JP2016206648A - レーザー走査顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 レーザー走査顕微鏡装置において、画像データを取得するために要する時間を、合焦動作を逐一行って広域の画像データを取得する場合と比較して短縮する。【解決手段】 レーザー走査顕微鏡装置１００は、レーザー光を集光して試料６に照射する照射部１と、照射位置から発せられる光を検出する光検出部３と、レーザー光をＸ方向およびＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、Ｚ方向に走査するＺ走査手段と、を有し、照射位置から試料６に関する情報を取得する。レーザー顕微鏡装置１００は、照射位置をＸＹ走査手段によってＸ方向およびＹ方向に走査してＸＹ二次元画像データを取得する際に、Ｚ走査手段によって照射位置をＺ方向にも走査して光を検出することで、Ｚ座標の異なる照射位置から発せられた前記光の情報がそれぞれ格納された少なくとも２つの画素を含むＸＹ二次元画像データを取得する。【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザー走査顕微鏡装置に関する。

顕微鏡を用いて試料を観察する場合、１度に観察できる視野の広さは、対物レンズの視野の広さによって制限される。そのため、対物レンズの視野の広さよりも大きな試料を観察する場合には、試料の全体を１度に観察することはできない。

一方、病理診断においては観察対象の見落としを防ぐために、試料全体を観察したいという要望がある。そこで病理診断では、高倍率の対物レンズを用いて特定の注目領域について詳細に観察を行う前に、低倍率の対物レンズを用いて試料の比較的広い領域についての観察を行って、注目領域を決定することが行われている。

顕微鏡の１つの視野よりも広い領域の画像を取得する方法として、顕微鏡の光軸方向（Ｚ方向）に直行する方向（Ｘ方向、Ｙ方向）に視野を移動させて複数の画像を取得し、取得した複数の画像を貼り合わせて、一つの大きな画像を得る方法が知られている。しかし、試料にうねりがある場合など、試料の存在するＺ方向における位置（Ｚ座標）が視野ごとに異なる場合があり、視野をＸ方向、Ｙ方向に移動すると顕微鏡の合焦面と試料とがずれてしまうことが考えられる。

そこで特許文献１には、視野をＸ方向、Ｙ方向に移動する度に合焦動作を行い、全体にピントの合った広域画像を取得する顕微鏡システムが記載されている。

特開平９−２８１４０５号公報

特許文献１では、合焦動作により焦点位置を試料に合わせた上で視野内の画像を取得する一連の動作を、視野を移動する度に繰り返して広域の画像を取得する。そのため、広域の画像を取得するために時間を要するという課題があった。

そこで本発明は、上述の課題に鑑み、レーザー走査顕微鏡装置において、画像データを取得するために要する時間を、合焦動作を行ってから視野内の画像を取得する一連の動作を視野の移動の度に繰り返して広域の画像データを取得する場合と比較して短縮することを目的とする。

本発明の一側面としてのレーザー走査顕微鏡装置は、レーザー光を対物レンズによって集光して試料に照射する照射部と、集光して照射される前記レーザー光の前記照射位置から発せられる光を検出する光検出部と、前記照射部によって前記試料に照射する前記レーザー光を、前記対物レンズの光軸方向に垂直なＸ方向ならびに前記光軸方向および前記Ｘ方向に垂直なＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、を有するレーザー走査顕微鏡装置であって、前記照射部によって前記試料に照射する前記レーザー光を、前記対物レンズの光軸方向と平行なＺ方向に走査するＺ走査手段を有し、前記ＸＹ走査手段によって前記照射位置を前記Ｘ方向および前記Ｙ方向に走査しつつ前記光を検出して、検出した前記光の情報が前記照射位置のＸ座標およびＹ座標に対応する画素ごとに格納されたＸＹ二次元画像データを取得する際に、前記Ｚ走査手段によって前記照射位置をＺ方向にも走査しつつ前記光を検出することで、Ｚ座標の異なる照射位置から発せられた前記光の情報がそれぞれ格納された少なくとも２つの画素を含むＸＹ二次元画像データを取得することを特徴とする。

本発明によれば、レーザー走査顕微鏡装置において、画像を取得するために要する時間を、合焦動作を行ってから視野内の画像を取得する一連の動作を視野の移動の度に繰り返して広域の画像データを取得する場合と比較して短縮することができる。

第１の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。 第１の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置の第２の計測モードにおける動作を示すフローチャートである。 第１の実施形態に係るスポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。 第２の実施形態に係るスポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。 （ａ）第１の実施形態に係る計測点の位置の変化を模式的に示した図と、（ｂ）第２の実施形態に係る計測点の位置の変化を模式的に示した図である。 第３の実施形態に係るスポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。 第４の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置の第２の計測モードにおける動作を示すフローチャートである。 第４の実施形態に係るスポットの照射位置の軌跡を、Ｘ方向から見た図である。 第５の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。 第６の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。

以下、本発明のレーザー走査顕微鏡装置に係るいくつかの実施形態について説明する。なお、これらの実施形態は本発明における最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はこれらの実施形態にて説明する各種構成、数値のみに限定されるものではない。これらの構成、数値は適宜選択することができるものである。

（第１の実施形態）
（装置構成）
まず、第１の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置１００（以下、「装置１００」と称する）の構成について、図１を用いて説明する。図１は、装置１００の構成を模式的に示す図である。

装置１００は、レーザー光を試料６の内部または試料６の表面の少なくとも一部にスポットとして照射し、レーザー光の照射位置から発せられる蛍光や非線形光学現象によって発生する光（以下、「光Ｌ」と称する）などを検出する。そして、レーザー光が試料６の照射位置Ｓを二次元的に走査して光Ｌの検出を行う。装置１００はこれにより光Ｌの二次元分布情報を取得し、試料６の二次元画像データを取得する。なお光Ｌの検出の際には、照射位置Ｓから発せられる光である光Ｌを直接検出してもよいし、試料６に照射したレーザー光の反射光や透過光、散乱光などを検出し、その強度変化から光Ｌを検出してもよい。

装置１００は、レーザー光を試料６にスポットとして集光照射し、照射位置Ｓを試料６の内部または試料６の表面で走査するレーザー走査顕微鏡装置であれば、その種類は特に限定はされない。具体的には、非線形光学顕微鏡装置や共焦点レーザー顕微鏡装置などが挙げられる。非線形光学顕微鏡装置は非線形光学効果を利用した顕微鏡装置であり、非線形光学効果としては、多光子励起や多光子吸収、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ：Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ：Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、第二高調波発生（ＳＨＧ：Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）などがある。

図１に示すように、装置１００は、照射部１と、試料ステージ２と、光検出部３と、制御部４と、データ取込部５と、および、データ処理部８と、を有する。

照射部１は、光源１１と、光スキャナ１２と、および、第１の対物レンズ１３と、を有する。照射部１は、光源１１から出射されたレーザー光を第１の対物レンズ１３により集光し、試料６の内部または試料６の表面にスポットとして照射する部分である。

光源１１は、レーザー光を発する光源である。光源１１の発するレーザー光の種類は、特に限定はされず、その波長帯域、出力、パルス光／ＣＷ光の区分等は任意に選択することができる。なお、本実施形態では１つの光源のみを用いた装置１００を説明するが、複数の光源を有する構成としてもよい。装置１００は例えば、第１のレーザーと第２のレーザーとを同時に用いるＳＲＳ顕微鏡装置の構成としてもよい。あるいは、装置１００は光源１１として、試料中の複数の蛍光色素の励起波長にそれぞれ対応する複数のレーザーを有するレーザー走査蛍光顕微鏡装置であってもよい。また、装置１００は、光源１１として波長可変光源を有し、操作者が必要に応じて波長を選択し、試料中の蛍光色素を選択的に励起する蛍光顕微鏡装置であってもよい。なお、光源１１が複数の光源を有する場合は、照射部１の複数の光源１１からのレーザー光を合波する合波部をさらに有していてもよい。

光スキャナ１２は、光源１１から出射され、第１の対物レンズ１３で集光されて試料６にスポットとして照射されるレーザー光の照射位置を、第１の対物レンズ１３の光軸Ｏに対して垂直な平面方向（以下、「ＸＹ方向」と称する）に走査する部分である。すなわち、光スキャナ１２は、スポットの照射位置を光軸Ｏに垂直なＸ方向に走査するＸ走査手段である。また、光スキャナ１２は、スポットの照射位置を光軸Ｏに垂直かつＸ方向に垂直なＹ方向に走査するＹ走査手段でもある。すなわち、光スキャナ１２はスポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向に走査するＸＹ走査手段である。

第１の対物レンズ１３は、光源１１から出射されたレーザー光を集光し、試料６にスポットとして照射する。

試料ステージ２は、試料６を載置する部分である。試料６は、操作者によって試料ステージ２上に載置されることにより、第１の対物レンズ１３と第２の対物レンズ３１（後述）との間に配置される。また試料ステージ２は、制御部４によって光軸Ｏに平行な方向（以下、「Ｚ方向」と称する）またはＸＹ方向に移動することができる。これにより、試料ステージ２に載置された試料６の装置１００に対する相対位置を移動させることができ、照射部１によって走査されるレーザー光の走査領域を移動させることができる。

光検出部３は、照射部１によってスポットとして照射されるレーザー光の試料６の内部または試料６の表面の照射位置Ｓから発せられる光を検出する。光検出部３はこれにより、スポットの照射位置から試料６に関する情報を取得することができる。光検出部は、第２の対物レンズ３１と、光学フィルタ３２と、検出器３３と、を有する。

第２の対物レンズ３１は、試料６から発せられる蛍光や試料６を透過したレーザー光など、試料６中または試料６上のスポットの照射位置から発せられた光を含む光を集める。第２の対物レンズとして、コンデンサレンズを用いてもよい。

光学フィルタ３２は、第２の対物レンズ３１によって集められた光のうち、所定の波長の光を遮ることで、必要な波長の光を取り出す部分である。例えば光Ｌとして蛍光を検出する場合、光学フィルタ３２は試料６中の蛍光体を励起する光の波長に該当する光を遮断し、検出すべき蛍光の波長の光のみを透過させる。また、光Ｌとして誘導ラマン散乱光を検出する場合、光学フィルタ３２は試料６に照射する２種類の光のうち、一方の波長の光を遮断し、もう一方の波長の光のみを通過させる。

なお、必要な波長の光の取り出しは、光学フィルタ３２の代わりにその他の方法によって行ってもよい。例えば、光学フィルタ３２の代わりにダイクロイックミラーや回折格子等の分光器を使用してもよい。

検出器３３は、光学フィルタ３２を透過した光を検出する部分である。検出器３３は光学フィルタ３２を通過した光を受光して光電変換し、電気信号を出力する。このとき検出器３３は、受光した光の光強度を電圧の信号強度として出力する。検出器３３としては、例えば光電子増倍管（フォトマルチプライヤーチューブ、ＰＭＴ）を使用することができる。検出器３３は、フォトダイオードとロックインアンプとを組み合わせた構成であってもよい。

制御部４は、光スキャナ１２および試料ステージ２を制御する部分である。制御部４は、試料ステージ制御部４１と、光スキャナ制御部４２と、を有する。

試料ステージ制御部４１は、試料ステージ２がＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向にそれぞれ移動するように、試料ステージ２を移動させるモータ（不図示）の駆動の制御を行う。

試料ステージ制御部４１によって駆動を制御される試料ステージ２の移動は、大きく分けてＸＹ移動とＺ移動に区分される。

ＸＹ移動は、試料ステージ２のＸ方向、Ｙ方向への移動である。これにより、照射部１によって走査されるスポットの走査領域（以下、「視野」と称する）が、ＸＹ方向に移動する。視野の広さは第１の対物レンズ１３および光スキャナ１２によって制限されるが、このようにＸＹ移動によって視野をＸＹ方向に移動することによって、１つの視野よりも広い範囲の観察ができる。

なお、本実施形態では光スキャナ１２によってスポットのＸ方向およびＹ方向の走査を行い、試料ステージ制御部４１によって視野のＸＹ移動を行う構成としたが、これに限定はされない。すなわち、試料ステージ２によってスポットのＸ方向およびＹ方向の走査を行う構成としてもよい。試料ステージ２によってスポットのＸ方向およびＹ方向の走査を行う構成とした場合には、Ｚ走査手段がＸＹ走査手段を兼ねることになる。しかし、光スキャナ１２による走査のほうがより高速に行うことが可能であるため、光スキャナ１２によってスポットのＸ方向およびＹ方向の走査を行う構成が好ましい。

Ｚ移動は、試料ステージ２のＺ方向への移動である。これにより、照射部１によって照射されるスポットのＺ方向における位置が移動する。スポットのＺ方向における位置を移動させることで、視野の試料６における深度を変えて観察を行うことができる。本実施形態に係る装置１００は、光スキャナ１２によってスポットをＸ方向およびＹ方向に走査するのと同様に、試料ステージ制御部４１によってスポットをＺ方向に走査することができる。すなわち、本実施形態において試料ステージ制御部４１および試料ステージ２はＺ走査手段である。本実施形態では、試料ステージ制御部４１によって試料ステージ２をＺ方向に移動させることで、スポットのＺ方向における位置を移動させる構成としたが、これに限定はされない。例えば、第１の対物レンズ１３をＺ方向に移動可能に構成し、第１の対物レンズ１３をＺ方向に移動させることによって、スポットのＺ方向における位置を移動させる構成としてもよい。すなわち、照射部１をＺ走査手段としてもよい。例えば、第１の対物レンズ１３にピエゾ素子や音叉、モーターおよびギヤを接続するなどにより、第１の対物レンズ１３と試料６との相対的な位置関係を変化させることができる。

データ取込部５は、光検出部３から受信した電気信号の信号強度を、光スキャナ１２および試料ステージ２の制御量から算出されるスポットの位置のＸ座標、Ｙ座標に関連付けてＸＹ二次元画像データを取込む部分である。なお、データ取込部５は、上記情報にさらにスポットの位置のＺ座標を関連付けたＸＹＺ三次元画像データを取込んでもよい。

なお、装置１００は透過型のレーザー走査顕微鏡装置としたが、反射型のレーザー走査顕微鏡装置であってもよい。その場合、一例として、第１の対物レンズ１３が、第２の対物レンズ３１の役割を兼ねる構成で実現される。

データ処理部８は、データ取込部５から送信されるデータを受信し、受信したデータを処理する部分である。データ処理部８は例えば、異なる視野に対応付けられる画像データを取込み、それらを貼り合わせることで広域画像データを生成する。またデータ処理部８は、多変量解析や機械学習等の手法によってＸＹ二次元画像データ等の各種データのデータ処理を行い、試料６に含まれる成分の可視化を行うことができる。データ処理部８は、各種データを一時的に記憶したり、データ処理結果や計測の際の各種条件等を記憶したりするための記憶部（不図示）を有してもよい。

また、装置１００は、画像表示部７１と、指示入力部７２と、を有していても良い。

画像表示部７１は、データ処理部８に接続され、計測結果やデータ処理部８によって生成された画像、計測の際の各種条件等を表示する部分である。画像表示部７１としては例えば、フラットパネルディスプレイなどを用いることができる。

指示入力部７２は、データ取込部５にデータ処理部８を介して接続され、装置１００を使用する操作者によって計測の際の各種条件等が入力される部分である。

（第１の計測モード）
次に、特定のＺ座標における１視野のＸＹ二次元画像データを取得する際の装置１００の動作について説明する。なお本明細書では、この動作を「第１の計測モード」と称する。

レーザー光は光源１１から出射し、光スキャナ１２に導入され、第１の対物レンズ１３によって集光された際のスポットの位置がＸＹ方向に走査されるように、光スキャナ１２によってＸＹ方向に走査される。光スキャナ１２を通過したレーザー光は、第１の対物レンズ１３により集光され、試料６の内部または試料６の表面にスポットとして照射される。

装置１００（光検出部３）は、光Ｌとして、レーザー光により励起されることで試料６から発せられ、試料６を透過する蛍光を検出する。よって、試料６の内部または試料６の表面のスポットから発せられた蛍光は、第２の対物レンズ３１によって集光される。このとき装置１００は、試料６から発せられる蛍光だけではなく、試料６を透過するレーザー光（励起光）も一緒に、第２の対物レンズ３１によって集光する。なお、本実施形態では光Ｌとして蛍光を検出する装置１００について説明するが、光Ｌはこれに限定されるものではない。光Ｌは、多光子励起や多光子吸収、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱、第二高調波発生などの非線形光学効果によって発生する光であってもよい。

第２の対物レンズ３１によって集光された光は、光学フィルタ３２を通過する。ここで本実施形態に係る光学フィルタ３２は、波長によって透過特性が異なり、光源１１から出射されたレーザー光（励起光）の波長の光は遮るように構成されている。蛍光の波長はレーザー光の波長とは異なるため、光学フィルタ３２を通過させることでレーザー光（励起光）を遮断し、蛍光のみを透過させることができる。

光学フィルタ３２を透過した蛍光は、検出器３３に導かれる。検出器３３は蛍光を受光し、蛍光の強度に対応した電圧値を有する電気信号を出力する。

検出器３３が出力した電気信号は、データ取込部５によってアナログ／デジタル変換（ＡＤ変換）される。そして、ＡＤ変換されて得られたデジタル信号は、記憶部（不図示）へと伝送される。データ取込部５はこれと同期して、スポットの照射位置の位置情報と、励起光および蛍光の波長情報と、を制御部４から取得する。データ取込部５は、このようにして取得した各種情報をもとに、蛍光強度がＸＹ座標に対応する画素ごとに格納されたＸＹ二次元画像データを生成する。

このように、装置１００は、特定のＺ座標におけるＸＹ二次元画像データを取得することができる。また、スポットのＺ座標をＺ走査手段によって移動させてＸＹ二次元画像データを取得することで、Ｚ座標（深度）の異なるＸＹ二次元画像データを複数取得することができる。

しかしながら、視野ごとにＺ座標を変えて複数のＸＹ二次元画像データを取得すると、ＸＹ二次元画像データの取得に時間がかかる。さらに、取得されるデータ量も膨大となるため、その後の解析に時間がかかる。そのため、視野をＸＹ方向に移動して広域の観察を行う際には、視野ごとに取得するＸＹ二次元画像データの数は少ないほうが好ましい。しかし、視野ごとのＸＹ二次元画像データの数を減らすために、例えば特定のＺ座標についてのみＸＹ二次元画像データの取得を行うと、視野によっては試料６の情報が得られない画像データが得られる場合が生じてしまう。この課題は特に、試料６が「うねり」を有する試料であり、ＸＹ方向の位置によって試料６の存在するＺ座標が異なる場合に顕著である。そこで装置１００は、広域の観察を行う際には、後述する「第２の計測モード」で、ＸＹ二次元画像データの取得を行う。

（第２の計測モード）
以下、装置１００の第２の計測モードにおける動作について、図２および図３を用いて説明する。図２は、装置１００の第２の計測モードにおける動作を表すフローチャートである。また、図３（ａ）および（ｂ）は、装置１００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。

まず操作者は、指示入力部７２を操作して、試料ステージ２をＺ方向に移動させ、スポットの照射位置をＺ方向に走査するためのパラメータを入力する（Ｓ２０１）。このとき操作者はパラメータとして、スポットの照射位置のＺ方向の走査範囲、スポットの照射位置の走査速度または走査周波数、を指示入力部７２に入力する。

スポットのＺ方向の走査範囲は、スポットの照射位置のＺ座標の下端から上端までの範囲であり、これは試料ステージ２のＺ方向の移動範囲に対応する。スポットのＺ方向の走査範囲は、試料６が存在する全てのＺ座標を少なくとも含むように設定することが好ましい。

試料６としては例えば生体組織切片などを用いることができ、試料６は試料の厚さが数μｍ程度の薄い試料を用いることが多い。また試料６は、スライドガラス（不図示）とカバーガラス（不図示）によって挟まれ、水などの液体中に保持された状態で、試料ステージ２に載置されることが多い。そのため試料６は、「うねり」を有することが多く、ＸＹ方向の位置によって試料６が存在するＺ座標が異なることが多い。

なお試料６は、上述のようにスライドガラス（不図示）およびカバーガラス（不図示）によって挟まれていなくてもよく、単にスライドガラス（不図示）上に載置された状態で、試料ステージ２上に載置されてもよい。この場合も、ＸＹ方向の位置によって試料６が存在するＺ座標が異なることが多い。

このように試料６が「うねり」を有する場合、ＸＹ方向の位置によって異なる試料６の存在するＺ座標の幅は、一般に数μｍから１０μｍ程度であることが多い。そのため、Ｓ２０１において入力するスポットのＺ方向の走査範囲は、この２倍〜３倍程度に設定することが好ましく、例えば試料６の有するうねりが１０μｍ程度の場合は２０μｍ〜３０μｍ程度と設定することが好ましい。これにより、スポットのＺ方向の走査範囲を、試料６が存在する全てのＺ座標を含むように設定することができる。ただしスポットのＺ方向の走査範囲の値はこれに限定はされず、試料６の形態に応じて任意に設定することができる。

本実施形態においては、試料ステージ２をＺ方向に移動させることによってスポットのＺ方向への走査を行うため、スポットのＺ方向の走査速度は、試料ステージ２のＺ方向への移動速度に対応する。

次に、装置１００は操作者によって入力されたパラメータに基づいて試料ステージ２のＺ方向への移動を開始し、スポットの照射位置のＺ方向への走査を開始する（Ｓ２０２）。続いて、装置１００は光スキャナ１２によって、スポットの照射位置のＸＹ走査を開始する（Ｓ２０３）。その後装置１００は、データ取込部５によるデータの取込みを開始する（Ｓ２０４）。

このように、装置１００は、スポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向に走査しつつ光Ｌの検出とデータの取込みを行ってＸＹ二次元画像データを取得する際に、スポットの照射位置をＺ方向にも走査しつつ光Ｌの検出とデータの取込みを行う。なお、本実施形態においてＸ方向への走査およびＹ方向への走査は、１つの視野内でのＸＹ走査が完了するまで周期的に繰り返される。また、Ｚ方向への走査についても１つの視野内でのＸＹ走査が完了するまで周期的に繰り返されることが好ましい。Ｚ方向への走査は、試料ステージ２をＺ方向に振動させることで行うことが好ましい。

装置１００は図３（ａ）に示すように、スポットの照射位置がＸＹ走査手段によってＹ方向に走査されている間に、スポットの照射位置をＺ走査手段によってＺ方向にも走査する。あるいは、図３（ｂ）に示すように、スポットの照射位置がＸＹ走査手段によってＸ方向に走査されている間に、スポットの照射位置をＺ走査手段によってＺ方向にも走査する。以下、図３（ａ）の場合について説明するが、図３（ｂ）の場合についても同様である。

また、本実施形態ではスポットの照射位置をＸＹ方向に走査する際に、Ｘ方向の走査を、走査線の一行毎に逆方向に走査する、いわゆる「牛耕式」あるいは「双方向」の走査方法によって走査を行うが、これに限定はされない。例えば、データの取込みを行う際にはＸ方向の走査は常に同じ方向に行う走査方式をとってもよい。

本実施形態においては、図３（ａ）に示すように、スポットの照射位置がＸ方向に走査されている間は、スポットの照射位置のＺ方向への走査は行わない。そして、１つの走査線についてＸ方向への走査およびデータの取込みが完了すると、スポットの照射位置はＹ方向へと走査される。このとき、装置１００はスポットの照射位置をＹ方向に走査しつつ、スポットの照射位置をＺ方向へも走査する。すなわち、光検出部３によりスポットの照射位置における光Ｌの検出を行った後、スポットの照射位置をＸＹ走査手段によってＹ方向に走査するとともに、Ｚ走査手段によってスポットの照射位置をＺ方向に走査する。なおこのとき、スポットの照射位置をＹ方向に移動させた後に、スポットの照射位置をＺ方向に移動させても良いし、Ｙ方向への移動とＺ方向への移動を同時に行い、スポットの照射位置を斜めに移動させてもよい。

そして、スポットの照射位置の移動が完了したら、光検出部３による光Ｌの検出を行い、データの取込みを行う。これにより、スポットの照射位置のＺ座標と、Ｘ座標またはＹ座標とが異なる照射位置において、光Ｌの情報を取得することができる。装置１００は、上述の動作を所定のＸＹ領域についてのデータの取込みが完了するまで繰り返す（Ｓ２０５）ことで、Ｚ座標の異なる照射位置から発せられた光Ｌの情報がＸＹ平面内の画素ごとに格納された、ＸＹ二次元画像データを取得することができる。すなわち、装置１００が取得するＸＹ二次元画像データは、Ｚ座標の異なる照射位置から発せられた光Ｌの情報がそれぞれ格納された少なくとも２つの画素を含む二次元画像データである。換言すると、一画像を構成するＸＹ二次元画像データには、複数のＺ座標値がＸＹ平面の画素毎に分散されて格納されている。データの構成例には、異なったＺ座標がＸＹ平面内の各画素にランダムに格納された構成や、隣接する画素間でＺ座標が規則的に異なる構成が含まれる。

なお、装置１００が第２の計測モードによってＸＹ二次元画像データを取得する際の動作は上述の具体例に限定はされない。すなわち、スポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向に走査することによってＸＹ二次元画像データを取得する際に、Ｘ方向およびＹ方向への走査が完了する前にスポットの照射位置をＺ方向にも走査すればよい。このとき、ＸＹ平面内における１つの計測点（画素）について複数のＺ座標において光Ｌの検出をそれぞれ行ってもよいが、このときのＺ座標の数はＺ方向の走査範囲全体のＺ座標の数よりも少なく設定される。

装置１００はこのようにＸＹ二次元画像データを取得することで、それぞれのＺ座標についてＸＹ二次元画像データを全て取得する場合に比べて計測点の数を減らすことができる。なおここで、「計測点」とは、スポットの照射位置のうち、データ取込部５によってデータの取込みを行う点を指す。

例えば、操作者が指示入力部７２を介して、スポットの照射位置のＺ方向の走査範囲を１０個の計測点を含むように設定した場合に、同一のＸ座標およびＹ座標を有する計測点からのデータの取り込みについては、それぞれ１つのＺ座標についてのみ行うように設定したとする。すると、従来はそれぞれのＺ座標ごとについてそれぞれＸＹ二次元画像データを取得していたが、本実施形態に係る装置１００の場合は計測点の数を１／１０倍に減らすことができる。すなわち、装置１００は、ＸＹＺの三次元空間に対応する信号を、Ｚ座標に関して間引いて、ＸＹ二次元平面に投影することができる。この結果、本実施形態によれば、画像データを取得するために要する時間もおよそ１／１０倍程度に短縮することができる。

なおこの場合、スポットの照射位置によっては試料６の内部に位置しない場合もあり、試料６に由来する光Ｌが取得できない点も生じる。そのような場合、装置１００は、隣接する計測点のうち試料６に由来する光Ｌが取得できた点の信号強度で補完するようにしてもよい。

装置１００は以上のようにして１つの視野においてＸＹ二次元画像データの取得を行うことで、試料６が「うねり」を有する場合であっても、試料６の形態を粗く示すＸＹ二次元画像データを高速に取得することができる。

１つの視野からのＸＹ二次元画像データの取得が完了したら（Ｓ２０５でｙｅｓ）、装置１００は、試料ステージ２をＸ方向またはＹ方向に移動させる（Ｓ２０７）。これにより、視野をＸＹ方向に移動させる。

装置１００は、視野のＸ方向またはＹ方向への移動を繰り返しつつ、各視野でのＸＹ二次元画像データの取得を繰り返す。そして、データ取込部５は取得した複数のＸＹ二次元画像データを貼り合わせ、広域のＸＹ二次元画像データを生成する。装置１００はこれにより、１つの視野のサイズよりも広い領域のＸＹ二次元画像データを取得することができる。

視野のＸ方向またはＹ方向への移動の仕方は特に限定はされない。例えば、まずＸ方向に順に視野を移動した後、所定の数だけ視野を移動し終えたらＹ方向に視野を一つ移動し、再びＸ方向に順に視野を移動していってもよい。すなわち、視野をラスタースキャンによって走査していってもよい。なお、Ｘ方向およびＹ方向の視野の数は、試料６全体が収まるように設定されることが好ましい。例えば、Ｘ方向、Ｙ方向それぞれについて１０ｍｍずつ、というように、取得される広域のＸＹ二次元画像データの領域のサイズによって規定してもよい。

以上の動作を繰り返し、予め設定した全ての領域についてＸＹ二次元画像データの取得が完了したら（Ｓ２０６でｙｅｓ）、光スキャナ１２によるスポットの照射位置のＸＹ走査を停止する（Ｓ２０８）。その後、試料ステージ２によるスポットの照射位置のＺ移動を停止する（Ｓ２０９）。

装置１００は以上のようにして１つの視野においてＸＹ二次元画像データの取得を行うことで、試料６が「うねり」を有する場合であっても、試料６の形態を粗く示すＸＹ二次元画像データを高速に取得することができる。特に、視野の数が多い広域のＸＹ二次元画像データを取得する際には、各々の視野での計測時間の短縮の効果が足し合わされるため、本実施形態の効果がより顕著にあらわれる。

装置１００は以上のようにＸ方向またはＹ方向に視野を移動しながらＸＹ二次元画像データを複数取得し、それらを貼り合わせて広域のＸＹ二次元画像データを生成する。これにより、試料６が「うねり」を有する場合であっても、試料６の形態を粗く示す広域のＸＹ二次元画像データを高速に取得することができる。すなわち、本実施形態に係る装置１００は、画像データを取得するために要する時間を短縮することができる。

なお、各々の視野におけるＸＹ二次元画像データが上述のように粗い画像データとなっていたとしても、最終的に得られる広域のＸＹ二次元画像データをもとに全域について試料６の状態や形態を粗く把握する上ではそれほど問題にならない。スポットのサイズは、例えば開口数（ＮＡ）が１程度の対物レンズを用いた場合、一般に１μｍ^３以下であるため、測定点の間隔は通常１μｍ以下に設定される。また、スポットのサイズは波長とＮＡに依存し、ＮＡが小さい場合にはスポットのサイズは大きくなるが、高々１０μｍ^３程度である。そのため、スポットのサイズの１０００倍以上大きな１０ｍｍ四方程度の広域から取得した画像全体においては、試料６からのデータが格納されていない画素があっても、全体の形態にはそれほど大きな影響を及ぼさない。

以上のように、本実施形態に係る装置１００は、広域のＸＹ二次元画像データを取得するために要する時間を短縮することができる。さらに、取得する画像データのデータ量を削減することができるため、画像データを多変量解析などの手法によって解析する際の計算コストや計算時間を短縮することができる。

（第２の実施形態）
次に、第２の実施形態に係る装置２００について説明する。装置２００の装置構成、および第１の計測モードにおける動作については装置１００と同様なので省略し、第２の計測モードにおける動作の相違点について、図４および図５を用いて説明する。図４（ａ）および図４（ｂ）は、装置２００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。

装置１００は、スポットの照射位置がＸＹ走査手段によってＸ方向またはＹ方向のいずれか一方に走査されている間に、スポットの照射位置がＺ走査手段によってＺ方向に走査されるように動作する。しかし装置２００では、スポットの照射位置がＸＹ走査手段によってＸ方向に走査されている間、および、スポットの照射位置がＸＹ走査手段によってＹ方向に走査されている間、の両方の間に、スポットの照射位置がＺ走査手段によってＺ方向に走査される。

換言すると、第１の実施形態では、Ｘ方向またはＹ方向へのスポットの照射位置の走査が完了するのを待ってから、Ｚ方向およびＹ方向またはＸ方向へのスポットの照射位置の走査を行っていた。しかし本実施形態では、Ｘ方向またはＹ方向へのスポットの照射位置の走査が完了するのを待たずに、Ｚ方向にもスポットの照射位置を走査する。

図４（ａ）は、装置２００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングの一例を模式的に示している。すなわち、装置２００は、スポットの照射位置のＸ方向への走査を行っている間に、Ｚ方向への走査も行う。そして装置２００は、スポットの照射位置のＹ方向への走査を行っている間に、Ｚ方向への走査も行う。

図５（ａ）は、装置１００において、スポットの照射位置のＸ方向への走査を行っている間にはＺ方向への走査は行わず、Ｙ方向への走査を行っている間にＺ方向への走査を行った場合の計測点の位置の変化を模式的に示した図である。なお、図５（ａ）および図５（ｂ）は、Ｘ方向から見た図である。図５（ａ）では描かれていないが、各計測点（黒丸）においてはスポットの照射位置が紙面奥方向または紙面手前方向、すなわちＸ方向に走査されている。

一方、図５（ｂ）は、装置２００において、スポットの照射位置のＸ方向およびＹ方向の両方向への走査を行っている間にＺ方向への走査を行った場合の計測点の位置の変化を模式的に示した図である。なお、図５（ｂ）の実線の矢印はスポットの照射位置のＸ方向への走査の軌跡を表している。

図５（ａ）の場合も図５（ｂ）の場合も、計測点が試料６の内部に存在する状態と存在しない状態とを繰り返す。しかし、図５（ｂ）の場合（第２の実施形態、装置２００）のほうが図５（ａ）の場合（第１の実施形態、装置１００）に比べて、計測点が試料６の内部に存在する状態と存在しない状態とを繰り返す頻度が高い。すなわち、装置２００のほうが、装置１００よりもスポットの照射位置のＺ方向への走査の頻度が高い。これにより、試料６の種類や形態にも依存するが、装置２００よりもＺ方向の情報がより均一に平均化され、試料６の形態をより密に表すＸＹ二次元画像データを取得することができる。

図４（ｂ）は、装置２００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングの別の例を模式的に示している。すなわち、装置２００は、スポットの照射位置のＸ方向への走査を行っている間に、Ｙ方向への走査を行い、さらに同時にＺ方向への走査も行う。この場合は図４（ａ）の場合よりもさらに、広域のＸＹ二次元画像データを取得するために要する時間を短縮することができる。

（第３の実施形態）
次に、第３の実施形態に係る装置３００について説明する。装置３００の装置構成、および第１の計測モードにおける動作については装置１００（第１の実施形態）と同様なので省略し、第２の計測モードにおける動作の相違点について、図６を用いて説明する。図６は、装置３００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングを模式的に示す図である。

第１の実施形態および第２の実施形態ではスポットの照射位置のＺ方向への走査の周波数は、Ｘ方向またはＹ方向への走査の周波数以下となるようにしていた。しかし第３の実施形態では、スポットの照射位置のＺ方向への走査の周波数を、Ｘ方向またはＹ方向への走査の周波数よりも大きくなるように設定する。

図６は、装置３００の第２の計測モードにおける、スポットの照射位置の経時変化とデータ取込みのタイミングの一例を模式的に示している。ここでは、第１の実施形態と同様に、スポットの照射位置をＸ方向に走査するとともにＺ方向にも走査し、Ｙ方向に走査するときにはＺ方向には走査しない場合を示している。第１の実施形態および第２の実施形態と同様に、第３の実施形態によっても、広域のＸＹ二次元画像データを取得するために要する時間を短縮することができる。

またここでは、スポットの照射位置のＺ方向への走査の周波数をＸ方向への走査の周波数の４倍に設定した場合を示している。このようにスポットの照射位置のＺ方向への走査の周波数を、Ｘ方向またはＹ方向への走査の周波数よりも大きくなるようにすることで、Ｚ方向への走査の頻度を高めることができる。これにより、計測点が試料６の内部に存在する状態と存在しない状態とを繰り返す頻度を高めることができる。その結果、Ｚ方向の情報がより均一に平均化され、試料６の形態をより密に表すＸＹ二次元画像データを取得することができる。

なおここでは第１の実施形態においてスポットの照射位置のＺ方向への走査の周波数をＸ方向またはＹ方向への走査の周波数よりも大きくなるように設定した場合について説明したが、第２の実施形態に適用しても同様の効果を得ることができる。

（第４の実施形態）
次に、第４の実施形態に係る装置４００について説明する。装置４００の装置構成、および第１の計測モードにおける動作については第１の実施形態と同様なので省略し、第２の計測モードにおける動作の相違点について、図７および図８を用いて説明する。図７は、装置４００の第２の計測モードにおける動作を表すフローチャートである。また、図８は、本実施形態におけるスポットの照射位置の軌跡を、Ｘ方向から見た図である。

装置４００は、スポットの照射位置のＺ方向への１回分の走査（始点８１から終点８２）を行った後、Ｚ方向における試料６の存在位置を判定する。装置４００はこれに基づいて、スポットの照射位置のＺ方向への次の走査を行う際のスポットの始点８１または終点８２を変更する。これにより、試料６の「うねり」が大きい場合であっても、試料６の「うねり」に追従して計測を行うことができる。以下、このフィードバック制御の一例について、図７のフローチャートを用いて説明する。

図７は、図２のフローチャートの一部（Ｓ２０４）を詳細に示したものである。装置４００の動作は、Ｓ２０４以外は図２のフローチャートと同様である。

スポットの照射位置のＺ方向への走査（Ｓ２０２）、ＸＹ方向への走査（Ｓ２０３）がそれぞれ開始された後、装置４００はスポットの照射位置をＺ方向に走査しつつデータの取込みを行う（Ｓ２０４１）。スポットの照射位置はＺ方向に往復して走査されるが、上述の走査およびデータの取込み動作は、Ｚ方向への走査が１つの走査線８０について完了するまで継続される。スポットの照射位置が終点８２に到達し、Ｚ方向の１走査が完了したら（Ｓ２０４２でｙｅｓ）、装置４００は走査線８０によって取得されたデータに基づいて、Ｚ方向における試料６の位置を判定する（Ｓ２０４３）。そして、装置４００はＳ２０４３において得られた試料６の位置に基づいて、次の走査線８０においてＺ方向について試料６の全体をスポットで走査できるように、Ｚ方向の走査の始点８１をＺ方向に移動する。

例えば、Ｚ方向における試料６の位置を判定する際（Ｓ２０４３）には、所定の閾値を超える値を有する信号が得られた複数の計測点のＺ座標をもとに、それらの中心Ｚ座標Ｚｃを算出して、試料６の位置とすることができる。そして図８のように、試料６のＺ方向における位置（Ｚｃ）と、次のＺ方向への走査線の中心のＺ座標（始点８１と終点８２の中心のＺ座標）とが一致するように、Ｚ方向の走査の始点８１をＺ方向に移動する（Ｓ２０４４）。

これにより、試料６の「うねり」が大きい場合であっても、試料６の「うねり」に追従して計測を行うことができる。また本実施形態によれば、第１乃至第３の実施形態に比べて、Ｚ走査の幅を小さく設定することができる。これにより、スポットの照射位置が試料６内または試料６上に位置しない場合を減らすことができ、試料６に由来するデータが得られない計測点を減らすことができる。その結果、試料６の形態をより密に表すＸＹ二次元画像データを取得することができる。

なお、本実施形態ではＺｃを試料６のＺ方向における位置として、次のＺ方向への走査線の中心のＺ座標がＺｃと一致するようにＺ方向の走査の始点８１をＺ方向に移動するようにしたが、これに限定はされない。例えば、所定の閾値を超える値を有する信号が得られた複数の計測点のＺ座標をもとに試料６のＺ方向における存在範囲を取得し、次のＺ方向への走査線の中心のＺ座標が取得した範囲内に入るように、Ｚ方向の走査の始点８１をＺ方向に移動してもよい。

（第５の実施形態）
次に、第５の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置１０１（以下、「装置１０１」と称する）について説明する。

まず、装置１０１の装置構成について、図９を用いて説明する。図９は、装置１０１の構成を模式的に示す図である。装置１０１は、光源部１により試料６に照射する光の波長を変更することができる。

第５の実施形態では、試料６に照射する光の波長を変化させながら計測を行う。第５の実施形態によれば、万一、試料６に含まれる構成成分が未知であり、これによって、試料６の構成成分に由来する光Ｌを得るために試料６に照射する光の波長として適切な波長が不明であったとしても、試料６に含まれる構成成分の分布情報を取得できる。ちなみに、試料６に含まれる構成成分が操作者にとって全く未知であることは稀である。また、後述するように、装置１０１は試料６に照射する光の波長を変化させながら計測を行うことで、各照射位置においてスペクトルデータを取得することができる。装置１０１はこのスペクトルデータを解析することで、試料６に含まれる構成成分に関する詳細な情報を取得することもできる。

装置１０１の装置構成は、装置１００の装置構成のうち、光源部１と制御部４の構成以外は同様であるため、光源部１および制御部４の構成についてのみ説明する。

装置１０１の有する光源部１は、第１の光源１１１と、第２の光源１１２と、波長変更手段１１３と、合波手段１１４と、を有する。

第１の光源１１１と第２の光源１１２はそれぞれ、第１のレーザー光と第２のレーザー光を発する光源である。第１の光源１１１および第２の光源１１２の発するレーザー光の種類は、特に限定はされない。

波長変更手段１１３は、第２の光源１１２から出射された第２のレーザー光の波長を変更する手段である。なお、本実施形態においては第２の光源１１２は、複数の波長の光が混合された光を発生するための広帯域光源である。波長変更手段１１３は分光手段であり、第２の光源から出射された第２のレーザー光を分光し、任意の波長の光のみを出射する。本実施形態に係る波長変更手段１１３は、出射する光の波長を、一定の周期で掃引することができる。波長変更手段１１３としては、例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナ、音響光学可変フィルタ、および、多面体ミラー型フィルタなどを用いることができる。

合波手段１１４は、第１の光源から出射した第１のレーザー光と、波長変更手段から出射した波長が変更された第２のレーザー光とを合波する手段である。

なお、本実施形態では光源部１が第１の光源１１１および第２の光源１１２の２つの光源を有する構成としたが、これに限定はされず、光源は１つであってもよいし、３つ以上であってもよい。また、本実施形態では波長変更手段１１３が第２のレーザー光の波長を変更する構成としたが、これに限定はされず、第１のレーザー光の波長を変更してもよいし、第１のレーザー光の波長および第２のレーザー光の波長を変更してもよい。

装置１０１の有する制御部４は、試料ステージ制御部４１と、光スキャナ制御部４２と、波長変更手段制御部４３と、を有する。

装置１０１は、波長変更手段１１３により第２のレーザー光の波長を変更することで、第１のレーザー光の波長と第２のレーザー光の波長との間の差分（波長差）を変更することができる。以下、装置１０１が波長差を変更する場合について説明するが、これに限定はされず、装置１０１が単一の波長のレーザー光を出射する光源を有し、その光源から出射したレーザー光の波長を変更する場合についても同様である。

なお、第１のレーザー光および第２のレーザー光として近赤外域の光を使用することで、光Ｌとして誘導ラマン散乱光やコヒーレントアンチストークスラマン散乱光等の非線形ラマン散乱光を好適に検出することができる。

（第１の計測モード）
第１の計測モードにおける装置１０１は、スポットの照射位置のそれぞれにおいて波長変更手段１１３によって前述の波長差を変更して光Ｌの検出およびデータの取り込みをｎ回行う。装置１０１は、上記の光Ｌの検出およびデータの取込みを各照射位置において行いつつ、ＸＹ走査手段によってスポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向に走査する。これにより装置１０１は、各々の照射位置においてスペクトルデータを取得する。あるいは装置１０１は、単一の波長差においてスポットの照射位置のＸ走査およびＹ走査を行い、１視野分の画像データが形成されたタイミングで波長差を変更してもよい。この場合、装置１０１はＸＹ走査が完了する度に波長差の変更を行い、ＸＹ走査をｎ回繰り返す。

第１の計測モードにおける装置１０１はこれらの動作により、各照射位置において、ｎ種の波長差のそれぞれに対して光Ｌの強度をそれぞれ格納したスペクトルデータを取得する。その結果装置１０１は、各照射位置のＸＹ座標に対応する各画素に、各照射位置におけるスペクトルデータがそれぞれ格納された「スペクトル画像データ」を取得することができる。

装置１０１はさらに、得られたスペクトル画像データをデータ処理部８によって解析することで、試料６に含まれる構成成分の分布情報を取得することができる。データ処理部８における解析は、例えば多変量解析や機械学習などの手法を用いて行うことができる。

（第２の計測モード）
一方、第２の計測モードにおける装置１０１は、各計測点において、第１の計測モードにおける装置１０１が用いるｎ種の波長差のうち、ｐ種（ただし、ｎ＞ｐ≧１）の波長差を用いて計測を行う。この結果、各照射位置において得られるスペクトルデータのデータ量をｐ／ｎ倍に削減させることができる。

第２の計測モードにおける装置１０１は、他の実施形態と同様、スポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向に走査しつつ光Ｌを検出してＸＹ二次元画像データを取得する際に、スポットの照射位置をＺ方向にも走査して光Ｌの検出を行う。これにより、他の実施形態と同様に、画像データを取得するのに要する時間を短縮することができる。第２の計測モードにおける装置１０１はさらに、スポットの照射位置を上述のようにＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向に走査するとともに、波長変更手段１１３によって試料６に照射する光の波長差を変更する。すなわち装置１０１は、１視野内でＸＹ二次元画像データを取得する間に、スポットの照射位置をＸ方向およびＺ方向に走査しつつ、照射する光の波長差の変更を行う。または装置１０１は、１視野内でＸＹ二次元画像データを取得する間に、スポットの照射位置をＹ方向およびＺ方向に走査しつつ、照射する光の波長差の変更を行う。あるいは装置１０１は、１視野内でＸＹ二次元画像データを取得する間に、スポットの照射位置をＸ方向およびＹ方向およびＺ方向に走査しつつ、照射する光の波長差の変更を行う。

第２の計測モードにおける装置１０１は、各計測点における計測に用いるｐ種の波長差を少なくとも１回変更して光Ｌの検出およびデータの取り込みを行い、ＸＹ二次元画像データを取得する。なお、ｐ種の波長差を変更する際には、ｐ種の波長差を全て変更してもよいし、ｐ種の波長差の一部を変更してもよい。すなわち、装置１０１は第１の計測モードにおける装置１０１が用いるｎ種の波長差のうち、第２の計測モードにおける装置１０１が各計測点の計測に用いるｐ種の波長差の組み合わせを変更する。これにより、装置１０１は、Ｚ座標の異なる照射位置に異なる波長差の光を照射した際に発生する光Ｌの情報が、ＸＹ平面内の画素ごとに格納されたＸＹ二次元画像データを取得することができる。換言すると、一画像を構成するＸＹ二次元画像データには、複数のＺ座標値及び複数の波長差の値がＸＹ平面の画素毎に分散されて格納されている。データの構成例には、異なったＺ座標及び異なった波長差の値がＸＹ平面内の各画素にランダムに格納された構成や、隣接する画素間でＺ座標及び波長差の値が規則的に異なる構成が含まれる。

波長差の変更の回数およびタイミングは、特に限定はされない。例えばスポットの照射位置をＸ方向およびＺ方向に走査しつつ、照射する光の波長差の変更を行う場合であれば、１視野内で少なくとも１回、スポットの照射位置をＸ方向およびＺ方向に走査しつつ、各計測点における計測に用いるｐ種の波長差を変更すればよい。例えば、ｐ＝１の場合であれば、スポットの各照射位置において１種の波長差を用いて計測を行い、スポットの照射位置をＸ方向およびＺ方向に１回走査する間に、波長差を（ｎ−１）回変更してもよい。波長変更手段１１３は、波長差を周期的に変更することが好ましい。

以上のように計測に用いる光の波長差を変更しつつ計測を行うことで、１視野内の全ての計測点について同じｐ種の波長差を用いて計測を行う場合よりも、１視野内でＸＹ二次元画像データを取得する際に使用する波長差の種類を多くすることができる。第５の実施形態によれば、１視野内全体でみると、計測に使用する波長差の種類をｐ種より多くすることができる。そのため、１視野内の全ての計測点について同じｐ種の波長差を用いて計測を行う場合よりも、試料６に含まれる構成成分からの信号が得られる可能性が高まる。そのため、万一、試料６に含まれる構成成分が未知であり、これによって、試料６の構成成分に由来する光Ｌを得るために試料６に照射する光の波長として適切な波長が不明であったとしても、試料６に含まれる分布情報を取得できる。

本実施形態によれば、各照射位置において得られるスペクトルデータのデータ量をｐ／ｎ倍に削減させることができる。同様に、得られるスペクトル画像データのデータ量も、第１〜第４の実施形態の第２の計測モードにおいて各計測点でｎ種の波長差で計測を行った場合と比較して、ｐ／ｎ倍に削減させることができる。一例として、装置１０１が、第１の計測モードでは第１のレーザー光および第２のレーザー光の波長差を９０回変更して試料６に照射して、光Ｌとして誘導ラマン散乱光の検出とデータの取込みを９１回行う誘導ラマン散乱顕微鏡の場合を考える。この場合、例えばｐ＝１とすれば、各照射位置において得られるスペクトルデータのデータ量を１／９１倍に削減することができ、スペクトル画像データのデータ量も１／９１倍に削減することができる。

さらに本実施形態によれば、各計測点におけるスペクトルデータの取得に要する時間もｐ／ｎ倍に短縮することができる。その結果、スペクトル画像データを取得するために要する時間も短縮することができる。すなわち、前述した条件の場合には、各計測点におけるスペクトルデータの取得に要する時間は、各計測点でｎ種の波長差で計測を行った場合と比較して、１／９１倍に短縮することができる。また、本実施形態によればスペクトル画像データのデータ量を削減することができるため、スペクトル画像データを解析して構成成分の分布を示す画像データを生成するために要する時間も短縮することができる。

以上のように本実施形態によれば第１〜第４の実施形態の第２の計測モードにおいて各計測点でｎ種の波長差で計測を行った場合と比べて、取得されるＸＹ二次元画像データの質を保ったまま、データ量を削減することができる。

第５の実施形態は特に、試料６について広域の観察を行う場合に特に有効である。第５の実施形態では、１つの視野内で試料６に含まれる構成成分に由来する光Ｌが得られる画素と得られない画素とが共存することになる。しかし、広域の画像で見れば試料６の状態や形態を粗く把握する上ではそれほど問題にならない。そのため、広域の観察を行う上で必要な画質を保ったままデータ量を削減できるため、本実施形態は有効である。

（第６の実施形態）
次に、第６の実施形態に係るレーザー走査顕微鏡装置１０２（以下、「装置１０２」と称する）について説明する。

装置１０２は、試料６から発生する光Ｌとして反射光を検出するレーザー走査顕微鏡装置である。まず、装置１０２の装置構成について、図１０を用いて説明する。図１０は、装置１０２の構成を模式的に示す図である。

装置１０２の装置構成は、第１の実施形態〜第５の実施形態の各レーザー顕微鏡装置の装置構成および機能のうち、光検出部３の構成以外の構成および機能はほぼ同じであるため、主に光検出部３の構成について説明する。

装置１０２は、上記実施形態と同様に、レーザー光を試料６の内部または試料６の表面の少なくとも一部にスポットとして照射し、レーザー光の照射位置から発せられる蛍光や非線形光学現象によって発生する光Ｌを検出する。このとき、光Ｌは、発生源を起点に四方に放出され、光Ｌの一部は試料６を透過するが、一部は散乱光として試料６の上部にも放出される。光Ｌのうち、試料面に垂直に放出された散乱光は、試料６に入射した光の反射光と混成する。そこで、本実施形態における光検出部３の反射型配置では、試料６の上部に放出された散乱光或いは反射光を検出し、その強度変化を測定することで光Ｌを検出する。反射型配置には、散乱光が透過できないような厚い試料でも、測定を行うことができるという長所がある。

図１０に示すように、本実施形態における光検出部３は、ビームスプリッタ１４と、対物レンズ１３と、光学フィルタ３２と、検出器３３と、で構成される。このうち、対物レンズ１３とビームスプリッタ１４は、照射部１の一部を構成する。

光源１１から出射されたレーザー光は、光スキャナ１２、ビームスプリッタ１４を通過し、対物レンズ１３で集光されて試料６に照射される。試料から反射した光は対物レンズ１３で捕集され、ビームスプリッタ１４でその一部が反射されて、光学フィルタ３２に入射する。光学フィルタ３２は、第一の光の波長と同波長の光のみを透過し、透過した光が光検出器３３に入射する。なお、ビームスプリッタ１４と光スキャナ１２の位置は入れ替えることも可能である。さらに、光源１１は、装置１０１の光源１１と同様に、複数の光源を有する構成であってよい。

ここで、ビームスプリッタ１４は、偏光ビームスプリッタでも良い。この場合、光源１１のレーザー光の偏光とビームスプリッタの偏光透過方向を一致させて、光源１１のレーザー光は透過するようにする。そして、試料６から放射された散乱光のうち、光源１１のレーザー光の偏光方向に一致しない成分がビームスプリッタ１４で反射され、光学フィルタ３２に入射し、更に、光検出器３３に入射する。ここで、光源１１が複数の光源から構成される場合は、光学フィルタ３２は、第一の光の波長と同波長の光のみを透過する。

光Ｌを検出するためには、試料６からの散乱光を直接検出してもよい。その場合、入射光用の対物レンズ１３とは別個に、散乱光を捕集するための捕集光学系を設ける。捕集光学系で集められた光は、光学フィルタ３２に入射し、更に、光学フィルタ３２を透過した光が光検出器３３に入射する。

光検出部３をよりコンパクトに配置して、効率良く散乱光を検出するために、捕集光学系を設けない構成をとることもできる。この場合、光学フィルタ、及び、光検出器を構成する光検出素子を試料に近接して設置して、散乱光が光学フィルタに直接入射するようにしてもよい。例えば、光学フィルタと光検出素子とを積層して形成し、これらを対物レンズ１３の開口部の近傍の対物レンズ１３の外部に設置する。或いは、光学フィルタ或いは光検出素子を対物レンズの内部に配置してもよい。

また、光源１１と対物レンズ１３の間、或いは、対物レンズ１３（或いは、捕集光学系）と光検出器３３の間の光路の一部が光ファイバで構成されていてもよい。このとき、試料ステージではなく、対物レンズ１３側に移動機構を設けて、レーザーの走査領域を移動させる構成とすることもできる。

１ 照射部
１２ 光スキャナ（ＸＹ走査手段）
３ 光検出部
４１ 試料ステージ制御部（Ｚ走査手段）
４２ 光スキャナ制御部（ＸＹ走査手段）
５ データ取込部
６ 試料

Claims (13)

1. レーザー光を対物レンズによって集光して試料に照射する照射部と、
   集光して照射される前記レーザー光の前記照射位置から発せられる光を検出する光検出部と、
   前記照射部によって前記試料に照射する前記レーザー光を、前記対物レンズの光軸方向に垂直なＸ方向ならびに前記光軸方向および前記Ｘ方向に垂直なＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、を有するレーザー走査顕微鏡装置であって、
   前記照射部によって前記試料に照射する前記レーザー光を、前記対物レンズの光軸方向と平行なＺ方向に走査するＺ走査手段を有し、
   前記ＸＹ走査手段によって前記照射位置を前記Ｘ方向および前記Ｙ方向に走査しつつ前記光を検出して、検出した前記光の情報が前記照射位置のＸ座標およびＹ座標に対応する画素ごとに格納されたＸＹ二次元画像データを取得する際に、前記Ｚ走査手段によって前記照射位置をＺ方向にも走査しつつ前記光を検出することで、Ｚ座標の異なる照射位置から発せられた前記光の情報がそれぞれ格納された少なくとも２つの画素を含むＸＹ二次元画像データを取得することを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。
2. 前記ＸＹ走査手段によって前記照射位置を前記Ｘ方向および前記Ｙ方向に走査するとともに、前記Ｚ走査手段によって前記照射位置を前記Ｚ方向にも走査しつつ前記光の検出を行うことを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
3. 前記レーザー光の波長を変更する波長変更手段をさらに有し、
   前記照射位置が前記Ｘ方向、前記Ｙ方向、および前記Ｚ方向の少なくとも１つの方向に走査されている間に、前記波長変更手段が前記レーザー光の波長を変更しつつ前記光を検出することで、前記レーザー光の波長の異なる前記光の情報がそれぞれ格納された少なくとも２つの画素を含むＸＹ二次元画像データを取得することを特徴とする請求項１または請求項２に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
4. 前記波長変更手段が、前記レーザー光の波長を周期的に変更することを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
5. 前記ＸＹ走査手段が、前記照射位置を前記Ｘ方向および前記Ｙ方向に周期的に走査する手段であり、
   前記Ｚ走査手段が、前記照射位置を前記Ｚ方向に周期的に走査する手段であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
6. 前記ＸＹ走査手段が前記照射位置を前記Ｘ方向および前記Ｙ方向に走査する周期が、前記Ｚ走査手段が前記照射位置を前記Ｚ方向に走査する周期よりも大きいことを特徴とする請求項５に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
7. 前記照射部が、
   第１のレーザー光を出射する第１の光源と、
   第２のレーザー光を出射する第２の光源と、
   前記第１のレーザー光と前記第２のレーザー光とを合波して前記レーザー光とする合波手段と、を備え、
   前記波長変更手段が前記第１のレーザー光の波長と前記第２のレーザー光の波長の差分を変更することを特徴とする請求項３乃至請求項６のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
8. 前記光が、誘導ラマン散乱光またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を含む光であることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
9. 前記Ｚ走査手段は、前記Ｚ走査手段による前記Ｚ方向への前記照射位置の走査によって検出された前記光の強度に基づいて、
   前記Ｚ方向への前記照射位置の走査の始点のＺ座標を変更することを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
10. 前記Ｚ走査手段が、前記試料を前記Ｚ方向に振動させることで、前記照射位置を前記Ｚ方向に周期的に走査する手段であることを特徴とする請求項５乃至請求項９のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
11. 前記ＸＹ二次元画像データが、前記レーザー光の前記波長に対して前記光の強度が格納されたスペクトルデータが、前記画素ごとにそれぞれ格納されたスペクトル画像データであることを特徴とする請求項３乃至請求項１０のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
12. 前記スペクトル画像データを多変量解析によって処理するデータ処理部をさらに有することを特徴とする請求項１１に記載のレーザー走査顕微鏡装置。
13. 前記光検出部が検出する光が、前記照射位置から発せられる透過光、反射光、および散乱光から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載のレーザー走査顕微鏡装置。

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