JP6006053B2 - レーザー走査蛍光顕微鏡装置 - Google Patents
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本発明は上記背景に鑑みてなされたもので、観察する領域すべてにおいて実時間観察可能であるだけでなく、アッベの回折限界を超える分解能で観察可能なレーザー走査蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記2つの光を1次元走査あるいは2次元走査する走査素子面を有する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された2つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
対象物を透過しあるいは反射したレーザー光とこのレーザー光によって励起された蛍光とを分離する光学フィルターと、
前記光学フィルターにより分離されたレーザー光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第1の受光素子と、
前記光学フィルターにより分離された蛍光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第2の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第1の光電変換部と、
前記第2の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第2の光電変換部と、
前記各光電変換部の和算または差算に基づいて得られたビームの位相情報および強度情報を求める信号比較器と、
前記信号比較器の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とに基づき2次元の画像を構築するデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置とされるものである。
前記第1の受光素子が、前記光学フィルターにより反射された光束を受光すると共に、前記第2の受光素子が、前記光学フィルターを透過した光束を受光するものが好適である。
さらに、本発明においては、光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、この反射光を前記光学フィルターに送るものが好適である。
前記光学フィルターが、前記第1のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、前記第2のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、からなり、
2つのレーザー光源から出射されたレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーと、
前記第1の光学フィルターと前記第2の光学フィルターとを使用するレーザー光に合わせ切り替える切替手段と、
を有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光変調器が、各レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光にそれぞれ変調させつつ、ビームの分離角を相互に同一とした相互に異なる方向にそれぞれ出射し、
前記第1の受光素子が、各光学フィルターで反射されたレーザー光を受光し、前記第2の受光素子が、各光学フィルターで透過した光束を受光し、
第1の光電変換部および第2の光電変換部が、前記第1のレーザー光源を使用する際には、第1の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第2のレーザー光源を使用する際には、第2の変調周波数でヘテロダイン検波するものが好適である。
前記光変調器が、2つのレーザー光源からのレーザー光のいずれかを相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する第1の光変調器と、第1の光変調器とは異なる周波数の光に変調し、かつ前記第1の光変調器による光の分離方向と同一に相互に異なる方向に出射する第2の光変調器と、からなり、
2つのレーザー光源から出射したレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーを有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光学フィルターが、第1のレーザー波長の光および、第2のレーザー波長の光により励起された蛍光を反射し、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第2のレーザー波長の光を透過し、
前記第1の受光素子が、前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割され、
前記第2の受光素子が、前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されているものが好適である。
前記第1のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第2のレーザー波長の光および、前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、
前記第1の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第2のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、
からなる請求項6記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記第1の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第1の受光素子と、
前記第2の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第2の受光素子と、
前記第2の光学フィルターを透過した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第3の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換した信号を前記第1の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第1の光電変換部と、
前記第2の受光素子で光電変換した信号の内、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光の信号を前記第1の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第2のレーザー波長の光の信号を前記第2の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから、それぞれ和算または差算を行う第2の光電変換部と、
前記第3の受光素子で光電変換された信号を前記第2の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第3の光電変換部と、
を含むものが好適である。
前記第1のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第2のレーザー波長の光および前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、
前記第1の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、および前記第2のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、
からなるものが好適である。
さらに、本発明においては、励起された蛍光から光電変換された信号をヘテロダイン検波する際に、ヘテロダイン検波の位相を光変調器の変調周波数に対して補正することが好適でもある。
レーザー光源から出射されたレーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に光変調器が出射する。つまり、周波数fcと周波数fmの電気信号で光変調器である音響光学変調素子を駆動すると、周波数fcをキャリアとするAM変調により、周波数fc+fmと周波数fc-fmを有する2つのビームが発生する。キャリア周波数である周波数fcを数十MHz程度とし、数MHz程度の周波数fmを付与すると、音響光学変調素子のブラッグ回折角はかなり大きくなる。
この2つの近接したビームによるビート信号は、対象物が反射物体である場合には、音響光学変調素子とほぼ共役な位置に配置された受光素子により取得することができ、対象物が透過物体である場合には、ファーフィールドではあるが対象物からあまり離れていない位置に配置した受光素子により取得することができる。
また、透過型にすれば、生物や細胞を生きたままリアルタイムかつ高い分解能で観察、計測できるので、細胞等を不活性化して計測する電子顕微鏡にはない大きな特徴ともなる。
図1は、本実施例に係るレーザー走査蛍光顕微鏡装置の構成を示すブロック図であり、図2は、図1の矢印Aより見た要部拡大図である。図1及び図2に示すように、光学系として、レーザー光が出射されるレーザー光源1aと光を分離するための光変調器である音響光学変調素子(AOM)4との間に、コリメーターレンズ2a及びビーム整形光学系3aが配置されている。これらレーザー光源1aおよび音響光学変調素子4aは制御基板14にそれぞれ接続されていて、この制御基板14により動作がそれぞれ制御されるようになる。音響光学変調素子4aに、キャリア交流信号としての周波数fcと正弦波信号としての変調周波数fmを制御基板14に内臓の信号発生器が印加する。
回折光が第1の瞳伝達拡大レンズ系6の光軸Lを通るよう、音響光学変調素子4aから第1の瞳伝達拡大レンズ系6への入射角に回折角θの傾きを持たせる。また、第1の瞳伝達拡大レンズ系6は2群のレンズからなるのに伴い、入射側レンズ群の焦点距離をfin 、出射側レンズ群の焦点距離をfoutとしている。
Ea=Aexpj(2π(fo+fc+fm)t)
Eb=Bexpj(2π(fo+fc-fm)t+δ)
この複素振幅Ebの式のδは、ビームLAのスポットAを基準としたビームLBのスポットBの高さ方向の位相差を表わし、foは光の周波数を表す。なお、前述したように、この2つのスポット間隔は、音響光学変調素子4aに加えた変調周波数fmと拡大光学系の倍率m4によって決定されるので、走査速度とは無関係である。
I=(Ea+Eb)(Ea+Eb)*=A2+B2+2ABcos(2π*2fmt+δ)
したがって、信号比較器21を用いて、周波数2fmのヘテロダイン検波の位相比較を行うことにより、位相差δを測定することができる。このようにすれば、変調周波数fmを高くし、かつ、ビームを非常に接近させることができるので、横分解能を高くすることができると同時に、データの取得を高速に行うことができる。
さて、上記のように音響光学変調素子にキャリア信号fcと変調信号fmの掛け算信号(DSB変調)を与えると、実質上、回折光は2つの僅かに分離したfc±fmの周波数を持った光となる。対物レンズで収束されるとΔxだけ分離した2つのビームとなり、各ビームプロファイルをu(x)とする。この場合、対物レンズから離れた場所では、表面プロファイルとビームプロファイルの積のフーリエ変換となる。
E=∫(Aejθ(x) u(x)ejkxdx・ej(ωc-ωm)t+Aejθ(x+Δx) u(x)ejkxdx・ej(ωc+ωm)tとなる。
I(k)=A2∫ej(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’e-j2ωmt
+A2∫e-j(θ(x)-θ(x'+Δx') u(x) u(x’) ejk(x-x')dxdx’ej2ωmt・・・・・(1)式
ここでまず、2つの受光素子の和信号がどのようになるかを考える。対象物Sから離れた位置では、フーリエ変換面であると考えられるので、受光素子で受光できる最大空間周波数をKmaxとすると、和信号では強度Iが下記式から求められる。
I=∫I(k)dk(積分範囲は-KmaxからKmax)
=A2∫cos(θ(x)−θ(x’+Δx’)−2ωmt) u(x) u(x’)sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)dxdx’
sin(Kmax(x-x’))/(x-x’)=Kδ(x-x’)となるので、以下の(2)式のようになる。
I=A2∫cos(θ(x) −θ(x+Δx) −2ωmt) u(x)2dx・・・・・(2)式
(2)式を変形すると下記の式を得る。
Iq=A2∫cos(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2dx・cos(2ωmt)
Ii=A2∫sin(θ(x)−θ(x+Δx) u(x)2dx・sin(2ωmt)
Θ=tan-1(∫sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx/∫cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx)・・・・・(3)式
I=∫I(k)dk(積分範囲は0からKmax)−∫I(k)dk(積分範囲は−Kmaxから0)
=A2∫sin(θ(x)−θ(x’+Δx’)−2ωmt) u(x) u(x’)( cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)dxdx’
(cos(Kmax(x-x’)-1)/(x-x’)=δ’(x-x’)+1/x(δ(x)-1)となるので、下記(4)式のようになる。
I=A2∫d/dx(sin(θ(x)―θ(x+Δx)―2ωmt) )u(x)2dx・・・・・(4)式
さらに、この(4)式を変形すると、下記のようになる。
Iq=A2∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx・cos(2ωmt)
Ii=−A2∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx・sin(2ωmt)
Θ=tan-1(−∫d/dx(cos(θ(x)−θ(x+Δx)) u(x)2dx/∫d/dx(sin(θ(x)−θ(x+Δx))u(x)2dx)・・・・・(5)式
まず、(3)式では、ビームの中心距離Δxだけ離れた2点の位相差をu(x)の重み関数で、平滑化した結果として得られる位相差を示しているので、ビーム内の平均的な位相差を示している。これは、微分干渉顕微鏡と等価な処理である。
図5は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る反射型の光学系のブロック図を示している。なお、本実施例の他、以下の実施例は、実施例1と同様の構成とされている箇所を有するが、実施例1と同様に構成されている箇所の説明を省略する。
本実施例では、実施例1の照明光学系のダイクロイックミラー18、受光素子19a、19b、光電変換部20a、20b等がなく、この替わりに、制限開口8と第1の1次元走査ディバイス11の間にビームスプリッター9が配置された構造とされている。
これに伴って、光電変換部26aで、受光素子25aの各分割受光素子に1対1で対応した電気的増幅を行い、信号比較器27において必要に応じた素子の組合せで蛍光による和信号または差信号を作成する。また、光電変換部26bで、受光素子25bの各分割受光素子に1対1で対応した電気的増幅を行い、信号比較器27において必要に応じた素子の組合せでレーザー光による和信号または差信号を作成する。
図6は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る2波長励起型の光学系のブロック図を示している。なお、図6における矢印Aより見た図は、実施例1の図2と同様なので、省略する。実施例1において用いられるレーザー光源1a、コリメーターレンズ2a、ビーム成形光学系3aの他、このレーザー光源1aとは異なる波長で異なる波長の蛍光を発光させるレーザー光源1bを有している。さらに、このレーザー光源1bのレーザー光を平行光束にするコリメーターレンズ2bとビーム成形光学系3bを有していて、音響光学変調素子4aに対して最適な径となるようにこのレーザー光源1bのレーザー光が成形される。これに伴い、レーザー光源1aが第1のレーザー光源であり、レーザー光源1bが第2のレーザー光源である。
従って、相互に波長の異なる2つレーザー光源1a、1bで音響光学変調素子4aを射出する光束の分離角を同じ角度とするためには、前出の回折角の式により印加する周波数を異ならせる必要がある。このため、各レーザー光源1a、1bを使用する際に印加する周波数を変更するが、以下の実施例においてもこのことは同様である。
以上より、データ処理部22において、信号比較器21からの信号を制御基板14からの音響光学変調素子4aの変調信号を用いてヘテロダイン検波を行い、実質的な直交変換により強度情報と位相情報を得る。
図7は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例3の照明光学系と同様に、レーザー光源1b、コリメーターレンズ2b、ビーム成形光学系3bおよびダイクロイックミラー5aを有している。
また、実施例2の反射光学系と同様に、ビームスプリッター9、ダイクロイックミラー24a、24b、受光素子25a、25b、光電変換部26a、26b、信号比較器27等を有している。そして、本実施例では、受光素子25aが第1の受光素子であり、受光素子25bが第2の受光素子である。したがって、実施例2と同様に、対物レンズ16から戻ってきた光束は、偏向成分がキャンセルされて、軸上光となり、ビームスプリッター9で直角に反射される。
2つのダイクロイックミラー24a、24bのいずれかを透過した蛍光光束は、受光素子25aに導かれ、2つのダイクロイックミラー24a、24bのいずれかを反射した反射レーザー光束は、受光素子25bに導かれる。
図8は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例3の照明光学系と同様に、レーザー光源1b、コリメーターレンズ2b、ビーム成形光学系3bを有している。そして、本実施例では音響光学変調素子4bをも有している他、ダイクロイックミラー5aの替わりに、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bがこれらの間に配置されている。これに伴い、音響光学変調素子4aが第1の光変調器であり、音響光学変調素子4bが第2の光変調器である。なお、以下の照明光学系は実施例1及び実施例3と同じため、説明を割愛する。
レーザー光源1a、1bからのレーザー光は、対象物Sを透過すると、第1のレーザー波長の光により蛍光が励起され、この蛍光とレーザー光源1a、1bによる透過光は、対象物S直下に設置されたダイクロイックミラー18aに入射される。このダイクロイックミラー18aは、第1のレーザー波長の光を反射し、第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第2のレーザー波長の光を透過する、波長選択性を有しているので、対象物S直下でこれらの光が分離される。ここで、第2のレーザー波長は、レーザー光源1bからのレーザー光の波長とされる。
光電変換部20aで、受光素子19aの各分割受光素子に1対1で対応した電気的増幅を行い、信号比較器21aにおいて、必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
図9は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例5の照明光学系のように、レーザー光源1b、コリメーターレンズ2b、ビーム成形光学系3b、音響光学変調素子4bを有している他、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bをも有している。
レーザー光源1a、1bからのレーザー光は対象物Sで反射すると、第1のレーザー波長の光により蛍光が励起され、対象物Sで第1のレーザー波長の光により励起された蛍光及び反射されたレーザー光は、照明光束と逆の光路を戻る。つまり、対物レンズ16、第3の瞳伝達レンズ系15、第2の1元走査ディバイス13、第2の瞳伝達レンズ系12、及び第1の1元走査ディバイス11を戻ることにより偏向成分がキャンセルされ軸上光となり、ビームスプリッター9で直角に反射される。
光電変換部26aで、受光素子25aの各分割受光素子に1対1で対応した電気的増幅を行い、信号比較器27aにおいて必要に応じた素子の組合せで戻り光による和信号または差信号を作成する。
図10は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。なお、図10における矢印Aより見た図は、実施例1の図2と同様なので、省略する。本実施例は、実施例5と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー5aの替わりに、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bが配置されている。なお、以下の照明光学系は実施例1及び実施例5と同じため、説明を割愛する。
ダイクロイックミラー18aが、第1のレーザー波長の光および、第2のレーザー波長の光によって励起された蛍光を反射し、第1のレーザー波長によって励起された蛍光および、第2のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。ダイクロイックミラー18bが、第1のレーザー波長の光および第2のレーザー波長の光を反射し、第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、第2のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
この際、ダイクロイックミラー18aまたはダイクロイックミラー18bのどちらか一方を、使用するレーザー光の波長と蛍光色素の組合せによって、切替機構28により自動または手動により、切り替わる。前記切替機構28は自動の場合、励起レーザーの選択に応じ、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
図11は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。 本実施例は、実施例5と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー5aの替わりに、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bが配置されている。なお、以下の照明光学系は実施例1及び実施例2と同じため、説明を割愛する。
ダイクロイックミラー24aが、第1のレーザー波長の光および第2のレーザー波長の光によって励起された蛍光を反射し、第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第2のレーザー波長の光を透過する波長選択性を持っている。ダイクロイックミラー24bが、第1のレーザー波長および第2のレーザー波長の光を反射し、第1のレーザー波長および第2のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
この際、ダイクロイックミラー24aまたはダイクロイックミラー24bのどちらか一方を、使用するレーザー波長の光と蛍光色素の組合せによって、切替機構29により自動または手動により切り替わる。前記切替機構29は自動の場合、励起レーザーの選択に応じ、リニアーアクチュエータによるスライド機構またはステッピングモータによる回転機構により切替が行われる。また、手動の場合、励起レーザーの選択に応じ、スライド機構または回転機構により切替を行う。
図12は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示しており、図13は、図12の矢印Aより見た要部拡大図である。本実施例は、実施例5と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー5aの替わりに、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bが配置されている。
また、ダイクロイックミラー18bは、第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および第2のレーザー波長の光を反射し、第2のレーザー波長の光によって励起された蛍光を透過する波長選択性を持っている。
図14は、本実施例のレーザー走査蛍光顕微鏡装置に係る光学系のブロック図を示している。本実施例は、実施例5と同様の光学系とされ、ダイクロイックミラー5aの替わりに、音響光学変調素子4aと音響光学変調素子4bとからの光束を同一光路上に合成するダイクロイックミラー5bが配置されている。
さらに、実施例8と同様にビームスプリッター9が配置されていて、レーザー光により励起された蛍光と反射光はこのビームスプリッター9で分離されるが、分離された光軸L上には、第1の光学フィルターであるダイクロイックミラー24a及び第2の光学フィルターであるダイクロイックミラー24bが設置されている。
第1〜3の受光素子である受光素子25a、25b、25cは、音響光学変調素子4a、4bによって分離されたビームの方向に沿って光軸Lを対称に複数に分割して配置されている分割受光素子により、それぞれ構成されている。
ダイクロイックミラー24aに、第1のレーザー波長の光を透過し、第1のレーザー波長の光、第2のレーザー波長によって励起された蛍光および第2のレーザー波長の光を反射する波長選択性を持たせた場合は、ダイクロイックミラー24aの反射側に隣り合わせてダイクロイックミラー24bを設置すればよく、また、ダイクロイックミラー24bの反射透過波長特性が逆の場合でも可能で、それぞれ、受光素子で検出可能な信号が換わることになる。
2a,2b コリメーターレンズ
3a,3b ビーム整形光学系
4a,4b 音響光学変調素子
5a,5b ダイクロイックミラー
6 第1の瞳伝達拡大レンズ系
7 ピンホール
8 制限開口
9 ビームスプリッター
11 第1の1次元走査ディバイス
12 第2の瞳伝達拡大レンズ系
13 第2の1次元走査ディバイス
14 制御基板
15 第3の瞳伝達拡大レンズ系
16 対物レンズ
18,18a,18b ダイクロイックミラー
19a,19b,19c 受光素子
20a,20b,20c 光電変換部
21,21a,21b,21c 信号比較器
22 データ処理部
23 ディスプレー
24,24a,24b ダイクロイックミラー
25a,25b,25c 受光素子
26a,26b,26c 光電変換部
27,27a,27b,27c 信号比較器
28, 29 切替機構
S 対象物
Claims (14)
- 蛍光色素を励起し蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する光変調器と、
前記2つの光を1次元走査あるいは2次元走査する走査素子面を有する走査光学素子と、
瞳位置を有し、配置されている対象物に2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器の回折光出射面と該対物レンズの瞳位置とを共役な配置とするように、前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器から出射された2つの光を拡大する瞳伝達拡大レンズ系と、
対象物を透過しあるいは反射したレーザー光とこのレーザー光によって励起された蛍光とを分離する光学フィルターと、
前記光学フィルターにより分離されたレーザー光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第1の受光素子と、
前記光学フィルターにより分離された蛍光を受光し、かつ前記光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されている第2の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第1の光電変換部と、
前記第2の受光素子で光電変換された信号を前記光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し各々の信号により和算または差算を行う第2の光電変換部と、
前記各光電変換部の和算または差算に基づいて得られたビームの位相情報および強度情報を求める信号比較器と、
前記信号比較器の位相情報および強度情報と前記走査光学素子の制御信号とに基づき2次元の画像を構築するデータ処理部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 前記光学フィルターが、対象物を透過したレーザー光を反射し、レーザー光によって励起された蛍光を透過することで、これらの光を分離し、
前記第1の受光素子が、前記光学フィルターにより反射された光束を受光すると共に、前記第2の受光素子が、前記光学フィルターを透過した光束を受光することを特徴とする請求項1記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、この反射光を前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項1記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
- 前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第1のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第2のレーザー光源と、からなり、
前記光学フィルターが、前記第1のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、前記第2のレーザー光源からのレーザー光を反射し、このレーザー光によって励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、からなり、
2つのレーザー光源から出射されたレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーと、
前記第1の光学フィルターと前記第2の光学フィルターとを使用するレーザー光に合わせ切り替える切替手段と、
を有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光変調器が、各レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光にそれぞれ変調させつつ、ビームの分離角を相互に同一とした相互に異なる方向にそれぞれ出射し、
前記第1の受光素子が、各光学フィルターで反射されたレーザー光を受光し、前記第2の受光素子が、各光学フィルターで透過した光束を受光し、
第1の光電変換部および第2の光電変換部が、前記第1のレーザー光源を使用する際には、第1の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第2のレーザー光源を使用する際には、第2の変調周波数でヘテロダイン検波することを特徴とする請求項1記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項4記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
- 前記レーザー光源が、蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第1のレーザー光源と、前記レーザー光と異なる波長の蛍光を発光させる波長のレーザー光を出射する第2のレーザー光源と、からなり、
前記光変調器が、2つのレーザー光源からのレーザー光のいずれかを相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ相互に異なる方向に出射する第1の光変調器と、第1の光変調器とは異なる周波数の光に変調し、かつ前記第1の光変調器による光の分離方向と同一に相互に異なる方向に出射する第2の光変調器と、からなり、
2つのレーザー光源から出射したレーザー光を同一光路上に合波するダイクロイックミラーを有したレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記光学フィルターが、第1のレーザー波長の光および、第2のレーザー波長の光により励起された蛍光を反射し、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第2のレーザー波長の光を透過し、
前記第1の受光素子が、前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割され、
前記第2の受光素子が、前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割されていることを特徴とする請求項1記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 光変調器と走査光学素子との間にビームスプリッターが配置され、該ビームスプリッターが、レーザー光源からのレーザー光を透過し、対象物から反射され前記対物レンズおよび前記走査光学素子を経た光を反射して、前記光学フィルターに送ることを特徴とする請求項6記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
- 前記光学フィルターが、
前記第1のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第2のレーザー波長の光および、前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、
前記第1の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光および、前記第2のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、
からなる請求項6記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置であって、
前記第1の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第1の受光素子と、
前記第2の光学フィルターを反射した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第2の受光素子と、
前記第2の光学フィルターを透過した光束を受光し、かつ前記第1および第2の光変調器によって生じるビームの分離方向に沿って複数に分割された第3の受光素子と、
前記第1の受光素子で光電変換した信号を前記第1の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第1の光電変換部と、
前記第2の受光素子で光電変換した信号の内、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光の信号を前記第1の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波し、前記第2のレーザー波長の光の信号を前記第2の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから、それぞれ和算または差算を行う第2の光電変換部と、
前記第3の受光素子で光電変換された信号を前記第2の光変調器の変調周波数でヘテロダイン検波してから和算または差算を行う第3の光電変換部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 前記光学フィルターが、
前記第1のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、前記第2のレーザー波長の光および前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第1の光学フィルターと、
前記第1の光学フィルターを透過した光束の内の、前記第1のレーザー波長の光によって励起された蛍光、および前記第2のレーザー波長の光を反射し、かつ前記第2のレーザー波長の光で励起された蛍光を透過する第2の光学フィルターと、
からなることを特徴とする請求項7記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 励起された蛍光から光電変換された信号をヘテロダイン検波する際に、ヘテロダイン検波の位相を光変調器の変調周波数に対して補正することを特徴とする請求項1から請求項9のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
- 前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる音響光学変調素子と、
前記音響光学変調素子にキャリア交流信号と正弦波信号を印加する信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項1から請求項10のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 前記光変調器は、
前記レーザー光源から出射されたレーザー光が入射させる空間光変調器と、
前記空間光変調器に振幅または位相情報として正弦波状の格子縞を書き込み、キャリア交流信号と正弦波信号を印加して、前記格子縞を一定方向に移動させる信号発生器と、
を含むことを特徴とする請求項1から請求項10のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。 - 前記第1の光電変換部および第2の光電変換部で作成されたビート信号は、前記第1の受光素子および第2の受光素子の2分割以上された複数の受光素子のすべての受光素子の和信号、または、2分割以上された分割素子の対応する位置にある受光素子同士の差信号より取得することを特徴とする請求項1から請求項10のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
- 前記走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーによる1次元走査素子、非線形光学結晶やフォトニック結晶を用いた光走査ディバイス、2つの1次元走査ディバイスと瞳伝達拡大レンズ系よりなる2次元走査光学系、あるいは、1次元走査または2次元走査のマイクロミラーディバイスよりなることを特徴とする請求項1から請求項13のいずれかに記載のレーザー走査蛍光顕微鏡装置。
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