２に記載の観察装置。
前記画像取得装置が、試料内部の焦点近傍から複数方向に発せられた光を、試料に対して一方向に配置された対物光学系に指向させる偏向部材を備える請求項１に記載の観察装置。