JP4148350B2 - 共焦点顕微鏡及び微小開口回転盤 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の微小開口を有する円盤型の微小開口回転盤を回転させて試料を光走査する共焦点顕微鏡、及びそれに備えられる微小開口回転盤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生きている生物試料を拡大観察する光学顕微鏡は、３００年以上の歴史を持つ。光学顕微鏡は、位相差法、偏光法、蛍光法、微分干渉法、暗視野法など種々の観察方法を取り入れて改良が進み、生物試料を生きているままに観察できるという特長を生かして医学、生物学において計り知れない貢献をしてきた。そして今や、生物試料を蛍光修飾することによって、細胞内のタンパク質や低分子まで観察できるようになっている。
【０００３】
このような蛍光修飾を用いる光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡と称され、中でも特に、微小開口を用いる共焦点顕微鏡が注目されている。通常の蛍光顕微鏡では、焦点面の上下の励起光が十分に集光していない領域での励起や蛍光の散乱が蛍光像のボケを引き起こすが、共焦点顕微鏡は微小開口（例えばピンホール）を用いることにより、この蛍光像のボケを除去することができる。
【０００４】
上記共焦点顕微鏡には、レーザ光を走査するのにガルバノ鏡を用いる型、音響光学素子を用いる型、ニポウ盤（微小開口回転盤）を用いる型がある。中でも、高速走査にはニポウ盤を用いる型が適しており、現状１秒間に７２０枚の像を得ることができる。
【０００５】
ニポウ盤は、アルキメデスの螺旋に沿って（中心の周りに等角度で分布し、中心からの距離が等間隔で減少するように）並んだ多数のピンホール（微小開口）を持つ円盤である。ニポウ盤は、２次元画像を１次元の電気信号に変換して画像電送を可能にするために１８８４年に考案された。ニポウ盤を用いた画像伝送は以下の通りである。
【０００６】
撮像レンズによって観察対象の像をニポウ盤の前面に形成し、ニポウ盤の後方に光電変換素子を配置し、かつ光電変換素子がニポウ盤上に離散するピンホールの１個を通過した光だけを受けるようにする。ニポウ盤が回転することによって像の異なる部分の光強度が電気信号に変換され、ニポウ盤の１回転で像の全体が走査される。この電気信号で明るさを変化させた電球を別のニポウ盤を通して見ると、元の像が再現される。
【０００７】
図３に、共焦点顕微鏡に用いられるように改良されたレーザ光走査用ニポウ盤３０の模式図を示す。画像伝送用ニポウ盤が１本の螺旋上にピンホールを配したのに対して、レーザ光走査用では、像の観察は接眼レンズを通して直接に、或いは撮像器を用いて行われるため、螺旋は１本である必要はなく、複数本の螺旋上にピンホール３１…を配している。図３には、アルキメデスの螺旋１本だけを太線Ｌで例示した。
【０００８】
図４に、このようなニポウ盤３０を用いた型の従来の共焦点顕微鏡の一構成例を示す。励起用レーザ（不図示）からのレーザ光（平行光）５１は、ニポウ盤３０の各ピンホール３１を通過すると、ニポウ盤３０の底面で平面上に並んだ点光源群６０となる。但し、図４では、図の煩雑さを避けるために一個のピンホール３１を通り抜けた１点光源の光路に関してのみ図示する。
【０００９】
この点光源群６０からの各光５１ａは、対物レンズ５２によって集光され、試料５３中でレーザ光５１の光軸と直交する平面状に並ぶ集光点群５４を形成し、各集光点で蛍光色素が励起される。
【００１０】
各集光点の励起した蛍光５５は、対物レンズ５２で集められ、ニポウ盤３０の下面に集光され、各々元のピンホール３１を通り抜ける。そして、ピンホール３１を通り抜けたこれら蛍光５５は、ダイクロイックミラー５６で結像レンズ５７へと反射され、結像レンズ５７によって平面状に結像される。この像５８を、接眼レンズを通して直接に、或いは撮像器を用いて観察する。
【００１１】
また、試料５３内の集光点の前後で生じる低強度の蛍光や、試料５３内で散乱された蛍光５９（点線にて示す）は、対物レンズ５２による集光位置がピンホール３１とずれるため、ピンホール３１を通り抜けることができず、像に混入することはない。そのために、共焦点顕微鏡は、通常の蛍光顕微鏡と違って、平面方向、及び光軸方向の分解能が高い、鮮明な像を得ることができる。
【００１２】
このような構成の共焦点顕微鏡において、例えば図３のニポウ盤３０の模式図に斜線で示した３０度の開き角の部分が顕微鏡の視野に相当するとすると、撮像器は、ニポウ盤３０の３０度の回転で、斜線部分に形成されたピンホール３１の個数に相当する数の走査線（図ではピンホール２が５０個形成されているので５０本の走査線）からなる画像を１つ構成できる。そして、ニポウ盤３０の一回転で、合計１２枚の画像が得られる。
【００１３】
現状用いられているニポウ盤では、上記斜線で示した顕微鏡の視野に相当する部分には、１０００個程度のピンホールが形成されており、一画面は１０００本程度の走査線で構成される。したがって、このようなニポウ盤の回転速度を６０回転毎秒とし、撮像器に高速カメラを用いると、毎秒７２０枚の画像を得ることができる。
【００１４】
このようなニポウ盤を用いた共焦点顕微鏡については、例えば、特許第３０８２１８３号の特許公報に記載されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記したニポウ盤を用いる型に限らず、従来の共焦点顕微鏡では、試料５３内の極薄い平面部分を観察するため、試料５３内の異なる深さを観察する際には、試料５３或いは対物レンズ５２を光軸方向に上下動させることによって焦点面を移動させる。そして、この様な深さを換えての平面部分の撮像を繰り返し行うことで、深さの異なるいくつかの面の像を取得し、後に画像処理することによって立体像を構築することが可能となる。
【００１６】
しかしながら、立体像をこのような試料５３或いは対物レンズ５２の上下動にて焦点面を移動させることで得る従来の構成では、焦点面の移動に時間が掛かるため、実時間で立体像を観察できないという問題がある。
【００１７】
本発明は上記課題に鑑み成されたものであって、実時間で立体像観察が可能な共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために、複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤を用い、該微小開口回転盤を回転しつつその一方の面よりレーザ光を照射して微小開口を通すことで他方の面に点光源群を形成し、該点光源群の光を対物レンズで試料内に集光して集光点群を形成し、該集光点群からの各戻り光を元の微小開口を通して微小開口回転盤より出射して結像レンズにて結像させる共焦点顕微鏡であって、上記微小開口回転盤が、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴としている。
【００１９】
これによれば、複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された微小開口回転盤が、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されている。
【００２０】
点光源群は微小開口回転盤の対物レンズ側の面に形成されるため、微小開口回転盤がこのような螺旋状を成すことで、点光源毎に点光源から対物レンズまでの距離が変化することとなる。対物レンズによる試料内の集光深さを決定する対物レンズと集光点との距離は、後述するレンズの公式に示されるように、対物レンズの焦点距離が同じ場合、点光源から対物レンズまでの距離が変化するとこちらも変化する関係にある。そのため、微小開口回転盤を上記のように構成することで、点光源毎に集光深さが異なることとなり、集光点群は試料内で水平面（深さが等しい）上には並ばず、立体的に並ぶようになる。
【００２１】
したがって、このような微小開口回転盤を回転させることで、試料内の異なる深さを走査させることが可能となる。微小開口回転盤の１回転で走査位置の深さは元に戻る。
【００２２】
また、微小開口回転盤がこのような螺旋状に形成されることで、微小開口回転盤より出射される戻り光の結像レンズまでの距離が、微小開口毎に変化することとなる。したがって、各微小開口を通って微小開口回転盤より出射された光は結像レンズにて立体像として形成される。したがって、この立体像を接眼レンズで直接観察することで、試料内の観察部位の立体像を実時間観察できる。なお、光軸と直交する方向の画質は低下するものの、この立体像を平面像として撮像して、３次元像を再生することもできる。
【００２３】
例えば、微小開口回転盤の開き角３０度の部分が顕微鏡の視野に相当するとすると、微小開口回転盤の１回転で深さの異なる１２枚の画像を得ることができ、撮像器を用いる場合は、これら１２枚の画像で１つの立体像が形成される。一方、接眼レンズによる観察であれば、微小開口回転盤が１回転する間に、試料を立体として観察することとなる。そして、このような微小開口回転盤の回転速度を例えば６０回転毎秒とすると、このような立体像を毎秒６０回観察することができる。
【００２４】
その結果、試料の時間的な変化や移動を実時間で立体的に観察可能な共焦点顕微鏡を提供できる。
【００２５】
また、本発明の微小開口回転盤は、上記課題を解決するために、共焦点顕微鏡に備えられる複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤であって、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴としている。
【００２６】
共焦点顕微鏡として既に説明したように、本発明の該微小開口回転盤を用いて光走査することで、立体像の実時間観察が可能となる。
【００２７】
したがって、従来の共焦点顕微鏡においても、微小開口回転盤を本発明の微小開口回転盤に交換することで、試料の時間的な変化や移動を実時間で立体的に観察可能なものに性能を高めることができる。
【００２８】
そしてまた、本発明の共焦点顕微鏡は、別の表現を用いれば、円周が一回転分の螺旋をなすばね座金状の円盤に多数の小孔をあけ、該円盤を回転しつつレーザ光を通して多数の点光源を作り、対物レンズで試料内に立体的に多数の集光点を形成して、励起された蛍光物質からの蛍光を該対物レンズで該円盤上の小孔に結像することによって、通り抜けた蛍光が結像レンズで形成する立体的な像を観察することを特徴しているとも表現できる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明に係る実施の一形態について、図１〜図３を用いて説明すれば、以下の通りである。
【００３０】
図１（ａ）（ｂ）に、本実施の形態における共焦点顕微鏡の構成を示す。同図（ａ）は、共焦点顕微鏡の正面図であり、同図（ｂ）は、同図（ａ）の矢印Ａより見た矢視図である。
【００３１】
本共焦点顕微鏡は、図１（ａ）（ｂ）に示すように、ニポウ盤（微小開口回転盤）１と、ダイクロイックミラー９と、対物レンズ６と、結像レンズ８とを主として備えている。そして、これら図１（ａ）（ｂ）よりわかるように、本共焦点顕微鏡は、ニポウ盤１の形状に特徴がある。
【００３２】
ニポウ盤１は、円盤状を成す回転体で、従来のニポウ盤３０と同様、図３の模式図に示すように、複数本のアルキメデスの螺旋上に沿って複数のピンホール（微小開口）２…が形成されている。図３では、アルキメデスの螺旋１本だけを太線Ｌで例示している。
【００３３】
そして、該ニポウ盤１は、図２の斜視図にその立体形状を示すように、回転軸５を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されており、回転軸５を中心に螺旋を描くように円周方向に漸次的に滑らかに変化している。
【００３４】
このような構成において、図示しない励起用レーザにて、ニポウ盤１の上面１ａ側より照射されたレーザ光（平行光）１０は、ニポウ盤１の各ピンホール２へと入る。なお、ニポウ盤１の上には、ダイクロイックミラー９が配設されているが、ダイクロイックミラー９は、該レーザ光１０を透過させる。
【００３５】
ニポウ盤１に入射されたレーザ光１０は、複数のピンホール２…を通過することで、ピンホール２の下端で拡散し、ニポウ盤１の底面１ｂに点光源群１４を形成する。上述したように、本共焦点顕微鏡におけるニポウ盤１は平板状ではなく、回転軸５を中心とした一回転分の螺旋状に形成されているので、点光源群１４もその底面１ｂである螺旋状斜面に並んだ状態で形成される。なお、図の煩雑さを避けるために、図１（ａ）（ｂ）では２個のピンホール２・２を通り抜けた光路に関してのみ図示している。
【００３６】
そして、ニポウ盤１の底面１ｂに形成された点光源群１４の各光１０ａは、対物レンズ６によって集光され、試料７中で集光点群１１を形成する。図４にて説明した底面が平面状に形成されたニポウ盤３０を用いた構成では、試料５３内に形成される集光点群５４は光軸と直交する水平面に並んでいた。これに対し、上記ニポウ盤１では、１回転分の螺旋を成すばね座金状に形成され、点光源群１４がその底面１ｂの螺旋状斜面に形成されているので、集光点群１１を水平に並ぶことなく、光軸方向に傾きを持った斜面上に並ぶこととなる。
【００３７】
これは、ニポウ盤１の底面１ｂが螺旋状斜面を成し、点光源毎に点光源から対物レンズ６までの距離が変化するためである。対物レンズ６による試料７内の集光深さを決定する対物レンズ６と集光点との距離は、レンズの公式
１／ｆ＝１／ａ＋１／ｂ
で決定される。ここで、ｆは対物レンズ６の焦点距離、ａは点光源つまりピンホール２の下端と対物レンズ６との距離、ｂは対物レンズ６と集光点との距離である。
【００３８】
この式よりわかるように、対物レンズ６の焦点距離ｆが同じ場合、点光源から対物レンズ６までの距離ａが変化すると、対物レンズ６と集光点との距離ｂも変化する関係にある。そのため、ニポウ盤１の底面１ｂを螺旋状斜面に形成することで、点光源毎に集光深さが異なることとなり、集光点群１１は試料７内で水平面（深さが等しい）上には並ばず、立体的に並ぶようになる。
【００３９】
したがって、このようなニポウ盤１を回転させることで、試料７内の異なる深さを走査させることが可能となる。ニポウ盤１の回転に伴って観察部位の深さが漸次的に変わり、ニポウ盤１が一回転すると観察部位の深さが元に戻る。
【００４０】
そして、各集光点で蛍光色素が励起され、励起した蛍光（戻り光）１２が、対物レンズ６で集められてニポウ盤１の底面１ｂに集光される。詳細には、各々先に通過した元のピンホール２の下端に集光され、ピンホール２を通り抜ける。そして、ピンホール２を通り抜けた蛍光１２は、ダイクロイックミラー９で結像レンズ８へと反射され、結像レンズ８によって結像される。
【００４１】
また、特に図示してはいないが、この場合も、試料７内の集光点の前後で生じる低強度の蛍光や、試料７内で散乱された蛍光は、対物レンズ６にてニポウ盤１の底面１ｂに集光された際、その集光位置がピンホール２とずれるため、ピンホール２１を通り抜けることはできない。
【００４２】
ピンホール２を通り抜け、ニポウ盤１の上面１ａより照射された光は、結像レンズ８にて結像されるが、ここで上記ニポウ盤１が螺旋状に形成されているので、その上面１ａも螺旋状斜面となり、ニポウ盤１より出射される蛍光１２の結像レンズ８までの距離が、ピンホール２毎に変化することとなる。したがって、各ピンホール２を通ってニポウ盤１より出射された光は結像レンズ８にて立体像１３として形成される。
【００４３】
そして、この立体像を接眼レンズ（不図示）で直接観察することで、試料７内の観察部位の立体像を実時間観察することができる。試料７や対物レンズ６の移動を伴わないので、振動のない安定な状態で、立体像の実時間観察が可能となる。そして、これにより、生態組織や細胞の電気生理学実験を容易に行うことができる。
【００４４】
このような共焦点顕微鏡において、図３の模式図にて斜線を付しているニポウ盤１の開き角３０度の部分が顕微鏡の視野に相当するとし、この部分にピンホール２が１０００個ほど形成されているとすると、撮像器１３はニポウ盤１の３０度の回転で、１０００本の走査線からなる画像を１つ構成でき、ニポウ盤１の１回転で深さの異なる１２枚の画像を得ることができる。そして、ニポウ盤１が１回転する間に、試料７を立体観察できる。
【００４５】
そしてまた、このようなニポウ盤１の回転速度を例えば６０回転毎秒とすると、このような立体像を毎秒６０回観察できる。毎秒６０回の立体像観察では、試料の立体形状に加えて試料の時間的な変化や移動を充分に観察できる。
【００４６】
なお、上記の説明では、立体像１３を接眼レンズで直接観察するとしたが、光軸と直交する方向の画質は低下するものの、この立体像を平面像として撮像して、３次元像を構築することもできる。その場合、ニポウ盤１の１回転毎に１２枚の画像を撮像して、毎秒７２０枚の像を得ることができ、かつ、撮像器の高速化を図ることで、毎秒当たりの取得画像数がさらに増加させることで、より緻密な立体像を得ることが可能になる。
【００４７】
また、上記した螺旋状のニポウ盤１における高さの変化量は、観察対象となる試料の厚みと、使用される対物レンズの倍率によって決定すればよい。
【００４８】
つまり、光軸方向の集光点の移動量には、
光軸方向の集光点の移動量＝光源の移動量／対物レンズの倍率の２乗
といった関係がある。
【００４９】
したがって、試料７が細胞試料である場合に要求される０．０１ｍｍの厚さを立体観察するには、光軸方向の集光点の移動量が０．０１ｍｍ必要となり、上記式より、対物レンズ６の倍率が２０倍である場合は、光源の移動量、つまり、ニポウ盤１における底面１ｂの螺旋状斜面の変化量（高さ変化）は４ｍｍとなる。また、対物レンズ６の倍率が４０倍である場合は、ニポウ盤１における底面１ｂの螺旋状斜面の変化量は１６ｍｍとなる。そして、ちなみに、１６ｍｍの厚み変化を持たせるためのニポウ盤１の直径は５０ｍｍ程度となる。
【００５０】
また、上記ニポウ盤１においては、各ピンホール２に中空管或いは棒状の透明体が埋め込まれている構成とすることが好ましい。ここで中空管としては例えばガラスキャピラリー等を挙げることができ、棒状の透明体としては、光ファイバー等を挙げることができる。
【００５１】
これにより、光の伝播ロスを小さくするために施されるピンホール２の内面平滑化処理が必要なくなるとともに、また、製造工程の簡素化も図れる。つまり、ニポウ盤１を製造するにあたり、形状を形成した後の円盤１枚ずつにピンホール２を形成していく方法もあるが、このように、中空管や棒状透明体よりピンホール２を形成することで、２枚の円盤にピンホール２を形成し、これらを離して各ピンホール２に中空管や棒状透明体を通し、それらの隙間を熱可塑性樹脂等で埋めて、スライス後にニポウ盤１の形状に加工することができる。
【００５２】
なお、ここで述べた具体的な実施の態様や実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の範囲内で、種々変更して実施することができるものである。
【００５３】
一例として、例えば、本実施の形態では設けていなかったが、ニポウ盤１と一体的に回転駆動されるマイクロレンズアレイ盤を具備させることもできる。マイクロレンズアレイ盤はニポウ盤１のピンホール２…と相対する複数のマイクロレンズを有したもので、ニポウ盤１のレーザ光１０照射側に配されることで、ニポウ盤１における開口面積比を上げてレーザ光の利用率を上げる働きがある。
【００５４】
このようなマイクロレンズアレイ盤は、上記ニポウ盤作製方法において用いられるグラスファイバー（光ファイバー）の代わりに、屈折率傾斜型グラスファイバーを用いることによって、ニポウ盤と同様にして作製される。屈折率傾斜型グラスファイバーは、ファイバーの中心（軸）で屈折率が高く周辺に行くにしたがって徐々に屈折率が低くなるグラスファイバーであり、スライスして厚さが一様な円盤にしたとき、レンズとして使用できる。焦点距離は、屈折率傾斜の程度及び円盤の厚さによって変えることができる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明は、以上のように、複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤を用い、該微小開口回転盤を回転しつつその一方の面よりレーザ光を照射して微小開口を通すことで他方の面に点光源群を形成し、該点光源群の光を対物レンズで試料内に集光して集光点群を形成し、該集光点群からの各戻り光を元の微小開口を通して微小開口回転盤より出射して結像レンズにて結像させる共焦点顕微鏡であって、上記微小開口回転盤が、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴としている。
【００５６】
これによれば、複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された微小開口回転盤が、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されているので、その底面の螺旋状斜面に形成された点光源毎に集光深さが異なることとなり、集光点群は試料内で水平面（深さが等しい）上には並ばず、立体的に並ぶようになる。
【００５７】
したがって、このような微小開口回転盤を回転させることで、試料内の異なる深さを走査させることが可能となる。微小開口回転盤の１回転で走査位置の深さは元に戻る。
【００５８】
また、微小開口回転盤がこのような螺旋状に形成されることで、微小開口回転盤より出射される戻り光の結像レンズまでの距離が、微小開口毎に変化することとなるので、各微小開口を通って微小開口回転盤より出射された光は結像レンズにて立体像として形成される。
【００５９】
したがって、この立体像を接眼レンズで直接観察することで、試料内の観察部位の立体像を実時間観察できる。なお、光軸と直交する方向の画質は低下するものの、この立体像を平面像として撮像して、３次元像を再生することもできる。
【００６０】
その結果、試料の時間的な変化や移動を実時間で立体的に観察可能な共焦点顕微鏡を提供できるという効果を奏する。
【００６１】
また、本発明の微小開口回転盤は、以上のように、共焦点顕微鏡に備えられる複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤であって、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴としている。
【００６２】
共焦点顕微鏡として既に説明したように、本発明の該微小開口回転盤を用いて光走査することで、立体像の実時間観察が可能となる。
【００６３】
したがって、従来の共焦点顕微鏡においても、微小開口回転盤を本発明の微小開口回転盤に交換することで、試料の時間的な変化や移動を実時間で立体的に観察可能なものに性能を高めることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態を示すもので、同図（ａ）は、共焦点顕微鏡の正面図であり、同図（ｂ）は、同図（ａ）の矢印Ａより見た矢視図である。
【図２】上記共焦点顕微鏡に備えられたニポウ盤の斜視図である。
【図３】共焦点顕微鏡で用いられるニポウ盤に形成される微小開口の並びを示す模式図である。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の一構成例を示す図面である。
【符号の説明】
１ ニポウ盤（微小開口回転盤）
２ ピンホール（微小開口）
６ 対物レンズ
７ 試料
８ 結像レンズ
１１ 集光点群
１３ 立体像
１４ 点光源群

Claims (2)

1. 複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤を用い、該微小開口回転盤を回転しつつその一方の面よりレーザ光を照射して微小開口を通すことで他方の面に点光源群を形成し、該点光源群の光を対物レンズで試料内に集光して集光点群を形成し、該集光点群からの各戻り光を元の微小開口を通して微小開口回転盤より出射し、結像レンズにて結像させる共焦点顕微鏡であって、
   上記微小開口回転盤が、回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 共焦点顕微鏡に備えられる複数の微小開口が螺旋状に並んで形成された円盤型の微小開口回転盤であって、
   回転軸を中心に一回転分の螺旋状を成すばね座金状に形成されていることを特徴とする微小開口回転盤。

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