JP2014010216A - 多焦点共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】光学系の走査を不要とする、多焦点化した共焦点顕微鏡の提供。
【解決手段】光源３からの光は回折素子５を利用してスポットアレイ状光源に変換されており、ピンホールがマトリックス状に二次元配列されたピンホール板９、２３を配設して共焦点光学系が構成されている。ラマン分光の検出用には、この共焦点光学系の出射側に配列変換手段としてのバンドルファイバー２７が配設されており、このバンドルファイバー２７を通すことでピンホール板２３のピンホール２５に対応した三次元情報が二次元情報となって出てくることになり、このバンドルファイバー２７から出てきたラマン散乱光は回折格子２９で分散され、ＣＣＤカメラ３１上にその分散スペクトルが結像される。ＣＣＤカメラ３１はその分散スペクトルからラマン分光イメージを形成する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、化学、物理学、医学、薬学等の様々な分野で、物質の組成や構造の解析に広く利用されている、共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点タイプの顕微鏡は、生体標本等の試料上の一点に集光するように点光源から光が照射され、その反射光が点光源及び試料上の集光点と共役的に配されたピンホール上に集光され、そのピンホールを通過した光のみが検出されるようになっており、焦点の有ったコントラストの良い、鮮明なイメージを取得することが可能となっている。
共焦点タイプの顕微鏡は、上記した構成上、単焦点になっているので、試料を二次元的に観察・測定をしたい場合に対応して、試料上で集光点を走査できるよう、特許文献１に示すような、スキャナユニットが設けられている。

特開２００６−３４３６０６号公報

而して、試料上で集光点を走査して逐次イメージング化していくとなると、時間が掛かることになる。また、スキャナユニットの振動による影響を受け易い。点光源に代えてライン光源を用いれば、一次元のスキャンで済むが、ライン光源を効率良く作り出す手段は未だ無いので、光の利用効率が落ちる。
更に、スキャナユニットの分だけ顕微鏡の構成部材が増えて、構造が複雑化し、装置サイズが大型化すると共に、製作コストの高騰を招く。
特に、ラマン分光のイメージ取得を目的とするラマン分光に利用しようとすると、ラマン散乱光は、信号強度が微弱なので、ラマン分光のイメージング化に多大な時間が掛かる上に、振動影響も深刻なものとなる。

本発明は、上記した課題を解決するものであり、点光源が二次元に配列された光源を利用した共焦点光学系を構築して、一度に試料上の複数位置でのイメージの取得を可能とする、多焦点共焦点顕微鏡を提供することを、その目的とする。
また、本発明は、反射光、透過光、散乱光等の観察光をファイバーで伝送した上で検出する系、その中でも信号強度の弱いラマン散乱光を検出系で有効な、多焦点共焦点顕微鏡を提供することを、その目的とする。

上記課題を達成するために、請求項１の発明は、二次元配列されたスポットアレイ状光源を有し、前記光源からの光が試料上の前記光源と略共役な位置に照射される照明光学系と、前記試料からの観察光を前記試料上の集光位置及び前記スポットアレイ状光源と略共役な位置に二次元配列されたピンホールアレイに結像する結像光学系と、前記結像した光を検出する検出手段と、を備えたことを特徴とする多焦点共焦点顕微鏡である。

請求項２の発明は、請求項１に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、検出手段は、二次元配列された観察光の光束を一次元配列に変換するバンドルファイバーと、前記一次元配列された光束を分光する分光手段と、前記分光された光束を受光する二次元受光手段と、を備えたことを特徴とする顕微鏡である。

請求項３の発明は、請求項２に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、二次元方向に移動可能な試料ステージを備え、ピンホールアレイのピンホール径φが以下の式に従う回折限界スポットより小さく設定されており、前記試料ステージの移動によりスキャン及び／またはステップしながらの試料の観察・測定が可能になっていることを特徴とする顕微鏡である。

λ：波長、ＮＡ：開口数

請求項４の発明は、請求項２または３に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、二次元方向に移動可能な試料ステージを備え、ピンホールアレイのピンホールのピッチ（pitch）が以下の式に従って設定されており、前記試料ステージの移動によりスキャン及び／またはステップしながらの試料の観察・測定が可能になっていることを特徴とする顕微鏡である。

tclad：ファイバーのクラッドの厚み、
Perror（max）：バンドルファイバーのPitch誤差

請求項５の発明は、請求項３または４に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、相対的なｍ次スキャン方向とｎ列ピンホール列との傾き角度θが、以下の式に従って設定されていることを特徴とする顕微鏡である。

（ｍ＝１、２、３‥‥の自然数）

請求項６の発明は、請求項１から５のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、スポットアレイ状光源は、光源と、前記光源からの光を二次元的に複数特定方向に偏向させる回折素子と、前記二次元的に複数特定方向に偏向された光を二次元配列されたスポットアレイに集光する集光光学系とにより構成されていることを特徴とする顕微鏡である。

請求項７の発明は、請求項１から５のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、スポットアレイ状光源は、光源と、前記光源からの光を二次元配列させるマイクロレンズアレイにより構成されていることを特徴とする顕微鏡である。

請求項８の発明は、請求項１から７のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、ラマン分光の検出用であることを特徴とする顕微鏡である。

本発明の多焦点共焦点顕微鏡によれば、一度に試料の多数位置で共焦点効果を伴ったイメージが取得でき、スキャナユニットによる走査が不要となっている。
従って、作業時間が短縮化され、顕微鏡全体の構造が単純化し、サイズがコンパクトになり、顕微鏡の製作コストも抑えられている。

本発明の第１の実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の光学系構成図である。 図１のピンホールアレイのピッチとピンホール径の設定指針の説明図である。 ピンホールアレイとファイバーピッチとの関係との説明図である。 図２のピンホールアレイに対応したスキャン動作方法の説明図である。 本発明の第２の実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の光学系構成図である。

本発明の第１の実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡１の構成を、図１に従って説明する。
先ず、共焦点光学系について説明する。
符号３は光源を示し、この光源３は励起光を発するレーザ光源になっている。符号５は回折素子を示し、この回折素子５に光源３からの励起光が入射すると、二次元的に複数の特定方向に偏向される。
符号７は集光レンズを、符号９は複数のピンホールがマトリックス状に二次元配列されたピンホール板をそれぞれ示す。集光レンズ７は回折素子５で偏向された光をピンホール板９のピンホール上に集光させる。光源３、回折素子５、集光レンズ７、及びピンホール板９によって、スポットアレイ状光源が構成されており、光源３からの光がピンホール板９を通過すると、図１のイメージ図に示すように、ピンホール数に対応した複数の光束に変わっている。

符号１１はコリメートレンズを、符号１３は第１分離手段としてのダイクロイックミラー（またはエッジフィルター）を、符号１５は対物レンズをそれぞれ示す。ピンホール板９を通過した複数の光束はそれぞれコリメートレンズ１１を通過してコリメートされ、ダイクロイックミラー１３に入射すると反射されて方向が変更される。この反射された複数の光束がそれぞれ照明光として対物レンズ１５に入射する。対物レンズ１５は入射した複数の光束を試料Ｓの表面上の複数の位置にそれぞれ集光させる。試料Ｓ上の複数の集光点はピンホール板９の複数のピンホールに１対１で対応している。
上記した光源３から試料Ｓに至る光路に配設されたもので、照明光学系が構成されている。

試料Ｓは試料ステージ１７上に載置されている。この試料ステージ１７は電動ＸＹ試料ステージで構成されており、スキャン動作やステップ動作が可能となっている。

符号１９は第２分離手段としてのハーフミラー（またはダイクロイックミラー）を、符号２１は集光レンズをそれぞれ示す。符号２３はピンホール板を示し、このピンホール板２３には複数のピンホール２５がマトリックス状に二次元配列されている。ピンホール２５は上記したピンホール板９のピンホール及び試料Ｓ上の複数の集光点と略共役な関係を満たす位置に設けられており、ピンホール２５が共焦点絞り用のピンホールアレイとしての役割を担っている。
試料Ｓからは観察光として複数の光束が反射されてくると、これらの光束は、それぞれ同じ光路を戻り、対物レンズ１５を通過してエッジフィルター１３に至ると、このエッジフィルター１３でラマン散乱光が透過される。透過されたラマン散乱光はハーフミラー１９で一部が反射され、この反射された分のラマン散乱光が集光レンズ２１に入射する。集光レンズ２１はこの入射した散乱光を、ピンホール板２３のピンホール２５上に集光させる。

ピンホール板２３の各ピンホール２５を通過した観察光の光束には焦点以外の光がカットされて共焦点効果が得られるようになっている。
上記した試料Ｓからピンホール板２３に至る光路に配設されたもので、結像光学系が構成されている。
そして、上記した照明光学系と結像光学系は共焦点光学系となっている。

次に、ラマン分光の観察光学系の構成について説明する。
符号２７はバンドルファイバーを示し、図１のイメージ図に示すように、このバンドルファイバー２７の一端側は二次元配列され、他端側が一次元配列されており、一端側が入射側に、他端側が出射側を向いている。
符号２９は分光手段としての回折格子を、符号３１は二次元受光手段としてのＣＣＤカメラをそれぞれ示す。

バンドルファイバー２７の一端側にピンホール板２３の各ピンホール２５を通過したラマン散乱光の光束が入射して、他端側から出射すると、三次元情報（二次元位置情報とスペクトル情報）が二次元情報（一次元位置情報とスペクトル情報）に変換されて出射することになる。このバンドルファイバー２７から出てきたラマン散乱光は回折格子２９で分散され、ＣＣＤカメラ３１上にその分散スペクトルが結像される。ＣＣＤカメラ３１はその分散スペクトルからラマン分光イメージを形成する。
上記したバンドルファイバー２７からＣＣＤカメラ３１に至る光路に配設されたもので、ラマン分光の観察光学系が構成されている。

なお、この顕微鏡１には、上記と別の結像光学系も構成されている。符号３３は結像レンズを、符号３５は観察窓を示す。この観察光学系では、ハーフミラー１９から透過された透過光を、結像レンズ３３が観察窓３５上に結像する。

次に、ピンホール板２３のピンホール２５の設計指針について、図２、図３に従って説明する。
ピンホールアレイのピンホール径φが以下の式に従って設定されている。

λ：波長、ＮＡ：開口数
ピンホール２５のピッチ（pitch）は、以下の式に従って設定されている。

tclad：ファイバーのクラッドの厚み、
Perror(max)：バンドルファイバーのPitch誤差
なお、Perror(max)は、各ファイバー、この実施の形態では、９つのファイバーについて誤差を計測し、その中の最大値を示す。図３では左側の中段に位置するファイバーにPerror(max)が出ている。

この実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡１は、上記指針で設定されているので、ピンホール２５どうしが十分に離れており、クロストークフリーな分光イメージの作成が可能となっている。また、ピンホール径が十分に小さいので、図３に示すように、バンドルファイバー２７に入射する光束群ｒとファイバーコアｃにピッチ誤差が生じても、各光束群ｒは各ファイバーコアｃ内に収まって入射するので、分解能の低下が起きないようになっている。

試料Ｓ上の焦点イメージは、図４のようになっている。
上記のようにピンホール板２３を設定すると、各焦点イメージは離間して、ラマン分光イメージが離散したものとなるが、ＸＹ試料ステージ１７を動かして試料Ｓに対して光学系を相対的にスキャンまたはステップ動作させ、ラマン分光イメージを合成することで試料Ｓの隙間無いラマン分光イメージを作り出せる。上記したスキャンやステップの動作は、光学系を動かすわけではないので、ラマン分光に振動の影響は与えない。

スキャンする場合には、相対的なｍ次スキャン方向とｎ列ピンホール列との傾き角度θを、以下の式に従って設定して、光学系を相対的走査させる。

（ｍ＝１、２、３‥‥の自然数）
傾き角度θを以下の式に従って設定し、光学系を相対的走査させることで効率良く短時間に作業を進めることができる。

ステップの場合には、ステップ幅ｋを以下の式に従って設定し、光学系を相対的に走査させることで効率良く短時間に作業を進めることができる。

次に、本発明の第２の実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡４１の構成を、図５に従って説明する。
第１の実施の形態に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡１と同じ構成部分は同じ符号を付すことで説明を省略する。
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡４１では、照明光学系に、エクスパンダー４３、マイクロレンズアレイ４５が配設されており、このマイクロレンズアレイ４５はピンホール板９のピンホールと共役的に配置されている。
光源３からの光がエクスパンダー４３に入射して拡大されることで、戻り光の危険が回避されている。そして、エクスパンダー４３からの拡大された光がマイクロレンズアイレ４５で分割されて複数の束になっている。マイクロレンズアレイ４５は共役的に配置されている。マイクロレンズアレイ４５で集光された光束がピンホール板９に向かうことになるので、光損失が少なくなっている。

以上、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の具体的構成は上記の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨から外れない範囲での設計変更があっても本発明に含まれる。
いずれにしても、特許請求されている事項を除いては、従来からあるまたは将来案出される光学系を任意に組み合わせることができる。

１‥‥多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡（第１の実施の形態）
３‥‥光源 ５‥‥回折素子
７‥‥集光レンズ ９‥‥ピンホール板
１１‥‥コリメートレンズ １３‥‥ダイクロイックミラー
１５‥‥対物レンズ １７‥‥試料ステージ
１９‥‥ハーフミラー ２１‥‥集光レンズ
２３‥‥ピンホール板 ２５‥‥ピンホール
２７‥‥バンドルファイバー ２９‥‥回折格子
３１‥‥ＣＣＤカメラ ３３‥‥結像レンズ
３５‥‥観察窓
４１‥‥多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡（第２の実施の形態）
４３‥‥エクスパンダー ４５‥‥マイクロレンズアレイ

Claims (8)

1. 二次元配列されたスポットアレイ状光源を有し、前記光源からの光が試料上の前記光源と略共役な位置に照射される照明光学系と、
   前記試料からの観察光を前記試料上の集光位置及び前記スポットアレイ状光源と略共役な位置に二次元配列されたピンホールアレイに結像する結像光学系と、
   前記結像した光を検出する検出手段と、
   を備えたことを特徴とする多焦点共焦点顕微鏡。
2. 請求項１に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   検出手段は、
   二次元配列された観察光の光束を一次元配列に変換するバンドルファイバーと、
   前記一次元配列された光束を分光する分光手段と、
   前記分光された光束を受光する二次元受光手段と、
   を備えたことを特徴とする顕微鏡。
3. 請求項２に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   二次元方向に移動可能な試料ステージを備え、
   ピンホールアレイのピンホール径φが以下の式に従う回折限界スポットより小さく設定されており、
   前記試料ステージの移動によりスキャン及び／またはステップしながらの試料の観察・測定が可能になっていることを特徴とする顕微鏡。
   

   

   λ：波長、ＮＡ：開口数
4. 請求項２または３に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   二次元方向に移動可能な試料ステージを備え、
   ピンホールアレイのピンホールのピッチ（pitch）が以下の式に従って設定されており、
   前記試料ステージの移動によりスキャン及び／またはステップしながらの試料の観察・測定が可能になっていることを特徴とする顕微鏡。
   

   

   tclad：ファイバーのクラッドの厚み、
   Perror(max)：バンドルファイバーのPitch誤差
5. 請求項３または４に記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   相対的なｍ次スキャン方向とｎ列ピンホール列との傾き角度θが、以下の式に従って設定されていることを特徴とする顕微鏡。
   

   

   （ｍ＝１、２、３‥‥の自然数）
6. 請求項１から５のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   スポットアレイ状光源は、光源と、前記光源からの光を二次元的に複数特定方向に偏向させる回折素子と、前記二次元的に複数特定方向に偏向された光を二次元配列されたスポットアレイに集光する集光光学系とにより構成されていることを特徴とする顕微鏡。
7. 請求項１から５のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   スポットアレイ状光源は、光源と、前記光源からの光を二次元配列させるマイクロレンズアレイにより構成されていることを特徴とする顕微鏡。
8. 請求項１から７のいずれかに記載した多焦点共焦点顕微鏡において、
   ラマン分光の検出用であることを特徴とする顕微鏡。

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