WO2019065271A1 - 共焦点顕微鏡及び画像化システム - Google Patents

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light
confocal microscope
wavelength
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丈夫 南川
栄治 長谷
周治 宮本
安井　武史
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国立大学法人徳島大学
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Definitions

  • the present invention relates to non-scanning (scanless) confocal microscopes and imaging systems.
  • CCM Confocal Laser Microscope
  • the light source pinhole, the sample focus, and the detection pinhole need to be conjugate, so they are based on point measurement. Therefore, in order to obtain a two-dimensional image, it is necessary to mechanically scan the focal spot two-dimensionally.
  • Mechanical scanning mechanisms such as galvano mirrors, polygon mirrors, and MEMS mirrors have generally been used for high-speed imaging, but the frame rate has remained at about several tens per second.
  • Non-Patent Document 3 As one approach for omitting mechanical scanning, there is a line focusing CLM (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • laser light that has passed through a light source pinhole is line-condensed on a sample.
  • a confocal slit is placed at a position conjugate to the line focus position, and the reflected light (or transmitted light) from the sample is passed to give a confocal effect, and finally a confocal line image is formed by the line image sensor. Is detected.
  • a one-dimensional mechanical scan in the orthogonal direction to the confocal slit is required.
  • Non-Patent Document 4 As another approach for omitting mechanical scanning, there is a method using wavelength / space conversion (see, for example, Non-Patent Document 4).
  • a broad band laser beam is expanded in one dimension by a diffraction grating and condensed by an objective lens to generate an iridescent line beam on a sample.
  • the reflected light (or transmitted light) from the sample propagates in the reverse direction of the same path as the forward path, thereby performing reverse conversion of the wavelength / space conversion, and the respective wavelength components spatially overlap to be one beam again.
  • one-dimensional image information on a sample is superimposed on a spectrum, so that a line image can be acquired without a scan by measuring the spectrum waveform with a multi-channel spectrometer.
  • one-dimensional mechanical scanning in the direction orthogonal to the iridescent line beam is required for two-dimensional image acquisition.
  • the one-dimensional image information (vertical direction) of the line-condensing CLM (vertical direction) and the spectral information (horizontal direction) of wavelength / space conversion are orthogonal, and acquired as a spectral line image with a multichannel spectroscope Will enable two-dimensional imaging without scanning.
  • spectral information can not be obtained because one wavelength is associated with one spatial position by wavelength / space conversion like a diffraction grating.
  • An object of the present invention is to solve the above problems and to provide a confocal microscope capable of two-dimensional imaging without a scan while acquiring spectral information and an imaging system using the same.
  • the confocal microscope is The light from the light source is wavelength- and space-converted by passing it multiple times, and is irradiated to the subject via the objective lens, and the reflected light from the subject is received via the objective lens and multiple-reflected A first VIPA assembly for wavelength conversion A second VIPA assembly for wavelength / space conversion and passing through multiple reflection of reflected light from the first VIPA assembly; It further comprises: a two-dimensional image sensor having a line condensing direction and a spatial direction after wavelength / space conversion, and an imaging means for imaging the reflected light from the second VIPA assembly.
  • the confocal microscope of the present invention it is possible to provide a confocal microscope capable of two-dimensional imaging without a scan and an imaging system using the same while acquiring spectral information.
  • FIG. 3 is a block diagram showing a detailed configuration of a VIPA (Virtually Imaged Phased Array) assembly 8 of FIG. 1 and FIG. 2; It is a graph which shows the depth resolution of the confocal microscope of FIG.1 and FIG.2. It is a photographic image which shows the longitudinal spatial resolution of the 1st reflective image among the reflective images of a test chart in a different arrangement position. It is a photographic image which shows the longitudinal spatial resolution of the 2nd reflective image among the reflective images of a test chart in a different arrangement position.
  • VIPA Virtual Imaged Phased Array
  • FIG. 1 is a block diagram showing the operation principle of a confocal microscope according to an embodiment of the present invention.
  • an assembly of a “virtually imaged phased array (hereinafter referred to as VIPA (Virtually Imaged Phased Array)) capable of making a plurality of discrete wavelength information correspond to one spatial position.
  • VIPA assembly a confocal laser microscope capable of two-dimensional imaging without scan can be provided while acquiring spectral information.
  • the imaging camera 10 has a two-dimensional image sensor 10A having a line condensing direction (X-axis direction) orthogonal to each other and a spatial direction (Y-axis direction) after wavelength / space conversion.
  • a plurality of image information in the spatial direction after wavelength / space conversion in the Y axis direction is obtained by the flat surface of the glass parallel flat plate 81 being slightly inclined (for example, 5 to 15 degrees) from the Y axis direction. It is provided so as to have (see virtual image 21 in FIG. 3). Provided.
  • FIG. 3 is a block diagram showing a detailed configuration of the VIPA (Virtually Imaged Phased Array) assembly 8 of FIG. 1 and FIG.
  • the VIPA assembly 8 is a known optical assembly and has a low reflection film (even a non-reflection film, for example, having a reflectance of 0) on the light incident surface which is the first surface of the glass parallel plate 81 having a thickness t. Well or preferably 10% or less) may be coated with a highly reflective film 8b having a reflectance of 100% while the reflectance of the second surface, that is, the output surface of light, may be covered.
  • a coating of 95% or more of the semitransparent film 8c is configured (see, for example, Patent Document 2).
  • the VIPA assembly 3 shown in FIGS. 1 and 2 has the same configuration as the VIPA assembly 8 and includes a low reflection film 3a and a high reflection film 3b on the wavelength region side and a semitransparent film 3c on the space area side.
  • FIGS. 1 and 3 light linearly condensed by the cylindrical lens 7 is incident on the VIPA assembly 8 through a low reflection film 8a formed on the high reflection film 8b side and adjacent to the high reflection film 8b.
  • the light incident on the VIPA assembly 8 is subjected to wavelength / space conversion by repeating multiple reflection while outputting part of the light from the semitransparent film 8c by the highly reflective film 8b and the semitransparent film 8c.
  • Interference of light output from the semitransparent film 8c provides a comb-like spectrum having a wavelength interval FSR (Free Spectral Range).
  • FSR Free Spectral Range
  • the VIPA assemblies 3 and 8 spatial information can be read as a wavelength by correlating space with a wavelength, as in the conventional method using wavelength / space conversion.
  • the wavelength corresponding to one space information becomes the entire comb-like spectrum of the FSR interval. That is, when the wavelength resolution required for confocal imaging is sufficiently lower than FSR, spectral information can also be acquired simultaneously.
  • the confocality (high depth resolution, stray light removal ability, etc.) in the present embodiment can be provided by the VIPA assemblies 3 and 8.
  • the confocality high depth resolution, stray light removal ability, etc.
  • FIG. 1 and FIG. 3 light condensed in space by the above-mentioned method follows a similar optical path by being scattered and reflected, and is incident again from the semitransparent film 8c of the VIPA assembly 8. At this time, the light can not pass through the VIPA assembly 8 and return to the original light path again unless it is propagated back the same light path as the light output from the translucent film 8c of the VIPA assembly 8. That is, light from the out-of-focus position is removed by the VIPA assembly 8 so that confocality can be realized.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a configuration example of an imaging system including the optical system of the confocal microscope (experimental apparatus) of FIG.
  • an imaging system including an optical system of a confocal microscope includes a laser light source 1, cylindrical lenses 2, 4, 7, 9, a convex lens 5, VIPA assemblies 3 and 8, an objective lens 6,
  • the imaging camera 10, the image processing apparatus 11, and the display unit 12 are provided.
  • a broadband laser beam (for example, Er-doped fiber laser, center wavelength 1560 nm, band 20 nm, average power 10 mW) is used as the laser light source 1.
  • the laser light source 1 is used in the present embodiment, the present invention is not limited to this, and another light source (LED, incoherent light source) may be used.
  • 3a and 3b of the VIPA assembly 3 indicate the surface on the low reflection film 3a and the high reflection film 3b side
  • 3c on the VIPA assembly 3 indicates the surface on the semitransparent film 3c side.
  • 8a and 8b of the VIPA assembly 8 show the surface on the side of the low reflection film 8a and the high reflection film 8b
  • 8c of the VIPA assembly 8 shows the surface on the side of the semitransparent film 8c.
  • the laser light from the laser light source 1 is reflected by the beam splitter 15, shaped from a circular beam to a line beam by the cylindrical lens 2, and then incident on the VIPA assembly 3 through the low reflection film 3 a of the VIPA assembly 3.
  • the VIPA assembly 3 performs wavelength / space conversion and passes by reflecting the incident light by multiple reflection of the highly reflective film 3 b and the semitransparent film 3 c, and the output light from the VIPA assembly 3 is transmitted from the semitransparent film 3 c to the cylindrical lens 4.
  • the light reflected and scattered from the sample reversely propagates the same optical path including the objective lens 6, the convex lens 5 and the cylindrical lens 4, and is again incident on the VIPA assembly 3 through the semitransparent film 3 c of the VIPA assembly 3. .
  • the VIPA assembly 3 light reflected from the sample 20 of the subject is subjected to space / wavelength conversion by being multi-reflected by the high reflection film 3 b and the semitransparent film 3 c, and light from other than the focus is removed The light with only information returns to the same light path again.
  • the light having focal point information passes through the cylindrical lens 2 and the beam splitter 15 and is incident on the detection optical system.
  • the light incident on the detection optical system is incident on the VIPA assembly 8 through the low reflection film 8 a of the VIPA assembly 8 through the cylindrical lens 7.
  • the VIPA assembly 8 performs wavelength / space conversion and passes by reflecting the incident light by multiple reflection of the highly reflective film 8 b and the semitransparent film 8 c.
  • light incident on the VIPA assembly 8 is dispersed by the VIPA assembly 8 and then condensed by the cylindrical lens 9 on the sensor surface of the two-dimensional image sensor 10A of the imaging camera (for example, InGaAs camera) 10.
  • the sample 20 and the imaging camera 10 are in an imaging relationship, an image corresponding to the space information of the sample 20 can be obtained by the imaging camera 10.
  • the image information taken by the imaging camera 10 is subjected to predetermined known imaging processing by the image processing device 11 to expand and generate two-dimensional image data, and then an image of the two-dimensional image data Is displayed on the display unit 12.
  • FIG. 4 is a graph showing the depth resolution of the confocal microscope of FIGS. 1 and 2;
  • depth resolution was measured to evaluate the confocality of the developed device.
  • the sample 20 used a mirror.
  • Z 0 ⁇ m
  • the average intensity in the acquired two-dimensional image was obtained.
  • the full width at half maximum of the depth profile was 76 ⁇ m.
  • the theoretical resolution in the case of a pinhole microscope based confocal microscope was 43 ⁇ m.
  • the present embodiment has substantially the same confocality as the confocal optical microscope using a pinhole.
  • the confocal microscope according to the present embodiment acquires a two-dimensional space at a time, and each measuring point, while a confocal microscope using a pinhole according to the prior art can obtain information of only one point at a time. Is advantageous in that it also has spectral information of
  • FIGS. 5A and 5B The results of measurement of the test chart (Edmund, 1951 USAF Resolution Target, negative type) with the optical system of FIG. 2 are shown in FIGS. 5A and 5B.
  • FIG. 5A is a photographic image showing the spatial resolution in the vertical direction of the first reflection image of the reflection images of the test chart at different arrangement positions
  • FIG. 5B is the reflection image of the test chart at different arrangement positions.
  • the Y-axis direction is the axis obtained by wavelength / space conversion
  • the X direction is the axis obtained by line focusing.
  • FIGS. 5A and 5B it can be seen that the structure of the test chart is visualized.
  • the spatial resolution in the XY plane was determined using the edge profile of the acquired image.
  • the cross-sectional profile having the structure of the test chart was obtained, and the edge profile was obtained.
  • the edge profile was differentiated and its half width was measured as in-plane resolution.
  • the X direction resolution was 26 ⁇ m and the Y direction resolution was 40 ⁇ m. From the above, it is clear that a scanless confocal optical microscope having three-dimensional spatial resolution and spectral information can be realized.
  • a new scanless confocal microscope is proposed in which wavelength / space conversion imaging using line focusing CLM and VIPA assemblies 3 and 8 is orthogonalized and expanded in a two-dimensional space, Basic imaging characteristics were acquired.
  • the line-focusing CLM and the wavelength / space conversion system realize scanless 2-dimensional imaging.
  • it was shown that using the VIPA assemblies 3 and 8 for wavelength / space conversion can realize scanless with spectral information.
  • the confocality high depth resolution, stray light removal ability, etc.
  • this embodiment does not have a mechanical movable part, it is robust against disturbances such as vibration and can be expected to be used in various applied measurement in the field.
  • the optical system it is considered that the spatial resolution in the order of sub- ⁇ m realized by the conventional confocal optical microscope can be realized. Since the image acquisition time depends only on the frame rate of the imaging camera, further speeding up can be expected by using a high-speed camera with a kHz frame rate.
  • a light source having RGB colors and a color camera it is also possible to obtain a color image having confocality.

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Abstract

本発明にかかる共焦点顕微鏡は、光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズ（６）を介して被写体（２０）に照射し、当該被写体（２０）からの反射光を上記対物レンズ（６）を介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリ（３）と、前記第１のＶＩＰＡアセンブリ（３）からの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリ（８）と、ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサー（１０Ａ）を含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリ（８）からの反射光を撮像する撮像手段とを備える。

Description

共焦点顕微鏡及び画像化システム
　本発明は、非走査（スキャンレス）型共焦点顕微鏡及び画像化システムに関する。
　共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ　Ｌａｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＣＬＭ）は、共焦点効果による深さ分解能と迷光除去能力を持ち、２次元／３次元イメージングが可能であることから、非接触表面形状測定やバイオイメージングの分野で広く用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
　通常のＣＬＭでは、光源ピンホール、サンプル焦点、検出ピンホールが共役である必要があるため、点計測に基づいている。そのため、２次元イメージを取得するためには、焦点スポットを２次元的に機械的走査する必要がある。高速イメージングのため、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、ＭＥＭＳミラーといった機械的走査機構が一般に用いられてきたが、フレームレートは数１０枚／秒程度に留まっていた。
　一方、光源ピンホール／サンプル焦点／検出ピンホールの共役ペアを２次元の渦巻状で展開したマイクロレンズアレイ／ニポウディスク対を高速回転させ、カメラと共に利用することにより、最大で１０００枚／秒程度までの高速化が可能になる（例えば、非特許文献２参照）。
特開２００７－３１６２８１号公報 特開２００３－２０２４７６号公報
Ｐ．　Ｄａｖｉｄｏｖｉｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｌａｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，"　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．　２２３，　Ｎｏ．　５２０８，　（１９６９）　ｐｐ．　８３１． Ｔ．　Ｔａｎａａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　１－ｆｒａｍｅ／ｍｓ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｉｃｒｏｌｅｎｓ　ａｎｄ　Ｎｉｐｋｏｗ　ｄｉｓｋｓ，"　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｏｐｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．　４１，　Ｎｏ．　２２，　（２００２）　ｐｐ．　４７０４． Ｙ．　Ｓ．　Ｓａｂｈａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｓｌｉｔ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｅｎｄｏｓｃｏｐｅ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ，"　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｏｐｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．　３８，　Ｎｏ．　３４，　（１９９９）　ｐｐ．　７１３３． Ｇ．　Ｊ．　Ｔｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，"　Ｏｐｔｉｃｓ　Ｌｅｔｔｅｒ，　Ｖｏｌ．　２３，　Ｎｏ．　１５，　（１９９８）　ｐｐ．　１１５２．
　しかし、これらの機械的な走査機構は、振動などの外乱に弱いため、光学定盤等の安定な計測環境が必要であった。このような現状から、機械的走査機構を不要とすることで、高速計測が可能かつ各種外乱にロバストなＣＬＭが強く望まれている。
　機械的走査を省略する１つのアプローチとして、ライン集光型ＣＬＭ（例えば、非特許文献３参照）がある。この手法では、光源ピンホールを通過したレーザー光をサンプルに対してライン集光する。ライン焦点位置と共役な位置に共焦点スリットを配置し、サンプルからの反射光（もしくは透過光）を通過させることにより、共焦点効果を付与した後、最終的にラインイメージセンサーで共焦点ラインイメージが検出される。しかし、２次元イメージを取得するためには、共焦点スリットと直交方向に１次元の機械的走査が必要である。
　機械的走査を省略する別のアプローチとして、波長／空間変換を用いた手法（例えば、非特許文献４参照）がある。この手法では、広帯域レーザー光を回折格子によって１次元空間展開し、それを対物レンズで集光することにより、サンプル上に虹色ラインビームを生成する。サンプルからの反射光（もしくは透過光）は、往路と同じ経路を逆方向に伝搬することにより、波長／空間変換の逆変換が行われ、各波長成分が空間的に重なって再び１つのビームとなる。これにより、サンプル上の１次元イメージ情報がスペクトルに重畳されるので、そのスペクトル波形をマルチチャンネル分光器で計測することにより、ラインイメージをスキャンレスで取得できる。しかし、この手法を用いても、２次元イメージ取得のためには、虹色ラインビームと直交方向に１次元の機械的走査が必要である。
　ライン集光型ＣＬＭの１次元イメージ情報（垂直方向）と、波長／空間変換のスペクトル情報（水平方向）が直交するように配置し、マルチチャンネル分光器と２次元イメージセンサーで分光ラインイメージとして取得を行えば、スキャンレスで２次元イメージングが可能になる。しかし、この手法では回折格子のように波長／空間変換によって１つの空間位置に対し１波長を対応させているため、分光情報を取得することはできなかった。
　本発明の目的は以上の問題点を解決し、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを提供することにある。
　本発明の一態様にかかる共焦点顕微鏡は、
　光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズを介して被写体に照射し、当該被写体からの反射光を上記対物レンズを介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリと、
　前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリと、
　ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサーを含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を撮像する撮像手段とを備えたことを特徴とする。
　従って、本発明に係る共焦点顕微鏡によれば、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを提供できる。
本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡の動作原理を示すブロック図である。 図１の共焦点顕微鏡の光学システムを含む画像化システムの構成例を示すブロック図である。 図１及び図２のＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ　Ｉｍａｇｅｄ　Ｐｈａｓｅｄ　Ａｒｒａｙ）アセンブリ８の詳細構成を示すブロック図である。 図１及び図２の共焦点顕微鏡の深さ分解能を示すグラフである。 異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第１の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。 異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第２の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。
　以下、本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡について以下に説明する。なお、同一又は同様の構成要素について同一の符号を付す。
１．測定原理
　図１は本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡の動作原理を示すブロック図である。
　本実施形態では、１つの空間位置に対して複数の離散的波長情報を対応させることが可能な「仮想的に画像化されるフェーズアレイ（以下、ＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ　Ｉｍａｇｅｄ　Ｐｈａｓｅｄ　Ａｒｒａｙ）という。）のアセンブリ（以下、ＶＩＰＡアセンブリという）３，８を用いることで、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点レーザー顕微鏡を提供することを特徴としている。
　図１において、光軸方向をＺ軸とし、光軸のＺ軸に直交した２次元平面をＸＹ面となるように３次元座標を定義した。本実施形態では、Ｘ軸方向に対しライン集光型ＣＬＭと同様のスキャンレス化を行い、Ｙ軸方向に対しＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換を用いたスキャンレス化を行う。すなわち、図１において、撮像カメラ１０は、互いに直交するライン集光方向（Ｘ軸方向）と波長／空間変換後の空間方向（Ｙ軸方向）を有する２次元イメージセンサー１０Ａを有する。また、ＶＩＰＡアセンブリ３，８は、ガラス平行平板８１の平面がＹ軸方向から若干（例えば５～１５度）傾斜することで、Ｙ軸方向で波長／空間変換後の空間方向の複数のイメージ情報（図３の仮想画像２１参照）を有するように設けられる。
して設けられる。
　図３は図１及び図２のＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ　Ｉｍａｇｅｄ　Ｐｈａｓｅｄ　Ａｒｒａｙ）アセンブリ８の詳細構成を示すブロック図である。ＶＩＰＡアセンブリ８は公知の光学アセンブリであって、厚さｔのガラス平行平板８１の第１の面である光の入射面に、例えば反射率０等の低反射膜（無反射膜であってもよく、もしくは、好ましくは１０％以下の反射率を有してもよい）８ａと、反射率１００％の高反射膜８ｂとを被覆する一方、第２の面である光の出力面に反射率９５％以上の半透明膜８ｃのコーティングがされて構成される（例えば、特許文献２参照）。ここで、８ｄは入射した光ビームのくびれを示す。２１は複数の仮想画像を示し、ｄは後述する多重反射による複数の出力光の間隔である。なお、図１及び図２のＶＩＰＡアセンブリ３もＶＩＰＡアセンブリ８と同様の構成を有し、波長領域側の低反射膜３ａ及び高反射膜３ｂと、空間領域側の半透明膜３ｃとを備える。
　図１及び図３において、シリンドリカルレンズ７によって線集光された光は、高反射膜８ｂ側であってそれに隣接する一部に形成された低反射膜８ａを介してＶＩＰＡアセンブリ８へ入射する。ＶＩＰＡアセンブリ８に入射された光は高反射膜８ｂと半透明膜８ｃによって、一部の光を半透明膜８ｃから出力しながら、多重反射を繰り返すことで、波長／空間変換を行う。半透明膜８ｃから出力された光の干渉により、波長間隔ＦＳＲ（Ｆｒｅｅ　Ｓｐｅｃｔｒａｌ　Ｒａｎｇｅ）を有する櫛状のスペクトルが得られる。このとき、櫛状のスペクトルの透過波長は、ＶＩＰＡアセンブリ３への入射角度に依存する。通常、ＦＳＲは０．０１～１ｎｍ程度である。
　本実施形態では、ＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで、従来の波長／空間変換を用いた手法と同様に、空間と波長を対応させることで、空間情報を波長として読み出すことが可能となる。ただし、ＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで１空間情報に対応する波長は、ＦＳＲ間隔の櫛状のスペクトル全体となる。すなわち、共焦点イメージングに求められる波長分解能がＦＳＲよりも十分低い場合、分光情報も同時に取得することができる。
　また、本実施形態における共焦点性（高い深さ分解能、迷光除去能など）は、ＶＩＰＡアセンブリ３，８によって与えることが可能である。例えば図１及び図３においては、前述の手法で空間に集光した光は、散乱及び反射されることで同様の光路を辿り、ＶＩＰＡアセンブリ８の半透明膜８ｃから再度入射される。このとき、ＶＩＰＡアセンブリ８の半透明膜８ｃから出力された光と全く同じ光路を逆伝播しなければ、ＶＩＰＡアセンブリ８を透過し再び元の光路に戻ることはできない。すなわち、焦点からずれた位置からの光は、ＶＩＰＡアセンブリ８によって除去されるため、共焦点性を実現することができる。
２．実験装置
　図２は図１の共焦点顕微鏡（実験装置）の光学システムを含む画像化システムの構成例を示すブロック図である。図２において、共焦点顕微鏡の光学システムを含む画像化システムは、レーザー光源１と、シリンドリカルレンズ２，４，７，９，と、凸レンズ５と、ＶＩＰＡアセンブリ３，８と、対物レンズ６と、撮像カメラ１０と、画像処理装置１１と、表示部１２とを備えて構成される。
　図２において、レーザー光源１には、広帯域レーザー光（例えばＥｒ－ｄｏｐｅｄ　ｆｉｂｅｒ　ｌａｓｅｒ、中心波長１５６０ｎｍ、帯域２０ｎｍ、平均パワー１０ｍＷ）を用いた。しかし、本実施形態ではレーザー光源１を用いたが、本発明これに限らず、他の光源（ＬＥＤ、インコヒーレント光源）を用いてもよい。なお、図２において、ＶＩＰＡアセンブリ３の３ａ，３ｂは低反射膜３ａ及び高反射膜３ｂの側の面を示し、ＶＩＰＡアセンブリ３の３ｃは半透明膜３ｃの側の面を示す。また、ＶＩＰＡアセンブリ８の８ａ，８ｂは低反射膜８ａ及び高反射膜８ｂの側の面を示し、ＶＩＰＡアセンブリ８の８ｃは半透明膜８ｃの側の面を示す。
　レーザー光源１からのレーザー光は、ビームスプリッタ１５により反射され、シリンドリカルレンズ２によって円形ビームからラインビームに整形された後、ＶＩＰＡアセンブリ３の低反射膜３ａを介してＶＩＰＡアセンブリ３に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ３は、入射する光を高反射膜３ｂ及び半透明膜３ｃにより多重反射することで波長／空間変換して通過させ、ＶＩＰＡアセンブリ３からの出力光は半透明膜３ｃから、シリンドリカルレンズ４及び凸レンズ５を通り、対物レンズ（ｘ１０型、開口数ＮＡ＝０．２５、オリンパス）６によって、櫛状のスペクトルと空間が対応するように被写体の試料に集光される。試料から反射しかつ散乱された光は、対物レンズ６、凸レンズ５及びシリンドリカルレンズ４を含む同様の光路を逆伝播し、再びＶＩＰＡアセンブリ３の半透明膜３ｃを介してＶＩＰＡアセンブリ３に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ３は、被写体の試料２０からの反射光を高反射膜３ｂ及び半透明膜３ｃにより多重反射することで空間／波長変換して通過させることで、焦点以外からの光が除去され、焦点のみの情報を持った光が再び同じ光路に戻る。
　焦点の情報を持った光は、シリンドリカルレンズ２及びビームスプリッタ１５を通り、検出光学系へ入射される。検出光学系へ入射された光は、シリンドリカルレンズ７を介してＶＩＰＡアセンブリ８の低反射膜８ａを介してＶＩＰＡアセンブリ８に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ８は、入射する光を高反射膜８ｂ及び半透明膜８ｃにより多重反射することで波長／空間変換して通過させる。ここで、ＶＩＰＡアセンブリ８に入射する光はＶＩＰＡアセンブリ８によって分光された後、シリンドリカルレンズ９により撮像カメラ（例えばＩｎＧａＡｓカメラ）１０の２次元イメージセンサー１０Ａのセンサ面に集光される。本光学系においては、試料２０と撮像カメラ１０が結像関係にあるため、試料２０の空間情報に対応した画像を撮像カメラ１０で得ることができる。ただし、焦点以外からの光は、ＶＩＰＡアセンブリ３，８によって除去されているため、焦点からの情報のみ撮像カメラ１０で取得可能である。そして、撮像カメラ１０で撮像された画像情報は画像処理装置１１により所定の公知の画像化（イメージング）処理が実行されて２次元画像データを展開して生成した後、当該２次元画像データの画像が表示部１２に表示される。
３．実験結果（空間分解能評価）
　図４は図１及び図２の共焦点顕微鏡の深さ分解能を示すグラフである。まず、開発装置の共焦点性を評価するため、深さ分解能を計測した。試料２０にはミラーを用いた。試料２０が対物レンズ６の焦点にある場合をＺ＝０μｍとし、試料２０の位置を移動させながら、取得した２次元画像内の平均強度を得た。その結果、Ｚ＝０μｍ近傍でのみ強い信号強度が得られた。その際、深さプロファイルの半値全幅は７６μｍであった。このとき、同じ対物レンズ６を用い、ピンホールに基づく共焦点顕微鏡の場合の理論分解能は、４３μｍであった。すなわち、本実施形態はピンホールを用いた共焦点光学顕微鏡と、ほぼ同等の共焦点性を有していることがわかる。ただし、従来技術に係るピンホールを用いた共焦点顕微鏡では１点の情報しか一度に取れないのに対し、本実施形態にかかる共焦点顕微鏡は２次元空間を一度に取得し、かつ各測定点の分光情報も有している点で優位である。
　次に、試料２０の面内の２次元イメージング（画像化）特性（ＸＹ面）について評価した。テストチャート（Ｅｄｍｕｎｄ、１９５１ＵＳＡＦ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ、ネガタイプ）を図２の光学システムで計測した結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。ここで、図５Ａは異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第１の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像であり、図５Ｂは異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第２の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。
　図５Ａ及び図５Ｂの写真画像において、Ｙ軸方向が波長／空間変換により得られた軸、Ｘ方向がライン集光により得られた軸である。図５Ａ及び図５Ｂから明らかなように、テストチャートの構造が可視化されていることがわかる。取得した画像のエッジプロファイルを用いて、ＸＹ面内での空間分解能を求めた。テストチャートの構造を有する断面プロファイルを取得し、エッジプロファイルを得た。エッジプロファイルを微分し、その半値幅を面内分解能として計測した。その結果、Ｘ方向分解能は２６μｍ、Ｙ方向分解能は４０μｍであった。以上のことから、３次元空間分解能・分光情報を有するスキャンレス共焦点光学顕微鏡が実現できることが明らかとなった。
４．まとめ
　本実施形態によれば、ライン集光型ＣＬＭとＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換イメージングを直交させて２次元空間に展開した、新たなスキャンレス共焦点顕微鏡を提案し、その基礎的なイメージング特性を取得した。ライン集光型ＣＬＭと波長／空間変換装置により、２次元イメージング法のスキャンレス化を実現した。また、波長／空間変換にＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで、分光情報を有したままスキャンレス化が実現できることを示した。さらに、ＶＩＰＡアセンブリ３，８の波長分散特性を利用することで、従来技術に係るピンホールやスリットで実現されてきた共焦点性（高い深さ分解能、迷光除去能など）を実現できることを明らかにした。
変形例．
　以上の実施形態では、ライン集光型ＣＬＭとＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換イメージングを直交させて２次元空間に展開した、新たなスキャンレス共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを開示したが、本発明はこれに限らず、ライン集光型ＣＬＭに限らず、点集光型ＣＬＭを構成してもよい。
　本実施形態は、機械的な可動部を有していないため、振動等の外乱に対しロバストで、現場における各種応用計測での利用が期待できる。また、光学系を最適化することで、従来の共焦点光学顕微鏡で実現されているサブμｍオーダーの空間分解能も実現できると考えられる。画像取得時間については、撮像カメラのフレームレートにのみ依存するため、ｋＨｚフレームレートの高速カメラの利用により更なる高速化が期待できる。また、ＲＧＢカラーを有する光源とカラーカメラを用いることで、共焦点性を有したカラー画像の取得も可能である。
１　レーザー光源
２　シリンドリカルレンズ
３，８　ＶＩＰＡアセンブリ
３ａ，８ａ　低反射膜
３ｂ，８ｂ　高反射膜
３ｃ，８ｃ　半透明膜
８ｄ　光ビームのくびれ
４　シリンドリカルレンズ
５　凸レンズ
６　対物レンズ
７　シリンドリカルレンズ
９　シリンドリカルレンズ
１０　撮像カメラ
１０Ａ　２次元イメージセンサー
１１　画像処理装置
１２　表示部
１５　ビームスプリッタ
２０　試料
８１　ガラス平行平板

Claims (6)

  1. 　光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズを介して被写体に照射し、当該被写体からの反射光を上記対物レンズを介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリと、
    　前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリと、
    　ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサーを含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を撮像する撮像手段とを備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
  2. 　前記光源からの光を前記第１のＶＩＰＡアセンブリ及び前記対物レンズを介して被写体に照射し、前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を通過させて前記第２のＶＩＰＡアセンブリを介して前記撮像手段に出力するビームスプリッタをさらに備えたことを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
  3. 　前記第１及び第２のＶＩＰＡアセンブリの前後にそれぞれ１対のシリンドリカルレンズを設けたことを特徴とする請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
  4. 　前記光源は、レーザー光源であることを特徴とする請求項１～３のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡。
  5. 　前記共焦点顕微鏡は、ライン集光型共焦点顕微鏡、又は点集光型共焦点顕微鏡であることを特徴とする請求項１～４のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡。
  6. 　前記共焦点顕微鏡がライン集光型共焦点顕微鏡である請求項１～４のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡と、
    　前記撮像手段からの撮像データに対して２次元画像化処理を行って２次元画像を生成する画像化手段とを備えたことを特徴とする画像化システム。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001511902A (ja) * 1996-12-05 2001-08-14 ライカ ミクロジュステムス ハイデルベルク ゲーエムベーハー 任意の対象物の表面プロフィールを同時多焦点結像するための装置および方法
JP2014010216A (ja) * 2012-06-28 2014-01-20 Lithotech Co Ltd 多焦点共焦点顕微鏡
JP2015519604A (ja) * 2012-05-16 2015-07-09 カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｍｂｈ 光学顕微鏡および光学顕微鏡を用いた画像記録方法
JP2015225222A (ja) * 2014-05-28 2015-12-14 三菱電機株式会社 ビーム走査装置、光無線通信システムおよびビーム走査方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001511902A (ja) * 1996-12-05 2001-08-14 ライカ ミクロジュステムス ハイデルベルク ゲーエムベーハー 任意の対象物の表面プロフィールを同時多焦点結像するための装置および方法
JP2015519604A (ja) * 2012-05-16 2015-07-09 カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハーＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｇｍｂｈ 光学顕微鏡および光学顕微鏡を用いた画像記録方法
JP2014010216A (ja) * 2012-06-28 2014-01-20 Lithotech Co Ltd 多焦点共焦点顕微鏡
JP2015225222A (ja) * 2014-05-28 2015-12-14 三菱電機株式会社 ビーム走査装置、光無線通信システムおよびビーム走査方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIULIANO SCARCELLI ET AL.: "Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging", NATURE PHOTONICS, vol. 2, 9 December 2007 (2007-12-09), pages 39 - 43, XP055025694, DOI: doi:10.1038/nphoton.2007.250 *

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