JP2021028644A - 共焦点顕微鏡及び画像化システム - Google Patents

Abstract

【課題】分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】本発明にかかる共焦点顕微鏡は、光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズを介して被写体に照射し、当該被写体からの反射光を上記対物レンズを介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリと、前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリと、ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサーを含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を撮像する撮像手段とを備える。【選択図】図２

Description

本発明は、非走査（スキャンレス）型共焦点顕微鏡及び画像化システムに関する。

共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＣＬＭ）は、共焦点効果による深さ分解能と迷光除去能力を持ち、２次元／３次元イメージングが可能であることから、非接触表面形状測定やバイオイメージングの分野で広く用いられている（例えば、非特許文献１参照）。

通常のＣＬＭでは、光源ピンホール、サンプル焦点、検出ピンホールが共役である必要があるため、点計測に基づいている。そのため、２次元イメージを取得するためには、焦点スポットを２次元的に機械的走査する必要がある。高速イメージングのため、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、ＭＥＭＳミラーといった機械的走査機構が一般に用いられてきたが、フレームレートは数１０枚／秒程度に留まっていた。

一方、光源ピンホール／サンプル焦点／検出ピンホールの共役ペアを２次元の渦巻状で展開したマイクロレンズアレイ／ニポウディスク対を高速回転させ、カメラと共に利用することにより、最大で１０００枚／秒程度までの高速化が可能になる（例えば、非特許文献２参照）。

特開２００７−３１６２８１号公報 特開２００３−２０２４７６号公報

Ｐ． Ｄａｖｉｄｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，" Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ． ２２３， Ｎｏ． ５２０８， （１９６９） ｐｐ． ８３１． Ｔ． Ｔａｎａａｍｉ ｅｔ ａｌ．， "Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ １−ｆｒａｍｅ／ｍｓ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏｌｅｎｓ ａｎｄ Ｎｉｐｋｏｗ ｄｉｓｋｓ，" Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． ４１， Ｎｏ． ２２， （２００２） ｐｐ． ４７０４． Ｙ． Ｓ． Ｓａｂｈａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｌｉｔ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｄｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ，" Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． ３８， Ｎｏ． ３４， （１９９９） ｐｐ． ７１３３． Ｇ． Ｊ． Ｔｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，" Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒ， Ｖｏｌ． ２３， Ｎｏ． １５， （１９９８） ｐｐ． １１５２．

しかし、これらの機械的な走査機構は、振動などの外乱に弱いため、光学定盤等の安定な計測環境が必要であった。このような現状から、機械的走査機構を不要とすることで、高速計測が可能かつ各種外乱にロバストなＣＬＭが強く望まれている。

機械的走査を省略する１つのアプローチとして、ライン集光型ＣＬＭ（例えば、非特許文献３参照）がある。この手法では、光源ピンホールを通過したレーザー光をサンプルに対してライン集光する。ライン焦点位置と共役な位置に共焦点スリットを配置し、サンプルからの反射光（もしくは透過光）を通過させることにより、共焦点効果を付与した後、最終的にラインイメージセンサーで共焦点ラインイメージが検出される。しかし、２次元イメージを取得するためには、共焦点スリットと直交方向に１次元の機械的走査が必要である。

機械的走査を省略する別のアプローチとして、波長／空間変換を用いた手法（例えば、非特許文献４参照）がある。この手法では、広帯域レーザー光を回折格子によって１次元空間展開し、それを対物レンズで集光することにより、サンプル上に虹色ラインビームを生成する。サンプルからの反射光（もしくは透過光）は、往路と同じ経路を逆方向に伝搬することにより、波長／空間変換の逆変換が行われ、各波長成分が空間的に重なって再び１つのビームとなる。これにより、サンプル上の１次元イメージ情報がスペクトルに重畳されるので、そのスペクトル波形をマルチチャンネル分光器で計測することにより、ラインイメージをスキャンレスで取得できる。しかし、この手法を用いても、２次元イメージ取得のためには、虹色ラインビームと直交方向に１次元の機械的走査が必要である。

ライン集光型ＣＬＭの１次元イメージ情報（垂直方向）と、波長／空間変換のスペクトル情報（水平方向）が直交するように配置し、マルチチャンネル分光器と２次元イメージセンサーで分光ラインイメージとして取得を行えば、スキャンレスで２次元イメージングが可能になる。しかし、この手法では回折格子のように波長／空間変換によって１つの空間位置に対し１波長を対応させているため、分光情報を取得することはできなかった。

本発明の目的は以上の問題点を解決し、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを提供することにある。

本発明の一態様にかかる共焦点顕微鏡は、
光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズを介して被写体に照射し、当該被写体からの反射光を上記対物レンズを介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリと、
前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリと、
ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサーを含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を撮像する撮像手段とを備えたことを特徴とする。

従って、本発明に係る共焦点顕微鏡によれば、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを提供できる。

本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡の動作原理を示すブロック図である。 図１の共焦点顕微鏡の光学システムを含む画像化システムの構成例を示すブロック図である。 図１及び図２のＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ Ｉｍａｇｅｄ Ｐｈａｓｅｄ Ａｒｒａｙ）アセンブリ８の詳細構成を示すブロック図である。 図１及び図２の共焦点顕微鏡の深さ分解能を示すグラフである。 異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第１の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。 異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第２の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。

以下、本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡について以下に説明する。なお、同一又は同様の構成要素について同一の符号を付す。

１．測定原理
図１は本発明の一実施形態にかかる共焦点顕微鏡の動作原理を示すブロック図である。

本実施形態では、１つの空間位置に対して複数の離散的波長情報を対応させることが可能な「仮想的に画像化されるフェーズアレイ（以下、ＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ Ｉｍａｇｅｄ Ｐｈａｓｅｄ Ａｒｒａｙ）という。）のアセンブリ（以下、ＶＩＰＡアセンブリという）３，８を用いることで、分光情報を取得しつつ、スキャンレスで２次元イメージング可能な共焦点レーザー顕微鏡を提供することを特徴としている。

図１において、光軸方向をＺ軸とし、光軸のＺ軸に直交した２次元平面をＸＹ面となるように３次元座標を定義した。本実施形態では、Ｘ軸方向に対しライン集光型ＣＬＭと同様のスキャンレス化を行い、Ｙ軸方向に対しＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換を用いたスキャンレス化を行う。すなわち、図１において、撮像カメラ１０は、互いに直交するライン集光方向（Ｘ軸方向）と波長／空間変換後の空間方向（Ｙ軸方向）を有する２次元イメージセンサー１０Ａを有する。また、ＶＩＰＡアセンブリ３，８は、ガラス平行平板８１の平面がＹ軸方向から若干（例えば５〜１５度）傾斜することで、Ｙ軸方向で波長／空間変換後の空間方向の複数のイメージ情報（図３の仮想画像２１参照）を有するように設けられる。
して設けられる。

図３は図１及び図２のＶＩＰＡ（Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ Ｉｍａｇｅｄ Ｐｈａｓｅｄ Ａｒｒａｙ）アセンブリ８の詳細構成を示すブロック図である。ＶＩＰＡアセンブリ８は公知の光学アセンブリであって、厚さｔのガラス平行平板８１の第１の面である光の入射面に、例えば反射率０等の低反射膜（無反射膜であってもよく、もしくは、好ましくは１０％以下の反射率を有してもよい）８ａと、反射率１００％の高反射膜８ｂとを被覆する一方、第２の面である光の出力面に反射率９５％以上の半透明膜８ｃのコーティングがされて構成される（例えば、特許文献２参照）。ここで、８ｄは入射した光ビームのくびれを示す。２１は複数の仮想画像を示し、ｄは後述する多重反射による複数の出力光の間隔である。なお、図１及び図２のＶＩＰＡアセンブリ３もＶＩＰＡアセンブリ８と同様の構成を有し、波長領域側の低反射膜３ａ及び高反射膜３ｂと、空間領域側の半透明膜３ｃとを備える。

図１及び図３において、シリンドリカルレンズ７によって線集光された光は、高反射膜８ｂ側であってそれに隣接する一部に形成された低反射膜８ａを介してＶＩＰＡアセンブリ８へ入射する。ＶＩＰＡアセンブリ８に入射された光は高反射膜８ｂと半透明膜８ｃによって、一部の光を半透明膜８ｃから出力しながら、多重反射を繰り返すことで、波長／空間変換を行う。半透明膜８ｃから出力された光の干渉により、波長間隔ＦＳＲ（Ｆｒｅｅ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｒａｎｇｅ）を有する櫛状のスペクトルが得られる。このとき、櫛状のスペクトルの透過波長は、ＶＩＰＡアセンブリ３への入射角度に依存する。通常、ＦＳＲは０．０１〜１ｎｍ程度である。

本実施形態では、ＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで、従来の波長／空間変換を用いた手法と同様に、空間と波長を対応させることで、空間情報を波長として読み出すことが可能となる。ただし、ＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで１空間情報に対応する波長は、ＦＳＲ間隔の櫛状のスペクトル全体となる。すなわち、共焦点イメージングに求められる波長分解能がＦＳＲよりも十分低い場合、分光情報も同時に取得することができる。

また、本実施形態における共焦点性（高い深さ分解能、迷光除去能など）は、ＶＩＰＡアセンブリ３，８によって与えることが可能である。例えば図１及び図３においては、前述の手法で空間に集光した光は、散乱及び反射されることで同様の光路を辿り、ＶＩＰＡアセンブリ８の半透明膜８ｃから再度入射される。このとき、ＶＩＰＡアセンブリ８の半透明膜８ｃから出力された光と全く同じ光路を逆伝播しなければ、ＶＩＰＡアセンブリ８を透過し再び元の光路に戻ることはできない。すなわち、焦点からずれた位置からの光は、ＶＩＰＡアセンブリ８によって除去されるため、共焦点性を実現することができる。

２．実験装置
図２は図１の共焦点顕微鏡（実験装置）の光学システムを含む画像化システムの構成例を示すブロック図である。図２において、共焦点顕微鏡の光学システムを含む画像化システムは、レーザー光源１と、シリンドリカルレンズ２，４，７，９，と、凸レンズ５と、ＶＩＰＡアセンブリ３，８と、対物レンズ６と、撮像カメラ１０と、画像処理装置１１と、表示部１２とを備えて構成される。

図２において、レーザー光源１には、広帯域レーザー光（例えばＥｒ−ｄｏｐｅｄ ｆｉｂｅｒ ｌａｓｅｒ、中心波長１５６０ｎｍ、帯域２０ｎｍ、平均パワー１０ｍＷ）を用いた。しかし、本実施形態ではレーザー光源１を用いたが、本発明これに限らず、他の光源（ＬＥＤ、インコヒーレント光源）を用いてもよい。なお、図２において、ＶＩＰＡアセンブリ３の３ａ，３ｂは低反射膜３ａ及び高反射膜３ｂの側の面を示し、ＶＩＰＡアセンブリ３の３ｃは半透明膜３ｃの側の面を示す。また、ＶＩＰＡアセンブリ８の８ａ，８ｂは低反射膜８ａ及び高反射膜８ｂの側の面を示し、ＶＩＰＡアセンブリ８の８ｃは半透明膜８ｃの側の面を示す。

レーザー光源１からのレーザー光は、ビームスプリッタ１５により反射され、シリンドリカルレンズ２によって円形ビームからラインビームに整形された後、ＶＩＰＡアセンブリ３の低反射膜３ａを介してＶＩＰＡアセンブリ３に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ３は、入射する光を高反射膜３ｂ及び半透明膜３ｃにより多重反射することで波長／空間変換して通過させ、ＶＩＰＡアセンブリ３からの出力光は半透明膜３ｃから、シリンドリカルレンズ４及び凸レンズ５を通り、対物レンズ（ｘ１０型、開口数ＮＡ＝０．２５、オリンパス）６によって、櫛状のスペクトルと空間が対応するように被写体の試料に集光される。試料から反射しかつ散乱された光は、対物レンズ６、凸レンズ５及びシリンドリカルレンズ４を含む同様の光路を逆伝播し、再びＶＩＰＡアセンブリ３の半透明膜３ｃを介してＶＩＰＡアセンブリ３に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ３は、被写体の試料２０からの反射光を高反射膜３ｂ及び半透明膜３ｃにより多重反射することで空間／波長変換して通過させることで、焦点以外からの光が除去され、焦点のみの情報を持った光が再び同じ光路に戻る。

焦点の情報を持った光は、シリンドリカルレンズ２及びビームスプリッタ１５を通り、検出光学系へ入射される。検出光学系へ入射された光は、シリンドリカルレンズ７を介してＶＩＰＡアセンブリ８の低反射膜８ａを介してＶＩＰＡアセンブリ８に入射される。ＶＩＰＡアセンブリ８は、入射する光を高反射膜８ｂ及び半透明膜８ｃにより多重反射することで波長／空間変換して通過させる。ここで、ＶＩＰＡアセンブリ８に入射する光はＶＩＰＡアセンブリ８によって分光された後、シリンドリカルレンズ９により撮像カメラ（例えばＩｎＧａＡｓカメラ）１０の２次元イメージセンサー１０Ａのセンサ面に集光される。本光学系においては、試料２０と撮像カメラ１０が結像関係にあるため、試料２０の空間情報に対応した画像を撮像カメラ１０で得ることができる。ただし、焦点以外からの光は、ＶＩＰＡアセンブリ３，８によって除去されているため、焦点からの情報のみ撮像カメラ１０で取得可能である。そして、撮像カメラ１０で撮像された画像情報は画像処理装置１１により所定の公知の画像化（イメージング）処理が実行されて２次元画像データを展開して生成した後、当該２次元画像データの画像が表示部１２に表示される。

３．実験結果（空間分解能評価）
図４は図１及び図２の共焦点顕微鏡の深さ分解能を示すグラフである。まず、開発装置の共焦点性を評価するため、深さ分解能を計測した。試料２０にはミラーを用いた。試料２０が対物レンズ６の焦点にある場合をＺ＝０μｍとし、試料２０の位置を移動させながら、取得した２次元画像内の平均強度を得た。その結果、Ｚ＝０μｍ近傍でのみ強い信号強度が得られた。その際、深さプロファイルの半値全幅は７６μｍであった。このとき、同じ対物レンズ６を用い、ピンホールに基づく共焦点顕微鏡の場合の理論分解能は、４３μｍであった。すなわち、本実施形態はピンホールを用いた共焦点光学顕微鏡と、ほぼ同等の共焦点性を有していることがわかる。ただし、従来技術に係るピンホールを用いた共焦点顕微鏡では１点の情報しか一度に取れないのに対し、本実施形態にかかる共焦点顕微鏡は２次元空間を一度に取得し、かつ各測定点の分光情報も有している点で優位である。

次に、試料２０の面内の２次元イメージング（画像化）特性（ＸＹ面）について評価した。テストチャート（Ｅｄｍｕｎｄ、１９５１ＵＳＡＦ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ、ネガタイプ）を図２の光学システムで計測した結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。ここで、図５Ａは異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第１の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像であり、図５Ｂは異なった配置位置におけるテストチャートの反射画像のうちの第２の反射画像の縦方向の空間分解能を示す写真画像である。

図５Ａ及び図５Ｂの写真画像において、Ｙ軸方向が波長／空間変換により得られた軸、Ｘ方向がライン集光により得られた軸である。図５Ａ及び図５Ｂから明らかなように、テストチャートの構造が可視化されていることがわかる。取得した画像のエッジプロファイルを用いて、ＸＹ面内での空間分解能を求めた。テストチャートの構造を有する断面プロファイルを取得し、エッジプロファイルを得た。エッジプロファイルを微分し、その半値幅を面内分解能として計測した。その結果、Ｘ方向分解能は２６μｍ、Ｙ方向分解能は４０μｍであった。以上のことから、３次元空間分解能・分光情報を有するスキャンレス共焦点光学顕微鏡が実現できることが明らかとなった。

４．まとめ
本実施形態によれば、ライン集光型ＣＬＭとＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換イメージングを直交させて２次元空間に展開した、新たなスキャンレス共焦点顕微鏡を提案し、その基礎的なイメージング特性を取得した。ライン集光型ＣＬＭと波長／空間変換装置により、２次元イメージング法のスキャンレス化を実現した。また、波長／空間変換にＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いることで、分光情報を有したままスキャンレス化が実現できることを示した。さらに、ＶＩＰＡアセンブリ３，８の波長分散特性を利用することで、従来技術に係るピンホールやスリットで実現されてきた共焦点性（高い深さ分解能、迷光除去能など）を実現できることを明らかにした。

変形例．
以上の実施形態では、ライン集光型ＣＬＭとＶＩＰＡアセンブリ３，８を用いた波長／空間変換イメージングを直交させて２次元空間に展開した、新たなスキャンレス共焦点顕微鏡及びそれを用いた画像化システムを開示したが、本発明はこれに限らず、ライン集光型ＣＬＭに限らず、点集光型ＣＬＭを構成してもよい。

本実施形態は、機械的な可動部を有していないため、振動等の外乱に対しロバストで、現場における各種応用計測での利用が期待できる。また、光学系を最適化することで、従来の共焦点光学顕微鏡で実現されているサブμｍオーダーの空間分解能も実現できると考えられる。画像取得時間については、撮像カメラのフレームレートにのみ依存するため、ｋＨｚフレームレートの高速カメラの利用により更なる高速化が期待できる。また、ＲＧＢカラーを有する光源とカラーカメラを用いることで、共焦点性を有したカラー画像の取得も可能である。

１ レーザー光源
２ シリンドリカルレンズ
３，８ ＶＩＰＡアセンブリ
３ａ，８ａ 低反射膜
３ｂ，８ｂ 高反射膜
３ｃ，８ｃ 半透明膜
８ｄ 光ビームのくびれ
４ シリンドリカルレンズ
５ 凸レンズ
６ 対物レンズ
７ シリンドリカルレンズ
９ シリンドリカルレンズ
１０ 撮像カメラ
１０Ａ ２次元イメージセンサー
１１ 画像処理装置
１２ 表示部
１５ ビームスプリッタ
２０ 試料
８１ ガラス平行平板

Claims (6)

1. 光源からの光を多重反射することで波長／空間変換して通過させて対物レンズを介して被写体に照射し、当該被写体からの反射光を上記対物レンズを介して受光し多重反射することで空間／波長変換して通過させる第１のＶＩＰＡアセンブリと、
   前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を多重反射することで波長／空間変換して通過させる第２のＶＩＰＡアセンブリと、
   ライン集光方向と波長／空間変換後の空間方向を有する２次元イメージセンサーを含み、前記第２のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を撮像する撮像手段とを備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記光源からの光を前記第１のＶＩＰＡアセンブリ及び前記対物レンズを介して被写体に照射し、前記第１のＶＩＰＡアセンブリからの反射光を通過させて前記第２のＶＩＰＡアセンブリを介して前記撮像手段に出力するビームスプリッタをさらに備えたことを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記第１及び第２のＶＩＰＡアセンブリの前後にそれぞれ１対のシリンドリカルレンズを設けたことを特徴とする請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記光源は、レーザー光源であることを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記共焦点顕微鏡は、ライン集光型共焦点顕微鏡、又は点集光型共焦点顕微鏡であることを特徴とする請求項１〜４のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記共焦点顕微鏡がライン集光型共焦点顕微鏡である請求項１〜４のうちのいずれか１つに記載の共焦点顕微鏡と、
   前記撮像手段からの撮像データに対して２次元画像化処理を行って２次元画像を生成する画像化手段とを備えたことを特徴とする画像化システム。