JP2018021954A - 顕微鏡及び観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】空間分解能及び時間分解能を向上させた顕微鏡を提供する。【解決手段】本発明に係る顕微鏡１００は、試料１３の試料面１３ａを、複数のスポット２３を含む照明光１５で照明する照明光学系と、照明光１５で照明された試料面１３ａからの光を結像する結像光学系と、結像された試料面１３ａからの光を検出して試料面１３ａの画像を撮像する撮像部１４と、を備え、複数のスポット２３は、試料面１３ａにおける一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の第１周期で配置され、一方向と交差する他方向には、構造化照明法による観察が可能な所定の第２周期で配置される。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡及び観察方法に関し、特に、時間分解能及び空間分解能を向上させた顕微鏡及び観察方法に関する。

モアレを利用して解像度を高める構造化照明法を用いることにより、解像限界を超えた空間分解能（超解像）での顕微鏡観察が実現されている。

特許文献１には、帯状の透明領域が周期的に配置された視野絞りを用いる撮像装置が記載されており、このような視野絞りに照明光を透過させることにより、構造化照明として機能する帯状の照明パターンを生成している。そして、照明パターンによる照明位置を少しずつずらした複数の画像を合成することにより、高分解能の画像を取得している。

特許文献２には、超音波空間光変調器を有する構造化照明装置が記載されている。超音波空間光変調器における超音波伝播路に、超音波の平面定常波を生起し、照明光を、０次、＋１次及び−１次の回折光に分岐することによって、縞ピッチが一様なストライプ状の照明パターンを生成している。この照明パターンを用いることにより、高分解能の画像を取得している。

一方、試料面にスポット光を照射し、その反射光を結像面に置かれたピンホール（またはスリット）を通して検出することにより、焦点の合っていない箇所からの不要散乱光を除去し、焦点の合った部分の解像度を向上させる共焦点顕微鏡観察が実現されている。

特許文献３には、複数のピンホールが形成されたディスクを回転させ、複数のピンホールを透過させた画像を結合することにより、コントラスト及び解像度を向上させた画像をリアルタイムで撮像する共焦点画像生成方法が記載されている。

特許文献４には、複数のピンホールが形成された微小ミラー網を透過させた共焦点効果を示す光束を、ガルバノメーターミラーを用いて試料面をスキャンすることにより、高分解能な画像を取得する共焦点用光学走査装置が記載されている。

特許文献５には、多色光源が生成するマトリクス状の複数の光束を用いた共焦点三次元計測装置が記載されており、複数の光束を試料に照射し、試料からの光をスペクトル分離することにより、試料の三次元形状を計測することが記載されている。

特許文献６には、照明光を線状に整形した構造化照明法において、超解像化の方向を１２０°毎に異なる３方向に設定して観察することにより、超解像の画像を取得することが記載されている。特許文献６では、構造化照明法により取得した画像をフーリエ変換し、波数空間において、構造化照明の空間周波数だけ構造化方向へシフトさせ、それによって得た画像データを逆フーリエ変換することにより超解像の画像を取得している。

特表２００９−５４３１０１号公報 国際公開第２０１３／０１１６８０号 特表２００２−５１７７７４号公報 特表２００４−５０９３７０号公報 特表２００９−５２６２１６号公報 国際公開第２００７／０４３３１３号

構造化照明法では、解像度を向上させたい方向に周期的に強度変調させた照明を用いることが必要であるため、二次元の全方向について解像度を向上させるためには、変調方向の異なる照明を用いて、多数の画像を撮影することが必要となる。このため、構造化照明法では、多数の画像の撮像に時間を要し、時間分解能を向上させることが困難である。

本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、空間分解能及び時間分解能を向上させた顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明に係る顕微鏡は、試料の試料面を、複数のスポットを含む照明光で照明する照明光学系と、前記照明光で照明された前記試料面からの光を結像する結像光学系と、結像された前記試料面からの光を検出して前記試料面の画像を撮像する撮像部と、を備え、前記複数のスポットは、前記試料面における一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の第１周期で配置され、前記一方向と交差する他方向には、構造化照明法による観察が可能な所定の第２周期で配置されている。このような構成により、空間分解能及び時間分解能を向上させることができる。

また、前記他方向に一列に配置した複数の前記スポットを１つの行とし、前記一方向に配置した複数の前記行に対して、前記一方向に順にＮ個ずつをそれぞれ１つのグループとし、各前記グループに含まれるＮ個の各前記行に、前記一方向に順に１番目からＮ番目まで番号をつけたとき、前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置は、各前記グループにおいて一致し、各前記グループにおける２番目からＮ番目までの前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置は、前記行の番号をＫ番目としたとき、前記１番目の前記行に配置された各前記スポットよりも、（（Ｋ−１）×第２周期／Ｎ）だけ前記他方向にシフトさせている。このような構成とすることにより、一度の走査によって、構造化照明された試料面１３ａの複数の画像を取得することができるので、画像を取得する時間を短縮し、時間分解能を向上させることができる。

さらに、前記照明光学系は、前記複数のスポットを走査する照明光走査手段を有し、前記照明光走査手段は、前記複数のスポットを前記一方向に走査し、前記撮像部は、各前記グループの前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第１画像から、各前記グループの前記Ｎ番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第Ｎ画像までのＮ個の画像を取得する。このような構造とすることにより、Ｎ行分だけ一方向に走査させればよいので、画像を取得する時間を短縮することができ、時間分解能を向上させることができる。

また、前記撮像部が撮像した前記画像を処理する処理部をさらに備え、前記処理部は、前記Ｎ個の各前記画像をフーリエ変換し、フーリエ変換した前記Ｎ個の各前記画像から、構造化照明の空間周波数よりも高空間周波数の成分と、低空間周波数の成分を抽出し、高空間周波数の成分のみを前記他方向における構造化照明の波数ベクトル方向に（±１／第２周期）だけシフトさせたフーリエ画像を合成し、合成した前記フーリエ画像を逆フーリエ変換して実空間内の前記画像を取得する。このような構成とすることにより、解像限界を超える空間周波数成分を含む実空間画像が得られるため、空間分解能を向上させることができる。

前記結像光学系は、照明された前記試料面からの光を集光する対物レンズを有し、前記照明光学系は、前記対物レンズの焦点と共役な位置に配置されたアパーチャーを有し、前記アパーチャーには複数の孔が形成され、前記複数の孔を光源からの光が通過することによって、前記複数のスポットを含む照明光が形成される。このような構成とすることにより、共焦点顕微鏡による観察が可能になり、空間分解能を向上させることができる。

また、各前記スポットの前記一方向の長さは、前記対物レンズの開口数及び前記照明光の波長に基づいて決定される解像限界と同じ長さであり、各前記スポットの前記他方向の長さは、顕微鏡のコントラストトランスファーファンクションに基づいて決定される構造化照明法が可能な長さとする。このような構成により、構造化照明法及び共焦点顕微鏡法の分解能を向上させることができる。

前記第２周期は、顕微鏡のコントラストトランスファーファンクションに基づいて決定される構造化照明法が可能な長さのうち、前記解像限界の２倍と同じか、それよりも長い。

また、前記照明光学系は、前記結像光学系の倍率に合わせて前記第１周期及び第２周期を変更する照明倍率調整レンズを有する。このような構成とすることにより、対物レンズの変更のたびにアパーチャー３を交換する必要がなく、倍率の変更が容易である。

本発明に係る観察方法は、試料の試料面を、複数のスポットを含む照明光で照明する手順と、前記照明光で照明された前記試料面からの光を結像する手順と、結像された前記試料面からの光を検出して前記試料面の画像を撮像する手順と、を備え、前記照明する手順において、前記複数のスポットを、前記試料面における一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の第１周期で配置し、前記一方向と交差する他方向には、構造化照明法による観察が可能な所定の第２周期で配置する。このような構成とすることにより、空間分解能及び時間分解能を向上させることができる。

また、前記照明する手順において、前記他方向に一列に配置した複数の前記スポットを１つの行とし、前記一方向に配置した複数の前記行に対して、前記一方向に順にＮ個ずつをそれぞれ１つのグループとし、各前記グループに含まれるＮ個の各前記行に、前記一方向に順に１番目からＮ番目まで番号をつけたとき、前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置を、各前記グループにおいて一致させ、各前記グループにおける２番目からＮ番目までの前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置を、前記行の番号をＫ番目としたとき、前記１番目の前記行に配置された各前記スポットよりも、（（Ｋ−１）×第２周期／Ｎ）だけ前記他方向にシフトさせる。このような構成とすることにより、一度の走査によって、構造化照明された複数の画像を取得することができるので、画像を取得する時間を短縮し、時間分解能を向上させることができる。

さらに、前記照明する手順において、前記複数のスポットを前記一方向に走査し、前記撮像する手順において、各前記グループの前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第１画像から、各前記グループの前記Ｎ番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第Ｎ画像までのＮ個の画像を取得する。このような構成とすることにより、Ｎ行分だけ一方向に走査させればよいので、画像を取得する時間を短縮することができ、時間分解能を向上させることができる。

また、撮像した前記画像を処理する手順をさらに備え、前記処理する手順において、前記Ｎ個の各前記画像をフーリエ変換し、フーリエ変換した前記Ｎ個の各前記画像から構造化照明の空間周波数よりも高空間周波数の成分と、低空間周波数の成分を抽出し、さらに、高空間周波数の成分のみを前記他方向における構造化照明の波数ベクトル方向に（±１／第２周期）だけシフトさせたフーリエ画像を合成し、合成した前記フーリエ画像を逆フーリエ変換して実空間内の前記画像を取得する。このような構成とすることにより、解像限界を超える空間周波数成分を含む実空間画像が得られるため、空間分解能を向上させることができる。

本発明によれば、空間分解能及び時間分解能を向上させた顕微鏡を提供することができる。

実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を例示した構成図である。 実施形態に係る顕微鏡のアパーチャーを例示した図である。 実施形態に係る試料面に投影された複数のスポットを例示した図である。 （ａ）は、実施形態に係る試料面に投影された複数のスポットの強度を例示した図であり、縦軸は行方向における位置を示し、横軸は照明光の強度を示し、（ｂ）は、縞状の構造化照明を構成する縞の周期と、ＣＴＦとの関係を例示したグラフであり、横軸は空間周波数を示し、縦軸はＣＴＦを示す。 （ａ）〜（ｆ）は、実施形態に係る顕微鏡により撮像した画像を例示した図である。 （ａ）〜（ｄ）は、実施形態に係る顕微鏡により撮像した画像を例示した図である。 実施形態に係る顕微鏡の処理部が行う画像の処理を例示したフローチャート図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施形態に係るフーリエ変換した画像の情報をイメージとして例示した図であり、横軸は列方向の波数ベクトルを示し、縦軸は行方向の波数ベクトルを示す。

以下、本実施形態の具体的構成について図面を参照して説明する。以下の説明は、本発明の好適な実施の形態を示すものであって、本発明の範囲が以下の実施の形態に限定されるものではない。以下の説明において、同一の符号が付されたものは実質的に同様の内容を示している。

（実施形態）
本実施形態に係る顕微鏡の構成を説明する。
図１は、実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を例示した構成図である。図１に示すように、顕微鏡１００は、照明光学系として、光源１、コリメーションレンズ２、アパーチャー３、照明倍率調整レンズ４及び５、ビームスプリッタ７、中間レンズ８、走査ミラー９、リレーレンズ１０及び１１、対物レンズ１２を有している。照明光学系は、試料１３の試料面１３ａを照明光１５で照明するように設定されている。

また、顕微鏡１００は、結像光学系として、対物レンズ１２、リレーレンズ１０及び１１、走査ミラー９、中間レンズ８、ビームスプリッタ７を有している。結像光学系は、照明光１５で照明された試料面１３ａからの光を結像するように設定されている。さらに、顕微鏡１００は、結像された試料面１３ａからの光を検出して試料面１３ａの画像を撮像する撮像部１４と、撮像部１４が撮像した画像を処理する処理部１６とを有している。なお、顕微鏡１００には、必要に応じて、適宜、その他の光学素子を追加してもよいし、上記の光学素子のいずれかを他の光学素子と交換してもよいし、省いてもよい。

光源１は、試料１３の照明光１５となる光を生成する。光源１は、照明光１５として、例えば、白色光を生成する。光源１は、例えば、光軸１７を中心軸にして、照明光１５を射出する。光源１は、照明光１５として、レーザ光を生成してもよい。

コリメーションレンズ２は、入射した光を平行光に整形する。コリメーションレンズ２は、入射した照明光１５を平行光に整形し、整形した照明光１５をアパーチャー３に対して入射させる。

図２は、実施形態に係る顕微鏡１００のアパーチャー３を例示した図である。図１及び図２に示すように、アパーチャー３は板状の部材である。アパーチャー３は、板面を光源１に対向するように配置されている。また、アパーチャー３は、対物レンズ１２の焦点と共役な位置に配置されている。なお、共役な位置には、対物レンズ１２及びその他のレンズの収差、光学系における設計事項等を考慮して共役となった位置も含まれている。以下で示す共役な位置も同様である。

アパーチャー３には、光源１側の面３ａから光源１側の面３ａと反対側の対物レンズ１２側の面３ｂまで貫通し、照明光１５を通過させる複数の孔３３が形成されている。複数の孔３３は、例えば、光源１側の面３ａにおいて、所定の位置に配置されている。例えば、光源１側の面３ａにおいて、直交する２つの方向に所定の周期で配置されている。複数の孔３３を光源１からの光が通過することによって、複数のスポットを含む照明光１５が形成される。複数のスポットを含む照明光１５の光軸１７に直交する断面を照明パターンという。照明パターンは、試料面１３ａの観察領域全面を覆うことができる十分な大きさとなっている。

図３は、実施形態に係る試料面１３ａに投影された複数のスポットを例示した図である。図３に示すように、複数のスポット２３は、試料面１３ａに投影される。図２で示したように、アパーチャー３の個々の孔３３は、光源１側の面３ａから見て、例えば、矩形となっている。よって、試料面１３ａ上の個々のスポット２３も矩形となっている。なお、スポット２３の形状は、矩形（正方形、長方形）に限らず、円形その他の形状でもよい。

試料面１３ａにおける一方向を、行方向２４とし、一方向と交差する他方向を、列方向２５とする。例えば、行方向２４と列方向２５は直交している。複数のスポット２３は、試料面１３ａにおける行方向２４（一方向）には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の周期Ｌ_Ｒ（第１周期）で配置され、列方向２５（他方向）には、構造化照明法による観察が可能な所定の周期Ｐ_Ｃ（第２周期）で配置されている。

次に、行方向２４におけるスポット２３の周期Ｌ_Ｒ及び長さ２４ａを説明する。その後、列方向２５におけるスポット２３の周期Ｐ_Ｃ及び長さ２５ａを説明する。

共焦点顕微鏡法による観察では、試料面１３ａにおいて、焦点のあった位置のみの光を検出する。焦点以外からの反射光は、カットされ、焦点位置のみの情報が得られる。したがって、試料面１３ａの焦点位置を２次元的に操作することにより、焦点のあった位置のみの情報が得られる。これにより、コントラストのよい、クリアな画像を形成することが可能となり、分解能を向上させることができる。周期Ｌ_Ｒ（第１周期）は、共焦点顕微鏡法による観察を可能とするために十分な周期としている。

図４（ａ）は、実施形態に係る試料面１３ａに投影された複数のスポット２３の強度を例示した図であり、縦軸は行方向２４における位置を示し、横軸は照明光１５の強度を示している。

図４（ａ）に示すように、スポット２３の強度は、スポット２３の周辺部に向かって減少する。そして、スポット２３の端部で、裾を有するように、少しずつ減少しながら周辺に広がっている。共焦点顕微鏡法による観察を可能とするためには、スポット２３の強度の裾が、相互に重ならないような周期Ｌ_Ｒとする。

図３に示すように、スポット２３の行方向２４の長さ２４ａは、結像光学系の解像限界Ｒ、例えば、対物レンズ１２の解像限界Ｒと同程度の幅となっている。例えば、長さ２４ａは、解像限界Ｒと同じ長さとなっている。解像限界Ｒは、対物レンズ１２の開口数（ＮＡ）及び照明光１５の波長（λ）等に基づいて決定され、（１）式で求められる。

Ｒ＝（ｋ・λ）／ＮＡ （１）

ここで、ｋは係数である。例えば、解像限界Ｒは、２００ｎｍである。その場合には、スポット２３の行方向２４の長さ２４ａを、２００ｎｍとする。また、周期Ｌ_Ｒは、光学系の設計によって変化するが、例えば、解像限界Ｒの３倍の長さとする。

次に、スポット２３の列方向２５における周期Ｐ_Ｃ及び長さ２５ａを説明する。
図４（ｂ）は、縞状の構造化照明を構成する縞の周期Ｐ_Ｃと、コントラストトランスファーファンクション（Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ＣＴＦ）との関係を例示したグラフであり、横軸は空間周波数を示し、縦軸はＣＴＦを示している。

図４（ｂ）に示すように、縞状の構造化照明を構成する縞の周期を大きくする、すなわち、周期の逆数である空間周波数を小さくすると、ＣＴＦは大きくなる。一方、周期を小さくすると、ＣＴＦは小さくなる。周期を解像限界Ｒ（例えば、２００ｎｍ）まで小さくすると、ＣＴＦは、非常に小さくなる。解像限界Ｒを超えると、コントラストが極端に低下し観察できなくなる。

そこで、縞状の構造化照明の縞の周期としては、顕微鏡のＣＴＦに基づいて決定される構造化照明法に最適な長さとする。したがって、解像限界Ｒよりも小さい空間周波数、すなわち、解像限界Ｒよりも大きな周期を用いる。構造化照明の縞の周期は、光学系の設計によって変化するが、ＣＴＦが得られる可能な限り解像限界Ｒに近い大きさを有する周期を用いることが望ましい。したがって、例えば、スポット２３の列方向２５の周期Ｐ_Ｃを、ＣＴＦに基づいて決定される構造化照明法が可能な長さのうち、解像限界Ｒの長さ以上、例えば、解像限界Ｒの２倍と同じ長さか、それよりも長くする。

スポット２３の列方向２５の長さ２５ａは、顕微鏡のＣＴＦに基づいて決定される構造化照明法に最適な長さであり、構造化照明法が可能な長さとする。例えば、周期Ｐｃの半分の長さとなっている。したがって、スポット２３の列方向２５の長さ２５ａは、光学系の設計によって変化するが、例えば、解像限界Ｒ同じ長さか、それよりも長くなっている。

スポット２３の形状が矩形の場合において、スポット２３が列方向２５に周期的に配列した時は、矩形波とみなすことができる。また、矩形波は、正弦波の高調波成分を含んでいるとみなすことができるが、対物レンズ１２の解像限界Ｒにより、高調波成分は透過しない。よって、この場合の矩形波を正弦波とみなすことができる。または他の解釈として、矩形波は、回折効果によって、正弦波とみなすこともできるといえる。このようなことにより、試料面１３ａにおける解像限界Ｒ以下の周期を有する微細な構造に、正弦波の照明光１５を照明することにより、スポット２３の周期との差に対応した微細な構造をモアレとして観察することができる。

次に、試料面１３ａにおける複数のスポット２３の配列を説明する。
図３に示すように、列方向２５（他方向）に一列に配置した複数のスポット２３を１つの行とする。行方向２４（一方向）に配置した複数の行に対して、行方向２４に順にＮ個ずつをそれぞれ１つのグループＧとする。例えば、図３では、Ｎ＝３として、３個ずつをそれぞれ１つのグループＧとしている。そして、各グループＧに含まれるＮ個の各行（行Ａ１〜行ＡＮ）に、行方向２４に順に１番目からＮ番目まで番号をつける。例えば、図３では、各グループに含まれる３個の各行に、行方向２４に１番目から３番目まで番号をつける。

このとき、１番目の行Ａ１に配置された複数のスポット２３の列方向２５における位置は、各グループにおいて一致している。

各グループＧにおける２番目からＮ番目までの行Ａ２〜行ＡＮに配置された複数のスポット２３の列方向２５における位置は、行の番号をＫ番目としたとき、１番目の行Ａ１に配置された各スポット２３よりも、（（Ｋ−１）×周期Ｐ_Ｃ／Ｎ）だけ列方向にシフトしている。例えば、２番目の行Ａ２に配置された複数のスポット２３の列方向における位置は、１番目の行Ａ１に配置された各スポット２３よりも、（１×周期Ｐ_Ｃ／３）だけ列方向にシフトし、３番目の行Ａ３に配置された複数のスポット２３の列方向における位置は、１番目の行Ａ１に配置された各スポット２３よりも、（２×周期Ｐ_Ｃ／３）だけ列方向にシフトしている。

アパーチャー３の孔３３は、上述したように複数のスポット２３が試料面１３ａ上に配置するように形成され、対物レンズ１２の焦点と共役な位置に配置されている。

引き続き、顕微鏡１００の構成を説明する。図１に示すように、照明倍率調整レンズ４及び５は、照明パターンの倍率を調整するレンズである。複数のスポット２３を含む照明光１５は、照明倍率調整レンズ４及び５に入射することにより、照明パターンの倍率が調整される。例えば、照明倍率調整レンズ４及び５は、結像光学系の倍率に合わせて、試料面１３ａ上の複数のスポット２３の周期Ｌ_Ｒ（第１周期）及び周期Ｐ_Ｃ（第２周期）を変更する。照明倍率調整レンズ４及び５は、相互の間の距離、アパーチャー３との間の距離、倍率の異なるレンズへの交換等により、照明倍率調整レンズ４及び５に入射する照明光の倍率を調整する。

ビームスプリッタ７は、入射した光の一部を反射し、一部を透過させる。ビームスプリッタ７には、照明倍率調整レンズ４及び５により倍率が調整された照明光１５が入射する。照明光１５は、共役面６を通過した後で、ビームスプリッタ７に入射する。共役面６は、アパーチャー３の位置と共役な位置であるとともに、対物レンズ１２の焦点と共役な位置である。ビームスプリッタ７は、入射した照明光１５の一部を透過させる。また、ビームスプリッタ７は、照明された試料面１３ａからの光を反射して、撮像部１４に入射させる。

撮像部１４は、例えば、２次元イメージセンサである。撮像部１４は、共役面６と共役な位置に配置されている。よって、撮像部１４は、対物レンズ１２の焦点と共役な位置に配置されている。撮像部１４は、対物レンズ１２により集光された試料１３からの光を検出して、試料１３の画像を撮像する。なお、撮像部１４は、ＣＣＤ、カメラ等でもよい。

処理部１６は、撮像部１４が撮像した画像を処理する。処理部１６は、画像のフーリエ変換、画像の合成、画像の逆フーリエ変換等の処理を行う。

中間レンズ８は、焦点距離を調整するレンズである。中間レンズ８は、ビームスプリッタ７を透過した照明光１５の焦点距離を調整して走査ミラー９に到達させる。また、中間レンズ８は、照明された試料面１３ａからの光の焦点距離を調整してビームスプリッタ７に入射させる。

走査ミラー９は、光を走査するための鏡である。走査ミラー９は、試料面１３ａの画像を取得するために、照明光１５を試料面１３ａ上で走査させる。よって、走査ミラー９は、複数のスポット２３を試料面１３ａ上で走査する照明光走査手段となっている。走査ミラー９は、例えば、複数のスポット２３を試料面１３ａ上で一方向に走査する。また、走査ミラー９は、照明された試料面１３ａからの光を中間レンズ８及びビームスプリッタ７を介して撮像部１４に到達させる。

リレーレンズ１０及び１１は、照明光１５を対物レンズ１２まで導くレンズであるとともに、照明された試料面１３ａからの光を走査ミラー９まで導くレンズである。

対物レンズ１２は、リレーレンズ１０及び１１を透過した照明光１５を集光して、試料１３を照明する。また、対物レンズ１２は、照明された試料面１３ａからの光を集光する。対物レンズ１２は、集光した試料面１３ａからの光をリレーレンズ１０及び１１に対して入射させる。

次に、本実施形態に係る顕微鏡１００の動作として、顕微鏡１００による観察方法を説明する。

光源１により生成された照明光１５を、コリメーションレンズ２に入射させる。コリメーションレンズ２に入射した照明光１５は、コリメーションレンズ２によって、平行光線に整形され、アパーチャー３に入射する。アパーチャー３の複数の孔３３を照明光１５が通過することによって、複数のスポット２３を含む照明光１５が形成される。

複数のスポット２３を含む照明光１５は、照明倍率調節レンズ４及び５によって、倍率が調整され、ビームスプリッタ７に入射する。ビームスプリッタ７を透過した照明光１５は、中間レンズ８を介して走査ミラー９に入射する。

走査ミラー９で反射した照明光１５は、リレーレンズ１０及び１１を介して対物レンズ１２で集光され、試料１３における試料面１３ａを照明する。例えば、図３に示すように、試料面１３ａを、複数のスポット２３を含む照明光１５で照明する。

照明された試料面１３ａからの光は、対物レンズ１２、リレーレンズ１０及び１１を介して走査ミラー９に入射する。走査ミラー９で反射した光は、中間レンズ８を介して、ビームスプリッタ７で反射され、撮像部１４に入射する。

図５（ａ）〜（ｆ）及び図６（ａ）〜（ｄ）は、実施形態に係る顕微鏡１００の撮像部１４で撮像した画像を例示した図である。図５（ａ）に示すように、撮像部１４は、複数のスポット２３を含む照明光１５により照明された試料１３からの光を検出して、試料面１３ａの画像を撮像する。試料面１３ａの画像は、照明パターンに相似したパターンとなっている。

図５（ｂ）に示すように、撮像部１４は、各グループＧの各１番目の行Ａ１の画像を撮像して第１画像Ｉ１を取得する。同様に、撮像部１４は、各グループＧの各２番目の行Ａ２の画像を撮像して第２画像（図示せず）を取得し、各グループＧの各Ｎ番目の行ＡＮの画像を撮像して第Ｎ画像（図示せず）を取得する。

次に、図５（ｃ）に示すように、走査ミラー９を駆動させて、複数のスポット２３を含む照明光１５を行方向２４に走査する。例えば、走査ミラー９をスポット２３の長さ２４ａだけ行方向に走査する。

図５（ｄ）に示すように、撮像部１４は、各グループＧの各１番目の行Ａ１の画像を撮像し、この画像データを第１画像Ｉ１に付加する。同様に、撮像部１４は、各グループＧの各２番目の行Ａ２の画像を撮像し、この画像データを第２画像（図示せず）に付加する。各グループＧの各Ｎ番目の行ＡＮの画像を撮像し、この画像データを第Ｎ画像（図示せず）に付加する。

次に、図５（ｅ）に示すように、走査ミラー９を駆動させて、複数のスポット２３を含む照明光１５を行方向２４に走査する。例えば、走査ミラー９をスポット２３の長さ２４ａだけ行方向に走査する。

図５（ｆ）に示すように、撮像部１４は、各グループＧの各１番目の行Ａ１の画像を撮像し、この画像データを第１画像Ｉ１に付加する。同様に、撮像部１４は、各グループＧの各２番目の行Ａ２の画像を撮像し、この画像データを第２画像（図示せず）に付加する。各グループＧの各Ｎ番目の行ＡＮの画像を撮像し、この画像データを第Ｎ画像（図示せず）に付加する。

図６（ａ）に示すように、走査ミラー９を駆動させることにより、複数のスポット２３を含む照明光１５を行方向に、１グループＧ分の長さだけ走査させる。これにより、図６（ｂ）〜（ｄ）に示すように、撮像部１４は、各グループＧの各１番目の行Ａ１に配置された複数のスポット２３を走査させた第１画像Ｉ１から、各グループＧのＮ番目の行ＡＮに配置された複数のスポット２３を走査させた第Ｎ画像ＩＮまでのＮ個の画像を取得する。なお、試料面１３ａにおいて、第１画像Ｉ１から第Ｎ画像ＩＮは、行方向に周期Ｌ_Ｒの所定の倍数だけ相互にずれが生じ、列方向に周期（Ｐ_Ｃ／Ｎ）の所定の倍数だけ相互にずれが生じているため、試料面１３ａにおける観察領域は、第１画像Ｉ１〜第Ｎ画像ＩＮの重なった部分に含まれるようにする。

図７は、実施形態に係る顕微鏡１００の処理部が行う画像の処理を例示したフローチャート図である。図８（ａ）及び（ｂ）は、実施形態に係るフーリエ変換した画像の情報をイメージして例示した図であり、横軸Ｋ_Ｘは列方向２５の波数ベクトルを示し、縦軸Ｋ_Ｙは行方向２４の波数ベクトルを示す。

図７のステップＳ１に示すように、処理部１６は、撮像部１４から、Ｎ個の構造化照明画像を取得する。Ｎ個の構造化照明画像は、具体的には、第１画像Ｉ１から第Ｎ画像ＩＮである。例えば、図６（ｂ）〜（ｄ）の第１画像Ｉ１から第３画像Ｉ３の３個の画像である。

次に、ステップＳ２に示すように、処理部１６は、Ｎ個の各画像をフーリエ変換する。具体的には、第１画像Ｉ１から第３画像Ｉ３までをフーリエ変換し、第１逆空間画像から第３逆空間画像までを取得する。

ステップＳ２で得られた逆空間画像には、図８（ａ）に示すように、横軸Ｋ_Ｘにおいて、空間周波数１／Ｐ_Ｃからその２倍（２／Ｐ_Ｃ）までの情報と、−１／Ｐ_Ｃから（−２／Ｐ_Ｃ）までの情報とを含む高空間周波数成分が、横軸Ｋ_Ｘ＝０から１／Ｒまでの情報を含む低空間周波数成分に重なるように含まれている。なお、図８（ａ）において、横軸Ｋ_Ｘ方向は、他方向における波数ベクトル方向であり、構造化照明法による観察によって高分解能化される方向である。

ステップＳ３に示すように、ステップＳ２で得られたＮ個のフーリエ変換した画像から、構造化照明の空間周波数よりも高空間周波数の成分と、構造化照明の空間周波数よりも低空間周波数の成分とを抽出する。具体的には、横軸Ｋ_Ｘ＝０から１／Ｒまでの情報と、空間周波数１／Ｐ_Ｃから２／Ｐ_Ｃまでの情報、および、−１／Ｐ_Ｃから（−２／Ｐ_Ｃ）までの情報を分離して抽出する。

次に、ステップＳ４に示すように、ステップＳ３で抽出した空間周波数１／Ｐ_Ｃから２／Ｐ_Ｃまでの情報、および、−１／Ｐ_Ｃから（−２／Ｐ_Ｃ）までの情報を含む高空間周波数成分のみを、他方向における構造化照明の波数ベクトル方向（横軸Ｋ_Ｘ）に（±１／周期Ｐ_Ｃ）だけシフトさせる。すなわち、空間周波数1／Ｐ_Ｃから２／Ｐ_Ｃまでの情報は、横軸Ｋ_Ｘの＋方向に１／Ｐ_Ｃだけシフトさせ、−１／Ｐ_Ｃから（−２／Ｐ_Ｃ）までの情報は横軸Ｋ_Ｘの−方向に１／Ｐ_Ｃだけシフトさせる。そうすると、図８（ｂ）に示すように、高空間周波数成分の情報は、横軸Ｋ_Ｘにおいて、±１／Ｐ_Ｃだけシフトする。

これにより、ステップＳ５に示すように、逆フーリエ変換した時に、実空間で最大２倍の分解能を示す高空間分解能画像とすることができる（ステップＳ６）。

次に、本実施形態に係る顕微鏡１００及び観察方法の効果を説明する。
本実施形態の顕微鏡１００は、試料面１３ａにおける一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能であり、他方向には、構造化照明法による観察が可能である。これにより、空間分解能を向上させることができる。

これに対して、例えば、他方向に延びた一本の線状の光を、他方向と直交する一方向に走査させる方法で観察した場合には、一方向には共焦点顕微鏡法による観察となるが、他方向には共焦点顕微鏡法による観察とならないので空間分解能を向上させることができない。

また、特許文献６に記載された構造化照明法による観察では、縞が延びる方向と垂直な方向にだけ構造化照明されるので、この方向のみ分解能が向上する。したがって、特許文献６の方法では、２次元上で１２０度の角度で変化させた３方向で撮像している。また、縞と縞との間の照明されない部分の情報を得ることができないので、縞状のパターンをずらした、例えば、３個の画像を取得している。よって、特許文献６では、少なくとも、９個の画像の情報を必要とする。さらに、各３方向においてフーリエ変換による処理を必要としている。このように、特許文献６の方法では、時間分解能を向上させることができない。

一方、本実施形態では、行方向には、共焦点顕微鏡法による観察によって高分解能化しているので、列方向２５に照明パターンをずらした例えば３個の画像の情報を取得すればよい。よって、空間分解能及び時間分解能を向上させることができる。

また、本実施形態の顕微鏡１００は、他方向に一列に配置した複数のスポットを１つの行とし、一方向に配置した複数の行のＮ個ずつを１つのグループＧとしている。そして、各グループＧに含まれる各行を少しずつずらして配置させている。これにより、一度の走査によって、構造化照明された試料面１３ａの複数の画像を取得することができる。画像を取得する時間を短縮することができ、時間分解能を向上させることができる。

さらに、複数のスポット２３は、Ｎ行分だけ一方向に走査されればよいので、走査させる長さを短くすることができる。これにより、画像を取得する時間を短縮することができ、時間分解能を向上させることができる。

複数の孔３３が形成されたアパーチャー３により、複数のスポット２３を形成している。そして、アパーチャー３を対物レンズ１２の焦点と共役な位置に配置させている。よって、共焦点顕微鏡による観察が可能になり、空間分解能を向上させることができる。

顕微鏡１００は、結像光学系の倍率に合わせて周期Ｌ_Ｒ及び周期Ｐ_Ｃを変更する照明倍率調整レンズ４及び５を有している。複数のスポット２３を形成するアパーチャー３の孔３３の配列周期は、使用する対物レンズ１２に合わせて、本来は、変更する必要があるが、顕微鏡１００では、照明倍率調整レンズ４及び５を有しているので、対物レンズ１２の変更のたびにアパーチャー３を交換する必要がなく、倍率の変更を容易にすることができる。

試料面１３ａ上における一方向及び他方向のスポットの長さを、解像限界Ｒと同じ長さとすることにより、構造化照明法による観察及び共焦点顕微鏡法による観察を高分解能とすることができる。

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明はその目的と利点を損なうことのない適宜の変形を含み、更に、上記の実施形態よる限定は受けない。

１ 光源
２ コリメーションレンズ
３ アパーチャー
３ａ、３ｂ 面
４、５ 照明倍率調節レンズ
６ 共役面
７ ビームスプリッタ
８ 中間レンズ
９ 走査ミラー
１０、１１ リレーレンズ
１２ 対物レンズ
１３ 試料
１３ａ 試料面
１４ 撮像部
１５ 照明光
１６ 処理部
１７ 光軸
２３ スポット
２４ 行方向（一方向）
２４ａ 長さ
２５ 列方向（他方向）
２５ａ 長さ
３３ 孔
１００ 顕微鏡
Ｌ_Ｒ 周期
Ｐ_Ｃ 周期
Ｒ 解像限界

Claims (12)

1. 試料の試料面を、複数のスポットを含む照明光で照明する照明光学系と、
   前記照明光で照明された前記試料面からの光を結像する結像光学系と、
   結像された前記試料面からの光を検出して前記試料面の画像を撮像する撮像部と、
   を備え、
   前記複数のスポットは、
   前記試料面における一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の第１周期で配置され、
   前記一方向と交差する他方向には、構造化照明法による観察が可能な所定の第２周期で配置された顕微鏡。
2. 前記他方向に一列に配置した複数の前記スポットを１つの行とし、前記一方向に配置した複数の前記行に対して、前記一方向に順にＮ個ずつをそれぞれ１つのグループとし、各前記グループに含まれるＮ個の各前記行に、前記一方向に順に１番目からＮ番目まで番号をつけたとき、
   前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置は、各前記グループにおいて一致し、
   各前記グループにおける２番目からＮ番目までの前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置は、前記行の番号をＫ番目としたとき、前記１番目の前記行に配置された各前記スポットよりも、（（Ｋ−１）×第２周期／Ｎ）だけ前記他方向にシフトした、
   請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記照明光学系は、前記複数のスポットを走査する照明光走査手段を有し、
   前記照明光走査手段は、
   前記複数のスポットを前記一方向に走査し、
   前記撮像部は、
   各前記グループの前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第１画像から、各前記グループの前記Ｎ番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第Ｎ画像までのＮ個の画像を取得する、
   請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記撮像部が撮像した前記画像を処理する処理部をさらに備え、
   前記処理部は、
   前記Ｎ個の各前記画像をフーリエ変換し、フーリエ変換した前記Ｎ個の各前記画像から、構造化照明の空間周波数よりも高空間周波数の成分と、低空間周波数の成分とを抽出し、前記高空間周波数の成分のみを前記他方向における前記構造化照明の波数ベクトル方向に（±１／第２周期）だけシフトさせたフーリエ画像を合成し、合成した前記フーリエ画像を逆フーリエ変換して実空間内の前記画像を取得する、
   請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記結像光学系は、照明された前記試料面からの光を集光する対物レンズを有し、
   前記照明光学系は、前記対物レンズの焦点と共役な位置に配置されたアパーチャーを有し、
   前記アパーチャーには複数の孔が形成され、前記複数の孔を光源からの光が通過することによって、前記複数のスポットを含む照明光が形成される、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
6. 各前記スポットの前記一方向の長さは、前記対物レンズの開口数及び前記照明光の波長に基づいて決定される解像限界と同じ長さであり、各前記スポットの前記他方向の長さは、コントラストトランスファーファンクションに基づいて決定される構造化照明法が可能な長さである、
   請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記第２周期は、コントラストトランスファーファンクションに基づいて決定される構造化照明法が可能な長さのうち、前記解像限界の２倍と同じ長さか、それよりも長い、
   請求項６に記載の顕微鏡。
8. 前記照明光学系は、前記結像光学系の倍率に合わせて前記第１周期及び第２周期を変更する照明倍率調整レンズを有する、
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
9. 試料の試料面を、複数のスポットを含む照明光で照明する手順と、
   前記照明光で照明された前記試料面からの光を結像する手順と、
   結像された前記試料面からの光を検出して前記試料面の画像を撮像する手順と、
   を備え、
   前記照明する手順において、前記複数のスポットを、
   前記試料面における一方向には、共焦点顕微鏡法による観察が可能な所定の第１周期で配置し、
   前記一方向と交差する他方向には、構造化照明法による観察が可能な所定の第２周期で配置する観察方法。
10. 前記照明する手順において、
    前記他方向に一列に配置した複数の前記スポットを１つの行とし、前記一方向に配置した複数の前記行に対して、前記一方向に順にＮ個ずつをそれぞれ１つのグループとし、各前記グループに含まれるＮ個の各前記行に、前記一方向に順に１番目からＮ番目まで番号をつけたとき、
    前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置を、各前記グループにおいて一致させ、
    各前記グループにおける２番目からＮ番目までの前記行に配置された複数の前記スポットの前記他方向における位置を、前記行の番号をＫ番目としたとき、前記１番目の前記行に配置された各前記スポットよりも、（（Ｋ−１）×第２周期／Ｎ）だけ前記他方向にシフトさせた、
    請求項９に記載の観察方法。
11. 前記照明する手順において、
    前記複数のスポットを前記一方向に走査し、
    前記撮像する手順において、
    各前記グループの前記１番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第１画像から、各前記グループの前記Ｎ番目の前記行に配置された複数の前記スポットを走査させた第Ｎ画像までのＮ個の画像を取得する、
    請求項１０に記載の観察方法。
12. 撮像した前記画像を処理する手順をさらに備え、
    前記処理する手順において、
    前記Ｎ個の各前記画像をフーリエ変換し、フーリエ変換した前記Ｎ個の各前記画像から構造化照明の空間周波数よりも高空間周波数の成分と、低空間周波数の成分とを抽出し、前記高空間周波数の成分のみを前記他方向における前記構造化照明の波数ベクトル方向に（±１／第２周期）だけシフトさせたフーリエ画像を合成し、合成した前記フーリエ画像を逆フーリエ変換して実空間内の前記画像を取得する、
    請求項１１に記載の観察方法。

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