JP6286449B2 - 光学顕微鏡および顕微鏡観察方法 - Google Patents
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Description
このために、汎用的な光学顕微鏡および顕微鏡観察方法では、試料平面内の点が検出装置上に生成するエアリー・ディスクより小さい検出素子が用いられる。
解像度の改善は、単一スポット・システムの光学的伝達スペクトルにおけるより高い空間周波数のより強い重み付けとしても説明することができる。画像生成のために1エアリー・ピンホール径以内の配光が使用されるので、より多くの光子を検出することができる。それによってSN比が改善される。
本発明による方法および本発明による光学顕微鏡の好ましい実施変形例は、従属請求項の対象であり、以下の説明では特に図面に関して解説する。
この際、異なる試料領域を同時に観察するために、第1および/または第2の光学装置の光学素子からの照明光が部分光線束に分割され、この部分光線束が互いから離間した試料領域へ導かれる。照明された試料領域からは試料光が放出される。この試料光は部分光線束として第1および/または第2の光学装置の光学素子から検出ユニットへさらに導かれる。
検出走査動作は、ある特定の検出素子の受信領域の試料平面内の動作である。検出素子の受信領域は、検出素子がそこから光を受信する試料平面内の領域である。受信領域は、試料平面と画像平面との間の結像のPSF、およびそれに属する検出素子の寸法によって決定される。また、受信領域は属する検出素子の試料平面内の結像として解釈することもできる。
記録された信号の再分類が不要になることにより、検出装置によって出力される唯一の画像が既に良好なSN比と共に高解像度を有するようになる。加えて、焦点外の試料光が低減される。
さらに、光学装置を用いて試料光を反転させずに<1の結像スケールで結像する必要がある。そうすれば、有利には、照明走査動作と検出走査動作との間の煩雑な調整が不要になる。
代替の1実施形態では、光学装置を直線的に変位させるための調節装置が設けられている。これには例えば圧電アクチュエータを使用することができる。この場合、光学装置の光学素子もまたチェス盤状に配置されていてもよい。
代替的に、第1の光学装置の光学素子もまたレンズであり、第2の光学装置の光学素子がミラーであってもよい。そうすれば、第2の光学装置によって反射された試料光の部分光線束を、別の光線分割器を介して検出装置の方向へ導くことができる。
前述の光学装置の結像スケールの好ましい値は0.5である。この値は、試料平面内に点状の光源が結像される際のPSF、および試料点が結像される際のPSFの幅が等しい場合に特に適している。これは、例えば図1の曲線44および46の場合に当てはまる。これにより、照明走査動作および検出走査動作の速度または増分が等しくなるはずである。これがまさに、走査装置の光学装置の結像スケールが0.5であることによって実現される。しかし、両方のPSFの幅または形状が異なっていれば、別の結像スケールが好ましい場合がある。これは特に、試料光および照明光の波長が互いに異なっている、例えば蛍光測定の場合に当てはまり得る。そのため、より一般的に0.3から0.7の間の結像スケールが選定される。格別に精密な測定については、結像スケールを可変的に設定することも可能である。このために、走査装置はズーム光学装置を備えていてもよい。このズーム光学装置は第1の光学装置と共に可動であり、作動時に試料光によってのみ通過されるように配置されている。ズーム光学装置は第1の光学装置の光学素子ごとにそれぞれ1つのズーム光学系を備えていてもよい。
図2には、本発明による光学顕微鏡100の1実施例が概略的に示されている。この光学顕微鏡100は、基本的な構成要素として、照明光15を送出するための光源10と、観察対象の試料41を配置可能な試料平面40と、試料光45を検出するための検出装置60と、走査装置50とを含んでいる。
試料41は試料光15の部分光線束によって照明され、その結果、試料光45を放出する。この試料光は、散乱された照明光または発光、つまり蛍光またはリン光であってよい。試料光は対物レンズ30および結像レンズ20によって中間画像平面70内に結像される。中間画像平面70に位置するピンホール75は、試料41の焦点面からの試料光45の大部分を通過させるが、焦点面に由来していない試料光45の大部分を除外する。この抑制の程度は穴径によって決まる。
第2の光学装置52の後には、試料41の画像を検出装置60上に生成する集束光学系79が設けられている。
図3には、図2の光学顕微鏡の構成要素が概略的に示されている。図示されているのは、光線分割器17から中間画像平面70までの照明光15の光線経路、および中間画像平面70から検出装置60までの試料光45の光線経路である。
図3から図4へレンズ71が上方に動かされたことによって、中間平面70における照射光15の強度分布44もまた上方に変位されている。したがって、強度分布44の最大値はもはや試料点42にはなく、試料点42の上方に位置している。中間画像平面70における強度分布44の変位の距離は、レンズ71の動作の距離に等しい。これは、レンズ71によって、当初は平行な光線束として延在する照射光15が、レンズ71の中心軸または光軸77上に位置する領域に集束されるからである。
さらに、図3および図4に示された構成要素において、回転ディスクとしては構成されていない光学装置が使用されてもよい。むしろ、光学素子の任意の他の1次元または2次元の装置が設けられていてもよい。この装置は回転される必要はなく、任意の方法で、例えば直線的またはジグザグに共に動かされてもよい。
図9および図10による別の1実施形態では、(不図示の)光学系によって一点に集中された照明光15が、再帰反射プリズム78の平坦化された先端部によって装置内に結合されている。結合点から出射する発散光は、平行化された後、光線分割器17から集束光学系79によって偏向される。照明フィールドの回転時にスキャンされるディスクの半径方向の領域には、(概略的に図示された)集束マイクロ・ミラーの装置が配置されており、集束マイクロ・ミラーの中心には光を通過させる開口81がそれぞれ設けられている。各マイクロ・ミラーに落ちる光のごく一部(各凹面ミラーの総面積に対する通過開口の面積に対応する)は、最初の衝突時に既にこの開口を通ってミラーを通過し、そこから顕微鏡光線経路を介して(不図示の)試料に到達する。しかし、光の最大部分はマイクロ凹面ミラー80によって反射され、その際、マイクロ凹面ミラーの焦点面にはディスクと共に回転する焦点パターンが生じる。焦点パターンは光学系79の(前方の)焦点面内または光学系79の近くに位置しているので、この焦点パターンは光学系79によって無限に結像され、プリズム78に到達し、そこで再度反射される。その際、プリズム78の反射しない平坦化された先端部が、マイクロ凹面ミラー80のそれぞれの中央の開口の結像に対応する。
図3および図4のレンズ71、72の動作と同様に、図9および図10によれば、検出素子の結像と照明光の結像との間に直径方向の変位をもたらすために、マイクロ・ミラー80の位置およびマイクロ散光レンズ72の位置を光軸に対して垂直に、合わせてずらすことによって、照明光の強度分布の変位が行われる。
11 部分透過的なミラーまたは色部分を備えたミラー段
12 音響光学的可同調フィルタ(AOTF)
14 偏光可変器
15 照明光
16 光線拡大用の望遠鏡
17 光線分割器または色分割器
20 結像レンズ
21 偏向手段
30 対物レンズ
40 試料平面
41 試料
42 試料点、試料の蛍光体
44 照明斑点の強度分布
44A〜44D 照明光の強度分布44の様々な位置
45 試料光
46 検出素子の受信感度の曲線
48 試料変位ユニット
50 走査装置
51 第1の光学装置
52 第2の光学装置
55 ピンホール装置
60 検出装置
61〜64 検出素子
61A〜61D 試料平面内に結像された検出素子の位置
65 駆動軸
70 中間画像平面
71 第1の光学装置の光学素子
72 第2の光学装置の光学素子
73 第3の光学装置の光学素子
74 第4の光学装置の光学素子
75 ピンホール
77 走査装置の光学素子の光軸
78 再帰反射プリズム
79 集束光学系
80 マイクロ・ミラー装置
81 マイクロ・ミラーの開口
100 光学顕微鏡
160 検出装置60の結像
161 検出素子61の結像
164 検出素子64の結像
Claims (15)
- 光学顕微鏡であって、
観察対象の試料(41)を配置可能な試料平面(40)と、
照明光(15)を送出するための光源(10)と、
該照明光(15)を該試料平面(40)内に導くための光学結像手段(16、17、20、21、30)と、
該試料(41)から到来する試料光(45)を検出するために複数の検出素子(61〜64)を備えた検出装置(60)とを備え、
隣接する該検出素子(63、64)の互いの間隔が、該試料平面(40)の点が該検出装置(60)上に生成するエアリー・ディスクよりも小さい、光学顕微鏡において、
少なくとも第1および第2の光学装置(51、52)を備えた走査装置(50)が設けられており、
該走査装置(50)の該光学装置(51、52)が、互いに逆方向である照明走査動作(81)および検出走査動作(82)を引き起こすために、同時に共通の方向に可動であり、
該照明走査動作(81)が、該照明光(15)の該試料平面(40)上の走査動作であり、
該検出走査動作(82)として、該検出素子(61〜64)の受信領域が該試料平面(40)上で可動であり、
該第1および第2の光学装置(51、52)が、互いから離間した試料領域を同時に観察可能とする、隣接して配置された複数の光学素子(71、72)をそれぞれ備えており、
該第1および第2の光学装置(51、52)が、該試料平面(40)から該検出装置(60)までの該試料光(45)の光線経路も、該光源(10)から該試料平面(40)までの該照明光(15)の光線経路も該第1の光学装置(51)を介して延在し、両方の該光線経路の一方のみが該第2の光学装置(52)を介して延在するように配置されており、
該照明走査動作(81)の方向の逆方向である該検出走査動作(82)の方向を実現するために、該走査装置(50)を用いて該試料光(45)を反転させずに1未満の結像スケールで結像可能であることを特徴とする、光学顕微鏡。 - 前記結像スケールが1:2であることを特徴とする、請求項1に記載の光学顕微鏡。
- 反転されていない結像のために、前記第1または第2の光学装置(51;52)の前記光学素子(71;72)がそれぞれ集光効果を有しており、他方の前記光学装置(52;51)の前記光学素子(72;71)がそれぞれ散光効果を有していることを特徴とする、請求項1または2に記載の光学顕微鏡。
- 前記走査装置(50)が第3の光学装置を備えており、該第3の光学装置が、1つまたは複数の画像フィールド回転器を含んでおり、前記試料光(45)の光線経路に配置されており、
前記第1の光学装置(51)または前記第1および第2の光学装置(51、52)を用いて反転された結像を生成可能であり、該反転された結像を該1つまたは複数の画像フィールド回転器の画像フィールド回転によって反転されていない結像に変換可能であることを特徴とする、請求項1または2に記載の光学顕微鏡。 - 前記走査装置(50)が前記画像フィールド回転器として第3および第4の光学装置を備えており、該第3および第4の光学装置が、前記第1の光学装置(51)の前記光学素子(71)のそれぞれに対して光学素子(73、74)をそれぞれ備えていることを特徴とする、請求項4に記載の光学顕微鏡。
- 前記試料平面(40)から前記検出装置(60)までの前記試料光(45)の前記光線経路が、前記第1および第2の光学装置(51、52)を介して延在しており、
前記第1および第2の光学装置(51、52)の前記光学素子(71、72)が集光効果をそれぞれ有していることを特徴とする、請求項4または5に記載の光学顕微鏡。 - 共焦点の試料画像を生成するために、前記第1の光学装置(51)と前記試料平面(40)との間にピンホール装置(55)が設けられており、該ピンホール装置(55)が前記第1および第2の光学装置(51,52)と共に可動であり、
該ピンホール装置(55)が、前記第1の光学装置(51)の各前記光学素子(71)に対してピンホール(75)をそれぞれ備えていることを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。 - 前記走査装置(50)の前記光学装置(51、52)がそれぞれ回転可能なディスク(51,52)によって構成されていることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。
- 前記回転可能なディスク(51、52)が共通の駆動軸(65)上に取り付けられていることを特徴とする、請求項8に記載の光学顕微鏡。
- 前記走査装置(50)の前記光学装置(51、52)を直線的に変位させるための調節装置が設けられていることを特徴とする、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。
- 前記第1の光学装置(51)の前記光学素子(71)が、少なくとも1つのレンズ(71)とミラーまたは光回折素子とによってそれぞれ形成されており、
前記第2の光学装置(52)の前記光学素子(72)が、少なくとも1つのレンズ(72)とミラーまたは光回折素子とによってそれぞれ形成されていることを特徴とする、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。 - 前記走査装置(50)がズーム光学装置を備えており、該ズーム光学装置が、前記第1の光学装置(51)と共に可動であり、作動時に前記試料光(45)のみによって通過されるように配置されていることを特徴とする、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。
- 照明光線経路には再帰反射体としてミラーまたはプリズムが設けられており、前記照明光が該再帰反射体によって、前記照明光の一部を前記試料の方向に通過させるためのピンホールを備えたマイクロ・ミラーの方向へ到達することを特徴とする、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の光学顕微鏡。
- 光学顕微鏡の試料平面(40)内に配置される試料(41)を観察するための顕微鏡観察方法であって、
照明光(15)を該試料平面(40)内に導き、
照明走査動作(81)として該照明光(15)を該試料平面(40)上で動かし、
該試料(41)から到来する試料光(45)を、複数の検出素子(61〜64)を備えた検出装置(60)によって検出し、
隣接する該検出素子(63、64)の互いの間隔が、該試料平面(40)の点が前記検出装置(60)上に生成するエアリー・ディスクよりも小さい、顕微鏡観察方法において、
走査装置(50)の光学装置(51、52)を、互いに逆方向である照明走査動作(81)および検出走査動作(82)を引き起こすために、同時に共通の方向に動かし、
該検出走査動作(82)として、該検出素子(61〜64)の受信領域を該試料平面(40)上で動かし、
隣接して配置された複数の光学素子(71、72)をそれぞれ備えている第1および第2の光学装置(51、52)を用いて、互いから離間した試料領域を同時に観察し、
該第1および第2の光学装置(51、52)を、該照明光(15)および該試料光(45)が該第1の光学装置(51)を介して導かれ、該試料平面(40)へ向かう該照明光(15)または該検出装置(60)へ向かう該試料光(45)のいずれか一方のみが該第2の光学装置(52)を介して導かれるように、配置しており、
該照明走査動作(81)の方向の逆方向である該検出走査動作(82)の方向を実現するために、該走査装置(50)を用いて該試料光(45)を反転させずに1未満の結像スケールで結像することを特徴とする、顕微鏡観察方法。 - 前記照明走査動作(81)および前記検出走査動作(82)を、前記検出装置(60)の前記検出素子(61〜64)の積分時間中に行うことを特徴とする、請求項14に記載の顕微鏡観察方法。
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