JP5412394B2 - 標本観察装置 - Google Patents
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Description
図11A及び図11Bは、結像光学系の結像特性について説明するための図である。図11Aに例示されるように、顕微鏡等の標本観察装置に用いられる結像光学系による結像では、標本上の1点からの発光は、結像面上の1点に投影されず、結像光学系固有の関数である点像分布関数(Point Spread Function)で示される分布で投影される。即ち、図11Bに例示されるように、標本上の各点からの発光は、結像面上に、それぞれ点像分布関数で示される分布で投影されることになる。
式(10)は、SIM回復画像の周波数特性を示している。ここで、ISIMは、SIM回復画像の強度分布を、PSFSIMは、SIM回復画像の点像分布関数を示している。
また、特許文献2には、構造化照明を生成する空間変調素子を中間像位置に配置し、標本の中間像をその空間変調素子を通して復調し撮像する構成が開示されている。
以上のような実情を踏まえ、本発明では、超解像画像を高い時間分解能で生成する技術を提供することを課題とする。
また、構造化照明を生成する空間変調素子を用いて中間像を復調する特許文献2の方法においては、後述の通り超解像成分がほとんど視認されない。
従って、本発明では、超解像成分の視認性が高い超解像画像を生成する技術を提供することも課題とする。
本発明の第12の態様は、第8の態様乃至第11の態様のいずれか1つに記載の標本観察装置において、さらに、励起光生成手段と共焦点変調手段の間に、スリット状の開口に集光位置を一致させたシリンドリカルレンズアレイを含み、変調駆動手段は、シリンドリカルレンズアレイとマスクを、シリンドリカルレンズアレイとマスクの相対的な位置関係を変えずに、移動させる標本観察装置を提供する。
本発明の第14の態様は、第1の態様乃至第10の態様のいずれか1つに記載の標本観察装置において、さらに、標本を励起光で輪帯照明する輪帯照明手段を含み、輪帯照明手段は、中間像形成手段に含まれる対物レンズの瞳位置と共役な位置近傍に配置される標本観察装置を提供する。
本発明の第20の態様は、第16の態様乃至第19の態様のいずれか1つに記載の標本観察装置において、さらに、励起光生成手段と共焦点変調手段の間に、ピンホール状の開口に集光位置を一致させたマイクロレンズアレイを含み、変調駆動手段は、マイクロレンズアレイとマスクを、マイクロレンズアレイとマスクの相対的な位置関係を変えずに、移動させる標本観察装置を提供する。
本発明の第29の態様は、第27の態様に記載の標本観察装置において、空間光変調器は、LCOSである標本観察装置を提供する。
本発明の第31の態様は、第1の態様乃至第30の態様のいずれか1つに記載の標本観察装置において、像リレー手段は、リレー倍率が可変である標本観察装置を提供する。
本発明の第35の態様は、第33の態様または第34の態様に記載の標本観察装置において、コンボリューション処理は、GPUを用いて行われる標本観察装置を提供する。
本発明の第37の態様は、第1の態様乃至第31の態様のいずれか1つに記載の標本観察装置において、高周波強調処理は、デジタル画像データから、共焦点変調手段を作用させずに撮像した標本の広視野画像を差し引く処理である標本観察装置を提供する。
まず、スキャンマスク4が、周期的パターンを形成し得る式(11)で示される透過率分布Mを有する場合を考える。ここで、fn = n/pは変調パターンの固有周波数であり、pは変調パターンのピッチであり、nは周波数展開の次数であり、x0は変調パターンの原点座標である。
の関係が成り立つ。
、つまりn = -n'の関係を満たす成分のみが残るため、変調後の中間像の光強度分布IIntは、式(16)で示され、式(16)をフーリエ変換して周波数特性を示す式に変形すると、式(17)が導出される。
図2Aに例示されるように、変調後の中間像の点像分布関数PSFIntを構成する各成分
の周波数は、それぞれ結像光学系の点像分布関数PSFの周波数に対して周波数fnだけシフトして分布している。このため、各成分の総和である点像分布関数PSFIntは、結像光学系の点像分布関数PSFより広い周波数帯域を有すことになる。従って、変調後の中間像のカットオフ周波数は、結像光学系のカットオフ周波数fcよりも高くなる。このため、蛍光顕微鏡1によれば、原画像に結像光学系のカットオフ周波数fcを超える周波数の超解像成分を記録することができる。
以下の行列A,Bは、それぞれ3x3、5x5のシャープフィルタを例示している。
図5に例示されるように、共焦点変調手段であるスキャンマスク4は、遮蔽部12aと周期的に配列されたピンホール状の開口部12bを有するマスク12であってもよく、いわゆる、2次元格子構造を有するマスクパターンを有してもよい。これにより、図5に例示されるXY平面上で等方的に超解像性を与えることが可能となる。より具体的には、図5に例示されるように、X方向に隣り合う開口部12bのY方向の位置を異ならせることによって、マスク12をX方向にのみ移動させるだけで、XY平面上で等方的に超解像性を与えることが可能となる。
また、開口部35の開口幅wは、およそ2Δ/βとなるように設定されている。蛍光顕微鏡20では、1/(2Δ)=2fcの関係が成り立っているので、開口部35の開口幅wは、およそ1/(2fcβ)である。すなわち、中間像位置での結像光学系22のカットオフ周波数f’c(=fcβ)により規定される周期の半分程度であり、好ましい。
図7は、図6Aに例示される蛍光顕微鏡に含まれるマスクのマスクパターンの変形例について説明するための図である。
また、本変形例に係る蛍光顕微鏡では、広視野画像と原画像が同じ冷却CCD26で取得されるため、画像間の位置合わせを行うことなく、高い精度で画像間の位置が一致した画像を取得することができる。また、広視野画像が取得される時刻と原画像が取得される時刻の時間差も極僅かであり、標本の移動に伴うアーティファクトの発生を抑えられる点において好適である。
また、全反射蛍光顕微鏡40では、蛍光顕微鏡20ト同様に、レーザ41の代わりに、水銀ランプなどの白色光源を用いることもできる。その場合、照明光路上に励起フィルタを含むことが望ましい。
Claims (37)
- 標本を励起するための励起光を生成する励起光生成手段と、
前記励起光を前記標本に投影すると共に、前記標本に前記励起光が照射されて生じた観察光から前記標本の中間像を中間像位置に形成する中間像形成手段と、
前記中間像位置で前記励起光および前記中間像の空間強度分布を変調する共焦点変調手段と、
前記共焦点変調手段が有する変調パターンを前記中間像に対して相対的に移動させる変調駆動手段と、
空間強度分布が変調された前記中間像を撮像面上にリレーする像リレー手段と、
前記撮像面上にリレーされた前記中間像の空間強度分布をデジタル画像データに変換する撮像手段と、
前記デジタル画像データに対して画像処理を行う画像処理手段と、を含み、
前記像リレー手段のカットオフ周波数は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数を上回り、
前記撮像手段のナイキスト周波数は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数を上回り、
前記画像処理手段は、前記デジタル画像データに対して、前記中間像形成手段のカットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する高周波強調処理を行う
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1に記載の標本観察装置において、
前記変調パターンは、周期的なパターンであり、
前記撮像素子による1枚の画像取得の露出時間が、前記変調パターンが前記中間像に対して前記変調パターンの1周期分移動する時間以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1に記載の標本観察装置において、
前記変調パターンは、周期的なパターンであり、
前記撮像素子による1枚の画像取得の露出時間が、前記変調パターンが前記中間像に対して前記変調パターンの1周期分移動する時間の整数倍である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項2または請求項3に記載の標本観察装置において、
前記変調駆動手段が、前記撮像素子による1枚の画像取得の露出時間に応じて、前記変調パターンの移動速度を調節する
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記像リレー手段のカットオフ周波数が、前記中間像形成手段のカットオフ周波数の1.5倍以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項5のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記撮像手段のナイキスト周波数が、前記中間像形成手段のカットオフ周波数の1.5倍以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項6に記載の標本観察装置において、
前記撮像手段のナイキスト周波数が、前記中間像形成手段のカットオフ周波数の4倍以下である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項7のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、周期的に配列されたスリット状の開口を有するマスクである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項8に記載の標本観察装置において、
前記スリット状の開口の幅は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数により規定される周期の半分以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項8に記載の標本観察装置において、
前記周期的に配列されたスリット状の開口の周期は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数により規定される周期よりも長い
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項10に記載の標本観察装置において、
前記スリット状の開口の周期は、前記スリット状の開口の幅の10倍以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項8乃至請求項11のいずれか1項に記載の標本観察装置において、さらに、
前記励起光生成手段と前記共焦点変調手段の間に、前記スリット状の開口に集光位置を一致させたシリンドリカルレンズアレイを含み、
前記変調駆動手段は、前記シリンドリカルレンズアレイと前記マスクを、前記シリンドリカルレンズアレイと前記マスクの相対的な位置関係を変えずに、移動させる
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項8乃至請求項12のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記マスクは、位相シフト膜を含む
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載の標本観察装置において、さらに、
前記標本を前記励起光で輪帯照明する輪帯照明手段を含み、
前記輪帯照明手段は、前記中間像形成手段に含まれる対物レンズの瞳位置と共役な位置近傍に配置される
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項14に記載の標本観察装置において、さらに、
前記標本と前記中間像形成手段の間に、前記標本及び前記標本の周りの媒質の屈折率より高い屈折率を有する透明物体を含み、
前記輪帯照明手段は、前記標本と前記透明物体との界面に入射した前記励起光の90パーセント以上が全反射するような角度で前記励起光が前記界面に入射するように、前記励起光の一部を遮断する
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項8のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、周期的に配列されたピンホール状の開口を有するマスクである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項16に記載の標本観察装置において、
前記ピンホール状の開口の径は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数により規定される周期の半分以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項16に記載の標本観察装置において、
前記周期的に配列されたピンホール状の開口の周期は、前記中間像形成手段のカットオフ周波数により規定される周期よりも長い
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項18に記載の標本観察装置において、
前記ピンホール状の開口の周期は、前記ピンホール状の開口の径の3倍以上である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項16乃至請求項19のいずれか1項に記載の標本観察装置において、さらに、
前記励起光生成手段と前記共焦点変調手段の間に、前記ピンホール状の開口に集光位置を一致させたマイクロレンズアレイを含み、
前記変調駆動手段は、前記マイクロレンズアレイと前記マスクを、前記マイクロレンズアレイと前記マスクの相対的な位置関係を変えずに、移動させる
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項16乃至請求項18のいずれか1項に記載の標本観察装置において、さらに、
前記標本を前記励起光で輪帯照明する輪帯照明手段を含み、
前記輪帯照明手段は、前記中間像形成手段に含まれる対物レンズの瞳位置と共役な位置近傍に配置される
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項21に記載の標本観察装置において、さらに、
前記標本と前記中間像形成手段の間に、前記標本及び前記標本の周りの媒質の屈折率より高い屈折率を有する透明物体を含み、
前記輪帯照明手段は、前記標本と前記透明物体との界面に入射した前記励起光の90パーセント以上が全反射するような角度で前記励起光が前記界面に入射するように、前記励起光の一部を遮断する
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項22のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、周期的なパターンを有する回転ディスクであり、
前記変調駆動手段は、前記回転ディスクを回転させるモータである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項22のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、周期的なパターンを有するプレートであり、
前記変調駆動手段は、前記プレートを振動させる振動子である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項22のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、周期的なパターンを有する回転ドラムであり、
前記変調駆動手段は、前記ドラムを回転させるモータである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項25のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記変調パターンの異なる複数の前記共焦点変調手段を含み、
前記複数の共焦点変調手段から任意の共焦点変調手段を選択して光路上に挿入する
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項22のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記共焦点変調手段は、空間光変調器であり、
前記変調駆動手段は、前記空間光変調器を駆動する駆動回路である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項27に記載の標本観察装置において、
前記空間光変調器は、DMDである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項27に記載の標本観察装置において、
前記空間光変調器は、LCOSである
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項29のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記中間像形成手段は、投影倍率が可変である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項30のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記像リレー手段は、リレー倍率が可変である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項31のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記高周波強調処理は、前記デジタル画像データ自体から、前記デジタル画像データにローパスフィルタを作用させた擬似広視野画像を差し引く処理である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項32に記載の標本観察装置において、
前記擬似広視野画像は、核行列を用いたコンボリューション処理により生成される
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項32に記載の標本観察装置において、
前記高周波強調処理は、核行列を用いたコンボリューション処理である
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項33または請求項34に記載の標本観察装置において、
前記コンボリューション処理は、GPUを用いて行われる
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項33または請求項34に記載の標本観察装置において、
前記コンボリューション処理は、FPDAを用いて行われる
ことを特徴とする標本観察装置。 - 請求項1乃至請求項31のいずれか1項に記載の標本観察装置において、
前記高周波強調処理は、前記デジタル画像データから、前記共焦点変調手段を作用させずに撮像した前記標本の広視野画像を差し引く処理である
ことを特徴とする標本観察装置。
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