JP2005091895A - 走査型共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の異なる波長の励起光に対応して発する複数の波長の蛍光を簡易かつ同時に分別することができる走査型共焦点顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】蛍光試薬を励起させる２つの励起光を試料２３に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置において、複数の異なる周波数信号を変調信号Ｆ１，Ｆ２として出力する周波数発生部２と、変調信号Ｆ１，Ｆ２によって２つの励起光を変調する変調部２７ａ，２７ｂと、変調部２７ａ，２７ｂによって変調された各変調励起光に応じて発光した蛍光を電気信号に変換する光電子増倍管１２と、光電子増倍管１２から出力された電気信号を異なる変調信号Ｆ１，Ｆ２の周波数毎に周波数分離して出力する周波数分離部１１とを備える。
【選択図】 図１

Description

この発明は、たとえば蛍光試薬によって蛍光染色された蛍光色素や蛍光蛋白を含む試料に励起光を照射し、この蛍光試薬や蛍光蛋白から発する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置に関するものである。

生物化学の分野において通常の光学顕微鏡を用いると、観察対象の組織を非常に薄い切片にする必要があるが、薄い切片にすると、観察画像は、鮮明になる一方、立体としての情報が失われる。また、切片を厚くすると、光軸方向のどの面で焦点を合わせても、その上下の焦点の合わない面からの情報が混入してノイズの多い低品質の画像しか得られない。一方、電子顕微鏡を用いると、分解能の点で圧倒的に優れているが、生細胞・組織、水中の組織などを観察できないという致命的な制約がある。このため、上述した不具合を解決することができるレーザ走査型共焦点顕微鏡が生物学や医学の分野で注目されている。

レーザビームを、ピンホールを通して集光して、厚い試料中の１点に焦点を合わせると、主に、この小さいスポットの中の蛍光物質のみが励起され蛍光を発する。スポットから逆行する蛍光は共焦点ピンホールに達し、迷光や散乱光によるノイズが除かれて厳密に１つのスポットからきた蛍光のみが光検出器で測定される。このようにして試料中の１点のみからの情報を得た後に、試料全体の情報を得るためレーザビームを走査すると、結果的に暗い３次元空間内でスポット大の光学的切片が切り出され、その集合として試料の全体像が得られる。

また、レーザビームを励起光として用いると、レーザは単波長の空間的・時間的コヒーレントが高い光で、指向性が非常に高く長距離伝送における広がりがきわめて小さい。このため、ピンホールを２つ用いる共焦点系を採用するにはレーザビームを用いることが必須といえる。

また、共焦点を用いると、レーザビームによる励起光はまず１つのピンホールを通過して、試料内の観察した１点のみを照射する。この点から発した蛍光はレーザビームと異なる自然放出光であるため指向性が低い。またレーザビームで照射したスポットは多少の空間的広がりをもつことは避けられないので、必要のない点からの情報がわずかながら混ざって励起される。光検出器の直前に挿入されたもう１つのピンホールによって逆行する蛍光を絞ると、これらの必要外の情報がカットされ、ほぼ厳密にレーザビームが照射したスポット１点からの蛍光（光学的切片）が測定できることになる。

また、上述した迷光や散乱光の影響を最小限にとどめるには、視野全体の照射を避け、小さな光スポットで１点ずつ試料を走査すればよい。すると、ＸＹ平面上の全て点で焦点が合った情報が得られ、高解像度・高コントラストの画像を得ることができる。またこのように１点ずつの情報（光学的切片）をデジタルデータとして扱うことが可能であり、各種画像処理をはじめとしてデータ処理に都合がよい。

そのため、レーザ走査型共焦点顕微鏡では、試料を局在的に、リアルタイムに、しかも立体的（３次元）に観察できるという特徴を備えている。また、さらに、分解能が高くシャープな画像と、試料の各点のデータがデジタル的に得られ、染色法の工夫で容易に多重染色を用いることができ、生細胞・組織の観察ができるという特徴も備えている。

図１６は、従来の走査型共焦点顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。図１６において、この走査型共焦点顕微鏡装置は、レーザユニット１と、走査ユニット３と、顕微鏡ユニット４と、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）５とを有している。レーザユニット１と走査ユニット３は、ファイバ９によって接続されており、走査ユニット３は、リレーレンズ１８によって、顕微鏡ユニット４と接続されている。

レーザユニット１から出射した２種類の波長のレーザビームは、走査ユニット３を介して、顕微鏡ユニット４に入射し、試料２３中の焦点位置２４に集光する。焦点位置２４からは夫々の波長に対する蛍光が発光し、蛍光は走査ユニット３に入射し、ダイクロイックミラー１６で反射し、夫々の波長に分離されて光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）１２ａ，１２ｂに入射する。ＰＭＴ１２ａ，１２ｂは入射した蛍光を電気信号に変換して、出力信号Ｓ１，Ｓ２をＰＣ５に出力する。ＰＣ５は入力した信号Ｓ１，Ｓ２を画像処理し、画像表示部２６に表示する。

すなわち、図１７―１に示すようにレーザ発振器６ａからは波長３５１ｎｍの励起光Ｅｘ１がレーザ出力され、レーザ発振器６ｂからは波長４８８ｎｍの励起光Ｅｘ２のレーザ出力がされる。そして、それぞれ対応して、図１７―２に示すように焦点位置２４では、蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１と、蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２とが同一ビーム光として蛍光出力され、主としてダイクロイックミラー１６によってこれら蛍光Ｅｍ１，Ｅｍ２を蛍光の波長の違いで分離し（図１７―３，図１７―４）、この分離された各蛍光Ｅｍ１，Ｅｍ２を複数のＰＭＴ１２ａ，１２ｂによって個別に検出するようにしている。

特開平１１−２３１２２２号公報

しかしながら、上述した従来の走査型共焦点顕微鏡装置を用いた蛍光波長ごとの識別表示を行う場合、蛍光波長ごとにＰＭＴ１２ａ，１２ｂと、ピンホール１３ａ，１３ｂと、励起光カット素子１４ａ，１４ｂと、コンフォーカルレンズ１５ａ，１５ｂと、ダイクロイックミラー１６ａ，１６ｂ等の光学系を備える必要があった。この結果、装置が大型化するとともに、焦点位置２４から発した蛍光Ｅｍ１，Ｅｍ２が多くの光学系を通過するため、蛍光光量のロスが多くなり、信号Ｓ１，Ｓ２のＳ／Ｎ比は小さくなり、最終的に得られる画像は、低解像度になるという問題点があった。

また、蛍光試薬の染色の違いに対応して、複数の異なる励起波長の励起光の照射に対して同一の蛍光波長を発光する試料が存在し、試料中の蛍光試薬の染色分布を調べる２波長励起１波長蛍光法がある。この２波長励起１波長蛍光法では、蛍光波長が同一であるため、励起波長ごとに時分割した蛍光観察をせざるを得ない。この結果、画像構築に多大な手間と時間を要するという問題点があった。

一方、２波長励起１波長蛍光法において、光学系を１つにし、ダイクロイックミラー１６を交換し、蛍光波長毎に画像を採取し、後に蛍光波長毎の画像を合成することができるが、この場合、画像構築に多大の時間を要し、リアルタイムで試料２３の変化が観察できないという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、複数の異なる波長の励起光に対応して発する複数の波長の蛍光を簡易かつ同時に分別することができる走査型共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、請求項１にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、蛍光試薬を励起させる１以上の励起光を試料に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置において、１以上の異なる周波数信号を変調信号として出力する周波数発生手段と、前記変調信号によって前記１以上の励起光を変調する変調手段と、前記変調手段によって変調された１以上の変調励起光に応じて発光した蛍光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記変調信号を用いて、前記光電変換手段から出力された電気信号を前記１以上の異なる周波数毎に周波数分離して出力する周波数分離手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる走査方共焦点顕微鏡装置は、蛍光試薬を励起させる複数の励起光を試料に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置において、複数の異なる位相をもった周波数信号を変調信号として出力する移相発生手段と、前記変調信号によって前記複数の励起光を変調する変調手段と、前記変調手段によって変調された複数の変調励起光に応じて発光した蛍光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記変調信号を用いて、前記光電変換手段から出力された電気信号を前記複数の異なる位相毎に位相分離して出力する位相分離手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項３にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記周波数分離手段は、前記変調信号の周波数に対応した１以上の可変周波数フィルタを用いて周波数分離することを特徴とする。

また、請求項４にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記周波数分離手段は、前記電気信号に対して高速フーリエ変換を施し、前記変調信号の周波数に対応した信号を抽出することによって周波数分離することを特徴とする。

また、請求項５にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記１以上の励起光または前記１以上の変調励起光を偏光光に変換する偏光手段を備えたことを特徴とする。

また、請求項６にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記偏光手段は、一つの励起光に対して互いに直交する偏光光に変換する２つの偏光手段であることを特徴とする。

また、請求項７にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記変調手段は、各変調信号によって各１以上の励起光を出力する励起光源の駆動要素に変調をかけることを特徴とする。

また、請求項８にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記変調手段は、前記１以上の励起光を出力する各励起光源から出力された各励起光に対して変調をかけることを特徴とする。

また、請求項９にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記１以上の励起光は、２光子励起法に対応した励起光であることを特徴とする。

また、請求項１０にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記１以上の励起光は、レーザ光であることを特徴とする。

また、請求項１１にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記１以上の励起光は、チタンサファイヤレーザから出力されたレーザ光であることを特徴とする。

この発明によれば、異なる励起波長の励起光に異なる周波数による変調をかけて、異なる蛍光波長の蛍光を一括して電気信号に変換し、その後変調信号によって周波数分離するようにしているので、簡易な光学系の構成で済み、かつ異なる複数の蛍光に対応した蛍光画像を同時に得ることができるという効果を奏する。

また、この発明によれば、２波長励起１波長蛍光法による蛍光観察である場合や、偏光光によって蛍光特性が異なる蛍光観察である場合であっても、異なる複数の励起光に対応した蛍光を同時に識別できるという効果を奏する。

また、この発明によれば、異なる励起波長の励起光に異なる位相の変調をかけて、異なる蛍光波長の蛍光を一括して電気信号に変換し、その後変調信号によって位相分離するようにしているので、簡易な光学系の構成で済み、かつ異なる複数の蛍光に対応した蛍光画像を同時に得ることができるという効果を奏する。

以下に、図面を参照して、この発明にかかる走査型共焦点顕微鏡装置の好適な実施の形態について説明する。

図１は、この発明の実施の形態１である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示すブロック図である。この走査型共焦点顕微鏡装置は、レーザユニット１０１と、周波数発生部２と、走査ユニット３０１と、顕微鏡ユニット４と、ＰＣ５とを有している。

レーザユニット１０１と走査ユニット３０１は、ファイバ９によって接続されており、走査ユニット３０１は、リレーレンズ１８によって、顕微鏡ユニット４と接続されている。また、周波数発生部２は、レーザユニット１０１の変調部２７ａ，２７ｂと走査ユニット３０１の周波数分離部１１に異なる変調信号Ｆ１，Ｆ２を送出している。そして、走査ユニット３０１の周波数分離部１１は、変調信号Ｆ１，Ｆ２を用いて波長分離された信号Ｓ１Ａ，Ｓ２ＡをＰＣ５に送出している。ＰＣ５は、入力した信号Ｓ１Ａ，Ｓ２Ａによって、蛍光波長ごとに識別した画像表示をおこなう。

周波数発生部２は、たとえば１０ＭＨｚの変調信号Ｆ１を発生する周波数発生器２ａと、たとえば２０ＭＨｚの変調信号Ｆ２を発生する周波数発生器２ｂとを有する。変調信号Ｆ１は、変調部２７ａおよび周波数分離部１１に送出され、変調信号Ｆ２は、変調部２７ｂおよび周波数分離部１１に送出される。

ここで、試料２３は、たとえば、蛍光試薬「ＤＡＰＩ」と、蛍光蛋白「ＧＦＰ」とで２重染色されているものとする。これに対応して、レーザ発振器６ａ，６ｂは、波長３５１ｎｍ，波長４８８ｎｍのレーザビームを夫々出射するものとする。

レーザユニット１０１の変調部２７ａは、レーザ駆動電源２８ａからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ１とが合成され、１０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ａに送出される。その結果、レーザ発振器６ａは１０ＭＨｚの変調のかかった波長３５１ｎｍのレーザビームを出射する。なお、変調度はレーザ出力１００％に対して数％が適当であり、ここでは３％としている（図２―１参照）。一方、変調部２７ｂで、レーザ駆動電源２８ｂからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ２とが合成され、２０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｂに送出される。その結果、レーザ発振器６ｂは２０ＭＨｚの変調のかかった波長４８８ｎｍのレーザビームを出射する。なお、ここでも上述と同様に変調度を３％としている（図２―２参照）。

レーザ発振器６ａから出射した波長３５１ｎｍのレーザビームはダイクロイックミラー７ａで反射し、ダイクロイックミラー７ｂで、レーザ発振器６ｂから出射した波長４８８ｎｍのレーザビームと合成される。合成されたレーザビームはカップリングレンズ８とファイバ９と、コリメートレンズ１０とを介して、走査ユニット３０１に入射する。

走査ユニット３０１は、入射したレーザビームを、ダイクロイックミラー１６を透過させ、つぎに走査光学ユニット１７によって試料２３上の観察ポイントに光路を変更し、さらにリレーレンズ１８を介して、顕微鏡ユニット４に出射する。顕微鏡ユニット４は、入射したレーザビームをミラー１９によって光路を試料２３方向に変更し、結像レンズ２０によってレーザビームを平行光にし、さらに対物レンズ２１によって、試料ステージ２２上に載置してある試料２３中の焦点位置２４にレーザビームを集光させる。焦点位置２４は、レーザビームが集光した１点であるが、走査させるため図１上では、平面上を指している。

例えば、蛍光試薬「ＤＡＰＩ」と、蛍光蛋白「ＧＦＰ」の例で説明する。蛍光試薬「ＤＡＰＩ」を励起させる１０ＭＨｚに変調のかかった励起波長３５１ｎｍの励起光Ｅｘ１Ａと、蛍光蛋白「ＧＦＰ」を励起させる２０ＭＨｚに変調のかかった励起波長４８８ｎｍの励起光Ｅｘ２Ａとが合成されたレーザビームが焦点位置２４に同時に照射されると、焦点位置２４からは、励起光Ｅｘ１Ａに対して１０ＭＨｚに変調のかかった蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａと、励起光Ｅｘ２Ａに対して２０ＭＨｚに変調のかかった蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａとが同時に発光する。

顕微鏡ユニット４は、焦点位置２４で発光した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを、焦点位置２４に入射したレーザビームと同じ光路を逆行させリレーレンズ１８を介し、走査ユニット３０１に出射する。走査ユニット３は、入射した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを、走査光学ユニット１７を介し、ダイクロイックミラー１６で反射させる。ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａは、コンフォーカルレンズ１５で集光し、励起光カット素子１４で励起光が除外され、さらに、ピンホール１３で焦点位置２４以外からの光が除外されてＰＭＴ１２に入射する。

ＰＭＴ１２は、入射した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを電気信号に変換し、出力信号ＳＰＡとして、周波数分離部１１に出力する。ＰＭＴ１２は、入射した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａの輝度に対応した電気信号に変換し、出力信号ＳＰＡとして出力する。そのため、ＰＭＴ１２は、蛍光Ｅｍ１Ａと蛍光Ｅｍ２Ａとが混在する光を入射するため、出力信号ＳＰＡからは蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａの波長を識別することはできない。しかし、ＰＭＴ１２は、蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａがもつ変調成分を反映させて出力信号ＳＰＡを出力させることはできる。

周波数分離部１１は、周波数発生部２から１０ＭＨｚの変調信号Ｆ１と２０ＭＨｚの変調信号Ｆ２とを入力している。そこで、周波数分離部１１は、ＰＭＴ１２から入力した出力信号ＳＰＡを変調信号Ｆ１，Ｆ２とによって、周波数分離する。出力信号ＳＰＡは、上述したように、１０ＭＨｚと２０ＭＨｚの変調成分をもっているため、１０ＭＨｚの変調成分をもつ変調信号Ｆ１と、２０ＭＨｚの変調成分をもつ変調信号Ｆ２とによって、周波数分離することができる。周波数分離を行うと、１０ＭＨｚの変調成分をもった蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａに対応した信号Ｓ１Ａと、２０ＭＨｚの変調成分をもった蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａに対応した信号Ｓ２Ａとに分離できる。

このようにして、周波数分離部１１は、蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａを信号Ｓ１Ａとして、また、蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａを信号Ｓ２Ａとして識別して、ＰＣ５に出力することができる。

ＰＣ５は、入力した信号Ｓ１Ａ，Ｓ２Ａを信号処理部２５に送出し、信号処理部２５は信号Ｓ１Ａ，Ｓ２Ａを画像信号に変換して画像表示部２６に送出する。画像表示部２６は蛍光Ｅｍ１Ａに対応した信号Ｓ１Ａと、蛍光Ｅｍ２Ａに対応した信号Ｓ２Ａを、たとえば、色を変えるなどによって、波長ごとに識別表示を行う。さらに、走査ユニット３０１は、走査光学ユニット１７によって、焦点位置２４を走査させ、また、ピンホール１３を変化させることによって、試料２３中の焦点位置２４の深さ方向を変化させ、試料２３中に存在する２種類の異なる蛍光を発する物質の立体像をリアルタイムに画像表示できる。

図３―１は、レーザ発振器６ａからは、１０ＭＨｚの変調のかかった波長３５１ｎｍの励起光Ｅｘ１Ａのレーザ出力が出射し、レーザ発振器６ｂからは、２０ＭＨｚの変調のかかった波長４８８ｎｍの励起光Ｅｘ２Ａのレーザ出力が出射することを示している。図３―２は、焦点位置２４で励起波長３５１ｎｍの励起光Ｅｘ１Ａが集光した結果、蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａが発光し、励起波長４８８ｎｍの励起光Ｅｘ２Ａが集光した結果、蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａが発光することを示している。図３―３は、ＰＭＴ１２が蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａの輝度に対応した電気信号に変換した出力信号ＳＰＡを送出することを示している。出力信号ＳＰＡは、１０ＭＨｚの変調成分をもった波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａに対応する信号と、２０ＭＨｚの変調成分をもった波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａに対応する信号が混在している。そのため、この信号ＳＰＡからは、蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを識別することはできない。

図３―４は、周波数分離部１１が周波数分離を行った後の周波数分離後信号Ｓ１Ａ，Ｓ２Ａを送出することを示している。周波数分離部１１は、１０ＭＨｚの変調信号Ｆ１と、２０ＭＨｚの変調信号Ｆ２とによって、出力信号ＳＰＡを周波数分離する。出力信号ＳＰＡは、１０ＭＨｚの変調成分と２０ＭＨｚの変調成分を含んでいるので、図３―４に示すように、波長４００ｎｍの信号Ｓ１Ａと波長５１５ｎｍの信号Ｓ２Ａとに分離することができる。このように、信号Ｓ１Ａと、信号Ｓ２Ａとに分離すれば、蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａと、蛍光波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａとを明確に識別できるようになる。

図４―１は、周波数分離部１１の具体例を示したブロック図である。周波数分離部１１は、高速フーリエ変換器（ＦＦＴ：Fast Fourier Transform）１１ｃがＰＭＴ１２からの出力信号ＳＰＡを入力し、波長ごとの信号に変換し、後段に設けた波長抽出フィルタ１１ｄで、変調信号Ｆ１によって１０ＭＨｚ成分の変調をもつ波長部分を取り出して波長４００ｎｍに対応する信号Ｓ１Ａを送出し、同様に、変調信号Ｆ２によって２０ＭＨｚ成分の変調成分を取り出して波長５１５ｎｍに対応する信号Ｓ２Ａを送出する。また、図４―２は、周波数分離部１１Ａの具体例を示したブロック図である。可変フィルタ１１ａに変調信号Ｆ１を入力して１０ＭＨｚの変調成分をもった信号Ｓ１Ａを抽出し、可変フィルタ１１ｂに変調信号Ｆ２を入力して２０ＭＨｚの変調成分をもった信号Ｓ２Ａを抽出する。

なお、上述の実施例１では、図５のブロック図に示すように、音響光学素子などの光変調器を変調部１２７ａ，１２７ｂに用いることによって、変調部１２７ａ，１２７ｂをレーザ発振器６ａ，６ｂのレーザ出射側に設けることができる。

上述した実施例１によれば、試料２３から発する蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを簡易な方法によって同時に識別して観察することができる。また、焦点位置２４から発光した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２ＡがＰＭＴ１２に入射するまでに経由する光学系が従来に比べて格段と少なくなり、光量のロスが少なくなる。したがって、多くの光学素子を必要とせずに、高いＳ／Ｎ比の蛍光画像が得られる。

つぎに、この発明の実施例２について説明する。上述した実施例１では、励起波長に対する蛍光波長が夫々異なっているために、レーザビームに夫々異なった変調をかけて、蛍光を識別していたが、この実施例２では、異なる励起波長に対する蛍光が同一波長の場合においても、レーザビームに異なった変調をかけて、発光する蛍光の違いを識別するようにしている。

図６は、この発明の実施例２である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示すブロック図である。レーザユニット１０３は、レーザ発振器６ｃの発振波長を３４０ｎｍとし、レーザ発振器６ｄの発振波長を３８０ｎｍとしている。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付す。図６において、変調部２７ａで、レーザ駆動電源２８ａからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ１とが合成され、１０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｃに送出される。その結果、レーザ発振器６ｃは１０ＭＨｚの変調のかかった波長３４０ｎｍのレーザビームを出射する。一方、変調部２７ｂで、レーザ駆動電源２８ｂからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ２とが合成され、２０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｄに送出される。その結果、レーザ発振器６ｄは２０ＭＨｚの変調のかかった波長３８０ｎｍのレーザビームを出射する。

試料２３は、「ｂｉｓ−Ｆｕｒａ−２」の蛍光試薬で染色され、蛍光波長は５１０ｎｍで同一であるものの、カルシウムイオンの濃度差によって、励起光Ｅｘ１Ｂ，Ｅｘ２Ｂに依存して、蛍光Ｅｍ２Ｂの発光強度が異なることが知られている。そこで、励起光Ｅｘ１Ｂ，Ｅｘ２Ｂに対応する蛍光Ｅｍ２Ｂを分別観察することによって、試料中のカルシウムイオン濃度差を知ることができる。

図７―１は、レーザ発振器６ｃからは、１０ＭＨｚの変調のかかった波長３４０ｎｍの励起光Ｅｘ１Ｂのレーザビームが出射し、レーザ発振器６ｄからは、２０ＭＨｚの変調のかかった波長３８０ｎｍの励起光Ｅｘ２Ｂのレーザビームが出射することを示している。図７―２は、焦点位置２４で励起波長３４０ｎｍの励起光Ｅｘ１Ｂと励起波長３８０ｎｍの励起光Ｅｘ２Ｂとが集光した結果、蛍光波長５１０ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ｂが発光することを示している。図７―３は、ＰＭＴ１２が蛍光Ｅｍ２Ｂの輝度に対応した電気信号に変換した出力信号ＳＰＢを送出することを示している。出力信号ＳＰＢは、１０ＭＨｚの変調成分と２０ＭＨｚの変調成分とをもった波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ｂに対応する信号であるため、この信号ＳＰＢからは、どの励起光Ｅｘ１Ｂ，Ｅｘ２Ｂによるものかを識別することはできない。

図７―４は、周波数分離部１１が周波数分離を行った後の周波数分離後の信号Ｓ１Ｂ，Ｓ２Ｂを送出することを示している。周波数分離部１１は、１０ＭＨｚの変調信号Ｆ１と、２０ＭＨｚの変調信号Ｆ２とによって、出力信号ＳＰＢを周波数分離する。出力信号ＳＰＢは、１０ＭＨｚの変調成分と２０ＭＨｚの変調成分を含んでいるので、図７―４に示すように、同一波長５１０ｎｍの信号Ｓ１Ｂ，Ｓ２Ｂとに分離することができる。このように、信号Ｓ１Ｂ，Ｓ２Ｂとに分離すれば、蛍光Ｅｍ２Ｂが分解されて、励起光Ｅｘ１Ｂが起因する蛍光Ｅｍ２Ｂの部分と、励起光Ｅｘ２Ｂが起因する蛍光Ｅｍ２Ｂの部分とを明確に識別できるようになる。

つぎに、この発明の実施例３について説明する。上述した実施例２では、異なる波長の励起光に対して同一波長の蛍光を識別するようにしていたが、この実施例３では、異なる偏光成分の励起光に対して同一波長の蛍光が発光する場合においても、レーザビームに異なった変調をかけて、発光する蛍光の違いを識別するようにしている。

図８は、この発明の実施例３である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示す機能ブロック図である。レーザユニット１０４は、レーザ発振器６ｅの発振波長をλ１とし、レーザ発振器６ｅのレーザ出射側にＰ波（紙面に対して垂直な偏光成分を透過する偏光特性をもつものを以下、Ｐ波と称す。）の偏光特性をもつフィルタ２９ａを備えている。また、レーザ発振器６ｆの発振波長をλ１とし、レーザ発振器６ｆのレーザ出射側にＳ波（紙面に対して平行な偏光成分を透過する偏光特性をもつものを以下、Ｓ波と称す。）の偏光特性をもつフィルタ２９ｂを備えている。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付す。

変調部２７ａで、レーザ駆動電源２８ａからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ１とが合成され、１０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｅに送出される。そして、レーザ出射側に取り付けられた偏光フィルタ２９ａにより、レーザ発振器６ｅは１０ＭＨｚの変調のかかった、さらにＰ波の偏光特性をもった波長λ１のレーザビームを出射する。

一方、変調部２７ｂで、レーザ駆動電源２８ｂからのレーザ駆動信号と変調信号Ｆ２とが合成され、２０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｆに送出される。そして、レーザ出射側に取り付けられた偏光フィルタ２９ｂにより、レーザ発振器６ｆは２０ＭＨｚの変調のかかった、さらにＳ波の偏光特性をもった波長λ１のレーザビームを出射する。

なお、上述のレーザユニット１０４は、レーザ発振器６ｅ，６ｆを偏光成分ごとに設けていたが、図９に示すように、偏光ビームスプリッタ７ｃ，７ｆとミラー７ｄ，７ｅとを組み合わせ、さらに、光変調器２７ｃ，２７ｄと偏光フィルタ２９ｃ，２９ｄとを設けることによって、レーザ発振器６ｅを１台とすることも可能である。

試料２３の蛍光試薬の染色状況によって、蛍光波長λ２は同一であるものの、試料２３中の特定の物質差によって、Ｐ波の偏光成分をもつ励起光ＥｘＰに対して励起するものと、Ｓ波の偏光成分をもつ励起光ＥｘＳに対して励起するものがある。そこで、励起光Ｅｘ１Ｐ，ＥｘＳに対応する蛍光ＥｍＰＳを励起光Ｅｘ１Ｐ，ＥｘＳごとに分別観察すると、試料中の特定の物質差を知ることができる。

図１０―１は、レーザ発振器６ｅからは、１０ＭＨｚの変調のかかった波長λ１の励起光ＥｘＰのレーザビームが出射し、レーザ発振器６ｆからは、２０ＭＨｚの変調のかかった波長λ１の励起光ＥｘＳのレーザビームが出射することを示している。図１０―２は、焦点位置２４で励起波長λ１の励起光ＥｘＰと励起光ＥｘＳとが集光した結果、蛍光波長λ２の蛍光ＥｍＰＳが発光することを示している。図１０―３は、ＰＭＴ１２が蛍光ＥｍＰＳの輝度に対応した電気信号に変換した出力信号ＳＨを送出することを示している。出力信号ＳＨは、１０ＭＨｚの変調成分と２０ＭＨｚの変調成分とをもった波長λ２の蛍光ＥｍＰＳに対応する信号であるため、この信号ＳＨからは、どの励起光ＥｘＰ，ＥｘＳによるものかを識別することはできない。

図１０―４は、周波数分離部１１が周波数分離を行った後の周波数分離後信号ＳＰ，ＳＳを送出することを示している。周波数分離部１１は、１０ＭＨｚの変調信号Ｆ１と、２０ＭＨｚの変調信号Ｆ２とによって、出力信号ＳＨを周波数分離する。出力信号ＳＨは、１０ＭＨｚの変調成分と２０ＭＨｚの変調成分を含んでいるので、図１０―４に示すように、同一波長λ２の信号ＳＰ，ＳＳとに分離することができる。このように、信号ＳＰ，ＳＳとに分離すれば、蛍光ＥｍＰＳに起因する励起光ＥｘＰ，ＥｘＳとを明確に識別できるようになる。

なお、上述した実施例３では、試料２３に異なる偏光特性の励起光ＥｘＰ，ＥｘＳを試料２３に同時に照射したが、１つの偏光特性をもつ励起光を試料２３に照射する場合でも、レーザビームに変調をかけ、偏光特性のある励起光から発光する蛍光以外の光を除去するようにしてもよい。

つぎに、この発明の実施例４について説明する。この実施例４では、単一の励起波長の励起光ＥｘＡを試料２３に照射し、単一の蛍光波長の蛍光ＥｍＢを受光する場合でも、照射するレーザビームに変調をかけることによって、蛍光に対応する信号をフィルタリングして、クロストーク等のノイズを除去するようにしている。

図１１は、この発明の実施例４である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示す機能ブロック図である。レーザユニット１０５は、実施の形態１のレーザユニット１０１からレーザ発振器６ａと、変調部２７ａと、レーザ駆動電源２８ａと、ダイクロイックミラー７ａ，７ｂとを取り除いた構成になっている。変調部２７ｂで、レーザ駆動電源２８ｂからのレーザ駆動信号と変調信号ＦＡとが合成され、１０ＭＨｚの変調のかかったレーザ駆動信号がレーザ発振器６ｂに送出される。その結果、レーザ発振器６ｂは１０ＭＨｚの変調のかかった波長λＡの励起光ＥｘＡのレーザビームを出射する。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付す。

焦点位置２４に集光された励起波長λＡの励起光ＥｘＡに対して蛍光波長λＢの蛍光ＥｍＢが発光するが、蛍光ＥｍＢは、厳密に励起光ＥｍＡによって励起された光だけではなく、焦点位置２４付近からの散乱光や迷光も含んでいる。そのため、蛍光ＥｍＢはノイズ成分の光を発光することになる。

図１２―１は、レーザ発振器６からは、１０ＭＨｚの変調のかかった波長λＡの励起光ＥｘＡのレーザビームが出射することを示している。図１２―２は、焦点位置２４で励起波長λＡの励起光ＥｘＡが集光した結果、蛍光波長λＢの蛍光ＥｍＢが発光することを示している。上述したように、蛍光ＥｍＢは、励起光ＥｘＡからの蛍光以外のノイズ成分の光を含んでいる。図１２―３は、ＰＭＴ１２が蛍光ＥｍＢの輝度に対応した電気信号に変換した出力信号ＳＮを送出することを示している。

図１２―４は、周波数分離部１１が周波数分離を行った後の周波数分離後信号ＳＡを送出することを示している。周波数分離部１１は、１０ＭＨｚの変調信号ＦＡによって、出力信号ＳＮを周波数分離する。ここで、出力信号ＳＮは、１０ＭＨｚの変調成分以外の信号を含んでいるが、周波数分離することによって、１０ＭＨｚの変調成分をもたない信号は除外される。したがって、図１２―４に示すように、出力信号ＳＮをフィルタリングし、ノイズ成分を除去した信号ＳＡを得ることができる。このように、ノイズを除去した信号ＳＡが得られると蛍光ＥｍＢからノイズ成分を取り除いたＳ／Ｎ比の高い蛍光画像を得ることができる。

上述した実施例４では、励起光のレーザビームに所定の変調をかけることによって、種々のノイズ成分を含んだＰＭＴ１２からの出力信号ＳＮから、試料２３中から発光した蛍光信号を抽出することができる。つまり、簡易な方法で、効果的なノイズ除去ができる。

つぎに、この発明の実施例５について説明する。上述した実施例１〜４では、１光子励起法を行っていたが、この実施例５では、２光子励起法を用いる。２光子励起法とは、光を光子と捉える考え方に基づいており、２光子が同時に、正確に同一箇所の蛍光色素に当たった（２光子吸収）際に出る蛍光を観察する方法である。２光子が同時に励起を行うことから、励起光の１光子のエネルギーは１／２でよいので、振動数は１／２となり、波長は２倍になる。

したがって、２光子励起法による蛍光を発光させるための装置は、１光子励起法と同じであって、励起光の集光が厳密に焦点位置２４に合っているために、発光した蛍光を焦点位置２４に合わせるためのピンホール１３が除かれているものとなる。そして、この発明の実施例５では、レーザ光源としてチタンサファイヤを用いている。チタンサファイヤは、利得帯域幅が広く１００ｆｓ以下の超短パルス光を発生・増幅可能である。そのため、ほとんど連続光として用いることができ、かつ、増幅率を自由に設定できるため、２光子励起光に用いるに適しているからである。

図１３―１は、１０ＭＨｚの変調のかかった波長７００ｎｍの光Ｅｘ３Ａのレーザビームが出射することを示している。図１３―２は、焦点位置２４で波長７００ｎｍの光Ｅｘ３Ａが集光した結果、あたかも励起波長３５０ｎｍの励起光Ｅｘ３Ｂが照射され、蛍光波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ３が発光することを示している。図１３―３は、ＰＭＴ１２が蛍光Ｅｍ３の輝度に対応した電気信号に変換した出力信号ＳＰ２を送出することを示している。図１３―４は、周波数分離部１１が周波数分離を行った後の周波数分離後信号Ｓ３を送出することを示している。したがって、２光子励起法においても、出射レーザビームに変調をかけることにより、試料２３中から蛍光Ｅｍ３を抽出することができる。この２光子励起法による蛍光観察法では、励起光のエネルギーを低く抑えることができるので、試料２３の損傷や変質を軽減することができ、励起波長が長くなるので、励起光の試料２３への透過性を改善できる。また、ピンホールを使用しなくても、高い分解能の画像を得ることができる。

つぎに、この発明の実施例６について説明する。上述した実施例１〜３では、異なる周波数の変調をかけて出射するレーザビームを識別していたが、この実施例６では、異なる位相の変調をかけて出射するレーザビームを識別している。

図１４は、この発明の実施例６である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示す機能ブロック図である。図１４に示すブロック図は、図１の周波数発生部２の代わりに周波数発生部２Ｃを設け、周波数分離部１１の代わりに位相検波部１１Ｂを設けている。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付している。

周波数発生部２Ｃは、周波数発生器２ｄと変調信号Ｆ４の位相を９０°ずらすための９０°移相器２ｅとを有している。周波数発生器２ｄは２０ＭＨｚの変調信号を送出分岐しているが、一方は、そのまま変調部２７ｂと位相検波部１１Ｂに変調信号Ｆ４として送出されるが、他方は、９０°移相器２ｅを介することにより、変調信号Ｆ４と９０°の位相差をもった変調信号Ｆ３となって変調部２７ａと位相検波部１１Ｂとに送出される。その結果、図１５に示すようにレーザ発振器６ａは、変調信号Ｆ３に対応し２０ＭＨｚの変調がかかった発振波長３５１ｎｍのレーザビームＬ１を出射し、レーザ発振器６ｂは、変調信号Ｆ４に対応した２０ＭＨｚの変調のかかった発振波長４８８ｎｍのレーザビームＬ２を出射する。そして、それぞれのレーザビームＬ１，Ｌ２の変調の位相差は９０°になる。

焦点位置２４では、２０ＭＨｚの変調のかかった励起波長３５１ｎｍのレーザビームＬ１に対して２０ＭＨｚの変調のかかった波長４００ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａが発光し、２０ＭＨｚの変調のかかった励起波長４８８ｎｍのレーザビームＬ２に対して２０ＭＨｚの変調のかかった波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａが発光する。蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａは同じ変調周波数２０ＭＨｚではあるが、９０°の位相差をもっている。そのため、ＰＭＴ１２が変換した出力信号ＳＰＣにも互いに９０°の位相差のある２０ＭＨｚの変調成分が含まれている。位相検波部１１Ｂは、入力した出力信号ＳＰＣを周波数発生部２Ｃから入力した変調信号Ｆ３，Ｆ４によって位相検波し、波長４８８ｎｍの蛍光Ｅｍ１Ａと波長５１５ｎｍの蛍光Ｅｍ２Ａとに対応した信号Ｓ３Ａ，Ｓ４Ａに分離し、ＰＣ５に出力する。

ＰＣ５は、入力した信号Ｓ３Ａ，Ｓ４Ａを識別表示することによって、試料２３中に存在する２種類の異なる蛍光を発する物質の立体像をリアルタイムに画像表示できる。

上述した実施例６によれば、試料２３から発する蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａを簡易な方法によって同時に識別して観察することができる。また、焦点位置２４から発光した蛍光Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２ＡがＰＭＴ１２に入射するまでに経由する光学系が従来に比べて格段と少なくなり、光量のロスが少なくなる。したがって、多くの光学素子を必要とせずに、高いＳ／Ｎ比の蛍光画像が得られる。

また、実施例６では、異なるレーザビームＬ１，Ｌ２に互いに９０°の位相差がある変調をかけて、レーザビームＬ１，Ｌ２を識別したが、位相差は９０°以外であってもよい。位相差があれば、位相検波部１１Ｂで位相検波ができ、レーザビームを識別できるからである。また、図１５では、レーザビームＬ１，Ｌ２のレーザ出力を同程度としたが、蛍光強度に対応するように変化させてもよい。

なお、上述した実施例１〜６では、レーザビームに対する変調をレーザ発振電源からの電流にかけていたが、レーザビーム出射後に音響光学素子を挿入し、音響光学素子の駆動電流を制御して変調をかけるようにしてもよい。

また、上述した実施例１〜６では、変調成分を１０ＭＨｚと２０ＭＨｚとしたが、それ以外の成分で変調してもよい。また、どちらか一方は、直流成分とし、その他方に変調をかけるという組み合わせにしてもよい。また、上述した実施例１〜４，６では、励起光光源を２個として説明したが、当然２以上の励起光光源を備えていてもよい。その場合、励起光光源数だけ、異なった変調成分を励起光にかければよい。あるいは、励起光光源数だけ、位相差のある変調を励起光にかけてもよい。あるいは、異なる変調周波数と位相差を組み合わせた変調をかけるようにしてもよい。

また、上述の実施例１〜６では、試料に対する励起光としてレーザ発振器によるレーザビームを用いた説明をしたが、発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）による光を用いてもよい。ＬＥＤは高エネルギーの光を出射することができるため、励起光として使用することができるからである。

また、上述の実施例１〜６では、レーザ出力に対する変調を、電気的変調を加えることにより行っていたが、光学的変調を加えることにより行ってもよい。

以上のように、本発明にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、蛍光試薬によって蛍光染色された蛍光色素や蛍光蛋白を含む試料に励起光を照射し、この蛍光試薬や蛍光蛋白から発する蛍光を励起光ごとに識別し、あるいは蛍光ごとに識別しリアルタイムに画像表示することに有用であり、特に、走査型共焦点レーザ顕微鏡装置に適している。

この発明の実施例１である走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 １０ＭＨｚの変調のかかったレーザ出力を示す説明図である。 ２０ＭＨｚの変調のかかったレーザ出力を示す説明図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 周波数分離部の出力信号を示す説明図である。 周波数分離部を詳細に示すブロック図である。 周波数分離部を詳細に示すブロック図である。 この発明の実施例１である走査型共焦点顕微鏡装置の変形例の概略構成を示すブロック図である。 この発明の実施例２である走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 周波数分離部の出力信号を示す説明図である。 この発明の実施例３である走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 この発明の実施例３である走査型共焦点顕微鏡装置のレーザユニットの変形例を示すブロック図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 周波数分離部の出力信号を示す説明図である。 この発明の実施例４である走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 周波数分離部の出力信号を示す説明図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での光入力と励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 周波数分離部の出力信号を示す説明図である。 この発明の実施例６である走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 ２０ＭＨｚの位相差が９０°の変調のかかったレーザビームを示す説明図である。 従来の走査型共焦点顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。 レーザ出力を示す説明図である。 焦点位置での励起光入力と蛍光出力とを示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。 ＰＭＴの出力信号を示す説明図である。

符号の説明

１，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５ レーザユニット
２，２Ｃ 周波数発生部
２ａ，２ｂ，２ｄ 周波数発生器
２ｅ ９０°移相器
３，３０１，３０２ 走査ユニット
４ 顕微鏡ユニット
５ ＰＣ
６，６ａ，６ｂ，６ｃ，６ｄ，６ｅ，６ｆ レーザ発振器
７，７ａ，７ｂ，１６，１６ａ，１６ｂ ダイクロイックミラー
７ｃ，７ｆ 偏光ビームスプリッタ
８ カップリングレンズ
９ ファイバ
１０ コリメートレンズ
１１，１１Ａ 周波数分離部
１１Ｂ 位相検波部
１１ａ，１１ｂ 周波数可変フィルタ
１１ｃ ＦＦＴ
１１ｄ 波長抽出フィルタ
１２，１２ａ，１２ｂ ＰＭＴ
１３，１３ａ，１３ｂ ピンホール
１４，１４ａ，１４ｂ 励起光カット素子
１５，１５ａ，１５ｂ コンフォーカルレンズ
１７ 走査光学ユニット
１８ リレーレンズ
１９，７ｄ，７ｅ ミラー
２０ 結像レンズ
２１ 対物レンズ
２２ 試料ステージ
２３ 試料
２４ 焦点位置
２５ 信号処理部
２６ 画像表示部
２７ａ，２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，１２７ａ，１２７ｂ 変調部
２８ａ，２８ｂ レーザ駆動電源
２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ 偏光フィルタ
Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４，ＦＡ 変調信号
ＳＰＡ，ＳＰＢ，ＳＰＣ，ＳＨ，ＳＮ，ＳＰ２，Ｓ１，Ｓ２ 出力信号
Ｓ１Ａ，Ｓ２Ａ，Ｓ１Ｂ，Ｓ２Ｂ，Ｓ３Ａ，Ｓ４Ａ，ＳＳ，ＳＰ，ＳＡ，Ｓ３ 信号
Ｅｘ１Ａ，Ｅｘ２Ａ，Ｅｘ１Ｂ，Ｅｘ２Ｂ，Ｅｘ１Ｃ，Ｅｘ２Ｃ，ＥｘＰ，ＥｘＳ，ＥｘＡ，Ｅｘ１，Ｅｘ３Ｂ 励起光
Ｅｘ３Ａ 光
Ｅｍ１Ａ，Ｅｍ２Ａ，Ｅｍ２Ｂ，Ｅｍ１Ｃ，Ｅｍ２Ｃ，ＥｍＰＳ，ＥｍＢ，Ｅｍ３，Ｅｍ１，Ｅｍ２ 蛍光
Ｌ１，Ｌ２ レーザビーム

Claims (11)

1. 蛍光試薬を励起させる１以上の励起光を試料に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置において、
   １または複数の異なる周波数信号を変調信号として出力する周波数発生手段と、
   前記変調信号によって前記１以上の励起光を変調する変調手段と、
   前記変調手段によって変調された１以上の変調励起光に応じて発光した蛍光を電気信号に変換する光電変換手段と、
   前記変調信号を用いて、前記光電変換手段から出力された電気信号を前記１以上の異なる周波数毎に周波数分離して出力する周波数分離手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡装置。
2. 蛍光試薬を励起させる複数の励起光を試料に照射し、該蛍光試薬から発光する蛍光を電気信号に変換して画像表示する走査型共焦点顕微鏡装置において、
   複数の異なる位相をもった周波数信号を変調信号として出力する移相発生手段と、
   前記変調信号によって前記複数の励起光を変調する変調手段と、
   前記変調手段によって変調された複数の変調励起光に応じて発光した蛍光を電気信号に変換する光電変換手段と、
   前記変調信号を用いて、前記光電変換手段から出力された電気信号を前記複数の異なる位相毎に位相分離して出力する位相分離手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡装置。
3. 前記周波数分離手段は、前記変調信号の周波数に対応した１以上の可変周波数フィルタを用いて周波数分離することを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
4. 前記周波数分離手段は、前記電気信号に対して高速フーリエ変換を施し、前記変調信号の周波数に対応した信号を抽出することによって周波数分離することを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
5. 前記１以上の励起光または前記１以上の変調励起光を偏光光に変換する偏光手段を備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
6. 前記偏光手段は、一つの励起光に対して互いに直交する偏光光に変換する２つの偏光手段であることを特徴とする請求項５に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
7. 前記変調手段は、各変調信号によって各１以上の励起光を出力する励起光源の駆動要素に変調をかけることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
8. 前記変調手段は、前記１以上の励起光を出力する各励起光源から出力された各励起光に対して変調をかけることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
9. 前記１以上の励起光は、２光子励起法に対応した励起光であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
10. 前記１以上の励起光は、レーザ光であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
11. 前記１以上の励起光は、チタンサファイヤレーザから出力されたレーザ光であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。

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