JP6564166B2 - 測定装置および蛍光測定方法 - Google Patents
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Description
この測定装置では、発光物質の発光量が蛍光物質の蛍光量に比べて無視し得るほどの微弱なものであるため、蛍光測定時には発光物質の発光の有無にかかわらず蛍光画像を取得することができた。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、発光量が大きな発光物質を使用してもノイズの少ない蛍光画像および発光画像を取得することができる測定装置および蛍光測定方法を提供することを目的としている。
本発明の一態様は、励起光源からの励起光を標本に照射する照明光学系と、前記標本において発生する光を測定して画像を取得する画像取得部と、励起光を照射することなく前記画像取得部により取得された第1の画像と、励起光を照射して前記画像取得部により取得された第2の画像とに基づいて、前記第2の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する画像処理部とを備え、前記第1の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、前記第2の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である測定装置を提供する。
このようにすることで、標本において発生した光が分光部によって波長ごとに分光された画像として第1の画像および第2の画像を取得することができる。これにより、第2の画像からの発光成分の除去を、分光された画像に基づいて波長ごとに行うことができる。
このようにすることで、発光成分と蛍光成分とを含む第2の画像から発光成分のみを含む第1の画像を減算して、簡易に、発光成分を除去した蛍光画像を生成することができる。
このようにすることで、励起光を照射せずに標本において発生した光を分光して得られた第1の画像から発光成分のみのスペクトルを得るとともに、励起光を照射して標本において発生した光を分光して得られた第2の画像から蛍光成分および発光成分の両方を含むスペクトルを得て、これらのスペクトルに基づいてアンミキシング処理をすることにより、蛍光成分と発光成分とを分離し、発光成分を除去した蛍光画像を得ることができる。
このようにすることで、シャッタの開閉によって簡易に第1の画像と第2の画像とを切り替えて取得することができる。
また、上記態様においては、前記第3のステップが、前記第2の画像から前記第1の画像を減算してもよい。
また、上記態様においては、前記第3のステップが、前記第1の画像と前記第2の画像とに基づいてアンミキシング処理を行ってもよい。
本実施形態に係る測定装置1は、顕微鏡であって、図1に示されるように、励起光を発生するレーザ光源(励起光源)2と、レーザ光源2に隣接して配置されレーザ光源2からの励起光をオンオフさせるシャッタ3と、標本Aを搭載するステージ4と、レーザ光源2からの励起光をステージ4上の標本Aに照射する一方、標本Aにおいて発生した蛍光および発光を集光する対物レンズ5とを備えている。
検出器7は、例えば、CCDあるいはCMOSのような撮像素子であり、標本Aの発光像あるいは蛍光像を撮影するようになっている。
画像処理部8は、コントローラ9によってシャッタ3が閉じられたときに取得された第1の画像と、シャッタ3が開かれているときに取得された第2の画像とを検出器7から受け取って、第2の画像から第1の画像を減算することにより、蛍光画像を生成するようになっている。コントローラ9および画像処理部8は、例えば、コンピュータにより実現されている。
本実施形態に係る測定装置1を用いて発光画像および蛍光画像を取得するには、ステージ4上に標本Aを載置し、レーザ光源2を作動させて励起光を射出させた状態で、コントローラ9の作動によってシャッタ3および検出器7を作動させる。
シャッタ3が閉じられている状態では、励起光が標本Aに照射されないので、標本Aにおいては発光物質からの発光のみが発せられる。標本Aから発せられた発光は、対物レンズ5によって集光され、フィルタ6を透過して検出器7により撮影される。これにより、検出器7により取得された第1の画像は、蛍光を含まない発光画像となっており、画像処理部8に送られる。
シャッタ3が開かれている状態では、レーザ光源2から発せられた励起光がフィルタ6において偏向されて対物レンズ5によって集光され、ステージ4上の標本Aに照射される。標本Aにおいては、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発生するとともに、励起光の有無に関わらず発光物質からの発光も発生している。
本実施形態の説明において、上述した第1の実施形態に係る測定装置1と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
画像処理部8は、検出器7a〜7cから送られてきた画像に基づいてスペクトルを生成し、生成されたスペクトルに基づいて発光蛍光画像に対して公知のアンミキシング処理を行うようになっている。
シャッタ3が閉じられている状態では、励起光が標本Aに照射されないので、標本Aにおいては発光物質からの発光のみが発せられる。
シャッタ3が開かれている状態では、レーザ光源2から発せられた励起光が対物レンズ5によって集光され、ステージ4上の標本Aに照射される。標本Aにおいては、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発生するとともに、励起光の有無に関わらず発光物質からの発光も発生している。
αX+βY=Z
なお、既知の蛍光スペクトルYは、蛍光だけのサンプルで事前に測定するか、蛍光だけが発している部分のスペクトルを使用する。
すなわち、発光蛍光スペクトルZに含まれる発光スペクトルXと蛍光スペクトルYとの割合が係数α,βの算出によって明らかとなるので、発光成分が除去された蛍光画像を生成することができる。このようにすることで、空間的に蛍光成分と発光成分とが重なっている場合においても発光成分を除去した蛍光画像を生成することができるという利点がある。
この場合には、それぞれの発光物質の発光スペクトルおよび/またはそれぞれの蛍光物質の蛍光スペクトルを生成する必要がある。
α1X1+α2X2+…+αnXn+β1Y1+β2Y2+…+βnYn=Z
ここで、α1,α2,…,αn,β1,β2,…,βnは未知の係数である。
1,20 測定装置
2 レーザ光源(励起光源)
3 シャッタ
7,7a,7b,7c 検出器(画像取得部)
8 画像処理部
10 照明光学系
21 分光部
22a,22b,22c 光検出器(画像取得部)
23 スキャナ(画像取得部)
Claims (9)
- 励起光源からの励起光を標本に照射する照明光学系と、
前記標本において発生する光を測定して画像を取得する画像取得部と、
励起光を照射することなく前記画像取得部により取得された第1の画像と、励起光を照射して前記画像取得部により取得された第2の画像とに基づいて、前記第2の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する画像処理部とを備え、
前記第1の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、
前記第2の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である測定装置。 - 前記画像取得部が、前記標本において発生する光を分光する分光部を備える請求項1に記載の測定装置。
- 前記画像処理部が、前記第2の画像から前記第1の画像を減算する請求項1または請求項2に記載の測定装置。
- 前記画像処理部が、前記第1の画像と前記第2の画像とに基づいてアンミキシング処理を行う請求項2に記載の測定装置。
- 前記照明光学系が励起光を遮断するシャッタを備え、
該シャッタを閉じて励起光を遮断した状態で、前記画像取得部により取得された画像を第1の画像とし、前記シャッタを開いて励起光を照射した状態で前記画像取得部により取得された画像を第2の画像とする請求項1から請求項4のいずれかに記載の測定装置。 - 励起光を照射することなく標本を撮影して第1の画像を取得する第1のステップと、
励起光を照射した状態で標本を撮影して第2の画像を取得する第2のステップと、
前記第1のステップにおいて取得された第1の画像と、前記第2のステップにおいて取得された第2の画像とに基づいて、第2の画像から発光成分を除去した蛍光画像を生成する第3のステップとを含み、
前記第1の画像が、前記標本に含まれる発光物質による発光成分のみを含む発光画像であり、
前記第2の画像が、前記発光成分および蛍光成分の両方を含む蛍光発光画像である蛍光測定方法。 - 前記第1のステップが、前記標本において発生する光を分光して第1の画像を取得し、
前記第2のステップが、前記標本において発生する光を分光して第2の画像を取得する
請求項6に記載の蛍光測定方法。 - 前記第3のステップが、前記第2の画像から前記第1の画像を減算する請求項6または請求項7に記載の蛍光測定方法。
- 前記第3のステップが、前記第1の画像と前記第2の画像とに基づいてアンミキシング処理を行う請求項7に記載の蛍光測定方法。
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