JP2003344775A - 共焦点顕微鏡及び微小開口回転盤 - Google Patents
共焦点顕微鏡及び微小開口回転盤Info
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Abstract
顕微鏡を提供する。 【解決手段】 複数のピンホール2…が螺旋状に並んで
形成されているニポウ盤1は、上面1aが平らで底面1
bが回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面を成して
いる。このニポウ盤1を回転しつつ上面1a側よりレー
ザ光10を照射して底面1bにピンホール2に応じた点
光源群14を作り、該点光源群14の光を対物レンズ6
にて試料7内に照射して集光点群11を立体的に形成す
る。そして、各集光点で励起された蛍光物質からの蛍光
12を対物レンズ6でニポウ盤1の元のピンホール2を
通して、結像レンズ8によって平面像を結ばせ、これを
3次元画像に構築する。
Description
有する円盤型の微小開口回転盤を回転させて試料を光走
査する共焦点顕微鏡、及びそれに備えられる微小開口回
転盤に関するものである。
顕微鏡は、300年以上の歴史を持つ。光学顕微鏡は、
位相差法、偏光法、蛍光法、微分干渉法、暗視野法など
種々の観察方法を取り入れて改良が進み、生物試料を生
きているままに観察できるという特長を生かして医学、
生物学において計り知れない貢献をしてきた。そして今
や、生物試料を蛍光修飾することによって、細胞内のタ
ンパク質や低分子まで観察できるようになっている。
は、蛍光顕微鏡と称され、中でも特に、微小開口を用い
る共焦点顕微鏡が注目されている。通常の蛍光顕微鏡で
は、焦点面の上下の励起光が十分に集光していない領域
での励起や蛍光の散乱が蛍光像のボケを引き起こすが、
共焦点顕微鏡は微小開口(例えばピンホール)を用いる
ことにより、この蛍光像のボケを除去することができ
る。
るのにガルバノ鏡を用いる型、音響光学素子を用いる
型、ニポウ盤(微小開口回転盤)を用いる型がある。中
でも、高速走査にはニポウ盤を用いる型が適しており、
現状1秒間に720枚の像を得ることができる。
(中心の周りに等角度で分布し、中心からの距離が等間
隔で減少するように)並んだ多数のピンホール(微小開
口)を持つ円盤である。ニポウ盤は、2次元画像を1次
元の電気信号に変換して画像電送を可能にするために1
884年に考案された。ニポウ盤を用いた画像伝送は以
下の通りである。
盤の前面に形成し、ニポウ盤の後方に光電変換素子を配
置し、かつ光電変換素子がニポウ盤上に離散するピンホ
ールの1個を通過した光だけを受けるようにする。ニポ
ウ盤が回転することによって像の異なる部分の光強度が
電気信号に変換され、ニポウ盤の1回転で像の全体が走
査される。この電気信号で明るさを変化させた電球を別
のニポウ盤を通して見ると、元の像が再現される。
改良されたレーザ光走査用ニポウ盤30の模式図を示
す。画像伝送用ニポウ盤が1本の螺旋上にピンホールを
配したのに対して、レーザ光走査用では、像の観察は接
眼レンズを通して直接に、或いは撮像器を用いて行われ
るため、螺旋は1本である必要はなく、複数本の螺旋上
にピンホール31…を配している。図3には、アルキメ
デスの螺旋1本だけを太線Lで例示した。
型の従来の共焦点顕微鏡の一構成例を示す。図中、40
はニポウ盤30のピンホール31…と相対するマイクロ
レンズ41…を配したマイクロレンズアレイ盤であり、
ニポウ盤30における開口面積比を上げてレーザ光の利
用率を上げる働きがある。マイクロレンズアレイ盤40
における各マイクロレンズ41の焦点位置にニポウ盤3
0の各ピンホール31が配されている。これらマイクロ
レンズアレイ盤40とニポウ盤30とは、共通軸50の
まわりに一体的に高速回転される。
(平行光)51は、マイクロレンズアレイ盤40の上方
より照射され、各マイクロレンズ41で集光され、一体
的に回転しているニポウ盤30の各ピンホール31を通
過すると、ニポウ盤30の底面で平面上に並んだ点光源
群60となる。但し、図4では、図の煩雑さを避けるた
めに一個のピンホール31を通り抜けた1点光源の光路
に関してのみ図示する。
物レンズ52によって集光され、試料53中でレーザ光
51の光軸と直交する平面状に並ぶ集光点群54を形成
し、各集光点で蛍光色素が励起される。
ズ52で集められ、ニポウ盤30の下面に集光され、各
々元のピンホール31を通り抜ける。そして、ピンホー
ル31を通り抜けたこれら蛍光55は、ダイクロイック
ミラー56で結像レンズ57へと反射され、結像レンズ
57によって平面状に結像され、撮像器58によって撮
像される。
低強度の蛍光や、試料53内で散乱された蛍光59(点
線にて示す)は、対物レンズ52による集光位置がピン
ホール31とずれるため、ピンホール31を通り抜ける
ことができず、像に混入することはない。そのために、
共焦点顕微鏡は、通常の蛍光顕微鏡と違って、平面方
向、及び光軸方向の分解能が高い、鮮明な像を得ること
ができる。
例えば図3のニポウ盤30の模式図に斜線で示した30
度の開き角の部分が顕微鏡の視野に相当するとすると、
撮像器58は、ニポウ盤30の30度の回転で、斜線部
分に形成されたピンホール31の個数に相当する数の走
査線(図ではピンホール2が50個形成されているので
50本の走査線)からなる画像を1つ構成できる。そし
て、ニポウ盤30の1回転で、合計12枚の画像が得ら
れる。
線で示した顕微鏡の視野に相当する部分には、1000
個程度のピンホールが形成されており、一画面は100
0本程度の走査線で構成される。したがって、このよう
なニポウ盤の回転速度を60回転毎秒とし、上記撮像器
58に高速カメラを用いると、毎秒720枚の画像を得
ることができる。
については、例えば、特許第3082183号の特許公
報に記載されている。
ポウ盤を用いる型に限らず、従来の共焦点顕微鏡では、
試料53内の極薄い平面部分を観察するため、試料53
内の異なる深さを観察する際には、試料53或いは対物
レンズ52を光軸方向に上下動させることによって焦点
面を移動させる。そして、この様な深さを換えての平面
部分の撮像を繰り返し行うことで、深さの異なるいくつ
かの面の像を取得し、後に画像処理することによって立
体像を構築することが可能となる。
対物レンズ52の上下動にて焦点面を移動させる従来の
構成では、焦点面の移動に時間を要するため、動きのあ
る試料の立体像を観察できないという問題がある。
って、動きのある試料の立体像の観察が可能な共焦点顕
微鏡を提供することにある。
決するために、複数の微小開口が螺旋状に並んで形成さ
れた円盤型の微小開口回転盤を用い、該微小開口回転盤
を回転しつつその一方の面よりレーザ光を照射して微小
開口を通すことで他方の面に点光源群を形成し、該点光
源群の光を対物レンズで試料内に集光して集光点群を形
成し、該集光点群からの各戻り光を元の微小開口を通し
て微小開口回転盤より出射して結像レンズにて結像させ
る共焦点顕微鏡であって、上記微小開口回転盤の対物レ
ンズ側の面が回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面
を成し、レーザ光が入射される側の面が平らに形成され
ていることを特徴としている。
並んで形成された微小開口回転盤は、対物レンズ側とな
る面が回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面を成
し、結像レンズ側となる面は平らに形成されている。
の面に形成されるため、微小開口回転盤の対物レンズ側
の面がこのような螺旋状斜面に形成されることで、点光
源毎に点光源から対物レンズまでの距離が変化すること
となる。対物レンズによる試料内の集光深さを決定する
対物レンズと集光点との距離は、後述するレンズの公式
に示されるように、対物レンズの焦点距離が同じ場合、
点光源から対物レンズまでの距離が変化するとこちらも
変化する関係にある。そのため、微小開口回転盤の対物
レンズ側の面を上記のように構成することで、点光源毎
に集光深さが異なることとなり、集光点群は試料内で水
平面(深さが等しい)上には並ばず、立体的に並ぶよう
になる。
回転させることで、試料内の異なる深さを走査させるこ
とが可能となる。微小開口回転盤の1回転で走査位置の
深さは元に戻る。
は平らに形成されているので、各微小開口を通って微小
開口回転盤のこの平坦面より出射された光は結像レンズ
にて平面像として形成される。したがって、この平面像
を撮像して、3次元像を再生することで、試料或いは対
物レンズを光軸方向に上下動させることなく、立体像を
得ることができる。
部分が顕微鏡の視野に相当するとすると、微小開口回転
盤の1回転で深さの異なる12枚の画像を得ることがで
き、これら12枚の画像で1つの立体像が形成される。
そして、このような微小開口回転盤の回転速度を例えば
60回転毎秒とすると、このような立体像を毎秒60個
形成できる。
を可能とし、立体形状に加えて試料の時間的な変化や移
動の情報を含む四次元顕微鏡観察が可能な共焦点顕微鏡
を提供できる。
開口に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれている構
成とすることが好ましい。ここで中空管としては例えば
ガラスキャピラリー等を挙げることができ、棒状の透明
体としては、光ファイバー等を挙げることができる。
口回転盤は、従来の微小開口回転盤よりも肉厚であるた
め、微小開口のアスペクト比(深さと直径の比)も高
く、高アスペクト比の微小開口は低アスペクト比のもの
に比べ形成が困難である。また、微小開口の内面が平滑
でない場合、光の伝播ロスが起こるが、このような伝播
ロスはアスペクト比が大きくなるほど顕著になるため、
微小開口の内面平滑化工程が必要となる。
微小開口に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれてい
る構成とすることで、微小開口の内面平滑化処理が必要
なくなり、かつ、高アスペクト比であっても困難なく製
造することができる。
を可能とし、立体形状に加えて試料の時間的な変化や移
動の情報を含む四次元顕微鏡観察が可能な共焦点顕微鏡
をより低コストにて提供できる。
題を解決するために、共焦点顕微鏡に備えられる複数の
微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口
回転盤であって、一方の面が回転軸を中心とした1回転
分の螺旋状斜面を成し、他方の面が平らに形成されてい
ることを特徴としている。
本発明の該微小開口回転盤を用いて光走査することで、
試料や対物レンズを上下動させることなく、立体像を得
ることができる。
も、微小開口回転盤を本発明の微小開口回転盤に交換す
ることで、動きのある試料の立体像の観察を可能とし、
立体形状に加えて試料の時間的な変化や移動の情報を含
む四次元顕微鏡観察が可能なものに性能を高めることが
できる。
の表現を用いれば、複数の微小開口が螺旋状に並んで形
成されると共に、上面が平らで底面が回転軸を中心とし
た1回転分の螺旋状斜面を成す円盤状の微小開口回転盤
を備えており、該微小開口回転盤を回転しつつ上面側よ
りレーザ光を照射して底面に微小開口に応じた複数の点
光源を作り、該点光源の光を対物レンズにて試料内に照
射して複数の集光点を立体的に形成し、各集光点で励起
された蛍光物質からの蛍光を該対物レンズで上記微小開
口回転盤の微小開口の下端に結像させ、上記微小開口回
転盤の上面より出射する光を結像レンズによって平面上
に結像させることを特徴しているとも表現できる。
て、図1〜図3を用いて説明すれば、以下の通りであ
る。
る共焦点顕微鏡の構成を示す。同図(a)は、共焦点顕
微鏡の正面図であり、同図(b)は、同図(a)の矢印
Aより見た矢視図である。
すように、ニポウ盤(微小開口回転盤)1と、マイクロ
レンズアレイ盤3と、ダイクロイックミラー9と、対物
レンズ6と、結像レンズ8とを主として備えている。そ
して、これら図1(a)(b)よりわかるように、本共
焦点顕微鏡は、ニポウ盤1の形状に特徴がある。
来のニポウ盤30と同様、図3の模式図に示すように、
複数本のアルキメデスの螺旋上に沿って複数のピンホー
ル(微小開口)2…が形成されている。図3では、アル
キメデスの螺旋1本だけを太線Lで例示している。
その立体形状を示すように、マイクロレンズアレイ盤3
と対向し、レーザ光10の入射側となる上面1aが平ら
で、対物レンズ6側となる底面1bが回転軸を中心とし
た1回転分の螺旋状斜面を成している。底面1bは、回
転軸5を中心に螺旋を描くように円周方向に漸次的に上
面1aから離間する方向へと滑らかに変化している。
ウ盤1と回転軸5にて一体的に回転駆動されるもので、
ニポウ盤1に形成された複数のピンホール2…に焦点を
合わせた複数のマイクロレンズ4…が形成されている。
用レーザにて、マイクロレンズアレイ盤3の上面側より
照射されたレーザ光(平行光)10は、マイクロレンズ
アレイ盤3の各マイクロレンズ4にて効率良くニポウ盤
1の各ピンホール2へと導かれる。なお、マイクロレン
ズアレイ盤3とニポウ盤1との間には、ダイクロイック
ミラー9が配設されているが、ダイクロイックミラー9
は、該レーザ光10を透過させる。
複数のピンホール2…を通過することで、ピンホール2
の下端で拡散し、ニポウ盤1の底面1bに点光源群14
を形成する。上述したように、本共焦点顕微鏡における
ニポウ盤1の底面1bは平らではなく、回転軸を中心と
した1回転分の螺旋状斜面を成しているので、点光源群
14もこの螺旋状斜面に並んだ状態で形成される。な
お、図の煩雑さを避けるために、図1(a)では1個の
ピンホール2を通り抜けた光路、図1(b)では2個の
ピンホール2・2を通り抜けた光路に関してのみ図示し
ている。
た点光源群14の各光10aは、対物レンズ6によって
集光され、試料7中で集光点群11を形成する。図4に
て説明した底面が平らに形成されたニポウ盤30を用い
た構成では、試料53内に形成される集光点群54は光
軸と直交する水平面に並んでいた。これに対し、上記ニ
ポウ盤1では、底面1bが螺旋状斜面を成し、点光源群
14がこの螺旋状斜面に形成されているので、集光点群
11は水平に並ぶことはなく、光軸方向に傾きを持った
斜面上に並ぶこととなる。
面に形成され、点光源毎に点光源から対物レンズ6まで
の距離が変化するためである。対物レンズ6による試料
7内の集光深さを決定する対物レンズ6と集光点との距
離は、レンズの公式 1/f=1/a+1/b で決定される。ここで、fは対物レンズ6の焦点距離、
aは点光源つまりピンホール2の下端と対物レンズ6と
の距離、bは対物レンズ6と集光点との距離である。
焦点距離fが同じ場合、点光源から対物レンズ6までの
距離aが変化すると、対物レンズ6と集光点との距離b
も変化する関係にある。そのため、ニポウ盤1の底面1
bを螺旋状斜面に形成することで、点光源毎に集光深さ
が異なることとなり、集光点群11は試料7内で水平面
(深さが等しい)上には並ばず、立体的に並ぶようにな
る。
させることで、試料7内の異なる深さを走査させること
が可能となる。ニポウ盤1の回転に伴って観察部位の深
さが漸次的に変わり、ニポウ盤1が1回転すると観察部
位の深さが元に戻る。
励起した蛍光(戻り光)12が、対物レンズ6で集めら
れてニポウ盤1の底面1bに集光される。詳細には、各
々先に通過した元のピンホール2の下端に集光され、ピ
ンホール2を通り抜ける。そして、ピンホール2を通り
抜けた蛍光12は、ダイクロイックミラー9で結像レン
ズ8へと反射され、結像レンズ8によって結像される。
も、試料7内の集光点の前後で生じる低強度の蛍光や、
試料7内で散乱された蛍光は、対物レンズ6にてニポウ
盤1の底面1bに集光された際、その集光位置がピンホ
ール2とずれるため、ピンホール21を通り抜けること
はできない。
面1aより照射された光は、結像レンズ8にて結像され
るが、ここで上記ニポウ盤1の上面1aは平らに形成さ
れているので、各ピンホール2を通ってニポウ盤1の上
面1aより出射された光は、結像レンズ8にて平面像と
して結ばれる。
撮像され、上記撮像器13にて撮像した平面像を基に、
図示しない画像処理装置等を使って3次元像を再生する
と、立体像が映し出される。
模式図にて斜線を付しているニポウ盤1の開き角30度
の部分が顕微鏡の視野に相当するとし、この部分にピン
ホール2が1000個ほど形成されているとすると、撮
像器13はニポウ盤1の30度の回転で、1000本の
走査線からなる画像を1つ構成でき、ニポウ盤1の1回
転で深さの異なる12枚の画像を得ることができる。そ
して、これら12枚の画像を三次元像再構築することで
1つの立体像が形成される。
速度を例えば60回転毎秒とすると、このような立体像
を毎秒60個形成できる。毎秒60個の画像よりなる四
次元像では、試料の立体形状に加えて試料の時間的な変
化や移動の情報を含む顕微鏡観察が可能となる。
転毎に12枚の画像を撮像して、毎秒720枚の像を得
るとしたが、撮像器13の高速化を図ることで、毎秒当
たりの取得画像数がさらに増加させることで、より緻密
な立体像を得ることが可能になる。
変化量は、観察対象となる試料の厚みと、使用される対
物レンズの倍率によって決定すればよい。
光軸方向の集光点の移動量=光源の移動量/対物レンズ
の倍率の2乗といった関係がある。
に要求される0.01mmの厚さを立体観察するには、
光軸方向の集光点の移動量が0.01mm必要となり、
上記式より、対物レンズ6の倍率が20倍である場合
は、光源の移動量、つまり、ニポウ盤1における底面1
bの螺旋状斜面の変化量(厚み変化)は4mmとなる。
また、対物レンズ6の倍率が40倍である場合は、ニポ
ウ盤1における底面1bの螺旋状斜面の変化量は16m
mとなる。そして、ちなみに、16mmの厚み変化を持
たせるためのニポウ盤1の直径は50mm程度となる。
ホール2に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれてい
る構成とすることが好ましい。ここで中空管としては例
えばガラスキャピラリー等を挙げることができ、棒状の
透明体としては、光ファイバー等を挙げることができ
る。
肉厚になり、ピンホール2のアスペクト比(深さと直径
の比)も高くなる。高アスペクト比のピンホール2は低
アスペクト比のピンホール2に比べ形成が困難であり、
また、ピンホール2の内面が平滑でない場合、光の伝播
ロスが起こり、伝播ロスはアスペクト比が大きくなるほ
ど顕著になる。そのため、ピンホールの内面平滑化工程
が必要となる。
ラスキャピラリー等の中空管や光ファイバー等の棒状透
明体が埋め込まれている構成とすることで、ピンホール
2の内面平滑化処理が必要なくなり、かつ、高アスペク
ト比であっても困難なく製造することができる。
形状を形成した後の円盤1枚ずつにピンホール2を形成
していく方法もあるが、このように、中空管や棒状透明
体よりピンホール2を形成することで、2枚の円盤にピ
ンホール2を形成し、これらを離して各ピンホール2に
中空管や棒状透明体を通し、それらの隙間を熱可塑性樹
脂等で埋めて、スライス後にニポウ盤1の形状に加工す
ることで、製造工程が簡素化されると共に、高アスペク
ト比であっても困難なく製造することができる。
実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにす
るものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義
に解釈されるべきものではなく、本発明の範囲内で、種
々変更して実施することができるものである。
ニポウ盤1と一体的に回転駆動されるマイクロレンズア
レイ盤3を配して、ニポウ盤1に設けられたピンホール
2の開口面積比を上げてレーザ光の利用率を上げている
が、このようなマイクロレンズアレイ盤3は必ずしも必
要なものではない。
口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤
を用い、該微小開口回転盤を回転しつつその一方の面よ
りレーザ光を照射して微小開口を通すことで他方の面に
点光源群を形成し、該点光源群の光を対物レンズで試料
内に集光して集光点群を形成し、該集光点群からの各戻
り光を元の微小開口を通して微小開口回転盤におけるレ
ーザ光入射側の面より出射して結像レンズにて結像させ
る共焦点顕微鏡であって、上記微小開口回転盤の対物レ
ンズ側の面が回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面
を成し、レーザ光が入射される側の面が平らに形成され
ていることを特徴としている。
並んで形成された微小開口回転盤は、対物レンズ側とな
る面が回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面に形成
されているので、螺旋状斜面に形成された点光源毎に集
光深さが異なることとなり、集光点群は試料内で水平面
(深さが等しい)上には並ばず、立体的に並ぶようにな
る。
回転させることで、試料内の異なる深さを走査させるこ
とが可能となる。微小開口回転盤の1回転で走査位置の
深さは元に戻る。
は平らに形成されているので、各微小開口を通って微小
開口回転盤のこの平坦面より出射された光は結像レンズ
にて平面像として形成される。したがって、この平面像
を撮像して、3次元像を再生することで、試料或いは対
物レンズを上下動させることなく、立体像を得ることが
できる。
を可能とし、立体形状に加えて試料の時間的な変化や移
動の情報を含む四次元顕微鏡観察が可能な共焦点顕微鏡
を提供できるといった効果を奏する。
開口に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれている構
成とすることが好ましい。
口回転盤は、従来の微小開口回転盤よりも肉厚であるた
め、微小開口のアスペクト比(深さと直径の比)も高
く、高アスペクト比の微小開口は低アスペクト比のもの
に比べ形成が困難で、また、微小開口の内面が平滑でな
い場合、光の伝播ロスが起こるため、微小開口の内面平
滑化工程が必要となる。
盤を微小開口に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれ
ている構成とすることで、微小開口の内面平滑化処理が
必要なくなり、また、高アスペクト比であっても困難な
く製造することができる。
を可能とし、立体形状に加えて試料の時間的な変化や移
動の情報を含む四次元顕微鏡観察が可能な共焦点顕微鏡
をより低コストにて提供できるといった効果を奏する。
題を解決するために、共焦点顕微鏡に備えられる複数の
微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口
回転盤であって、一方の面が回転軸を中心とした1回転
分の螺旋状斜面を成し、他方の面が平らに形成されてい
ることを特徴としている。
本発明の該微小開口回転盤を用いて光走査することで、
試料や対物レンズを上下動させることなく、立体像を得
ることができる。
も、微小開口回転盤を本発明の微小開口回転盤に交換す
ることで、動きのある試料の立体像の観察を可能とし、
立体形状に加えて試料の時間的な変化や移動の情報を含
む四次元顕微鏡観察が可能なものに性能を高めることが
できるという効果を奏する。
(a)は、共焦点顕微鏡の正面図であり、同図(b)
は、同図(a)の矢印Aより見た矢視図である。
図である。
る微小開口の並びを示す模式図である。
る。
Claims (3)
- 【請求項1】複数の微小開口が螺旋状に並んで形成され
た円盤型の微小開口回転盤を用い、該微小開口回転盤を
回転しつつその一方の面よりレーザ光を照射して微小開
口を通すことで他方の面に点光源群を形成し、該点光源
群の光を対物レンズで試料内に集光して集光点群を形成
し、該集光点群からの各戻り光を元の微小開口を通して
微小開口回転盤より出射し、結像レンズにて結像させる
共焦点顕微鏡であって、 上記微小開口回転盤の対物レンズ側の面が回転軸を中心
とした1回転分の螺旋状斜面を成し、レーザ光が入射さ
れる側の面が平らに形成されていることを特徴とする共
焦点顕微鏡。 - 【請求項2】上記微小開口回転盤に形成された微小開口
には中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれていること
を特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡。 - 【請求項3】共焦点顕微鏡に備えられる複数の微小開口
が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤で
あって、 一方の面が回転軸を中心とした1回転分の螺旋状斜面を
成し、他方の面が平らに形成されていることを特徴とす
る微小開口回転盤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002151511A JP4148349B2 (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | 共焦点顕微鏡及び微小開口回転盤 |
Applications Claiming Priority (1)
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