JPH02148012A - 光ヘテロダイン螢光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、光ヘテロダイン螢光顕微鏡に関する。さら
に詳しくは、この発明は、試料に励起用レーザ光を照射
し、試料から発せられる螢光を参照用レーザ光と光混合
してヘテロダイン検波し、高分解能で螢光像を得られる
ようにする光ヘテロダイン螢光顕微鏡に関する。

（背景技術） 螢光像の観察は生物試料等の情報を得る重要な手段とな
っており、そのために従来より螢光顕微鏡が用いられて
いる。

螢光Ｗ！徹鏡としては、一般に、落射方式で試料に励起
光を照射し、試料か発する螢□光を照射光軸と同軸に設
置した励起光カッ１ヘフイルターを通して観察するもの
が使用されている。このような螢光顕微鏡の光学系にお
いては、第４図に示すように、タングステンフィラメン
ト等の光源（１”）から発せられた励起光かコンデンサ
ーレンズ（し。）で集光され、試料（Ｓ）を視野全域に
わたって照射し、その照射により試料（Ｓ）が発する螢
光か対物レンズ（し。）によって観察像（１）を結像す
るようになっている。

しかしながら、このような螢光顕Ｗ１．鏡では、通常の
顕Ｗ１鏡に比べれは明瞭な観察像か得られるものの、螢
光の重なり合いにより像にぼけが生じ、低い分解能しか
得られない。また試料の特定面の観察像を鮮明に得るこ
とも困難となっている。

これに対して、近年、螢光の重なり合いによる分解能の
低下を改善し、特定面での観察像も鮮明に得られるよう
にするものとして、共焦点型レーザ螢光顕微鏡が提案さ
れている。この共焦点型レーザ螢光顕微鏡の光学系は、
第５図に示すように、集束光学系か常に光軸−Ｌの光線
からなるように構成し、収差による像の歪みを解消した
ものである。

また、二の光学系においては、励起光が試料（Ｓ）の測
定面全域を同時に照射するのではなく、試料（Ｓ）の−
点を照射し走査するため、不必要な散乱光やフレアーに
よるコントラス）〜の低１ぐも防止される。さらに、検
出器ｆＤ）の前面に配置したピンホール（Ｐ）により解
像能を向上させ、また対物レンズ（［。）内の不要な散
乱光をほぼ完全に排除することもできるようになる。

しかしながら、このように螢光の空間四重なり合いの分
別能か向上し、従来の螢光顕微鏡に比べて高い分解能を
達成することができる共焦点型のレーザ螢光ｓｍｉによ
っても、周波数帯域の重なった螢光を分別することはで
きない。そのなめ、螢光の周波数域か重なり合うことの
多い生体系の種々の物質の分析に対しては、濯足できる
ものとはなっていないのが実状である。

（発明の目的） この発明は、以上の通りの事情を！１ｌＩｉまえてなさ
れたものであり、空間的に重なり合った螢光だけでなく
周波数域か重なり合った螢光も高い分解能で分別できる
ようにし、周波数域が重なり合うことの多い生体系等の
物質に対しても詳細な螢光分析が行えるようにすること
を目的としている。

（発明の開示） この発明は、上記の目的を実現するため、試料に励起用
レーザ光を照射して螢光を発生させる試料照射手段と、
試料から発せられた螢光に参照用レーザ光を光混合し、
ヘテロダイン検波する検出手段とを有する光ヘテロダイ
ン螢光ｇｆｉ＆鏡を提供する。

この螢光顕微鏡は、分析すべき光を参照用レーザ光と光
混合してヘテロダイン検波し、高分解能検出を可能とす
る光へゾロダイン・レーザ顕微鏡め原理を螢光分析に応
用し、周波数域か重なり合った螢光であっても高い分解
能で分析できるようにしたものである。

このようなこの発明の螢光顕微鏡は、さらに、空間的に
重なり合った螢光の分別能か高い共焦点型レーザ螢光顕
微鏡の原理を兼ね倫えることもできる。そのように構成
した場合の具体的態様として、この発明は、上記の光ヘ
テロダイン螢光顕微鏡において、試料照射手段と検出手
段が共焦点光学系を構成するように、試料に励起用レー
ザ光をスポラ１〜照射する試料照射手段と、試料の照射
スポットから発せられた螢光を、参照用レーザ光との光
混合前または光混合後に点像に結像し、アパーチャのピ
ンホールを介して検出する検出手段とを有する光ヘテロ
ダイン螢光顕微鏡を提供する。

この発明の螢光顕微鏡においては、試料に励起用レーザ
光を照射して螢光を発生させる試料照射手段は、従来の
共焦点型レーザ螢光顕微鏡の試料照射手段と同様に、励
起用レーザ構成光源や励起光の集光照射用のレンズ系等
から構成することかでき、また、試料からの螢光に参照
用レーザ光を光混合し、ヘテロダイン検波する検出手段
は、従来の光ヘテロダイン・レーザ顕微鏡と同様に、光
混合器、二乗検波器、増幅器等から構成することかでき
る。

たたし、試料から発せられた螢光を参照用レーザ光と光
混合させるに際しては、試料からの螢光のコヒーレンシ
ーを高めた後に光混合させるのかより高い分解能を得る
ために好ましい。そのように光混合する光学系の例とし
ては、試料から発せられた螢光を、検出手段のアパチャ
ーとレンズ系から定まる回折限界の視青の光束にして光
混合するものをあげることができる。

また、この発明の螢光顕微鏡においては、参照用レーザ
光の周波数を変化させることにより、変化させた周波数
ごとの螢光画像が得られ、その周波数幅の分解能が得ら
れることとなるか、参照用レーザ光の周波数を変化させ
る態様としては、参照用レーザ光の周波数が、発振周波
数の調整によりが変化するようにすることができる。ま
た、周波数変化の幅を小さくして、より高分解の画像を
得られるようにする場合には、参照用レーザ光の周波数
か周波数変換器によりシフト変化するようにすることが
できる。

また、この発明においては、試料の検出点を３次元方向
に走査し、試料の検出点の位置信号と参照用レーザ光の
周波数と共にその検出点ごとの検出結果を、コンピュー
タに蓄積し、ＣＲＴに画像化するか、このような顕微鏡
の走査についても従来の光ヘテＶ″！タイン螢光顕微鏡
あるいは共焦点型レーサ螢光顕微鏡と同様にすることが
できる。

以下、この発明を実施例に基づいて具体的に説明する。

第１図は、この発明の光ヘテロダイン螢光顕微鏡の一実
施例の光学配置図である。

この螢光顕微鏡においては、励起用レーザ光（１１）が
励起用レーザ光源（１）より射出し、ミラー（２）とハ
ーフミラ−（３）によりレンズ（４）に入射して集束し
、試料（５）をスポット照射するようになっている。

この励起用レーザ光（［１）の照射により試料（５）は
螢光は２）を発するが、その螢光（Ｌ２　）はレンズ（
６）により結像してアパーチャのピンポーフ ルＤ）十、に点ｆ象となり、そのアパーチャのピンポー
ル（７）を透過していくようになっている。アパーチャ
のピンポール（７）を透過した螢光（１−２）は、レン
ズ（８）により平行光束（Ｉ３）にしてビームスプリッ
タ（９）に入射さぜ、そこで参照用レーザ光と光混合す
るようにしである。その際、コし−レジ１〜性を高めた
状態で光混合して高分解能か得られるようにするために
、平行光束（１，）は、レンズ（８）とアパーチャのピ
ンポール（７）の径により定まる回折限界の径となるよ
うにしである。

一方、参照用レーザ光（１−４）は、参照用レーザ光源
（１０）から波長調整器（１１）の制御により所定の発
振周波数（波長λ１）で射出するようになっており、ミ
ラー（１２）、レンズ（１３）、レンズ（１４）により
上記の回折限界の径の平行光束（Ｌ５）に変換され、ビ
ームスプリッタ（９）に入射し、そこで試料か発した螢
光の平行光束（ｌ、）と光混合するようになっている。

このように光混合した両光束（１，ｓ　、Ｌ、）は、回
折格子駆動装置（１５）で角度調整した回折格子（１６
）により回折して分光帯域外の不要な光成分が除去され
、レンズ（１７）で集光されて光電検出器（１８）に入
射する。そしてその光電検出器（１８）による検出信号
は、増幅器（１９）と選択レベル測定器（２０）により
所定の周波数成分のみがＣＲＴ　（２１）に選別出力さ
れるようになっている。

このような検出信号の出力は、試料（５）の分析点ごと
に出力されるので、試料（５）の所定範囲の分析を行う
に際しては、この試料（５）の分析点を試料設置台（２
２）を動かして走査する。この走査は、ドライバー（２
４）で制御しつつ、試料設置台移動モータ（２３）で試
料設置台（２２）をｘ　−ｙ　−ｚの３軸方向に移動し
て行うにようになっている。また、試料（５）の分析点
は、ドライバー（２４）からＣＲ’Ｔ’（２１）に伝達
されるようになっている。

この試料（５）の分析点の情報と」１記の螢光の検出信
号とから、ＣＲＴ（２１）は螢光像を上記の周波数（波
長λｌ）の場合の像として表示し、また、フレームメモ
リー（２５）に伝達してその螢光像が蓄積されるように
している。

このような螢光顕微鏡において、参照用ドーザ光は、）
の発振周波数が異なる場合の螢光像は、上記の波長調整
器（１１）を制御し、参照用レーザ光源（１０）に異な
る発振周波数（波長λ２）を発振させて得る、−とがで
きる。そしてこのようにして得な各波長での検出データ
をフレームメモリー（２５）に蓄積し、それをモニター
（２Ｇ）に表示させ、螢光像を参照用レーザ光（［４）
のスベクｈル幅の分解能で周波数（波長）分析すること
を可能としている。

なお、実視野での観察は、ランプ（２７）、レンズ（２
８）、ハーフミラ−（２９）による照明と、レンズ（４
）、プリズム（３０）、接眼レンズ（３１）の光学系に
より行うことができる。

第２図は、この発明の他の実施例の光字配置図である。

この実施例の螢光顕微鏡は、第１図に示した実施例が参
照用レーザ光（［４）の周波数を参照用レーザ光源（１
０）の発振周波数を変えることにより可変としているの
に対し、参照用レーザ光源（１ｏ）に周波数変換器（１
１’）を接続してその周波数をシフトさせるようにした
ものである。すなわち、参照用ドーザ光源（１０）から
周波数ω。（波長λ。）て発振された参照用レーザ光（
１４）を、周波数変換器（１１°）で周波数ω。−１−
△ω１に変換し、△ωまたζＪ変化させるようにしたも
のであり、これにより螢光波長大、近傍での螢光像の高
分解分析を一１ｉ１能にするものである。

第３図は、さらに異なるこの発明の実施例の光学配置図
である。

この実施例は、上記第１図および第２図に示した実施例
と異なり、試料からの螢光（［２）を参照用レーザ光（
Ｌ、）とを光混合した後に点像に結像し、アバーチＡ・
のピンホールを介して検出するようにしたらのである。

この場合、試料からの螢光（［２）を点像に結像させる
光学系としては、第１図あるは第２図のレンズ（６）の
代わりに、凹面回折格子（１６’）が機能する。また、
アパーチャのビンポール（７）は光電検出器（１８）の
前面に設置したものとなっている。

このような実施例においては、試料からの螢光（１□）
と参照用レーザ光（［、）とは、双方とも球面波として
光混合することとなる。

また、この実施例では、選択レベル測定器（２０）から
の出力を同期検波器（３２）で同期検波し７、それに基
づいて試料からの螢光（１２）の射出光路をチョッパー
（３３）で開閉することにより背景光の影響を除りるよ
うになっている。

以十１．３種の実施例について説明したが、この発明の
実施例はこれらに限られるものではなく、種々の態様を
とることかできる。

（発明の効果） この発明の螢光顕微鏡によれば、試料に励起用レーザ光
を照射して螢光を発生させ、その螢光を参照用レーザ光
と光混合し、ヘテロダイン検波して検出するので、従来
分別が困難であった螢光帯域の重なった物質の螢光分析
を高い分解能で行えるようになる。特に、この螢光顕微
鏡を共焦点型光学系に構成した場合には、解像力を一層
向上させ、また不要な散乱光を除去することらできるの
で、より高精度に鮮明な螢光像を得ることができるよう
になる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、それぞれこの発明の光ヘテロダイン
螢光顕微鏡の光学配置図である。 第４図は、従来の螢光顕微鏡の原理を示す光学配置図で
ある。 第５図は、従来の共焦点型の螢光顕微鏡の原理を示す光
学配置図である。 １ｉ　）励起用レーザ光 ［２）螢　光 １−１）平行光束 １−２）参照用レーザ光 １）励起用レーザ光源 ２）　　ミ　　　　　ラ ３）ハーフミラ− ４）し　ン　ズ ５）試　　　料 ６）し　ン　ズ ７）アパーチャのピンホール ８）し　　ン　ズ（９）ビームスグリ・ツタ１０）参照
用し・−ザ光源 １１）波長調整器 １Ｇ）回　折　格　了 １６゛）凹面回折格子 １８光電検出器 １９増　幅　器 ２０）選択レベル測定器 ２１ＣＲ，Ｔ ２４　　ドライバー ２５　フレームメモリー ２Ｇモニニター

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料に励起用レーザ光を照射して螢光を発生させ
   る試料照射手段と、試料から発せられた螢光に参照用レ
   ーザ光を光混合し、ヘテロダイン検波する検出手段とを
   有する光ヘテロダイン螢光顕微鏡。
2. （２）試料照射手段と検出手段が共焦点光学系を構成す
   るように、試料に励起用レーザ光をスポット照射する試
   料照射手段と、試料の照射スポットから発せられた螢光
   を、参照用レーザ光との光混合前または光混合後に点像
   に結像し、アパーチャのピンホールを介して検出する検
   出手段とを有する請求項（１）記載の光ヘテロダイン螢
   光顕微鏡。
3. （３）試料から発せられた螢光を、検出手段のアパチャ
   ーとレンズ系から定まる回折限界の視野の光束にして光
   混合する請求項（１）または（２）記載の光ヘテロダイ
   ン螢光顕微鏡。
4. （４）参照用レーザ光の周波数が、発振周波数の調整に
   よりが変化する請求項（１）または（２）記載の光ヘテ
   ロダイン螢光顕微鏡。
5. （５）参照用レーザ光の周波数が、周波数変換器により
   シフト変化する請求項（１）または（２）記載の光ヘテ
   ロダイン螢光顕微鏡。