CN111175228A - 一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置 - Google Patents

一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，该装置激光器、第一转盘、分束镜、第二转盘、第三透镜、样品、相机；其中，第一转盘设有N个第一透镜，且第一转盘与第二转盘之间的距离等于第一透镜的焦距；第二转盘设有N个针孔板，第二转盘的针孔板与第一转盘的第一透镜一一对应；每个针孔板的下方设有一个第二透镜，且针孔板的上表面到第二透镜中心的距离等于第二透镜的焦距，其中，第二透镜的焦距等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值；第二透镜中心到第三透镜焦点的距离等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值。本发明无需将样品图像进行缩放，从而减少图像的处理时间，进而提高图像的采集效率。

Description

一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置
技术领域
本发明涉及光学成像技术领域，尤其涉及一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置。
背景技术
超分辨荧光显微技术在生物成像领域意义重大。提高空间分辨率是科学家们不断追求的目标。近年来，提出了多种超分辨技术，如模拟发射损耗(STED)显微，结构照明显微(SIM)图像扫描显微(ISM)和单分子定位显微(SLM)，包括光激活定位显微(PALM)和随机光学重建显微技术(STORM)等。
图像扫描显微成像技术(ISM)采用衍射受限的光斑作为光源对样品照明，采用面阵型探测器成像，探测器的每一个像素点都可成像，最终可达到普通宽场显微成像两倍的分辨率。图像扫描显微成像技术因其结构简单，避免光漂白现象、分辨率提升效果好等优势而在生物成像方面显示出较大的潜力，但为获取一张图像扫描显微的高分辨率图像，需要采集大量的原始图像，并需要将每一个图像缩放至原始图像的一半，再进行合成，后续的图像处理过程严重限制了图像扫描显微成像技术的成像速度。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，无需将样品图像进行缩放，从而减少图像的处理时间，进而提高图像的采集效率。
为实现上述目的，本发明实施例提供了一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，包括激光器、第一转盘、分束镜、第二转盘、第三透镜、样品、相机；
所述激光器与所述样品之间依次设置所述第一转盘、所述分束镜、所述第二转盘、所述第三透镜，且所述激光器、所述第一转盘、所述分束镜、所述第二转盘、所述第三透镜设于同一光轴上；所述相机设于所述分束镜的反射光轴上；
所述第一转盘设有N个第一透镜，且所述第一转盘与所述第二转盘之间的距离等于所述第一透镜的焦距；
所述第二转盘设有N个针孔板，其中，每个所述针孔板的上表面设有一个针孔，所述第二转盘的针孔板与所述第一转盘的第一透镜一一对应；每个所述针孔板的下表面设有一个第二透镜，且所述针孔板的上表面到所述第二透镜中心的距离等于所述第二透镜的焦距，其中，所述第二透镜的焦距等于所述第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值；
所述第二透镜中心到所述第三透镜焦点的距离等于所述第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值。
作为优选方案，所述第二转盘的每个所述针孔板的针孔与对应的第一透镜为同心关系。
作为优选方案，所述第一转盘的圆心与所述第二转盘的圆心之间通过竖直的支撑架进行连接。
作为优选方案，所述支撑架内设有驱动所述第一转盘和所述第二转盘转动的主轴电机。
作为优选方案，所述激光器与所述第一转盘之间设有偏振片，且所述激光器、所述偏振片设于同一光轴上。
作为优选方案，所述第三透镜与所述样品之间设有物镜，且所述第三透镜、所述物镜、所述样品设于同一光轴上。
作为优选方案，所述分束镜与所述相机之间依次设有第四透镜、滤光片、第五透镜，且所述分束镜、所述第四透镜、所述滤光片、所述第五透镜、所述相机设于同一反射光轴上。
作为优选方案，所述转盘为圆盘。
作为优选方案，所述第三透镜为管状透镜。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：
本发明提供一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，当激光器发射的激光经过第一转盘上的多个第一透镜时，由于多个第一透镜起到分光的作用，将激光转化为多束光源，又因为第一转盘与第二转盘之间的距离等于第一透镜的焦距，使得经过第一透镜的光束聚焦在对应的针孔板上；由于针孔板的上表面到第二透镜中心的距离为第二透镜的焦距，使得光源经过第二透镜以平行光的方式入射到第三透镜上；第三透镜将平行光聚焦在样品上，使得样品产生荧光，当样品产生荧光后，荧光光束沿原路返回，若第三透镜聚集荧光光线的入射角为θ时，由于第二透镜中心到第三透镜焦点的距离等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值，且第二透镜的焦距等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值，使得荧光光线以2θ入射角聚焦在针孔上，且通过针孔的入射角等于出射角可知，荧光光线以2θ的出射角射入分束镜后，分束镜将荧光光线反射到相机上，并在相机中生成样品图像，因为经过第二透镜的出射角与未经过第二透镜的入射角之比为2：1，当角度很小时，焦距的大小与锥角近似成反比，则焦距之比为1：2，从而使得样品图像缩小至原图像一半，进而使得本发明无需将相机获取的样品图像进行缩放，减少图像的处理时间，提高图像的采集效率。
附图说明
图1是本发明提供的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置的一种实施例的结构示意图；
图2是本发明提供的一种实施例的第二转盘的局部放大结构示意图；
图3是本发明提供的一种实施例的像素重分配前后与成像大小关系示意图；
其中，说明书附图中的附图标记如下：
1、激光器；2、偏振片；3、第一转盘的第一透镜阵列；4、分束镜；5、第二转盘的第二透镜阵列；6、第二转盘的针孔板阵列；7、第三透镜；8、物镜；9、样品；10、第四透镜；11、滤光片；12、第五透镜；13、相机；14、主轴电机；
d、像素点距离光轴的位置；p、像素重分配后像素焦点中心位置与像素点的距离；D、单个图像直径。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参见图1，图1是本发明提供的基于转盘式(Spinning disk)的全光学图像扫描显微装置的一种实施例的结构示意图，如图1所示，该装置激光器1、第一转盘、分束镜4、第二转盘、第三透镜7、样品9、相机13；
激光器1与样品9之间依次设置第一转盘、分束镜4、第二转盘、第三透镜7，且激光器1、第一转盘、分束镜4、第二转盘、第三透镜7设于同一光轴上；相机13设于分束镜4的反射光轴上；
第一转盘设有N个第一透镜，且第一转盘与第二转盘之间的距离等于第一透镜的焦距；
第二转盘设有N个针孔板，其中，每个针孔板的上表面设有一个针孔，第二转盘的针孔板与第一转盘的第一透镜一一对应；每个针孔板的下表面设有一个第二透镜，且针孔板的上表面到第二透镜中心的距离等于第二透镜的焦距，其中，第二透镜的焦距等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值；
第二透镜中心到第三透镜7焦点的距离等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值。
在本实施例中，可参见图2，第二转盘的局部放大结构示意图，若第二转盘没有第二透镜时，第三透镜7将样品9产生的荧光进行聚焦，则光束的锥角为θ，但是本发明的第二转盘设置第二透镜，将光束的锥角变为2θ，若角度很小，焦距的大小与锥角近似成反比，从物镜8出发的荧光光束入射到第二转盘的入射角和从第二转盘射出的出射角的角度之比为1:2，则焦距之比为2:1，由焦距和成像大小的关系，则成像也缩小了1/2，即该微透镜阵列在保持焦距方向的同时将焦距缩小了1/2，图像大小缩小了1/2。
譬如，第三透镜7的焦距为f1＝250mm,第二透镜的直径为250μm，则
Figure BDA0002368733010000051
Figure BDA0002368733010000052
由此获得L2＝250mm-L1，在已知第三透镜7焦距，第二透镜直径后，通过调节第二透镜与第三透镜7的距离，就能够实现2θ的锥角。
在本实施例中，第一转盘上设有N个第一透镜，其中，N为大于1的整数，由N个第一透镜组成第一微透镜阵列3；第一微透镜阵列3，用于将激光器1发射的激光转为多束光源，从而实现多焦照明，提高成像速度。
在本实施例中，第二转盘设有由N个针孔板，构成针孔板阵列6，第二转盘的针孔板与第一转盘的第一透镜一一对应；每个针孔板的下表面设有一个第二透镜，组成第二微透镜阵列5，从而使得经过第一透镜的光源能够聚焦在对应的针孔板上，并通过针孔板下方的第二透镜，将光束入射到第三透镜7中；需说明的是，光束通过针孔板的针孔，能够实现对失焦光源的阻隔，进一步提高图像的分辨率。
在其中一种优选实施例中，第二转盘的每个针孔板的针孔与对应的第一透镜为同心关系，以使第一透镜将多束光源聚焦在针孔的中心位置，同时第一转盘与第二转盘之间的距离等于第一透镜的焦距时，能够使得第一透镜能够将多束光源的聚焦在第二转盘的针孔板上，能够进一步实现对失焦光源的阻隔，提高图像的分辨率。
在其中一种优选实施例中，第一转盘的圆心与第二转盘的圆心之间通过竖直的支撑架进行连接。
在其中一种优选实施例中，支撑架内设有驱动第一转盘和第二转盘转动的主轴电机14，通过主轴电机14驱动第一转盘和第二转盘转动，促使多个激发焦点对样品9进行扫描，同时主轴电机14驱动第一转盘和第二转盘转动，能够使得整个平面被照明，能够进一步增加曝光率，有利于激发样品9产生荧光，从而提高样品9图像的分辨率。
在其中一种优选实施例中，请参见图1，激光器1与第一转盘之间设有偏振片2，且激光器1、偏振片2设于同一光轴上。
在其中一种优选实施例中，请参见图1，第三透镜7与样品9之间设有物镜8，且第三透镜7、物镜8、样品9设于同一光轴上。其中，第三透镜7用于将第二转盘发散的多束发散光源聚焦在样品9上，使得样品9产生荧光，第三透镜7还用于将样品9产生的荧光进行聚焦。
在其中一种优选实施例中，请参见图1，分束镜4与相机13之间依次设有第四透镜10、滤光片11、第五透镜12，且分束镜4、第四透镜10、滤光片11、第五透镜12、相机13设于同一反射光轴上；需说明的是，相机13为sCMOS相机。
作为本发明的优选实施例，像素焦点中心位置p与像素点偏离光轴距离d的关为p＝d/2。
请参见图3，对于sCMOS像素点成像，需要将每个激发焦点的位置重新定位，相机13由许多个像素点组成，每一个像素点均采集一个图像，如果一个像素距离光轴的距离是d，那么它的扫描图像在添加到最终图像之前必须移动p的距离，这相当于将探测器阵列在激发焦点的任意位置所记录的图像添加到最终图像的激发焦点位置之前按p/d＝1/2的因子进行重新标定，其中关于对激发焦点的位置重新进行1:2的标定的依据如下：
首先定义：以光轴为中心的激发强度分布为E(x)，其宽度决定了传统共焦显微镜的横向分辨率，它的形状是这种显微镜的点扩散函数(PSF)在焦平面上的横向截面；单个像素点的有效探测函数为D(x-d)，等同于宽场显微镜的点扩散函数，该函数描述了距光轴距离为d处的像素点从样品9中给定的x位置检测荧光的能力；被选择像素的最终的点扩散函数为PSF，它是激发强度分布E(x)和有效探测函数D(x-d)的乘积；
为了使像素分配量化，假设E(x)和D(x-d)用简单的高斯函数表示：
激发强度分布
Figure BDA0002368733010000071
有效探测函数
Figure BDA0002368733010000072
然后，两个函数的乘积为最终的点扩散函数，与高斯函数成正比，但函数的宽度会减小，由于点扩散函数的宽度代表分辨率的大小，点扩散函数宽度减小表示分辨率的提高：
Figure BDA0002368733010000073
Figure BDA0002368733010000074
像素焦点中心位置p可由下式决定：
Figure BDA0002368733010000075
近似λdet＝exc，所以可以得出最终焦点中心位置与像素点偏离光轴距离的关系：p＝d/2。
在本实施例中，通过第四透镜10和第五透镜12组成中继透镜，并将中继透镜和滤光片11配合使用能够将经过分束镜4反射的荧光放大两倍，从而使得光束能够充满相机13的整个平面，进而提高样品9图像的清晰度。
在其中一种优选实施例中，分束镜4与光轴呈一定角度放置，优选为45°。需说明的是，分束镜4的反射面面向第二转盘，使得光束从上到下传播的过程为透射，光束从下到上为反射。
在其中一种优选实施例中，第一转盘、第二转盘分别为第一圆盘、第二圆盘。
在其中一种优选实施例中，第三透镜为管状透镜。
由上可见，本发明提供一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，当激光器发射的激光经过第一转盘上的多个第一透镜时，由于多个第一透镜起到分光的作用，将激光转化为多束光源，又因为第一转盘与第二转盘之间的距离等于第一透镜的焦距，使得经过第一透镜的光束聚焦在对应的针孔板上；由于针孔板的上表面到第二透镜中心的距离为第二透镜的焦距，使得光源经过第二透镜以平行光的方式入射到第三透镜上；第三透镜将平行光聚焦在样品上，使得样品产生荧光，当样品产生荧光后，荧光光束沿原路返回，若第三透镜聚集荧光光线的入射角为θ时，由于第二透镜中心到第三透镜焦点的距离等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值，且第二透镜的焦距等于第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值，使得荧光光线以2θ入射角聚焦在针孔上，且通过针孔的入射角等于出射角可知，荧光光线以2θ的出射角射入分束镜后，分束镜将荧光光线反射到相机上，并在相机中生成样品图像，因为经过第二透镜的出射角与未经过第二透镜的入射角之比为2：1，当角度很小时，焦距的大小与锥角近似成反比，则焦距之比为1：2，从而使得样品图像缩小至原图像一半，进而使得本发明无需将相机获取的样品图像进行缩放，减少图像的处理时间，提高图像的采集效率。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，包括激光器、第一转盘、分束镜、第二转盘、第三透镜、样品、相机；
所述激光器与所述样品之间依次设置所述第一转盘、所述分束镜、所述第二转盘、所述第三透镜，且所述激光器、所述第一转盘、所述分束镜、所述第二转盘、所述第三透镜设于同一光轴上；所述相机设于所述分束镜的反射光轴上；
所述第一转盘设有N个第一透镜，且所述第一转盘与所述第二转盘之间的距离等于所述第一透镜的焦距；
所述第二转盘设有N个针孔板，其中，每个所述针孔板的上表面设有一个针孔，所述第二转盘的针孔板与所述第一转盘的第一透镜一一对应；每个所述针孔板的下表面设有一个第二透镜，且所述针孔板的上表面到所述第二透镜中心的距离等于所述第二透镜的焦距，其中，所述第二透镜的焦距等于所述第二透镜的半径除以荧光光线入射角的正切值；
所述第二透镜中心到所述第三透镜焦点的距离等于所述第二透镜的半径除以荧光光线入射角的二分之一的正切值。
2.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述第二转盘的每个所述针孔板的针孔与对应的第一透镜为同心关系。
3.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述第一转盘的圆心与所述第二转盘的圆心之间通过竖直的支撑架进行连接。
4.如权利要求3所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述支撑架内设有驱动所述第一转盘和所述第二转盘转动的主轴电机。
5.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述激光器与所述第一转盘之间设有偏振片，且所述激光器、所述偏振片设于同一光轴上。
6.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述第三透镜与所述样品之间设有物镜，且所述第三透镜、所述物镜、所述样品设于同一光轴上。
7.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述分束镜与所述相机之间依次设有第四透镜、滤光片、第五透镜，且所述分束镜、所述第四透镜、所述滤光片、所述第五透镜、所述相机设于同一反射光轴上。
8.如权利要求1所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述转盘为圆盘。
9.如权利要求1至8任意一项所述的基于Spinning disk的全光学图像扫描显微装置，其特征在于，所述第三透镜为管状透镜。
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