JP2022527827A - 構造化照明顕微鏡法を使用した高度な試料画像化 - Google Patents

Abstract

空間解像度を向上させるために、共焦点レーザー走査型顕微鏡または試料走査型顕微鏡などの走査型顕微鏡に構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）を適用する方法および装置を開示する。本開示の特定の態様は、（ｉ）試料への光スループットを増加させて、それにより信号／雑音比を向上させ、かつ／または露光時間を短縮し、さらに、（ｉｉ）処理する生画像の数を減少させ、それにより画像取得時間を短縮する能力における重要な進歩の発見に関する。どちらの効果も、走査型顕微鏡のユーザーの利益のために、全体的な性能の大幅な改善をもたらす。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２日に出願された米国特許出願第６２／８２７，９２１から得られる優先権を主張し、これにより、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。

本発明は、走査型顕微鏡（例えば、共焦点レーザー走査型または試料走査型顕微鏡）を使用した試料の画像化と、解像度を改善するための構造照明と、に関する。

従来の光学顕微鏡は、回折によって制限される空間解像度を有する。顕微鏡の対物レンズの後部開口が完全に平行光で満たされている場合には、その焦点または試料平面の画像はエアリーディスクであり、その半径ｒ_airy（ナノメートル（ｎｍ））は以下に従う。

式中、λ（ｎｍ）は照明の波長であり、ＮＡ（無次元）は顕微の鏡対物レンズの開口数であり、その解像力の基準を与える。この量に関連するのは顕微鏡の解像度であり、通常単一の物体ではなく、２つの物体を個別に画像化できるようにする２つの物体間の最小距離として定義される。エアリーディスクビームを試料上で掃引してこの試料を画像化すると、得られた画像の解像度は以下のようになる。

式中、この場合のｒは解像度（ｎｍ）であり、λおよびＮＡは上記で定義されたとおりであり、ｎは周囲の媒体の屈折率であり、θはレンズに入射、または、出射できる光の最大光錐の半角である。この式から明らかなように、照明光の波長を短くするか、対物レンズの開口数を大きくすることで、空間解像度を向上させることができる（つまり、「ｒ」の値を小さくすることができる）。ただし、これは、直線偏光ビームが顕微鏡の対物レンズの後部開口全体を満たす状況にのみ当てはまる。特定の技術的に検討された部分のみを満たすことにより、エアリーディスクとは異なる干渉パターンを生成し、この干渉パターンを試料表面上で掃引することができる。重要なのは、干渉パターンのフリンジ間隔がエアリーディスクの直径よりも比較的小さいことである。そのような技術的に検討された照明パターン、および、それらの結果として生じる検出ならびに再構成アルゴリズムは、当該技術分野では「構造化照明」と呼ばれ、それは顕微鏡の解像度を最大２倍に改善可能な技術である。

構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）システムは、様々な蛍光顕微鏡で市販されている。ただし、これらのＳＩＭシステムは「広視野」照明を使用する。これは、平行化された光源が対物レンズ入射前に収束レンズを通過することで広い試料領域を照明することを意味する。蛍光画像化の通常の目的は、スペクトル全体を収集することではなく、対象の波長の発光光を単にフィルタリングして、それをカメラに導くことである。広視野顕微鏡は様々な蛍光画像化用途に適しているが、共焦点顕微鏡が優れている場合もある。共焦点顕微鏡は、ピンホールを利用して焦点が合っていない光を排除することによって、厚い試料を用いた画像化を大幅に改善する。共焦点画像は（広視野画像化のように）広い領域ではなくピクセルごとに構築されるため、発光または散乱した光をピンホール下流の分光器に送ることができる。それゆえ、共焦点顕微鏡は分光画像化に適している。共焦点顕微鏡の特定の用途には、厚くて、かつ不均一な試料を用いた蛍光セクショニングと、ラマン顕微鏡の画像化の場合などのハイパースペクトル画像化と、が挙げられる。

共焦点顕微鏡は、広視野顕微鏡の場合のように試料全体を一度に照らすわけではないため、既存のＳＩＭシステムとその再構成アルゴリズムは、共焦点顕微鏡と直接「ドロップイン」互換ではない。ただし、ＳＩＭの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）への特定の用途は、Ｇａｏ他（Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０１６）Ｖｏｌ．４１、Ｎｏ．６：１１９３－９６）に記載されている。この出版物によると、顕微鏡の対物レンズを通った光の２つの「円形瞳孔」の集光から生成されたフリンジパターンを使用して、試料が点ごとに複数回走査される。より具体的には、これらのフリンジパターンは、瞳孔を結ぶ線の角度を参照する方向指数ｍ、および、２つの瞳孔のうちの一方の他方に対する位相シフトｎによって特徴付けられる。４つの異なる角度と４つの異なる相対位相を使用する場合には、高度な画像を再構成するために１６の生画像を収集する必要がある。特に効率性能の観点から、ＣＬＳＭなどの走査型顕微鏡へのＳＩＭの適用を改善することは、現在の最先端技術にとって有利になるであろう。

本発明の態様は、空間解像度を改善するために、構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）を、共焦点レーザー走査型顕微鏡または共焦点試料走査型顕微鏡などの走査型顕微鏡に適用する方法および装置に関する。特定の態様は、（ｉ）試料への光スループットを増加させて、それにより信号／雑音比を向上させ、かつ／または露光時間を短縮する能力と、さらに、（ｉｉ）処理する生画像の数を減少させ、それにより画像取得時間を短縮する能力と、における重要な進歩の発見に関する。どちらの効果も、走査型顕微鏡のユーザーの利益のために、全体的な性能の大幅な改善をもたらす。

ＳＩＭが共焦点顕微鏡法に適用された、試料を画像化するための特定の方法によれば、干渉縞、すなわち、収束フリンジパターンは、試料領域にわたって走査されるか、より具体的には、この領域にわたって、試料の等間隔等の目立たない点に生成される。収束フリンジパターンは、２つレーザービームを所与の角度と位相差で顕微鏡の対物レンズの２つの側面に送ることによって生成される。この角度および位相を変えるには、例えば、ピクセルごとに光ビームの波面を変調することができる既知のプログラム可能なデバイスなどの空間光変調器を使用することができる。位相変調に使用される一般的なタイプは、液晶オンシリコン空間光変調器（ＬＣＯＳ－ＳＬＭ）である。これは、ＬＣＤディスプレイと同様に動作する。つまり、液晶は電界が印加された状態でその屈折率が変化し、光がその結晶と相互作用するため、位相遅延が発生する。空間光変調器は、コンピュータを二次ディスプレイとして利用することができ、その結果、カラーパターンが位相ストロークに変換される。例えば、８ビットのカラーパターンの場合には、１２８と２５６はそれぞれπと２πの位相遅延を表してよい。光が顕微鏡の対物レンズの後部開口の端部のみに向けられている場合には、２つのビームは試料上で構造的、かつ、激しく相互干渉し、上記のエアリーディスクの直径の約半分の周期の正弦波パターンになる。これは、従来の共焦点顕微鏡と比較して、ＳＩＭを使用して画像のさらなる解像度を取得するための基礎を提供する。

しかしながら、単一の所与の角度と位相から取得された生の画像は、高分解画像を再構成するのに十分ではない。むしろ、画像を構築するために、光ビームを生成するレーザーは試料にわたって掃引され、例えば、一連の、または、所定の組の目立たない角度および位相の各々で、共焦点ピンホールを介して複数回画像化される。つまり、顕微鏡の対物レンズの背面開口部の照明領域に対応する２つのビームの照明パターンが、これらの角度と位相で投影される。例えば、空間光変調器を使用して、一方のビームの位相を他方に対して遅らせることによって、０ラジアンなどの所与の角度で２つ以上の位相画像を収集してよい。位相シフトが０の１つの画像と、同一の角度であるが相対的にπ／２、π、３π／２ラジアンなどのゼロ以外の位相シフトを有する別の画像と、を角度と位相の他の組み合わせの他の収束フリンジパターンに対応する画像と共に使用して、特定の対象の試料領域の走査共焦点画像全体をピクセルごとに合成（再構成）することができる。このように、共焦点顕微鏡法などの走査型顕微鏡法において、ＳＩＭを使用することで、有利的に空間分解能を例えば約１．８倍から約２．０倍など、約１．５倍以上向上させる（上記式の「ｒ」の値を減少させる）ことができる。

本発明の特定の態様は、顕微鏡の対物レンズの対応する照明領域が非円形になるように２つのビームの照明パターンを使用することによって、システム全体の光スループットを大幅に改善することを可能にするパラメータの発見に関する。円形領域の場合には、円形プロファイルの２つのビームは、２つの円の変位軸に沿って試料上に正弦波パターンを生成する。ここで、この変位軸は、２つの円の中心を通る線を意味する。試料上で最良の正弦波を生成する際の重要な要素は、軸に沿った２つの円の変位の長さまたは距離である。重要なことであるが、円の上または下に光が存在しても（または、不在でも）、変位距離は維持されるが、試料で生成される正弦波の品質は影響されない。したがって、２つの円だけで照明するのではなく、円の外部の領域で後部開口をさらに照明して、画質を犠牲にすることなく導入される光の量を増やすことができる。

例えば、「照明増強領域」は、スリット形状の照明領域で形成することができる。ここで、最大スリット幅は、スリット内の最大内接円を表す円形の「瞳孔」の直径と同一である。顕微鏡の対物レンズを通って取り込まれたさらなる光も干渉して、選択された角度と位相で正弦波の収束フリンジパターンを形成する。特定の実施形態では、スリットの形態の照明領域、すなわち、顕微鏡の対物レンズの後部円形開口に対応するはるかにより大きな円の円形の一部分は、最大内接円の外側（外部）に照明増強領域を与え、それにより、信号／雑音比を有利に増加させ、および／または露光時間を短縮することができる光スループットの増加に貢献する。これは共焦点または他の走査型顕微鏡の全体的な性能にとって重要である。それは、レーザーによって生成された光のほとんどが対物レンズに向けられないため、従来の光スループットが非常に制限されるからである。有利的には、１つまたは複数（好ましくは２つの双方）の非円形の照明領域の使用への変更は、容易に実施される。対応する劇的な（例えば、４倍の）光スループットの増加により、照明領域内の最大内接円で表されるリファレンスまたはベースラインの円形領域を使用する場合と比較して、同等の信号／雑音比、しかし、短いカメラの露光時間で画像収集が可能になる。その結果、全体的な画像取得時間が短縮され、走査型顕微鏡の分野のユーザーに様々なメリットがもたらされる。他の実施形態によれば、非円形の照明領域は、レファレンスまたはベースライン円形領域と同一の総照明を提供するように構成することができるが、これらの参照またはベースライン円形領域と比較して小さい最大内接円を有する。これにより、変位軸に沿った領域の間隔を広げることができ、画質を向上させる効果がある。

また、ＳＩＭを共焦点レーザー顕微鏡または試料走査型顕微鏡に適用した場合には、１次元および２次元の物理的な光伝播シミュレーションで実証されたように、角度ごとに３つの位相で画像を収集しなければならないという数学的な制限はなく、実際には２つ以上の位相の照明で十分であるという発見にも関する。これの直接の影響としては、取得される生画像の総数が減少することである。つまり、全体的な画像取得時間も同様に短縮される。例えば、角度ごとに４つの位相を使用する手法（例えば、４つの別々の角度で合計１６の画像を収集する）、または角度ごとに３つの位相のみを使用する（例えば、３つの別々の角度で合計９つの画像を収集する）手法と比較すると、画像の取得時間はそれぞれ約５０％または約３３％減少する。このような取得時間の改善としては、時間がユーザーにとって貴重であるだけでなく、熱ドリフトまたは振動の影響を受けにくくなり、画像に大きな収差が発生しにくくなることである。これにより、画質が向上する。取得する生画像の数が少なくなると、管理、追跡、および保存に必要なソフトウェアのオーバーヘッドも減少する。したがって、ＳＩＭの利点である、例えば高開口数（ＮＡ）の対物レンズを使用することによる１．８倍以上の空間分解能の向上は、既知の方法および装置を使用する場合と比較して、著しく低いコストで達成することができる。

これらおよびその他の実施形態は、例えば、イメージングラマン分光法などのハイパースペクトル画像化または、蛍光顕微鏡法などのラベルベースの画像化を行う際に、画像の解像度を向上させるためにＳＩＭを利用する方法および装置に関するものであるが、これらは以下の詳細な説明から明らかになるだろう。

円（図１Ａ）およびスリットの形態における、入力ビームプロファイル、すなわち、顕微鏡の対物レンズの後部開口の照明領域である。 より大きな直径を有する円の一部分（図１Ｂ）の形態における、入力ビームプロファイル、すなわち、顕微鏡の対物レンズの後部開口の照明領域である。 異なる角度で回転軸を有する、図１Ｂに示すような入力ビームプロファイルを示す。 向上した解像度で試料を画像化するためにＳＩＭ（共焦点ＳＩＭ）を利用した共焦点走査型顕微鏡の概実質的に図である。 焦点距離７５ｍｍのレンズを通して２５μｍのピンホールに焦点を合わせた、１００倍、０．７ＮＡの対物レンズを通して５３２ｍｍの波長を照射する共焦点ＳＩＭのシミュレーションされた点広がり関数を示している。６つのシミュレーションされた画像は、光ビームの３つの異なる角度（０、π／３、２π／３）の使用に基づいており、角度ごとに２つの光ビームの照明パターンが０とπだけ位相がお互いに対してにシフトしている。 従来のＣＬＳＭを用いたサンプルのシミュレーション画像と、解像度を向上させた共焦点ＳＩＭを用いた同一のシミュレーション画像を示す。図３に示すように角度と位相の６つの組み合わせを使用して、試料全体にわたって掃引される照明パターンに対して超解像画像を再構成することによって改善が得られている。

これらの図は、本発明の実施形態および／または関連する原理の例示を提示するものと理解されるべきであり、同一または類似の要素を示すために図の中で同一番号が使用されている。本開示の知識を有する当業者に明らかであるように、ＳＩＭを使用する他の方法および装置は、特定の画像化用途に従って部分的に決定される関連するステップおよび構成要素を有するであろう。

本発明の代表的な実施形態は、対象領域上などの試料の複数の点を複数の収束フリンジパターン（または、干渉フランジ）で照明する、試料を画像化する方法に関する。また、当該収束フリンジパターンは、回転軸に様々な角度で導かれ、かつ、位相がお互いに対して様々な位相だけシフトされた光ビームから生成される。したがって、これらの複数の収束フリンジパターンは、「第１の収束フリンジパターン」、「第２の収束フリンジパターン」、「第３の収束フリンジパターン」などで指定してよく、「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、これらの収束フリンジパターンが当該収束フリンジパターンを生成するために干渉する光ビームの特性、すなわち、各々の特性回転軸および位相シフト（例えば、「第１の回転軸」、「第２の回転軸」、「第３の回転軸」等の角度、または、「第１相」、「第２相」、「第３相」等のシフト）に関連することを単に示すために用いている。これらの用語は、収束フリンジパターンを生成するために特定の順序が必要であると解釈されることを意図するものではない。また、これらの用語は、必ずしも異なる値の角度および／または位相を必要とするものとして解釈されるべきではない。実際、好ましい実施形態によれば、所与の試料を複数の点で照明するために使用されるいくつかの収束フリンジパターンは、他の収束フリンジパターンを生成するために使用される光ビームと同一の回転軸角度を有する（実質的に一致する回転軸を有する）。しかしながら、他の収束フリンジパターンは、異なる位相だけシフトされた光ビームが生成される。本明細書でより詳細に説明するように、この回転軸角度は、これらのビームによって照明される顕微鏡の後部開口上の別個の照明領域の向きを指す。同様に、いくつかの収束フリンジパターンは、他の収束フリンジパターンを生成するために使用される光ビームと同一の位相だけシフトされた光ビームから生成され得るが、他の収束フリンジパターンは異なる回転軸角度を有する光ビームから生成される。したがって、試料を照明するために使用される任意の２つの収束フリンジパターンに対して、これらは、それらの特徴的な回転軸角度のみ、それらの特徴的な位相シフトのみ、またはそれらの特徴的な回転軸角度と位相シフトの双方に関して異なる可能性がある。

特に顕微鏡の対物レンズを通って出射され、当該顕微鏡の対物レンズによって収束され、かつ、対物レンズの後部開口に照明領域を与える光の文脈における、「光」および「光ビーム」という用語は、任意の波長、好ましくは電磁スペクトルの紫外線（ＵＶ）部分から電磁スペクトルの中赤外線部分までの範囲、例えば、約２００ｎｍから約１１μｍの範囲の波長λの電磁放射を指す。多くの場合には、例えば約３８０ｎｍから約７５０ｎｍの波長を有する可視光が使用される。特に明記されていない限り、すべての角度はラジアンで示され、２πラジアン＝３６０°である。

本明細書に記載の方法は、例えば、特に共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）に適用される場合の共焦点ＳＩＭの場合に、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を利用する。そのような方法によれば、対象の試料の複数の点は、従来の共焦点顕微鏡の場合のように顕微鏡の対物レンズの後部開口全体を占めるレーザービームによってだけではなく、顕微鏡の対物レンズを通って出射され、当該顕微鏡の対物レンズによって集光される２つ以上、しかし、好ましくは２つだけの光ビーム（例えば、平行レーザービーム）の干渉によって生成された正弦波の収束フリンジパターンによって照射される。特に、これらの光ビームは、技術的に検討された照明領域など、対物レンズの後部開口の一部のみを満たす。ビームが顕微鏡の対物レンズによって収束され、試料に出射されるこれらの領域は、例えば、後部開口の直径の両端にあってよい。所与の収束フリンジパターンは、試料領域にわたって走査または掃引され、例えば、マイクロメートル当たり複数の試料など、所与のサンプル周波数に対応する目立たないサンプル間隔で、照明データを取得するために使用され得る。照明データは、例えば、単一の元素検出器から得られた強度値、あるいは、分光器から得られたスペクトルであってよい。

図１Ａおよび１Ｂは、例えば、顕微鏡の対物レンズの後部開口１４に投射された光ビームの対応するそれぞれの照明領域１２、２２を備えたそれぞれの入力ビームプロファイル１０、２０の２つの図を提供する。左側の図は、これらの光ビームを、平面領域を照明する白い領域（図１Ａの場合は円、図１Ｂの場合はスリット）として示しており、それ以外は完全に暗くなっている。右側の図は、更なる詳細を示すために、これらの暗い背景を削除している。図１Ａおよび１Ｂの実施形態では、ビームは上記のように顕微鏡の後部開口１４の直径の両端から出射され、この直径はビームが間隔を置いて、または、分離して配置された変位軸１６と一致する。したがって、ビームは、アパーチャの領域よりも少ない合計量を表す「照明領域」のみを照明する。一般に、これらの照明領域１２、２２を、後部開口１４の近接端部に配置されるように、または、これらの端部の少なくとも一部に一致するように構成して、可能な限り最大の分離距離を獲得することにより、画質を改善することができる。特に、これらの照明領域１２、２２を提供する光ビームの干渉によって試料上に生成される正弦波の品質は、それらの間の距離の関数であり、距離が大きいほどより高い品質が得られる。

図１Ａの実施形態では、これらの照明領域１２は、円または瞳孔の形態であり、後部開口１４の中心１８も含む変位軸１６に沿って間隔を置いて配置されている。図１Ｂは、異なる入力ビームプロファイル２０を示している。ここでは、（図１Ａに示されているものとは異なり）別個の照明領域２２が非円形である、これらの領域は、最大内接円２５を含む。すなわち、最大内接円２５は、それぞれの照明領域２２内に内接し得る最大の円であって、図示の実施形態では、図１Ａの円形の照明領域１２全体と面積が同等である円に対応する。したがって、最大内接円２５は、変位軸１６に沿って、後部開口１４の中心１８と同一直線上にあるそれぞれの中心２７を有してよい。最大内接円がそのような同一線上の中心を有しないの場合には、「最大内接円」という用語は、対応する照明領域に適用される限り、実施形態によっては、必ずしもその必要はないが、そのような同一直線上の中心を有する（すなわち、後部開口１４の中心１８と同一直線上にある）最大内接円を意味する。

図１Ｂに示される非円形の照明領域２２からも明らかであるように、これらは照明増強領域２９をさらに含み、照明増強領域２９は、変位軸１６の方向に沿って、すなわち、図１Ｂに示されているような水平方向に、最大内接円２５のいずれの部分よりも近接していない、最大内接円２５の外側の任意の照明領域を指す。（これらの要件を満たす）照明増強領域２９内の光は、画質（解像度）を犠牲にすることなく光スループットを増加させるのに有利に機能する。対照的に、円形の一部分またはスリット形状の照明領域２２の２つの弦２３の間の光は、光スループットを増加させながら、それにもかかわらず、技術的に検討された照明パターンを後部開口が照明される従来の共焦点顕微鏡法の方向に動かすことによって解像度を低下させてしまう。この説明を考慮して、円形の一部分（すなわち、円の縁および弦によって境界が定められた領域）である照明領域２２は、最大内接円２５の任意の所与の直径に対して最大の照明増強領域を提供することが理解され得る。直径は、特定の変位距離を定義し、その結果、特定の解像度を定義する。図１Ｂの好ましい実施形態によれば、スリットまたは円の一部分の形状の照明領域２２の弦２３は平行であり、変位距離ｄだけ離れており、このようにして、上記の方法で光スループットおよび解像度の双方に影響を与える。また、この好ましい実施形態では、スリット形状の照明領域２２は、顕微鏡の対物レンズの円形の後部開口１４の反対側部分、すなわち、円弧２１に一致し、それにより、これらの領域は、（ｉ）円形の後部開口１４の円弧、すなわち、これらの反対側部分２１と実質的に一致する円弧２１と、（ｉｉ）この円形の後部開口１４の弦も定義する弦２３と、を含む円形の一部分を定義する。さらに、本実施形態では、最大内接円２５の直径２８が、その最も広い点（この場合は変位軸１６に沿っている）でのスリット幅に対応することが分かる。

一般に、照明増強領域を提供する任意の非円形の照明領域を使用ことにより、ＳＩＭを共焦点顕微鏡に適用する際に関連するトレードオフを改善できる。つまり、これは、（ｉ）生成されたフリンジパターンの精細度を増加させ、その結果、生成された画像の解像度を向上させる変位距離の増加と、（ｉｉ）信号／雑音比を低下させ、かつ／または、露光時間を延長させる光スループットの低下と、のトレードオフである。すなわち、照明増強領域は、（ｉ）に影響を与えることなく（ｉｉ）を有利的に補償するか、あるいは（ｉｉ）に影響を与えることなく（ｉ）の改善を可能にする。有利的には、照明増強領域は、照明領域全体の相当な部分を表すことができ、それによって、最大内接円からの光スループットのベースライン量を、例えば、少なくとも約１．５倍（例えば、約１．５から約６．０倍）、あるいは、少なくとも約２．０（例えば、約２．０から約５．０倍）増加させることができる。この係数は、最大内接円の面積に対する総照明面積の比率を表す。例えば、スリット形状の照明領域の場合には、この比率が増加するにつれて、後部開口の直径に対する最大内接円の直径（この場合は、変位軸を横切るスリット幅）の比率が減少する。すなわち、スリットが後部開口に比べて小さくなる。例えば、後部開口の幅の３／８、１／４、１／８のスリット幅を有するスリット状の照明領域は、ベースライン量を超える増加係数がそれぞれ２．４、３．１、または４．５になるように、照明領域全体のそれぞれ５９％、６８％、７８％を表す照明増強領域から光を提供する。そのような円形の一部分またはスリット形状の照明領域の特定の場合において、後部開口の直径に対するスリット幅の比率は、一般に、約０．０２から約０．４であり、典型的には約０．０５から約０．３であり、多く場合約０．１から約０．２５である。

本開示から、照明領域の多くの可能な非円形形状が、本明細書に記載されるように、照明増強領域からの光スループットを有利に可能にすることが理解され得る。例えば、レンズ形状（フットボールの断面）、多角形、または曲線的な多角形を使用することができる。レンズ形状の照明領域の場合など、場合によっては、最大内接円の外側のすべての照明領域が、上記で定義された「照明増強領域」の特性を満たす場合がある。他の場合には、非円形の照明領域の形状は、それらの最大内接円の外側に照明領域を提供する可能性があり、これは、上記で定義された「照明増強領域」の特性を満たさないであろう。特定の形状に関係なく、好ましくは、（ｉ）最大内接円の外側の照明領域の少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、またはすべてが「照明増強領域」であり、（ｉｉ）照明増強領域は、照明領域全体の少なくとも約５０％（例えば、約５０％から約９５％）、少なくとも約７５％（例えば、約５０％から約９０％）、または少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約９０％）を示し、（ｉｉｉ）最大内接円は、変位軸と実質的に一致する中心を有し、それゆえ後部開口の中心と実質的に同一直線上にあり、および／または、（ｉｖ）照明領域全体は、後部開口の面積の約２５％未満（例えば、約１％から約２５％）または約１５％未満（例えば、約２％から約１５％）を示す。

図１Ｃは、図１Ｂと同様に、顕微鏡の対物レンズの後部開口１４の直径と一致する変位軸１６に沿って分離されたスリット形状の照明領域２２を示している。図１Ｃにさらに示されているのは、変位軸１６に垂直な回転軸３２である。本実施形態によれば、回転軸３２は、別個の照明領域２２の間に延在し、それらと交差せず、照明領域２２が互いの鏡像となる対称軸と一致する。この図に示されているように、回転軸３２の代表的な角度は、０（０°）、π／３（６０°）、および２π／３（１２０°）であり、これらの異なる角度で出射される干渉ビームは、異なる収束フリンジパターンとなる。つまり、収束フリンジパターンは様々な方向から生成される。回転軸の特徴的な角度が変化する収束フリンジパターンで試料表面を走査または掃引することにより、これにより、様々な方向に沿った画像解像度の向上が可能になる。したがって、図１Ｃに示されるように、０、π／３、および２π／３の異なる回転軸の角度で、画像解像度の向上が空間全体に対して達成され得る。それゆえ、実施形態によっては、複数の収束フリンジパターンで試料は走査または掃引されよく、それによって、試料の点は、異なる第１、第２、および第３の回転軸（例えば、０、π／３、２π／３）を有する収束フリンジパターンで第１回目、第２回目、第３回目の照明がされる。ただし、特定の方向に沿った解像度の向上が不要な画像化用途の場合には、２つの異なる回転軸、または、１つの回転軸のみを有する収束フリンジパターンを使用した試料の照明で十分であると見なされる場合がある。図１Ｃでは、垂直方向は、特に０の回転軸３２の角度に対応するが、これは任意の方向であり、主な考慮すべき事項は、別個の照明領域が異なる回転軸を有するための異なる収束フリンジパターンの組み合わせを使用して、所望の方向、すなわち、異なる方向の組み合わせに沿って画像解像度を向上させる能力にある。

図２は、共焦点走査顕微鏡（例えば、共焦点レーザー走査顕微鏡）２００と、改善された解像度で試料を画像化するための構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を利用したその動作を示している。レーザー２０１は、偏光保持光ファイバ２０３およびファイバコリメータ２０５を通って、約２ｍｍから約２０ｍｍ（例えば、約５ｍｍから約１５ｍｍ）のビーム径を有する、水平に偏光され、かつ、平行になった光のビーム２０７を提供する。このビームは、空間光変調器（ＳＬＭ）２０９に向けられる。ＳＬＭは、固定された空間（例えば、ピクセル）パターンに従って光を変調する電気的にプログラム可能な装置でよい。特に、各ピクセルのアドレスにプログラムされた情報は、その光学特性を変更し、入射光または読み出し光の適切な変調を与える。この場合には、ＳＬＭ２０９は、特に回折をもたらす位相格子２１１を表示することにより、この光の位相を変更するために使用される。ＳＬＭに存在する変調光ビーム２１３’、２１３”が追加の機器を通った後、ＳＬＭ２０９および位相格子２１１の組み合わせが顕微鏡の対物レンズ２２３の後部開口１４に上述の所望の照明領域および回転軸方向に従った光パターンを投射する。そのような追加の装置には、（ｉ）例えば、ビーム分離を後部開口１４の直径内に低減するように構成された可変ビームコンプレッサなどのビームコンプレッサ２１５と、（ｉｉ）励起波長を出射波長から区別するための端部フィルタ２１７と、（ｉｉｉ）ビームの操作および移動のための検流計を備えたレーザー走査モジュール２１９と、（ｉｉｉ）適切な反射／透過特性を備えたダイクロイックミラー２２１と、が挙げられる。対物レンズ２２３は、周囲媒体として、屈折率１を有する空気を使用しておよい。そうでない場合は、対物レンズ２２３は、油浸対物レンズの場合の油など、より高い屈折率（例えば、約１．２から約１．６）を有する媒体で動作し、それによって顕微鏡の解像力を高めてよい。

ＳＬＭ２０９は、図１Ｂに示される非円形の照明領域２２に対応する２Ｄパターン（画像）を表示することができる。実施形態によっては、ぼかしを使用して、表示されたパターンの端部（例えば、円形部分パターンの端部）で発生する回折を低減、すなわち、これらの端部を「ソフト」にしてよい。ぼかしは、例えば、特定の標準偏差のガウスカーネルを使用して画像の畳み込みを実行することによって実現できる。標準偏差が大きいほど、結果として生じる画像が大きくぼやける。ＳＬＭ２０９または他の位相変調デバイス上に表示する前の画像のぼかしは、ガウスぼかしフィルタ２０８として知られているソフトウェアアルゴリズムを適用することによって達成してよい。ＳＬＭ２０９は、例えば、位相のみのＳＬＭ、またはそうでなければ、振幅を変調する追加の機能を有する振幅と位相との組み合わせＳＬＭでよい。位相のみのＳＬＭは、出射された光に回折を生じさせる位相格子を表示する。ただし、振幅変調は、位相格子パターンが表示される箇所と表示されない箇所とを選択することで実現できる。例えば、スリット形状のパターンの生成が必要な場合は、ＳＬＭは、この形状の格子パターンを表示し、他の場所には格子を表示しないように構成できる。この場合には、格子から回折された光はスリット状の振幅プロファイルを有し、０次の回折ビームはスリットのネガティブイメージを有する。ＳＬＭは格子パターンの上で位相を変調することもできるため、２つのスリットの１つに位相遅延（例えば、πの位相遅延）を追加することができる。

特に、ＳＬＭ２０９を使用して（例えば、プログラムして）、対物レンズ２２３上に投射され、通過する１つの光ビーム２１３’の別の光ビーム２１３”に対する位相シフトを変調することができる。変調された光ビーム２１３´、２１３”は、すなわち、図１Ａ～１Ｃに示されるような照明領域２２などの照明領域を提供するために使用される。これらの図に関して説明され、さらに図２を考慮して、ビーム２１３’、２１３”は、対物レンズ２２３によって収束され、試料２２５上で干渉して、上記のように異なる回転軸角度および／またはビーム間の位相シフトを有する収束フリンジパターンを生成する。各収束フリンジパターンは、試料２２５の複数の点を走査し、対応する生画像の照明データを収集するために使用される。これは、例えば、検出器２５０を使用して、収束レンズ２２９および共焦点ピンホール２３１の下流に出射された光を検出することによって実行され得る。検出器２５０は、画像データが２Ｄアレイの形態で収集され得るように、強度値を提供する単一の要素検出器であってよい。そうでない場合は、検出器２５０は、スペクトルデータを提供する分光器などの多要素検出器であってよく、その結果、画像データは、３Ｄデータキューブの形態で収集されてよく、第３の次元は分光学的次元である。画像再構成アルゴリズムはいずれの場合も同一であるが、スペクトルデータの場合は一般に長い時間が必要である。ラマン分光画像化の場合には、検出器２５０は、ＤＸＲ２分光器などの市販の分光器であってよい。共焦点顕微鏡２００は、固定位置に維持された試料に従ったレーザー走査装置として動作してよく、試料上の画像に対して収束フリンジパターンを走査することによって、所与の画像が構築されるか、または、関連する照明データがピクセルごとに取得される。あるいは、共焦点顕微鏡２００は、固定位置に維持された試料に従ったこのピクセル情報を取得するための試料走査デバイスとして動作してよく、例えば、電動ステージ２２７（例えば、ＸＹＺ電動ステージ）を用いて、例えば２次元、または可能であれば三次元で試料は移動する。（例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）内の）プロセッサ２６０は、ガウスぼかしフィルタ２０８、ＳＬＭ２０９、レーザー走査モジュール２１９、電動ステージ２２７、および／または検出器２５０の動作を連動させ、かつ、動作可能にリンクするために使用されてよい。プロセッサ２６０は、照明データを収集および処理し、画像再構成アルゴリズムを実行するための命令のプログラムを含んでよい。

ビームの異なる回転軸角度および／または２つのビーム間の異なる位相シフトを有する異なる収束フリンジパターンを使用することにより、複数の「生」画像の照明データ取得することができる。ここで、各生画像は、複数の点で試料を照明（走査または掃引）するために使用される各収束フリンジパターンに対応する。次いで、この生画像データを使用して、従来の共焦点顕微鏡で得られたものと比較して、より高い解像度で超分解され、合成された画像を再構成することができる。したがって、試料を画像化するための代表的な方法は、試料の対象の領域上など、試料の複数の点を、第１の収束フリンジパターンおよび少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンで照射することを含んでよく、（例えば、コリメートされたレーザー光源からの）光ビームの干渉によって複数の点の各々で、これらパターンのそれぞれが生成される。これらのビームは、顕微鏡の対物レンズを通って、例えば、その背面または背面の開口の直径の両端で出射されてよい。「構造化照明」を提供するために、ビームは開口部全体よりも少なく照明する。最初の収束フリンジパターンの場合には、このパターンを生成するために使用される「第１の別個の照明領域」と見なされ得る顕微鏡の対物レンズの別個の照明領域に光ビームが向けられる。第１の別個の照明領域は、「第１の回転軸」と見なされ得る上記のような回転軸を有してよく、光ビームは「第１の位相」だけお互いに対してに位相がシフトされてよい。上記のように、対応する修飾子「第２」、「第３」、「第４」、「第５」、および「第６」は、それぞれの「２番目、「３番目」、「４番目」、「５番目」、「６番目」の収束フリンジパターンの別個の照明領域、回転軸、位相を言及する従来の方法として使用され得る。これらの修飾子は、試料を画像化するために特定の順序で使用される必要がなく、別個の照明領域、回転軸、位相を異ならせる必要もない。回転軸角度と位相シフトの可能な値には０が含まれる。また、序数が大きいこれらの修飾子のいずれにとって、必ずしもそれよりも小さい修飾子を必要としない。したがって、本明細書に記載されているように、例えば、試料は必ずしも「第３」および「第４」の収束フリンジパターンによって画像化されることなく、「第１」、「第２」、「第５」、「第６」の収束フリンジパターンで画像化されてよい。

代表的な方法は、試料の複数の点を第１の収束フリンジパターンで照明することに加えて、これらの点を少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンで照明することをさらに含む。ここで光ビーム（したがって、別個の照明領域の後部開口に投射される光）は、最初の位相に対して、異なる位相だけお互いに対して位相がシフトされる。第１の収束フリンジパターンに対して異なる位相シフトを有するこの少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンの場合には、回転軸角度は、第１の収束フリンジパターンの回転軸角度と同一であっても異なっていてもよい。すなわち、この少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンに関して、（ｉ）顕微鏡の対物レンズの同一の別個の照明領域が使用され、当該別個の照明領域は、第１の回転軸に対して角度付けられていない（すなわち、実質的に一致している）同一の回転軸を有するか、あるいは、（ｉｉ）顕微鏡の対物レンズの異なる別個の照明領域が使用され、当該別個の照明領域は、第１の回転軸に対して角度付けられている異なる回転軸を有し、それによって光ビームが試料に収束される方向に差を生じさせる。特定の実施形態（上記のケース（ｉ）に該当する）によれば、少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、第１の収束フリンジパターンに対して異なる位相シフトを有する第２の収束フリンジパターンであってよい。他の特定の実施形態によれば、少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる収束フリンジパターンであってよい。したがって、本明細書に記載されているように、特徴的な回転軸角度（所与の収束フリンジパターンに対する別個の照明領域の回転軸の角度）が異なり、かつ／または、それらの特徴的な位相シフト（別個の照明領域に投射された光ビームが所与の収束フリンジパターンに対してシフトされる位相）が異なる、例えば、合計で３つ、４つ、５つ、または６つの異なる収束フリンジパターン等の、合計で少なくとも２つの異なる収束フリンジパターン（第１の収束フリンジパターンと少なくとも１つの異なる収束フリンジパターン）を用いて試料を照明する。

複数回実行されるこの照明（走査または掃引）は、例えば、収束フリンジパターンおよび少なくとも１つの異なる収束フリンジパターン等の複数の収束されたフリンジパターンの各々に対応する複数の生画像の各々に対応する照明データの取得を可能にする。上記のように、照明データは、例えば、（２Ｄアレイの形態でデータを収集するため）単一要素検出器、または、（３Ｄ立体データの形態でデータを収集するための）スペクトルグラフから取得してよい。次いで、特定の検出器に関係なく、超分解合成画像は、以下の画像再構成アルゴリズムに従って、複数の生画像の各々の照明データから再構成されてよい。

、
式中、Ｉ_synは、合成画像であり、ｎ_imageは、使用する収束フリンジパターンの数に対応する生画像の数である。これらの収束フリンジパターン、すなわち、第１の収束フリンジパターンおよび少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンの各々に対して、ｉはその特徴的な回転軸角度に対応する指数であり、ｊはその特徴的な位相シフトに対応する指数である。上記の式のインデックスｉ、ｊは、それぞれＸおよびＹの一意の番号を有してよい（例えば、回転軸角度インデックスｉは１、２、３の３つの番号を有することができ、位相シフトインデックスｊは１と２の２つの番号を有することができる。）。ＸとＹは、回転軸角度と位相シフトのそれぞれのＸとＹの一意の値にそれぞれ対応する。例えば、３つの固有の回転角および２つの固有の位相シフトを有する６つの収束フリンジパターンの場合のように、Ｘ個の固有の回転軸角度およびＹ個の固有の位相シフトを有するＸおよびＹ収束フリンジパターンの組を利用してよい。用語Ｉ_rawi、jは、対応する回転軸角度および位相シフト指数ｉ、ｊを有する、複数の生画像のそれぞれの照明データである。Ａは、収束フリンジパターンのコントラストを表す係数であり、試料上で生成された干渉パターンの正弦波の振幅で得られる。位相は、位相シフトの値（ラジアン単位）である。

ｃｏｓ（位相）の係数で重み付けされた上記の合計の第２項を考慮すると、特定の位相シフト、特にこの係数の値が比較的低いものは、合成画像Ｉ_synへの寄与が比較的小さくなる。すなわち、実施形態によっては、ｃｏｓ（位相）が比較的低くなるような特徴的な位相シフトを伴う収束フリンジパターンに対応する追加の照明データに起因する合成画像の解像度のわずかな改善は、この照明データを収集することに関連する追加の取得および処理時間を正当化しない。特定の実施形態では、収束フリンジパターンのいずれもが特徴的な位相シフトを有さないか、さもなければ、第１および少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンのいずれに対しても、別個の照明領域は、余弦が０となる位相だけシフトされる。例えば、そのような実施形態では、Ｉ_synを生成する際に、π／２または３π／２の特徴的な位相シフトを有する収束フリンジパターンの使用が除外される。特定の、より具体的な実施形態では、収束されたフリンジパターンのより広い可能性の使用は除外され得る。例えば、そのような実施形態によれば、収束フリンジパターンのいずれも特徴的な位相シフトを有さないか、さもなければ、第１および少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンのいずれに対しても、別個の照明領域が０．５未満の絶対値を有する余弦を有する位相だけシフトする。そのような実施形態では、Ｉ_synを生成する際に、例えば、π／３から２π／３の範囲、または、５π／３から５π／３の範囲の特徴的な位相シフトを有する収束フリンジパターンの使用が除外される。

上記のように、特徴的な回転軸角度および位相シフトを有する第１の収束フリンジパターン、ならびに、同一回転軸角度を有するが異なる位相シフトを有する第２（または第３または第４）の収束フリンジパターンで試料を照明することにより、その回転軸角度の方向に沿って高度な画像解像度を十分に提供し得る。したがって、特定の実施形態では、少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、光ビームが第１の位相とは異なる第２の位相だけシフトするが、第２の別個の照明領域が第２の収束フリンジパターンのそれと同一である、第２の収束フリンジパターンでよい。それにより、これらの別個の照明領域が、第１の回転軸に対して角度付けられていない（実質的に一致する）第２の回転軸を有する。好ましい実施形態では、第１の位相シフト（または、第１の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してシフトされる位相）がゼロ（０）であり、かつ、第２の位相シフト（または、第２の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してシフトされる位相）がｐｉ（π）である場合などのように、第２の位相は第１の位相とπだけ異なる。

同様に、別の方向への画像解像度の向上が望まれる場合には、別の特徴的な回転軸角度を有するが異なる特徴的な位相シフトを有する、第３および第４の収束フリンジパターンを使用してよい。したがって、代表的な画像化方法によれば、少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、第２の収束フリンジパターンだけでなく、第３および／または第４の収束フリンジパターン、好ましくは第３および第４の収束フリンジパターンの双方を使用することを含んでよい。第３の収束フリンジパターンの場合は、光ビームは、第１の位相と実質的に同一である第３の位相だけシフトされてよいが、第３の別個の照明領域は、第１の回転軸および２番目の回転軸の双方に対して角度付けられている第３の回転軸を有してよい。第４の収束フリンジパターンの場合は、光ビームは、第２の位相と実質的に同一である第４の位相だけシフトしてよいが、第４の別個の照明領域は、第３の回転軸に対して角度付けられていない（実質的に一致する）第４の回転軸を有してよい。好ましい実施形態では、第３の位相シフト（または、第３の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してにシフトされる位相）がゼロ（０）であり、かつ、第４の位相シフト（または、第４の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してシフトされる位相）がｐｉ（π）である場合など、第４に位相は第３の位相とπだけ異なる。他の好ましい実施形態では、第３の回転軸、またはそうでなければ第３および第４の回転軸の双方は、第１の回転軸、またはそうでなければ第１および第２の回転軸の双方に対して約π／４から約π／２など、約π／６から約π／２だけ角度付けられている。例えば、第１および／または第２の回転軸は、ゼロ（０）の基準回転軸角度を有してよく、第３および／または第４の回転軸は、第１および／または第２の回転軸に対してπ／３だけ角度付けられてよい。

さらに別の方向に沿って画像解像度の向上が望まれる場合には、別の特徴的な回転軸角度を有するが異なる特徴的な位相シフトを有する第５および第６の収束フリンジパターンを使用してよい。したがって、代表的な画像化方法によれば、少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、第２、第３、第４の収束フリンジパターンだけでなく、第５および／または第６の収束フリンジパターン、好ましくは第５および第６の収束フリンジパターンの双方を含んでよい。第５の収束フリンジパターンの場合は、光ビームは第１および第３の位相と実質的に同一である第５の位相だけシフトしてよいが、第５の別個の照明領域は、第１、第２、第３、第４の回転軸のすべてに対して角度付けられている第５の回転軸を有してよい。第６の収束フリンジパターンの場合は、光ビームは第２および第４の位相と実質的に同一である第６の位相だけシフトしてよいが、第６の別個の照明領域は、５番目の回転軸に対して角度付けられている（実質的に一致する）第６の回転軸を有してよい。好ましい実施形態では、第５の位相シフト（または、第５の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してシフトされた位相）がゼロ（０）であり、かつ、第６の位相シフト（または、第６の収束フリンジパターンを生成する光ビームがお互いに対してシフトされた位相）がｐｉ（π）である場合など、第６の位相は第５の位相とπだけ異なる。他の好ましい実施形態では、第５の回転軸、またはそうでなければ第５および第６の回転軸の双方は、第１の回転軸に対して、またはそうでなければ第１および第２の回転軸の双方に対して約π／２から約３π／４など、約π／２から約５π／６の角度付けられている。例えば、第１および／または第２の回転軸は、ゼロ（０）の基準回転軸角度を有してよく、第５および／または第６の回転軸は、第１および／または第２の回転軸に対して２π／３だけ角度付けられてよい。

したがって、本明細書に記載の代表的な試料画像化方法は、複数の生画像の各々に対して照明データを取得することを含み、各生画像は、一組の収束フリンジパターンの所与の１つに対応する。顕微鏡の対物レンズを通って出射された一対の光ビームの干渉によって各収束フリンジパターンは生成され、例えば、固定された試料の周りのパターンを走査し、レーザー走査顕微鏡法を実行することで、あるいは、固定したパターンの周りで試料を移動させ、レーザー走査顕微鏡法を実行することで、試料の複数のポイントを照明する。収束フリンジパターンの組は、構成要素ＸおよびＹを備えてよい。構成要素ＸおよびＹは、（ｉ）光ビームの回転軸が向くＸ個の固有の角度と、（ｉｉ）光ビームがシフトするＹ個の固有の位相と、の組み合わせであるか、あるいは、それらのマトリクスを定義する。有利的には、本明細書で説明するように、位相シフトの対応するＹ固有の値を適切に選択することにより、従来の方法では追加の利点をほとんど、または、まったく提供しない照明データの収集を制限または排除することにより、時間およびデータ処理を減らして高度な画像解像度が得られる。例えば、πの位相シフト指数１および２の値の差に対応する位相差を選択することは、これらの値の余弦が有意である場合（例えば、０の値を有する位相シフト指数１、および、πの値を有する位相シフト指数２）は望ましい場合があるが、これらの値の余弦がそれほど重要でない場合（例えば、π／２の値を有する位相シフト指数１、および、３π／２の値を有する位相シフト指数２の場合）は望ましくない場合がある。したがって、位相シフト指数の値の差を単に選択するだけでは、場合によっては不十分であり得ることが理解できる。しかしながら、インデックス値の適切な選択により、位相シフトの２つ以下の固有の値、および／または合計で６つ以下、または４つ以下の収束フリンジパターンを用いて、本明細書に記載の方法に従って試料を画像化され得る。

代表的な実施形態では、例えば、それらの回転軸角度指数ｉおよび位相シフト指数ｊに関して、以下の表１に特徴付けられるように、収束フリンジパターン１～６のうちの２つ、４つ、または６つを用いて試料を画像化され得る。

例えば、収束フリンジパターン１、２のみ、１～４のみ、または１～６のみで試料を画像化してよい。回転軸角度指数ｉの値は、例えば、０、π／３、および２π／３でよく、位相シフト指数ｊの値は、例えば、０およびπでよい。この場合には、上記の特定の収束フリンジパターン１～６は、表１の回転軸指数ｉおよび位相シフト指数ｊのそれぞれに対して、回転軸角度および位相シフトの値によってより具体的に特徴付けることができる。これらの値は以下の表２に記載される。

本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の画像化方法のいずれかに従ってラマン分光法または蛍光顕微鏡法を実施するための装置に関する。そのような装置は、本明細書に記載されるように、顕微鏡の対物レンズの後部開口に投射され、試料上に収束フリンジパターンを生成するために干渉する光ビームの位相を変調するためのプログラム可能な空間光変調器（ＳＬＭ）などの構成要素を含んでよい。好ましくは、ＳＬＭは、光ビームが顕微鏡の対物レンズの別個の照明領域を通るようにする位相格子を表示する。ここで、これらの別個の領域は非円形である。装置、またはより具体的には、装置で使用されるプロセッサのソフトウェアは、これらの非円形の別個の照明領域の端部に沿った回折を低減または排除するために、（ガウスブラーリングフィルタとして知られたソフトウェアアルゴリズムに従った）ガウスぼかしをさらに実行してよい。

全体として、本発明の態様は、試料画像化用途において、レーザー光ビームを顕微鏡の後部開口の別個の照明領域に向けることで達成される利点に関するものであり、実施形態によってはこれらの領域は非円形（例えば、スリットまたは円の一部分の形状）である。円形の照明領域の使用と比較して、後部開口を横切る特定の変位（距離）に対して、２つの非円形の照明領域は光スループットを向上させることができる。例えば、図１Ａおよび１Ｂに示されるような水平変位軸１６に沿って、２つの円の間の距離（図１Ａ）は、２つの非円形スリットの間の距離（図１Ｂ）と同一である。しかしながら、２つの非円形スリット（この特定の実施形態では円形の一部分である）の場合には、実質的により多くの光が垂直方向に沿って顕微鏡の対物レンズに入射する。例えば、この対物レンズの後部開口の光強度の少なくとも４倍の増加を達成することができる。あるいは、円形の照明領域の使用と比較して、所与の光スループットに対して、２つの非円形の照明領域は、干渉から生じる高品質（より細かい）正弦波を提供する変位を増加させることができる。他の態様は、試料走査用の収束フリンジパターンプロファイルの適切な選択による、照明データの収集と処理の効率から生じる利点に関連している。本開示から得られた知識を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、これらおよび他の利点を達成するために開示された装置および方法に様々な変更を加えることができることを認識されたい。したがって、本明細書に記載の特徴は、変更または置き換えを受けやすいことを理解されたい。本明細書で例解および説明される特定の実施形態は、例解のみを目的としており、添付の特許請求の範囲に記載される本発明を限定するものではない。

以下の実施例は、本発明の典型例として示されている。これらおよび他の同等の実施形態は、本開示および添付の特許請求の範囲を考慮して明らかであるため、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１
シミュレーション研究
「グラウンドトゥルース画像」を有する真の試料の画像化を、共焦点ＳＩＭを用いて本明細書に記載された改良された画像化方法に従ってシミュレーションし、従来のＣＬＳＭと比較した。シミュレーション結果は、「ＰＲＯＰＥＲ」としてオンラインで入手できる光伝搬ライブラリを使用して取得した。フーリエ変換アルゴリズム（フレネル、角度スペクトル法）を使用して光学システムを介した光の伝播をシミュレーションするため、この一連のルーチンは物理的な光伝播ツールとして十分に検証されており、望遠鏡の性能をモデル化する際に天文学者によって一般的に使用されている。このライブラリは、特に、焦点距離７５ｍｍのレンズを通して２５μｍの共焦点ピンホールに焦点を合わせた、１００ｘ、０．７ＮＡの対物レンズを通して５３２ｎｍレーザーの共焦点および共焦点ＳＩＭの点像分布関数をシミュレーションするために使用された。図３は、光ビームの３つの異なる角度（０、π／３、２π／３）および各角度に対するこの共焦点ＳＩＭの例のシミュレーションされた点広がり関数を示している。光ビームは０とπの位相だけお互いに対してシフトしている。次いで、収集された結果の画像は、点像分布関数とグラウンドトゥルース画像の畳み込みをすることにより、これらのパターンを使用してシミュレーションした。角度０、位相シフトπの生の共焦点ＳＩＭ画像の場合には、この画像自体はほとんど役立たなかった。すべての角度と位相の生画像データが収集され、ここで説明する画像再構成アルゴリズムに従って超解像画像を再構成するために使用された場合にのみ、従来のＣＬＳＭに対する改善が明らかになった。

図４は、従来のＣＬＳＭを使用してシミュレーションされた試料の画像の集まりと、同一のシミュレーションされた画像であるが、解像度を向上させるために共焦点ＳＩＭを使用しているものが示している。図３に示すように角度と位相の６つの組み合わせを使用して、試料全体にわたって掃引される照明パターンに対して超解像画像を再構成することによって改善が得られた。画像再構成アルゴリズムは上記の通りであった。したがって、シミュレーション作業は、シミュレーションされた顕微鏡解像度標準で上記の改善を使用した共焦点ＳＩＭ画像のシミュレーションが成功したことを証明した。他の研究では、１Ｄシミュレーションと２Ｄシミュレーションの双方で、特定の回転軸角度で２つの異なる照明の位相シフトのみが必要であることが証明した。

実施例２
実験的実証
共焦点ＳＩＭを実行するためのプロトタイプ顕微鏡は、図２に示す構成に従って構築された。ダイクロイックミラーは、顕微鏡カメラを使用して、試料上のレーザースポットを観察する能力を提供した。このカメラは、実施例１で記載した物理的な光伝搬シミュレーション研究と同様に、同一の収束フリンジパターンが生成されたことを証明するために、ＳＬＭパターンからＳＩＭで生成されたスポットの画像を取得するために使用された。これは、この実験的実証で得られた画像の周りの円形の境界を考慮して、シミュレーション結果と並べて比較することに基づいており、共焦点ピンホールとの実質的に位置揃えを示すのに有益である。シミュレーション研究では、図３に示すように、シミュレーションされたＳＩＭレーザーパターンが共焦点マスクの適用をすでに説明しており、これがこれらのパターンの外形が円形の理由である。

Ｐｅｌｃｏｔｅｃ（登録商標）ＣＤＭＳ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ株式会社によるＣｒｉｔｉｃａｌ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して、ライン走査とフル２Ｄ画像の双方で、共焦点ＳＩＭによる超解像度が実証することに成功した。ＣＤＭＳ試料には５００ｎｍ間隔の線があり、共焦点画像化システムでは分離できなかった。対照的に、共焦点ＳＩＭを使用して画像化する場合には、画像は分解できる。さらに、１００ｘ、０．９ＮＡの対物レンズを使用して５３２ｎｍの励起で画像化する場合には、上記の背景技術の章で示した式に従って計算された共焦点解像度は２９６ｎｍになる。これは、カーボンナノチューブの試料を使用して実験的に確認でき、２７９ｎｍの共焦点（非ＳＩＭ）解像度を達成することにより、共焦点システムで確認された。同一システムで、同一の励起波長、対物レンズ、およびカーボンナノチューブの試料を使用して、組み合わせた共焦点ＳＩＭを使用して画像化すると、１８６ｎｍの改善された解像度が達成された。

Claims (22)

1. 試料を画像化する方法であって、
   顕微鏡の対物レンズを通って出射された光ビームの干渉によって、複数の点の各々において生成された第１の収束フリンジパターンで、前記試料の前記複数の点を照明することを含み、
   前記第１の収束フリンジパターンに対して、前記顕微鏡の対物レンズの第１の別個の照明領域は第１の回転軸を有し、前記光ビームの位相は、第１の位相だけお互いに対してシフトされ、
   前記方法が、前記複数の点を少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンで照明することをさらに含み、前記光ビームは、前記第１の位相に対して、異なる位相だけ互いに対して位相がシフトされ、（ｉ）前記顕微鏡の対物レンズの同一の別個の照明領域は、前記第１の回転軸に対して角度付けられていない同一の回転軸を有するか、または、（ｉｉ）前記顕微鏡の対物レンズの異なる別個の照明領域は、前記第１の回転軸に対して角度付けられている異なる回転軸を有し、
   前記別個の照明領域の一方または双方が、非円形である、方法。
2. 単一要素検出器または分光器から、前記第１の収束フリンジパターンおよび前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンの各々に対応する、複数の生画像の各々に対する照明データを取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 以下の式に従って、前記複数の生画像の各々に対する前記照明データから、超解像合成画像を再構成することをさらに含み、
   

   

   式中、Ｉ_synは、前記合成画像であり、ｎ_imagesは、前記複数の生画像の各々の数であり、
   前記第１の収束フリンジパターンおよび前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンの各々に対して、
   ｉは、回転軸角度に対応する指数であり、
   ｊは、前記光ビームのお互いに対しての位相シフトに対応する指数であり、
   Ｉ_rawi、jは、前記回転軸角度に対応する指数ｉおよび前記位相シフトに対応する指数ｊを有する、前記複数の生画像の各々に対する前記照明データであり、
   Ａは、収束フリンジパターンのコントラストを表す係数であり、
   ｐｈａｓｅは、前記位相シフトである、請求項２に記載の方法。
4. 前記別個の照明領域が、前記顕微鏡の対物レンズの後部開口の中心と実質的に同一直線上にある中心を有する最大内接円を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記別個の照明領域が、各々、前記最大内接円の外部の照明増強領域をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記照明増強領域が、前記別個の照明領域の少なくとも約５０％を表す、請求項５に記載の方法。
7. 前記照明領域が、前記顕微鏡の対物レンズの後部円形開口の反対側部分に一致するスリットとして形状化される、請求項５に記載の方法。
8. 前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンに対して、前記光ビームが、プログラム可能な空間光変調器を使用して同位相で変調される、請求項１に記載の方法。
9. 前記第１および前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンのいずれに対しても、前記別個の照明領域が、０の余弦を有する位相だけシフトされていない、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１および前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンのいずれに対しても、前記別個の照明領域が、０．５未満の絶対値を有する余弦を有する位相だけシフトされていない、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンが、前記第１の位相とは異なる第２の位相だけ前記光ビームがシフトされている第２の収束フリンジパターンであり、前記同一の別個の照明領域が、前記第１の回転軸に対して角度付けられていない第２の回転軸を有する第２の別個の照明領域である、請求項１に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、
    前記光ビームが前記第１の位相と実質的に同一である第３の位相だけシフトされており、かつ、第３の別個の照明領域が前記第１の回転軸および前記第２の回転軸に対して角度付けられている第３の回転軸を有する、第３の収束フリンジパターンをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、
    前記光ビームが前記第２の位相と実質的に同一である第４の位相だけシフトされており、かつ、第４の別個の照明領域が前記第３の回転軸に対して角度付けられていない第４の回転軸をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第２の位相が、前記第１の位相とはπだけ異なる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の位相が、０であり、前記第２の位相が、πである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つの異なる収束フリンジパターンは、
    前記光ビームが前記第１の位相および前記第３の位相と実質的に同一である第５の位相だけシフトし、かつ、第５の別個の照明領域が前記第１、第２、第３、および第４の回転軸に対して角度を有する第５の回転軸を有する、第５の収束フリンジパターンと、
    前記光ビームが前記第２の位相および前記第４の位相と実質的に同一である第６の位相だけシフトされ、かつ、第６の別個の照明領域が前記第５に対して角度を有さない第６の回転軸を有する、第６の収束フリンジパターンと、を含む、請求項１３に記載の方法。
17. 前記第１、第３、および第５の位相が０であり、前記第２、第４、および第６の位相がπである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第３の回転軸は、前記第１の回転軸に対して約π／６から約π／２の角度を有し、前記第５の回転軸は、前記第１の回転軸に対して約π／２から約５π／６の角度を有する、請求項１６に記載の方法。
19. 試料を画像化する方法であって、
    複数の生画像の各々の照明データを取得することを含み、前記生画像の各々は、１組の収束フリンジパターンの所与の１つに対応し、前記収束フリンジパターンの各々は、顕微鏡の対物レンズを通って出射される一対の光ビームの干渉によって生成され、前記試料の複数の点を照明し、
    前記収束フリンジパターンの組は、（ｉ）前記光ビームがシフトされたＸ位相と、（ｉｉ）前記光ビームの回転軸が向けられたＹ角度と、の組み合わせであるＸおよびＹ構成要素を含み、前記組は、Ｘの２つの異なる値以下である。
20. ラマン分光法または蛍光顕微鏡法を実行するための装置であって、前記光ビームの位相を変調するためのプログラム可能な空間光変調器（ＳＬＭ）を備え、かつ、請求項１に記載の方法を実行するように構成されている、装置。
21. 前記ＳＬＭは、前記光ビームを前記顕微鏡の対物レンズの前記非円形の別個の照明領域に通過させる位相格子を表示する、請求項２０に記載の装置。
22. 前記非円形の別個の照明領域を平滑化するためにガウスぼかしを実行するように構成されている、請求項２１に記載の装置。

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