JP6806161B2 - 顕微鏡システム - Google Patents

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Description

本発明は、顕微鏡システムに関する。
蛍光物質を２光子で励起し、誘導放出を誘起するレーザビームを照射して、誘導放出により減衰した蛍光を取得して画像を構築する顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。顕微鏡では、高速に画像を取得する必要がある。
Lu Wei et. al., Biomedical Optics Express 1465-1475, vol. 3, No.6, 1 June 2012
本発明の第１の態様においては、顕微鏡システムであって、標本に含まれる第１の蛍光物質を励起する第１の光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、第１の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、第１の光および第２の光を標本において走査する走査部と、標本からの蛍光を検出する検出部とを備え、走査部は、共振ミラーを有するレゾナントスキャナを有し、検出部は、標本からの蛍光を受光し、周波数ｆ１＋ｆ２の成分を検出する。
本発明の第２の態様においては、顕微鏡システムであって、標本に含まれる蛍光物質を励起する第１の光を前記標本に照射し、前記標本からの蛍光を検出部において受光させる第１の観察方法と、前記第１の光を周波数ｆ１で強度変調して前記標本に照射し、前記蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調して前記標本に照射し、前記検出部において前記標本からの蛍光を受光させ、周波数ｆ１＋ｆ２の成分または周波数ｆ１−ｆ２の成分を検出させる第２の観察方法とが選択可能に構成された。
上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となりうる。
本実施形態に係る顕微鏡システム１０の構成を示す図である。 ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す概念図である。 蛍光の強度の時間変化を説明する概念図である。 ロックイン検出における復調周波数を説明する概念図である。 スキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。 他の走査部１５１の例を示す。 さらに他の走査部１５６の例を示す。 他の顕微鏡システム１２の構成を示す図である。 顕微鏡システム１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。 顕微鏡システム１２の動作の一例を示すフローチャートである。 共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作のフローチャートである。 顕微鏡システム１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作のフローチャートである。 図１２のフローチャートで示される動作に用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。 さらに他の顕微鏡システム１４の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡システム１６の構成を示す図であり、 各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。 さらに他の顕微鏡システム１８の構成を示す図である。 各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長関係を示す。 ストークスシフトが小さい場合の吸収・蛍光スペクトルと検出波長領域の関係を示す。 第１検出波長領域、第２検出波長領域のそれぞれにおいて、観測されうる蛍光と励起光の関係を示す。 （ａ）は蛍光Ｃ'と蛍光Ｄ'の時間波形を示し、（ｂ）は蛍光Ｃ'と蛍光Ｄ'をフェーザ表示で表現している。 図１５から図２１の２色観察に用いられるＧＵＩ画面３６０を示す。 さらに他の顕微鏡システム２０の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡システム２２の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡システム２４の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡システム２６の構成を示す図である。 他の光源１０１の例を示す。 光学ディレイステージ７００を平行移動したときの時間差の様子を示す。 減衰蛍光信号が、蛍光寿命を反映する様子を示す。
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
図１は、本実施形態に係る顕微鏡システムの一例である顕微鏡システム１０の構成を示す図である。顕微鏡システム１０は、強度変調させたポンプ光およびプローブ光を標本に照射することで、標本に含まれる蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号（以下、減衰蛍光、減衰蛍光信号などと記載する）をロックイン検出する。これにより、空間分解能を向上させつつ検出時間を短縮することができる。なお、以下、減衰蛍光を蛍光と総称して記載する場合もある。また、以下、減衰蛍光を取得する顕微鏡を減衰蛍光顕微鏡と記載する。図１では説明のためにｘｙｚ軸を示す。
顕微鏡システム１０は、ポンプ光およびプローブ光を出力する光源１００と、ポンプ光およびプローブ光で標本１８６を照明する照明光学系１４０と、標本１８６から発せられた光を観察する観察光学系１６０と、観察光学系１６０を介して光を検出する検出部１３６を備える。顕微鏡システム１０はさらに、標本１８６を支持するステージ１８０を備える。顕微鏡システム１０はさらに、顕微鏡システム１０全体を制御する制御部１３０と、当該制御部１３０との間で信号を送受信する入力部２２０、表示部２２４および記憶部２２６を備える。
照明光学系１４０は、音響光学チューナブルフィルタ１１４（以下、ＡＯＴＦともいう）と、音響光学素子１２４（以下、ＡＯＭともいう）と、ダイクロイックミラー１４１、１４４と、ミラー１４２、１４３と、走査部１５０と、レンズペア１７３と、ダイクロイックミラー１６２と、対物レンズ１６４とを有する。
観察光学系１６０は、対物レンズ１６４と、ダイクロイックミラー１６２と、光学フィルタ１６６と、レンズペア１７２とを有する。
標本１８６は、観察対象物１８４と、観察対象物１８４を載置するスライドガラス１８２とを有する。観察対象物１８４は例えば生物細胞である。観察対象物１８４には蛍光物質が含まれている。
光源１００は、ポンプ光用のレーザ光源１０２、プローブ光用のレーザ光源１０４、および、これらポンプ光およびプローブ光を合波するダイクロイックミラー１０６を有する。レーザ光源１０２、１０４は例えばいずれも連続発振方式であって、かつ、互いに異なる波長のレーザ光を出力する。ポンプ光は蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。プローブ光は蛍光物質において誘導放出を誘起することで、蛍光を減衰させる。ポンプ光の波長はプローブ光の波長より短く、例えば、ポンプ光は５３２ｎｍ, プローブ光は６４０ｎｍである。これらポンプ光およびプローブ光の波長は蛍光物質の吸収帯（吸収スペクトル）および蛍光帯（蛍光スペクトル）に合せて適宜設定される。これらポンプ光およびプローブ光の波長は自動的に設定されてもよいし、入力部２２０でユーザからの入力を受け付けてもよい。
ＡＯＴＦ１１４は、ダイクロイックミラー１０６により同軸に合成されたレーザ光の光路上に配される。ミラー１４２、１４３は、ＡＯＭ１２４を透過しない光路を構成する。
ＡＯＴＦ１１４は光にとって回折格子として機能する。ＡＯＴＦ１１４により生じた１次回折光はダイクロイックミラー１４１に導かれる。ＡＯＴＦ１１４に印加するドライバ１１２の電圧を制御することで、波長ごとに１次回折光の発生を制御することができる。光の波長ごとに、常に１次回折光を生じさせる状態（ＯＮ状態、すなわち強度が最大の状態）とすることもできるし、常に生じさせない状態（ＯＦＦ状態、すなわち強度が最小の状態）とすることもできるし、光強度を変調することもできる。例えば、ドライバ１１２から時間的に一定の電圧値を付与した場合には、電圧値に応じて光強度は時間的に一定値となる。例えば、ドライバ１１２から付与される電圧値が時間的にゼロであれば、光強度もゼロになる。例えばドライバ１１２の電圧波形が正弦波の場合に光の強度を正弦波に変調する。本実施形態では、発振器１３２からの発振に基づいて、ＡＯＴＦ１１４によりポンプ光を、周波数ｆ１で強度変調し、プローブ光をＯＮ状態（変調しない）とする。ＡＯＴＦ１１４の利点は複数の波長の異なる光の強度を独立に制御できる点である。なお、これらＡＯＴＦ１１４とドライバ１１２とにより第１強度変調部１１０が構成される。
本実施形態では、ＡＯＴＦ１１４においてポンプ光が所定の周波数で変調されるように、ＡＯＴＦ１１４に印加するドライバ１１２の電圧を制御する。ＡＯＴＦ１１４にはポンプ光と、プローブ光の波長に応じた２つの音響周波数が付与される。これにより、ＡＯＴＦ１１４よりポンプ光、プローブ光の回折光が生じる。ここでは、ポンプ光のみの強度を変調するために、ポンプ光波長に対応した音響周波数の電気信号の振幅を変調周波数ｆ１で変調する。これにより、ＡＯＴＦ１１４を透過したポンプ光の強度がｆ１で変調される。一方、プローブ光波長に対応する音響周波数の電気信号の振幅は変調しないため、プローブ光の強度は変調されない。
ダイクロイックミラー１４１は、ＡＯＴＦ１１４において変調されたポンプ光を反射する一方で、プローブ光を透過する。これにより、プローブ光はＡＯＭ１２４に導かれる。ＡＯＭ１２４に印加するドライバ１２２の電圧を制御することで、一次回折光の発生を制御することができる。常に１次回折光を生じさせる状態（ＯＮ状態、すなわち強度が最大の状態）とすることもできるし、常に生じさせない状態（ＯＦＦ状態、すなわち強度が最小の状態）とすることもできるし、光強度を変調することもできる。例えば、ドライバ１２２から一定の電圧値を付与した場合には、電圧値に応じて光強度は一定値となる。例えば、ドライバ１２２から付与される電圧値が時間的にゼロであれば、光強度もゼロになる。例えばドライバ１２２の電圧波形が正弦波の場合に光の強度を正弦波に変調する。本実施形態では、発振器１３２からの発振に基づいて、ＡＯＭ１２４によりプローブ光を、周波数ｆ１と異なる周波数ｆ２で強度変調する。ＡＯＭ１２４の利点は、数十ＭＨｚという比較的高い周波数で強度変調できることである。なお、これらＡＯＭ１２４とドライバ１２２とにより第２強度変調部１２０が構成される。
一方、ポンプ光はダイクロイックミラー１４１で反射された後に、ミラー１４２、１４３で反射し、ダイクロイックミラー１４４に入射する。ダイクロイックミラー１４４は、それぞれに強度変調されたポンプ光とプローブ光とを同軸に合波する。
走査部１５０は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。このために、走査部１５０とダイクロイックミラー１６２の間にはレンズペア１７３が設置されていることが望ましい。走査部１５０の一例はガルバノスキャナであり、互いに直交する方向に回転可能な一対のガルバノミラーを有する。それらガルバノミラーの角度を変化させることで標本１８６におけるレーザ光のスポット位置をｘｙ方向にスキャンする。走査部１５０の他の例はレゾナントスキャナ（共振型スキャナ）である。レゾナントスキャナは、共振により動作する共振ミラー（レゾナントミラー）を有する。レゾナントスキャナは、例えば、主走査用のレゾナントミラーと、副走査用のガルバノミラーを備える。レゾナントスキャナを用いることで、より高速なスキャンをすることができる。
走査部１５０から出力されたレーザ光はダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に導かれる。対物レンズ１６４はレーザ光を標本１８６に集光する。
標本１８６の蛍光物質から生じた蛍光は対物レンズ１６４を透過し、ダイクロイックミラー１６２で反射し、光学フィルタ１６６によりポンプ光とプローブ光が除去される。蛍光はレンズペア１７２により対物レンズ瞳面とほぼ共役な位置に設置された受光部１７４に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６２は、レンズペア１７３や走査部１５０よりも光源側に設置されても良い。
検出部１３６は、受光部１７４およびロックインアンプ１３４を備える。受光部１７４は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。受光部１７４の一例は、光電子増倍管である。受光部１７４は光電変換によって、受光した蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。受光部１７４の出力はロックインアンプ１３４に入力されてロックイン検出される。ロックイン検出については後述する。
入力部２２０、表示部２２４、記憶部２２６および制御部１３０は例えばＰＣ等であってもよい。入力部２２０は、ユーザから制御部１３０への入力を受け付けるものであって、例えば、キーボード、タッチパネル、マウス等である。表示部２２４は、例えば、ＧＵＩ、検出結果、観察画像を表示するディスプレイである。記憶部２２６は、顕微鏡システム１０を制御するプログラム、パラメータ等、および、検出結果、観察画像等が記憶される。
制御部１３０は、周波数制御部２２９、スキャナ制御部２２８および画像生成部２２２を有する。周波数制御部２２９はユーザからの入力により、または、蛍光物質に基づいて自動で、発振器１３２に発生させる発振周波数を制御する。スキャナ制御部２２８は、走査部１５０を制御する。画像生成部２２２は検出部１３６の検出結果に基づいて画像を生成し、表示部２２４に表示する。
図２は、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す概念図である。図２において破線は特定の蛍光物質の吸収帯を示し、実線は当該蛍光物質の蛍光帯を示す。ポンプ光の波長は吸収帯に含まれるように設定され、プローブ光は蛍光帯の強度のピークよりも長い波長に設定されることが好ましい。これにより、蛍光帯の強度のピークを含む波長領域を、受光部１７４で蛍光を検出する波長領域である検出波長領域とすることができる。
図３は蛍光の強度の時間変化を説明する概念図である。図４はロックイン検出における復調周波数を説明する概念図である。
ポンプ光、プローブ光は時間的に互いに異なる周波数ｆ１，ｆ２で強度変調されており、それぞれの時間波形をＩＰｕｍｐ，ＩＰｒｏｂｅとすると、以下のように表される。
ここで、Ｉ１，Ｉ２はポンプ光, プローブ光の強度であり、ｍ，ｎは変調のコントラストである。誘導放出はＩＰｕｍｐとＩＰｒｏｂｅの積に比例するので、誘導放出によって減衰した蛍光（減衰蛍光信号）ＩＲＦもＩＰｕｍｐとＩＰｒｏｂｅの積に比例し、以下のように表せる。
式(1.3)の時間波形を図３に示す(最大値で規格化してある)。受光部１７４で取得される蛍光信号には、複数の周波数が含まれるので、時間波形は図３のようになる。このうち、ポンプ光が励起する蛍光は周波数ｆ１で、プローブ光が励起する蛍光は周波数ｆ２で生じるので、式(1.3)より、ｆ１−ｆ２あるいはｆ１＋ｆ２で変動する成分を検出することで、ポンプ光単独およびプローブ光単独で励起された蛍光を除去して、減衰蛍光信号のみを検出できる。そこで、検出部１３６において、ロックイン検出技術を用いて復調することで、所望の周波数に同期した信号のみを検出する。
式(1.3)に含まれる差周波（ｆ１−ｆ２）と和周波（ｆ１＋ｆ２）の時間波形を図４に示す。差周波よりも和周波の方が周波数が高いので、周期も短くなる。ロックイン検出では、この復調周波数の周期が最小の積算時間を決めるので、周期が短いほど高速検出が可能となる。
そこで、本実施形態では、和周波で復調する。より具体的には発振器１３２から和周波の復調周波数がロックインアンプ１３４に入力される。ロックインアンプ１３４は復調周波数に同期する信号を抽出する。走査部１５０で標本１８６を走査しつつ、ロックインアンプ１３４でピクセルごとにロックイン検出を実施し、当該ピクセルの位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、減衰蛍光の観察画像を生成し、表示部２２４に表示する。
ここで、誘導放出現象が非線形現象なので、減衰蛍光の信号発生領域がポンプ光とプローブ光の集光スポットの強度の高い局所領域に制限される。これにより、空間分解能の向上が可能となる。
図５は、走査部１５０のスキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。ガルバノスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はレゾナントスキャナと比較して長いので、図５の（ａ）に示すように差周波の復調で検出するのにかかる時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。しかしながら、レゾナントスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はガルバノスキャナと比較して短いので差周波の復調で検出するのにかかる時間の間に、図５の（ｂ）に示すようにビームの位置が大きく変わってしまい正確な画像取得が困難になるというおそれがある。しかしながら、和周波で復調した場合、復調の周波数が高いので検出にかかる時間も短くなり、レゾナントスキャナを用いても所定位置における信号検出に必要な所定時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。したがって、レゾナントスキャナを用いて高速で検出しつつ、正確な画像取得をすることができる。
図６は、他の走査部１５１の例を示す。走査部１５１は、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３および一対のミラー１５４、１５５を有する。一対のミラー１５４、１５５はそれぞれ図中矢印の方向に移動可能に設けられており、これらの位置に基づいて、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３のいずれを用いるかが選択される。
図６は、レゾナントスキャナ１５２が選択された状態が示されている。この場合、ダイクロイックミラー１４４から出射される光の光路上にミラー１５４が配され、レゾナントスキャナ１５２から出射される光の光路上にミラー１５５が配されている。これにより、ミラー１５４で反射された光はレゾナントスキャナ１５２に入射する。レゾナントスキャナ１５２で所定の方向に偏向された光はミラー１５５で反射されて、ダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。
一方、ガルバノスキャナ１５３が選択される場合には、ダイクロイックミラー１４４から出射される光の光路上からミラー１５４が退避するとともに、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間からミラー１５５が退避する。これにより、ガルバノスキャナ１５３に光が入射し、ガルバノスキャナ１５３で偏向された光がダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。
走査部１５１によれば、用途に応じてレゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３を使い分けることができる。なお、一対のミラー１５４、１５５の位置を移動させる手段は、例えばリニアモーターが挙げられるが、これに限られずそれぞれが対応するターレット上に配され、当該ターレットの回転によりミラー１５４、１５５が移動してもよい。一対のミラー１５４、１５５に代えて、一対のダイクロイックミラーを配することにより、当該一対のダイクロイックミラーを反射する波長の光に対してはレゾナントスキャナ１５２を用い、当該一対のダイクロイックミラーを透過する波長の光に対してガルバノスキャナ１５３を用いることができる。なお、レゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３の位置は図６と逆でもよい。
図７は、さらに他の走査部１５６の例を示す。図７において図６と同じ構成については同じ番号を付して説明を省略する。
走査部１５６は、走査部１５１の一対のミラー１５４、１５５に代えて、それらが一体化したミラー１５７を有する。当該ミラー１５７は紙面に垂直な方向に移動可能に設けられる。ここで図７の状態は図６の状態に対応しており、ミラー１５７によって光が反射されることにより、レゾナントスキャナ１５２が用いられる状態が示されている。一方、図７の状態からミラー１５７が紙面に垂直な方向に移動して、ダイクロイックミラー１４４とガルバノスキャナ１５３との間の光路、および、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間の光路から同時に退避することで、ガルバノスキャナ１５３が用いられる状態となる。
図８は他の顕微鏡システム１２の構成を示す図である。顕微鏡システム１２は顕微鏡システム１０と同様に減衰蛍光顕微鏡として用いることができるとともに、共焦点顕微鏡としても用いることができる。顕微鏡システム１２において顕微鏡システム１０と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム１２において、蛍光を反射して、ポンプ光およびプローブ光を透過するダイクロイックミラー４０２は、ダイクロイックミラー１４４と走査部１５０との間の光路上に配される。さらに、ダイクロイックミラー４０２で反射された光が入射する、光学フィルタ４０４、レンズ４０６、受光部４１０を有する。光学フィルタ４０４および受光部４１０は、顕微鏡システム１０の光学フィルタ１６６および受光部１７４と同様の構成であってよい。顕微鏡システム１２はさらに開口部を有する開口部材の一例としてピンホール４０８を有する。ピンホール４０８は、標本と共役の位置に配置される。レンズ４０６はピンホール４０８に光を集光する。受光部４１０はピンホール４０８に近接して設置される。あるいは、不図示のレンズにより、ピンホールと略共役位置に受光部が設置される構成としても良い。
上記構成により、標本１８６からの蛍光は走査部１５０を通り、ダイクロイックミラー４０２で反射されて、光学フィルタ４０４、レンズ４０６およびピンホール４０８を介して受光部４１０で受光される。これにより、走査部１５０により標本１８６の観察位置が変わっても、走査部１５０でデスキャンされて、ピンホール４０８でのスポット位置は不変である。ピンホール４０８は穴の大きさが可変となっており、詳細は後述する。上記構成により、ピンホール４０８は受光部４１０とダイクロイックミラー４０２との間に設けられているともいえる。また、ピンホール４０８は受光部４１０と走査部１５０との間に設けられているともいえる。さらには、ピンホール４０８は受光部４１０と対物レンズ１６４との間に配されているともいえる。
顕微鏡システム１２はさらに、レーザ光源１０２、１０４の光の波長を制御する波長制御部２３０を有する。
図９は顕微鏡システム１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。ＧＵＩ画面３００は表示部２２４に表示され、入力部２２０を用いてユーザからの入力を受け付ける。
チェックボックス３０２は共焦点観察の画像を取得するか否かの入力欄である。チェックボックス３０４は共焦点観察においてポンプ光を変調することを指定する入力欄であり、チェックボックス３０６は変調しないことを指定する入力欄である。
入力欄３０８はポンプ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３１０はピンホールの大きさを指定する入力欄である。入力欄３１０の「ＯＰＥＮ」は穴の大きさが最大であることを示す。さらに、「１」をエアリーサイズとしたときの大きさの目盛りとともに、指定された穴の大きさが縦の太線で示されている。ここで、エアリーサイズとは、波長と開口数で決まる回折限界の光スポットの大きさで、ピンホール径を規格化した値である。
さらに、チェックボックス３１２は、共焦点観察のタイムラプス画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１４はタイムラプスの時間間隔の入力欄である。
チェックボックス３１６は減衰蛍光観察の画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１８はポンプ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３２０はプローブ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。
入力欄３２２は減衰蛍光観察におけるピンホール４０８の穴の大きさの入力欄であって、入力欄３１０と同様の構成である。また、チェックボックス３２４および入力欄３２６は減衰蛍光観察におけるタイムラプスに関する入力欄であり、チェックボックス３１２、入力欄３１４と同様の構成である。
ＧＵＩ画面３００には、共焦点の観察画像３３０と減衰蛍光の観察画像３３２とが並べて表示される。これに代えて、重ねて表示されてもよい。また、互いにリンク付けされることで、共焦点の観察画像３３０の対象領域をクリックすると減衰蛍光の観察画像３３２が表示されるようにしてもよい。さらに、共焦点観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３４が時間順に並べて表示される。同様に、減衰蛍光観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３５が時間順に並べて表示される。
図１０は顕微鏡システム１２の動作（Ｓ１０）の一例を示すフローチャートである。
フローチャートＳ１０において、制御部１３０は、ＧＵＩ画面３００のチェックボックス３１６の入力に基づいて、減衰蛍光観察の画像を取得するかどうかを判断する（Ｓ１００）。ステップＳ１００の判断がＹｅｓの場合に、制御部１３０は入力欄３１８、３２０の入力に基づいて、減衰蛍光観察のポンプ光およびプローブ光の変調周波数を設定する（Ｓ１０２）。
制御部１３０はピンホール４０８の径を設定する（Ｓ１０４）。減衰蛍光観察時においてピンホール４０８はデフォルトで開放、すなわち図９の入力欄３２２においてデフォルトで「ＯＰＥＮ」が設定されている。ユーザが入力欄３２２の値をデフォルトから変更した場合には、変更された値に基づいてピンホール４０８の大きさが設定される。減衰蛍光観察時において、ピンホール４０８を開放することで、ピンホール共役面である焦点面から生じたにも関わらず散乱等により結像関係が乱されてしまった蛍光も検出することができるので、より多くの光子を検出することができ、結果として信号対雑音比の向上が可能となる。
以上の設定に基づいて、減衰蛍光観察の画像が取得される（Ｓ１０６）。この場合、復調周波数は、差周波であってもよいし、和周波であってもよいが、レゾナントスキャナを使用する場合には和周波であることが好ましい。減衰蛍光観察の画像を取得する方法は、顕微鏡システム１０で説明したものと同一であり、説明を省略する。
ステップＳ１０６の後、または、ステップＳ１００の判断がＮｏの場合に、共焦点観察の画像を取得するかどうかが、チェックボックス３０２の入力に基づいて判断される（Ｓ１０８）。共焦点観察の画像を取得すると判断された場合に（Ｓ１０８：Ｙｅｓ）、チェックボックス３０４、３０６に基づいて共焦点観察に用いられるポンプ光を変調するか否かが判断され（Ｓ１１２）、変調する場合には（Ｓ１１２：Ｙｅｓ）、入力欄３０８に入力された変調周波数が設定される（Ｓ１１４）。
ステップＳ１１４の後にまたはステップＳ１１２でポンプ光を変調しない場合に（Ｓ１１２：Ｎｏ）、ユーザからの入力欄３１０への入力に基づいてピンホール４０８の径が設定される（Ｓ１１６）。共焦点観察におけるピンホールの径は減衰蛍光観察におけるピンホールの径より小さいことが好ましい。
上記設定に基づいて共焦点観察の画像が取得される（Ｓ１１８）。より詳しくは、ポンプ光をＯＮ状態または強度変調し、プローブ光をＯＦＦ状態にして、走査部１５０で標本１８６を走査しつつ、ピクセルごと検出部１３６で蛍光を検出する。当該検出結果を位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。ポンプ光を強度変調した場合は、ロックインアンプにおいて、変調周波数でロックイン検出する。なお、ポンプ光をＯＮ状態とする場合（強度変調しない場合）には、ロックインアンプは不要であるので、受光部４１０の出力を画像生成部２２２に直接入力する構成とすることが望ましい。
画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、共焦点の観察画像３３０および減衰蛍光の観察画像３３２を生成し、表示部２２４に表示する（Ｓ１２０）。
さらに、チェックボックス３１２で共焦点観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡システム１２は入力欄３１４で設定された時間間隔で共焦点観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。同様に、チェックボックス３２４で減衰蛍光観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡システム１２は入力欄３２６で設定された時間間隔で減衰蛍光観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。
なお、標本１８６の広い視野の画像を共焦点観察で取得し、共焦点観察の画像のうちの一部の領域を指定して減衰蛍光観察の画像を取得する構成としても良い。この場合、共焦点観察で画像を取得して、減衰蛍光観察に適した範囲が自動で選択されてもよい。
図１１は、共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作（Ｓ３０）のフローチャートである。まず、共焦点観察により画像が取得される（Ｓ３００）。この場合に、図１０の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１１２からＳ１１８が実行される。次に、ユーザからの入力に基づいて減衰蛍光観察の範囲を自動選択するか否かが判断される（Ｓ３０２）。
自動選択する場合には（Ｓ３０２：Ｙｅｓ）、共焦点画像を画像処理解析し、減衰蛍光観察に適した範囲を選択する。例えば、画像を微分フィルタ処理し、ピークが多く生じる領域を選択する。
一方、自動選択しない場合には（Ｓ３０２：Ｎｏ）、ユーザからの指定に基づいて減衰蛍光観察の領域を設定する（Ｓ３０８）。この場合に、図９の共焦点の観察画像３３０上で領域指定を受け付けてもよい。
ステップＳ３０４またはＳ３０８で設定された領域について、減衰蛍光観察を実行して観察画像を取得する（Ｓ３０６）。この場合に、図１０の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１０２からＳ１０６が実行される。
図１２は、顕微鏡システム１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作（Ｓ２０）のフローチャートであり、図１３は当該動作で用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。
記憶部２２６には、蛍光物質の名称に対応付けて、観察の方法、例えば共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいか、および、共焦点観察の場合のポンプ光の波長または減衰蛍光観察の場合のポンプ光およびプローブ光の波長が記憶されている。ＧＵＩ画面３５０には、記憶部２２６に記憶されている蛍光物質の名称３５３がチェックボックス３５２とともに表示される。
ユーザによるチェックボックス３５２へのチェックにより蛍光物質が選択される（Ｓ２００）。制御部１３０は、選択された蛍光物質に応じて、記憶部２２６を参照して共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいかを判断する（Ｓ２０２）。共焦点観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、制御部１３０は記憶部２２６を参照して当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長を決定し、表示欄３５４に表示する（Ｓ２０４）。この場合、プローブ光のボックス３５７は白色であって、波長の表示欄３５６はグレーアウトされる。減衰蛍光観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、制御部１３０は記憶部２２６を参照して当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長を決定して表示欄３５４に表示するとともに、プローブ光のボックス３５７にも色が付いて、当該蛍光物質に対応したプローブ光の波長を決定し表示欄３５６に表示する（Ｓ２０４）。いずれの場合も、表示欄３５８に蛍光物質の吸収帯、蛍光帯、光源の波長および検出波長領域の関係が図示される（Ｓ２０６）。
減衰蛍光観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２、１０４の光の波長を設定する。さらに、周波数制御部２２９が発振器１３２に変調周波数を設定する。この場合に、図９のＧＵＩ画面３００で変調周波数の入力を受け付けてもよいし、蛍光物質に変調周波数を対応付けて記憶部２２６に記憶しておき、蛍光物質の選択に伴って記憶部２２６を参照することにより制御部１３０が当該変調周波数を自動的に決定してもよい。上記設定に基づいて、図１０のステップＳ１０２からＳ１０６と同様に減衰蛍光観察の画像が取得される。
一方、共焦点観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２の光の波長を設定する。上記設定に基づいて、図１０のステップＳ１１２からＳ１１８と同様に共焦点観察の画像が取得される。
図１４は、さらに他の顕微鏡システム１４の構成を示す図である。顕微鏡システム１４において顕微鏡システム１０、１２と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム１４は、顕微鏡システム１０と顕微鏡システム１２とを組み合わせたものに相当する。すなわち、対物レンズ１６４と走査部１５０との間の光路上にダイクロイックミラー１６２が配され、ダイクロイックミラー１６２で反射された蛍光が入射する光学フィルタ１６６、レンズペア１７２および受光部１７４が設けられる。さらに、走査部１５０とダイクロイックミラー１４４との間の光路上にダイクロイックミラー４０２が配され、ダイクロイックミラー４０２で反射された蛍光が入射する光学フィルタ４０４、レンズ４０６、ピンホール４０８および受光部４１０を有する。
受光部１７４で蛍光を受光する場合には、ダイクロイックミラー１６２を対物レンズ１６４と走査部１５０との間の光路上に進出させるとともに、ダイクロイックミラー４０２を走査部１５０とダイクロイックミラー１４４との間の光路上から退避させる。ダイクロイックミラー１６２で反射した蛍光を受光部１７４で受光する場合には、蛍光が通る光学素子が少ないのでより明るい信号を検出できる。よって、減衰蛍光観察に用いられることが好ましい。
受光部４１０で蛍光を受光する場合には、ダイクロイックミラー１６２を対物レンズ１６４と走査部１５０との間の光路上から退避させるとともに、ダイクロイックミラー４０２を走査部１５０とダイクロイックミラー１４４との間の光路上に進出させる。ダイクロイックミラー４０２で反射した蛍光を受光部４１０で受光する場合には、走査部１５０によりデスキャンされる。よって、ピンホール４０８を用いる共焦点観察に用いられることが好ましい。
図１５はさらに他の顕微鏡システム１６の構成を示す図であり、図１６は各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。顕微鏡システム１６は、多色の蛍光による減衰蛍光観察に用いられる。例えば、顕微鏡システム１６は、蛍光物質が二種類であって、ポンプ光が共通でプローブ光が異なる場合に用いられる。顕微鏡システム１６において顕微鏡システム１２と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム１６は、第１のプローブ光用のレーザ光源１０４に加えて、第２のプローブ光用のレーザ光源５００と、第２のプローブ光と第１のプローブ光とを合波するダイクロイックミラー５０２とをさらに有する。ダイクロイックミラー１０６は、ポンプ光を第１および第２のプローブ光に合波する。図１６に示すように、ポンプ光の波長は第１の蛍光物質の吸収スペクトルＣと第２の蛍光物質の吸収スペクトルＤとの共通部分にあり、両方の蛍光物質を励起する。第１のプローブ光の波長は第１の蛍光物質の蛍光スペクトルＡ内にあり、第１の蛍光物質において誘導放出を誘起する。第２のプローブ光の波長は第２の蛍光物質の蛍光スペクトルＢ内にあり、第２の蛍光物質において誘導放出を誘起する。ストークスシフト（吸収スペクトルと蛍光スペクトルの波長差）の大きな蛍光物質を用いてポンプ光を共通にすることで、光源数を減らして装置構成を簡便にすることができる。なお、標本１８６には第１および第２の蛍光物質が含まれている。
ＡＯＴＦ１１４はドライバ１１２から各光に応じた駆動電圧が印加されており、ポンプ光をＯＮ状態とし、第１のプローブ光を周波数ｆ２で強度変調し、第２のプローブ光を周波数ｆ３で強度変調する。ＡＯＴＦ１１４で回折した光のうち、ポンプ光はダイクロイックミラー１４１を透過するとともに、第１および第２のプローブ光はダイクロイックミラー１４１で反射される。ポンプ光はＡＯＭ１２４で周波数ｆ１で強度変調される。一方、第１および第２のプローブ光はＡＯＭ１２４を迂回するようにミラー１４２、１４３で反射されてダイクロイックミラー１４４でポンプ光と合波される。ポンプ光、第１のプローブ光および第２のプローブ光は、ダイクロイックミラー４０２を透過し、走査部１５０を経て、対物レンズ１６４により標本１８６に集光される。周波数ｆ１、ｆ２、ｆ３は互いに異なるように設定される。
ポンプ光をＩＰｕｍｐ、第１のプローブ光をＩＰｒｏｂｅ１、第２のプローブ光をＩＰｒｏｂｅ２とすると、それぞれの時間波形は、下記の通り表される。
なお、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３はそれぞれ、ポンプ光、第１のプローブ光、第２のプローブ光の光強度である。
顕微鏡システム１６は、ダイクロイックミラー１４４と走査部１５０との間にダイクロイックミラー４０２を有する。ダイクロイックミラー４０２は、第１の蛍光物質からの蛍光を検出する波長領域（第１検出波長領域）および第２の蛍光物質からの蛍光を検出する波長領域（第２検出波長領域）を含む波長領域を反射する。
ダイクロイックミラー４０２により反射された光の光路上にはさらにダイクロイックミラー４１２が配される。ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域を含む波長領域を透過し、第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。
ダイクロイックミラー４１２を透過した第１の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４０４で第１検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４０６を通って受光部４１０で受光される。受光部４１０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３４でロックイン検出される。受光部４１０とロックインアンプ１３４とが第１の検出部１３６を構成する。
一方、ダイクロイックミラー４１２で反射した第２の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４１４で第２検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４１６を通って受光部４２０で検出される。受光部４２０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３５でロックイン検出される。受光部４２０とロックインアンプ１３５とが第２の検出部１３７を構成する。
受光部４１０で受光される信号と、受光部４２０で受光される信号をそれぞれＩＲＦ１，ＩＲＦ２とすると、
これより、ロックインアンプ１３４ではｆ１＋ｆ２で、ロックインアンプ１３５ではｆ１＋ｆ３で、それぞれ復調することが望ましい。
図１６に示すように、一般的な多色観察において、第２検出波長領域では第１の蛍光物質から生じる蛍光も検出されてしまうため、蛍光のクロストークが課題になる。しかしながら、第２検出波長領域に混入する第１の蛍光物質からの減衰蛍光の信号は、周波数ｆ１＋ｆ２で生じるのに対し、第２検出波長領域で取得したい第２の蛍光物質からの減衰蛍光の信号は周波数ｆ１＋ｆ３で生じる。従って、第２検出波長領域の復調周波数をｆ１＋ｆ３とすることで、蛍光のクロストークを抑制することができる。このように、２つのプローブ光の変調周波数をそれぞれ異なる値に設定することによって、蛍光信号のクロストークを抑制することができるので、２色同時観察が可能となる。なお、ダイクロイックミラー４１２により、第１検出波長領域の蛍光が反射され、第２検出波長領域の蛍光が透過する構成としても良い。
図１７はさらに他の顕微鏡システム１８の構成を示す図であり、図１８は各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。顕微鏡システム１８も顕微鏡システム１６と同様に、多色の蛍光による減衰蛍光観察に用いられる。例えば、顕微鏡システム１８は、蛍光物質が二種類であって、プローブ光が共通でポンプ光が異なる場合に用いられる。顕微鏡システム１８において顕微鏡システム１６と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム１８は、第１のポンプ光用のレーザ光源１０２に加えて、第２のポンプ光用のレーザ光源５０４と、第２のポンプ光とプローブ光とを合波するダイクロイックミラー５０６を有する。ダイクロイックミラー１０６は、第１のポンプ光を第２のポンプ光およびプローブ光に合波する。
図１８に示すように、第１のポンプ光の波長は第１の蛍光物質の吸収スペクトルＨ内にあり、第１の蛍光物質を励起する。第２のポンプ光の波長は第２の蛍光物質の吸収スペクトルＧ内にあり、第２の蛍光物質を励起する。プローブ光の波長は第１の蛍光物質の蛍光スペクトルＥと第２の蛍光物質の蛍光スペクトルＦとの共通部分にあり、両方の蛍光物質において誘導放出を誘起する。ストークスシフトの大きな蛍光物質を用いてプローブ光を共通にすることで、光源数を減らして装置構成を簡便にすることができる。なお、標本１８６には第１および第２の蛍光物質が含まれている。
ＡＯＴＦ１１４はドライバ１１２から各光に応じた駆動電圧が印加されており、プローブ光をＯＮ状態とし、第１のポンプ光を周波数ｆ１で強度変調し、第２のポンプ光を周波数ｆ４で強度変調する。ＡＯＴＦ１１４で回折した光のうち、プローブ光はダイクロイックミラー１４１を透過するとともに、第１および第２のポンプ光はダイクロイックミラー１４１で反射される。プローブ光はＡＯＭ１２４で周波数ｆ２で強度変調される。一方、第１および第２のポンプ光はＡＯＭ１２４を迂回するようにミラー１４２、１４３で反射されてダイクロイックミラー１４４でポンプ光と合波される。第１のポンプ光、第２のポンプ光およびプローブ光は、ダイクロイックミラー４０２を透過し、走査部１５０を経て、対物レンズ１６４により標本１８６に集光される。周波数ｆ１、ｆ２、ｆ４は互いに異なるように設定される。
第１のポンプ光をＩＰｕｍｐ１、第２のポンプ光をＩＰｕｍｐ２、プローブ光をＩＰｒｏｂｅとすると、それぞれの時間波形は、下記の通り表される。
なお、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３はそれぞれ、第１のポンプ光、第２のポンプ光、プローブ光の光強度である。
顕微鏡システム１８は、ダイクロイックミラー１４４と走査部１５０との間にダイクロイックミラー４０２を有する。ダイクロイックミラー４０２は、第１の蛍光物質からの蛍光を検出する波長領域（第１検出波長領域）および第２の蛍光物質からの蛍光を検出する波長領域（第２検出波長領域）を含む波長領域を反射する。
ダイクロイックミラー４０２により反射された光の光路上にはさらにダイクロイックミラー４１２が配される。ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域を含む波長領域を透過し、第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。
ダイクロイックミラー４１２を透過した第１の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４０４で第１検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４０６を通って受光部４１０で受光される。受光部４１０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３４でロックイン検出される。
一方、ダイクロイックミラー４１２で反射した第２の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４１４で第２検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４１６を通って受光部４２０で検出される。受光部４２０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３５でロックイン検出される。
受光部４１０で受光される信号と、受光部４２０で受光される信号をそれぞれＩＲＦ１，ＩＲＦ２とすると、
これより、ロックインアンプ１３４ではｆ１＋ｆ２で、ロックインアンプ１３５ではｆ４＋ｆ２で、それぞれ復調することが望ましい。
図１８においても、蛍光のクロストークが課題になる。しかしながら、第２検出波長領域に混入する第１の蛍光物質からの減衰蛍光の信号は、周波数ｆ１＋ｆ２で生じるのに対し、第２検出波長領域で取得したい第２の蛍光物質からの減衰蛍光の信号は周波数ｆ４＋ｆ２で生じる。従って、第２検出波長領域の復調周波数をｆ４＋ｆ２とすることで、蛍光のクロストークを抑制することができる。このように、２つのポンプ光の変調周波数をそれぞれ異なる値に設定することによって、蛍光信号のクロストークを抑制することができるので、２色同時観察が可能となる。
ストークスシフトが小さい等の理由により、多色観察において励起のクロストークが問題となる場合に同時観察を実現するための好ましい形態について述べる。図１９にストークスシフトが小さい場合の吸収・蛍光スペクトルと検出波長領域の関係を示す。
図１９の例において、第１のポンプ光の波長は第１の蛍光物質の吸収スペクトルＫに、第２のポンプ光の波長は第２の蛍光物質の吸収スペクトルＬにそれぞれ位置している。プローブ光は誘導放出を誘起するために、第１の蛍光物質の蛍光スペクトルＩと第２の蛍光物質の蛍光スペクトルＪに位置している。また、第１検出波長領域は第１蛍光物質の蛍光スペクトルＩのピークを含むように、第２波長領域は第２蛍光物質の蛍光スペクトルＪのピークを含むように設定されている。
図２０に第１検出波長領域、第２検出波長領域のそれぞれにおいて、観測されうる蛍光と蛍光物質の関係を示す。各検出波長領域において、４種類の信号が観測される可能性がある。
第１検出波長領域においては、蛍光Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの４つの信号が検出される可能性がある。このうち、検出したい信号は、第１のポンプ光によって励起される第１の蛍光物質からの蛍光Ａである。従って、これ以外の蛍光を除去することが望ましい。蛍光ＢとＤは、第１検出波長領域から第２の蛍光物質からの蛍光スペクトルが外れるように、第１検出波長領域を設定することで除去できる。蛍光Ｃは復調周波数の違いを利用することで除去できる。
第２検出波長領域においては、蛍光Ａ'，Ｂ'，Ｃ'，Ｄ'の４つの信号が検出される可能性がある。このうち、検出したい信号は、第２のポンプ光によって励起される第２の蛍光物質からの蛍光Ｄ'である。従って、これ以外の蛍光を除去することが望ましい。蛍光Ａ'とＢ'は復調周波数の違いを利用することで除去できる。これについて、下記に詳細を述べる。
第１のポンプ光、第２のポンプ光およびプローブ光の時間波形は式(2.6)-(2.8)で表される。第１のポンプ光により第１の蛍光物質から生じた蛍光Ａ'と第１のポンプ光により第２の蛍光物質から生じた蛍光Ｂ'の時間波形をＩＲＦ１とすると、
一方、所望の信号光である蛍光Ｄ'の時間波形をＩＲＦ２とすると、
従って、ｆ４＋ｆ２で復調することにより、蛍光Ａ'，Ｂ'の影響を除去できる。
しかしながら、第２検出波長領域において、第２のポンプ光によって励起される第１の蛍光物質からの蛍光Ｃ'は所望の信号光である蛍光Ｄ'と同じ周波数を持つので、周波数による分離はできない。この場合は、第２のポンプ光が第１の蛍光物質を励起しないようにすることが望ましい。それが難しい場合には、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質の蛍光寿命の差を利用して蛍光Ｃ'の混入を低減することが望ましい。蛍光寿命τ、復調周波数ｆ、位相θの間には下記の関係が成り立つ。
図２１（ａ）に復調周波数ｆ＝ｆ４＋ｆ２で検出される、蛍光Ｃ'と蛍光Ｄ'の時間波形を示す。第１の蛍光物質, 第２の蛍光物質の蛍光寿命をそれぞれτ１、τ２とすると、位相はθ1, θ2となる。従って、ロックイン検出において、検出する信号の位相を蛍光Ｄ'に設定することで、蛍光Ｃ'の影響を低減することができる。図２１（ｂ）はロックイン検出される蛍光Ｃ'と蛍光Ｄ'の信号強度をフェーザ表示で表現している。ロックイン検出の位相としてθ２を選ぶことで、蛍光Ｃ'の大きさをcos(θ１−θ２)だけ低減することができる。また、第１のポンプ光が第２蛍光物質を励起し、第１検出波長領域に第２の蛍光物質の蛍光が混入する場合には、第１検出領域において、第１蛍光物質の位相に合わせてロックイン検出しても良い。また、上記位相による検出を、ポンプ光が共通でプローブ光が二種類ある場合（例えば図１６に記載）に適用してもよい。
なお、（ｉ）第１検出波長領域に、第１のポンプ光による第２の蛍光物質からの蛍光が混入せず、かつ、（ｉｉ）第２検出波長領域に、第２のポンプ光による第１の蛍光物質からの蛍光が混入しない場合には、受光部は１つでも良い。上記、（ｉ）（ｉｉ）の条件を満たさない場合には、図１７に示すようにダイクロイックミラー４１２により、蛍光帯域を分離して、それぞれの蛍光を取得することが望ましい。
図２２は、図１５から図２１の２色観察に用いられるＧＵＩ画面３６０を示す。チェックボックス３６２、３６４で蛍光物質の選択を受け付ける。選択された蛍光物質に対応付けて記憶部２２６に記憶されている波長を読み出し、表示欄３６６から３７２にそれぞれ波長が表示される。さらに、選択された蛍光物質の励起・蛍光スペクトルと、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の関係が表示欄３７４表示される。なお、自動設定に代えて、ユーザが任意に、光源波長や検出波長領域を選ぶこともできる。
図２３はさらに他の顕微鏡システム２０の構成を示す図である。顕微鏡システム２０において上記顕微鏡システム１０等と同一の構成については同一の参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム２０では、ドライバ５５２とＡＯＴＦ５５４を有する強度変調部５５０が配されている。単一のＡＯＴＦ５５４によりポンプ光とプローブ光の両方が強度変調される。この場合に当該ＡＯＴＦ５５４においてポンプ光がｆ１で、プローブ光がｆ２でそれぞれ強度変調され、それにより発生した蛍光をロックインアンプ１３４においてｆ１＋ｆ２の復調周波数で復調する。これにより、簡便な構成で減衰蛍光の観察画像を取得することができる。
図２４はさらに他の顕微鏡システム２２の構成を示す図である。顕微鏡システム２２において上記顕微鏡システム１０等と同一の構成については同一の参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム２２では、第１のポンプ光用のレーザ光源１０２に加えて、第２のポンプ光用のレーザ光源５０４と、第２のポンプ光をプローブ光に合波するダイクロイックミラー５０６を有する。ダイクロイックミラー１０６は、第１のポンプ光を第２のポンプ光およびプローブ光に合波する。さらに、顕微鏡システム２０と同様に、強度変調部５５０が配されている。単一のＡＯＴＦ５５４により二種類のポンプ光およびプローブ光の全てが強度変調される。この場合に当該ＡＯＴＦ５５４において第１のポンプ光がｆ１で、第２のポンプ光がｆ４で、プローブ光がｆ２でそれぞれ強度変調される。顕微鏡システム１６と同様に、第１のポンプ光に対応する蛍光を受光部４１０で受光し、ロックインアンプ１３４においてｆ１＋ｆ２の復調周波数で復調する。一方、第２のポンプ光に対応する蛍光を受光部４２０で受光し、ロックインアンプ１３５においてｆ４＋ｆ２の復調周波数で復調する。これにより、簡便な構成で減衰蛍光の多色の観察画像を取得することができる。
図２５はさらに他の顕微鏡システム２４の構成を示す図である。顕微鏡システム２４において上記顕微鏡システム１０等と同一の構成については同一の参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム２４では、ポンプ光用のレーザ光源１０２に対して強度変調部５６０が設けられ、プローブ光用のレーザ光源１０４に対して強度変調部５７０が設けられる。強度変調部５６０は、ドライバ５６２とＡＯＭ５６４を有しており、ポンプ光をｆ１で強度変調する。また、強度変調部５７０は、ドライバ５７２とＡＯＭ５７４を有しており、プローブ光をｆ２で強度変調する。さらに、強度変調されたポンプ光とプローブ光とはミラー４５２およびダイクロイックミラー４５０により合波される。受光部４１０で受光された蛍光はロックインアンプ１３４においてｆ１＋ｆ２の復調周波数で復調する。これにより、高い変調周波数で復調でき、従って減衰蛍光の観察画像を取得する時間を短くすることができる。
図２６はさらに他の顕微鏡システム２６の構成を示す図である。顕微鏡システム２６において上記顕微鏡システム１０等と同一の構成については同一の参照番号を付して説明を省略する。
顕微鏡システム２６では、第１のポンプ光用のレーザ光源１０２に対して強度変調部５６０が設けられ、プローブ光用のレーザ光源１０４に対して強度変調部５７０が設けられ、第２のポンプ光用のレーザ光源５０４に対して強度変調部５８０が設けられる。強度変調部５６０は第１のポンプ光をｆ１で強度変調し、強度変調部５７０はプローブ光をｆ２で強度変調する。さらに、強度変調部５８０は、ドライバ５８２とＡＯＭ５８４を有し、第２のポンプ光をｆ４で強度変調する。強度変調された第１のポンプ光、第２のポンプ光およびプローブ光は、ミラー４５８、４６０およびダイクロイックミラー４５４、４５６により合波される。顕微鏡システム１６と同様に、第１のポンプ光に対応する蛍光を受光部４１０で受光し、ロックインアンプ１３４においてｆ１＋ｆ２の復調周波数で復調する。一方、第２のポンプ光に対応する蛍光を受光部４２０で受光し、ロックインアンプ１３５においてｆ４＋ｆ２の復調周波数で復調する。これにより、多色観察においても、高い変調周波数で復調でき、従って減衰蛍光の観察画像を取得する時間を短くすることができる。
なお、顕微鏡システム１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６において走査部１５０に代えて、図６の走査部１５１または図７の走査部１５６が用いられてもよい。
また、顕微鏡システム１０等においてＡＯＴＦ１１４でＯＮ状態としたプローブ光をＡＯＭ１２４で変調したが、ＡＯＴＦ１１４によってプローブ光をｆ１で変調して、ＡＯＭ１２４によってポンプ光をｆ２で変調する構成としても良い。
また顕微鏡システム１０から２６においてＡＯＭ１２４等の代わりに、チョッパーなどのメカニカルシャッターを用いて強度変調しても良い。変わりに、ＥＯＭ(電気光学素子)と偏光子を用いて、偏光方向を高速に切り替えることで、強度変調しても良い。
レーザ光源１０２等として連続発振方式を用いたが、パルスレーザを用いてもよい。パルスレーザの方がピーク強度が大きいので誘導放出が効率よく生じ、減衰蛍光信号も効率良く生じるという利点がある。なお、パルスの繰り返し周波数は蛍光寿命やパルスのピークパワーによるダメージを考慮して決定されることが望ましい。一方、ＣＷレーザの方が価格が安いという利点がる。また、受光部１７４等として光電子増倍管を用いたが、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を用いても良い。
図２７は他の光源１０１の例を示す。光源１０１においてレーザ光源１０４、１０２はパルスレーザである。これらのパルスレーザを用いて、蛍光寿命を測定する。光源１０１において、プローブ光用レーザ光源１０４から出力された光をミラー４７０で反射させ、光学ディレイステージ７００に入射させる。光学ディレイステージ７００は矢印方向に移動可能であり、ミラー４７１とミラー４７２により構成されている。光学ディレイステージを矢印方向に平行移動することで、プローブ光の光路長が変化し、ポンプ光とプローブ光の光パルスに時間差をつけることができる。ミラー４７０で反射した光は、ミラー４７１とミラー４７２で反射し、ミラー４７０から導入された光に対して平行にミラー４７３へ導かれる。ミラー４７３を反射した光はダイクロイックミラー１０６によって、ポンプ光と合成される。以降は図１と同様である。
光学ディレイステージ７００を平行移動したときのポンプ光パルスとプローブ光パルスとの時間差および蛍光の時間波形の様子を図２８に示す。（ａ）−（ｃ）は光学ディレイステージ７００の移動量ｄｚとパルスの時間差の関係を示している。移動量ｄｚが小さいと時間差も小さく、移動量ｄｚが大きくなると時間差も大きくなる。（ｄ）はポンプ光によって生じる蛍光の時間波形を示している。蛍光は寿命に従ってこのように指数関数的に減少するのが一般的に知られている。誘導放出によって蛍光を減衰させるためには、ポンプ光に対するプローブ光の時間差は蛍光の発光持続時間よりも短い必要がある。また、時間差が短いほど、蛍光が多く減少するので、減衰蛍光信号も大きくなる。従って、光学ディレイステージ７００によって時間差をつけて、各時間差で減衰蛍光信号を取得することで、蛍光寿命を測定することができる。この様子を図２９に示す。減衰蛍光信号が、蛍光寿命を反映する様子を示している。イメージングにおいて、複数の時間差で減衰蛍光像を取得することで、蛍光寿命イメージングができる。
また、上記実施形態において励起には一光子励起を用いたが、二光子励起、三光子励起といった多光子励起を用いても良い。
上記実施形態において、減衰蛍光観察時、デスキャンにより蛍光を検出する構成において、ピンホール４０８等を絞る構成としても良い。その結果、結像系の点像分布関数も光学分解能向上に寄与するため、さらなる分解能向上が可能となる。光量が十分確保される明るい蛍光を観察する場合には、ピンホール４０８等を絞る構成とすることが望ましい。一方で、光量が十分に確保されない暗い蛍光を観察する場合には、ピンホール４０８等を開放することが望ましい。また、図１５から図２６に示す顕微鏡システム１４から２６においてデスキャン光学系を有しかつピンホール４０８、４１８等が配されているので、共焦点顕微鏡としても用いることができる。
また、広視野観察時において倍率色収差によりポンプ光とプローブ光の面内方向のスポットズレが問題となる場合や、深部観察において軸上色収差によりポンプ光とプローブ光の光軸方向のスポットずれが問題となる場合は、ポンプ光のビーム径をプローブ光のビーム径に比べて細く（小さく）することが望ましい。これにより、ポンプ光のスポットが面内方向・光軸方向に広がり、ビームのオーバーラップがより容易になる。なお、ポンプ光のビーム径を細くする理由は、ポンプ光はプローブ光に比べて波長が短いことから、同一の対物レンズにおいて同一のビーム径でスポットを生成した際に、ポンプ光の方がプローブ光に比べてスポット径が小さいためである。
また、顕微鏡システム１０、２０、２２、２４、２６においても、顕微鏡システム１４等と同様に、波長制御部２３０を設けてレーザ光源の光の波長を制御してもよい。
なお、ダイクロイックミラー１６２、４０２は照射光を透過して蛍光を反射するが、これに代えて、照射光を反射して蛍光を透過するようにしてもよい。また、ダイクロイックミラー１６２、４０２等のダイクロイックミラーは、予め定められた波長の光を他の波長の光から分離する波長分離部材の一例である。
なお、特定の周波数の信号成分を検出する方式としてロックインアンプについて説明したが、他の方法でも良い。例えば、時間信号をフーリエ変換することで特定の周波数の信号成分を検出しても良い。例えば、周波数変換器により、復調周波数を持つ参照信号と信号光を乗算し、直流成分のみを抽出する構成としても良い。なお、ここでいう直流成分とは、正弦波の振動成分を直流に変換した値に相当する。
なお、ポンプ光とプローブ光の偏光は同一であることが望ましい。例えば、同一の直線偏光、円偏光であることが望ましい。あるいは、ポンプ光とプローブ光の偏光を直交する直線偏光とした場合と、平行な直線偏光とした場合でそれぞれ減衰蛍光像を取得し、両者を比較することで、標本の偏光特性を可視化する構成としても良い。これは、誘導放出の効率が偏光に依存するためである。
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６ 顕微鏡システム
１００、１０１ 光源
１０２、１０４、５００、５０４ レーザ光源
１０６、１４１、１４４、１６２、４０２、４１２、４５０、４５４、４５６、５０６ ダイクロイックミラー
１１０ 第１強度変調部
１１２ ドライバ
１１４ 音響光学チューナブルフィルタ
１２０ 第２強度変調部
１２２ ドライバ
１２４ 音響光学素子
１３０ 制御部
１３２ 発振器
１３４、１３５ ロックインアンプ
１３６、１３７ 検出部
１４０ 照明光学系
１４２、１４３、１５４、１５５、１５７、４５２、４５８、４６０ ミラー
１５０、１５１、１５６ 走査部
１５２ レゾナントスキャナ
１５３ ガルバノスキャナ
１６０ 観察光学系
１６４ 対物レンズ
１６６、４０４、４１４ 光学フィルタ
４０６、４１６ レンズ
１７２、１７３ レンズペア
１７４、４１０、４２０ 受光部
１８０ ステージ
１８２ スライドガラス
１８４ 観察対象物
１８６ 標本
２２０ 入力部
２２２ 画像生成部
２２４ 表示部
２２６ 記憶部
２２８ スキャナ制御部
２２９ 周波数制御部
２３０ 波長制御部
３００、３５０、３６０ ＧＵＩ画面
３０２、３０４、３１２、３１６、３２４、３５２、３６２、３６４ チェックボックス
３５４、３５６、３５８、３６６、３７４ 表示欄
３０８、３１０、３１４、３１８、３２０、３２２、３２６ 入力欄
３３０、３３２ 観察画像
３３４、３３５ タイムラプス画像
４０８、４１８ ピンホール
５５０、５６０、５７０、５８０ 強度変調部
５５２、５６２、５７２、５８２ ドライバ
５５４ ＡＯＴＦ
５６４、５７４、５８４ ＡＯＭ

Claims (27)

  1. 標本に含まれる第１の蛍光物質を励起する第１の光を周波数ｆ１で強度変調し、前記第１の蛍光物質と種類が異なる第２の蛍光物質を励起する第４の光を前記周波数ｆ１と異なる周波数ｆ４で強度変調する第１の強度変調部と、
    前記第１の蛍光物質および前記第２の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を前記周波数ｆ１および前記周波数ｆ４とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、
    前記第１の光および前記第２の光を前記標本において走査する走査部と、
    前記標本からの蛍光を検出する検出部と
    を備え、
    前記走査部は、共振ミラーを有するレゾナントスキャナを有し、
    前記検出部は、
    前記標本からの蛍光を受光し、周波数ｆ１＋ｆ２の成分および周波数ｆ４＋ｆ２の成分を検出する
    顕微鏡システム。
  2. 前記検出部は、
    前記標本からの蛍光を受光する受光部と、
    前記受光部で受光した蛍光を前記周波数ｆ１＋ｆ２、および、前記周波数ｆ４＋ｆ２でロックイン検出するロックインアンプ
    を備える
    請求項１に記載の顕微鏡システム。
  3. 標本に含まれる第１の蛍光物質および前記第１の蛍光物質と種類が異なる第２の蛍光物質を励起する第１の光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、
    前記第１の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、前記第２の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第３の光を前記周波数ｆ１および前記周波数ｆ２と異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、
    前記第１の光および前記第２の光を前記標本において走査する走査部と、
    前記標本からの蛍光を検出する検出部と
    を備え、
    前記走査部は、共振ミラーを有するレゾナントスキャナを有し、
    前記検出部は、
    前記標本からの蛍光を受光し、周波数ｆ１＋ｆ２の成分および周波数ｆ１＋ｆ３の成分を検出する
    顕微鏡システム。
  4. 前記検出部は、
    前記標本からの蛍光を受光する受光部と、
    前記受光部で受光した蛍光を前記周波数ｆ１＋ｆ２、および、前記周波数ｆ１＋ｆ３でロックイン検出するロックインアンプ
    を備える
    請求項３に記載の顕微鏡システム。
  5. 前記走査部は、主走査方向を走査する共振ミラーと副走査方向を走査するガルバノミラーとを有する
    請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  6. 前記走査部と、前記標本との間に対物レンズが設けられ、
    前記対物レンズと、前記走査部との間に第１の波長分離部材が設けられ、
    前記検出部は、前記第１の波長分離部材を透過又は反射した蛍光を検出する
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  7. 光源と、前記走査部との間に第２の波長分離部材が配置され、
    前記検出部は、前記第２の波長分離部材を透過又は反射した蛍光を検出する
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  8. 前記第２の波長分離部材と前記検出部との間に、開口部を有する開口部材が設けられ、
    前記開口部材の開口部の大きさは可変である
    請求項７に記載の顕微鏡システム。
  9. 前記走査部は、前記レゾナントスキャナとガルバノスキャナとが選択可能に構成されている
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  10. 前記第１の光のビーム径は、第２の光のビーム径よりも小さい
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  11. 前記第１の蛍光物質と第１の光の波長とを対応付けた情報と、前記第１の蛍光物質と第２の光の波長とを対応付けた情報とを記憶する記憶部と、
    前記第１の蛍光物質の選択を受け付ける受付部と
    制御部と
    をさらに備え、
    前記制御部は、
    前記記憶部を参照して、前記受付部により受け付けられた前記第１の蛍光物質に対応する前記第１の光および第２の光の波長を決定する
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  12. 前記記憶部は、
    前記第１の蛍光物質と第１の光の波長と前記第１の光の変調周波数とを対応付けた情報と、前記第１の蛍光物質と前記第２の光の波長と前記第２の光の変調周波数とを対応付けた情報とを記憶し、
    前記制御部は、
    前記記憶部を参照して、前記受付部により受け付けられた前記第１の蛍光物質に対応する前記第１の光および前記第１の光の変調周波数と、第２の光の波長および前記第２の光の変調周波数を決定する
    請求項１１に記載の顕微鏡システム。
  13. 前記第１の強度変調部および前記第２の強度変調部の一方は音響チューナブルフィルタを有し、他方は音響光学素子を有する
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  14. 前記周波数ｆ１＋ｆ２の成分および前記周波数ｆ１＋ｆ３の成分の少なくとも一方の成分について、所定の位相で検出する
    請求項３を引用する請求項５〜１３、請求項３、および、請求項４、のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  15. 前記周波数ｆ１＋ｆ２の成分および前記周波数ｆ４＋ｆ２の成分の少なくとも一方の成分について、所定の位相で検出する
    請求項１を引用する請求項５〜１３、請求項１、および、請求項２、のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  16. 前記検出部にて検出した蛍光に基づき蛍光寿命を測定する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  17. 前記第１の蛍光物質および前記第２の蛍光物質の励起において、多光子励起を用いる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  18. 標本に含まれる第１の蛍光物質を励起する第１の光を前記標本に照射し、前記標本からの蛍光を検出部において受光させる
    第１の観察方法と、
    前記第１の光を周波数ｆ１で強度変調し、前記第１の蛍光物質と種類が異なる第２の蛍光物質を励起する第４の光を前記周波数ｆ１と異なる周波数ｆ４で強度変調して前記標本に照射し、
    前記第１の蛍光物質および前記第２の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を前記周波数ｆ１および前記周波数ｆ４とは異なる周波数ｆ２で強度変調して前記標本に照射し、
    前記検出部において前記標本からの蛍光を受光させ、周波数ｆ１＋ｆ２の成分および周波数ｆ４＋ｆ２の成分を検出させる
    第２の観察方法と
    が選択可能に構成された顕微鏡システム。
  19. 標本に含まれる第１の蛍光物質および前記第１の蛍光物質と種類が異なる第２の蛍光物質を励起する第１の光を前記標本に照射し、前記標本からの蛍光を検出部において受光させる
    第１の観察方法と、
    前記第１の光を周波数ｆ１で強度変調して前記標本に照射し、
    前記第１の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第２の光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、前記第２の蛍光物質において誘導放出を生じさせる第３の光を前記周波数ｆ１および前記周波数ｆ２と異なる周波数ｆ３で強度変調して前記標本に照射し、
    前記検出部において前記標本からの蛍光を受光させ、周波数ｆ１＋ｆ２の成分および周波数ｆ１＋ｆ３の成分を検出させる
    第２の観察方法と
    が選択可能に構成された顕微鏡システム。
  20. 前記検出部と前記標本との間には、開口部を有する開口部材が設けられ、
    前記開口部材の開口部の大きさは可変である
    請求項１８又は１９に記載の顕微鏡システム。
  21. 対物レンズを有し、
    前記開口部材は、前記検出部と前記対物レンズとの間に設けられている
    請求項２０に記載の顕微鏡システム。
  22. 前記対物レンズと前記検出部との間に走査部を有し、
    前記開口部材は、前記検出部と前記走査部との間に設けられている
    請求項２１に記載の顕微鏡システム。
  23. 前記走査部と前記検出部との間に波長分離部材を有し、
    前記開口部材は、前記検出部と前記波長分離部材との間に設けられている
    請求項２２に記載の顕微鏡システム。
  24. 前記第１の観察方法における前記開口部の前記開口部の大きさは、前記第２の観察方法における前記開口部の大きさよりも小さい
    請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  25. 前記蛍光物質の種類に基づいて、前記第１の観察方法または第２の観察方法が選択されるように構成されている
    請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  26. 前記検出部にて検出した蛍光に基づき蛍光寿命を測定する、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  27. 前記第１の蛍光物質および前記第２の蛍光物質の励起において、多光子励起を用いる、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
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