WO2021251130A1

WO2021251130A1 - 観察装置及び観察方法

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Publication number: WO2021251130A1
Application number: PCT/JP2021/019820
Authority: WO
Inventors: 貴文樋口; 正典小林
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-12-16
Also published as: JP2023106643A

Abstract

観察装置は、複数の変調パターンでそれぞれ変調された複数の励起光を、観察対象物に同時に照射する照射部と、観察対象物からの複数の検出光を検出信号として検出する検出部と、検出信号を復調することにより、複数の検出光の画像を検出光毎に生成する画像処理部と、を備える。複数の検出光は、第１の検出光と、第１の検出光よりも小さい光量を有する第２の検出光と、を含む。各変調パターンは、励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間と励起光の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが切り替わるように励起光を変調させる変調パターンであり、検出信号が復調される復調タイミングにおいて互いに直交条件を満たすように設定されている。ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比として表した場合に、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比は、第２の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている。

Description

観察装置及び観察方法

　本開示は、観察装置及び観察方法に関する。

　従来、観察対象物の蛍光観察を行う観察装置として、例えば特許文献１に記載された顕微鏡装置が知られている。この顕微鏡装置では、複数の蛍光物質により多重染色された試料に対して、複数の蛍光物質をそれぞれ励起する波長を有し且つ互いに異なる変調周波数で変調された複数の励起光が、同時に照射される。複数の励起光の照射に伴って、これら励起光に対応する複数の蛍光が試料から発生する。この顕微鏡装置では、これら蛍光が同時に検出され、各蛍光を示す信号が変調周波数に基づいて周波数分離されることによって、各蛍光の画像が蛍光毎に生成される。

特開２００５－０９１８９５号公報

　上述した顕微鏡装置では、各蛍光の画像が生成される際、或る蛍光のショットノイズ成分が他の蛍光の画像に偽信号として現れることがある。このような現象は、当該或る蛍光の光量が当該他の蛍光に比して大きい場合に、特に顕著に現れる。このような現象が生じると、各蛍光の正確な画像を生成することが困難となり得る。

　本開示は、上記課題の解決のためになされたものであり、観察対象物の正確な画像を得ることができる観察装置及び観察方法を提供する。

　本開示の一側面に係る観察装置は、互いに異なる波長を有すると共に、互いに異なる変調条件による複数の変調パターンでそれぞれ変調された複数の励起光を、観察対象物に同時に照射する照射部と、複数の励起光の照射に伴う観察対象物からの複数の検出光を検出信号として検出する検出部と、検出信号を復調することにより、複数の検出光の画像を検出光毎に生成する画像処理部と、を備える。複数の検出光は、第１の検出光と、第１の検出光よりも小さい光量を有する第２の検出光と、を含む。各変調パターンは、励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間と励起光の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが切り替わるように励起光を変調させる変調パターンであり、検出信号が復調される復調タイミングにおいて互いに直交条件を満たすように設定されている。ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比として表した場合に、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比は、第２の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている。

　各検出光の画像が生成される際、光量の大きい第１の検出光のショットノイズ成分が、光量の小さい第２の検出光の画像に偽信号として現れることがある。このようなショットノイズ成分は、一定期間における第１の検出光の光量の積算値が大きくなるほど大きくなる。この積算値は、第１の検出光に対応する励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間が長くなるほど大きくなる。これに対し、上記の観察装置では、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比は、第２の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている。このように第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比を低く設定すれば、励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間を短くできるので、第１の検出光のショットノイズ成分を低減できる。これにより、第１の検出光のショットノイズ成分が第２の検出光の画像に現れる事態を抑制できる。更に、復調タイミングにおいて各変調パターンが互いに直交条件を満たすように設定されているので、各変調パターンに対応する各検出光を示す検出信号を正確に復調できる。したがって、上記の観察装置によれば、各検出光の正確な画像を得ることが可能となる。

　照射部は、複数の変調パターンを記憶する記憶部を有してもよい。この場合、各変調パターンを生成する処理を行う必要がないので、各変調パターンを生成する場合と比べて、処理負担を軽減できる。

　照射部は、複数の変調パターンを生成する生成部を有してもよい。この場合、所望の各変調パターンを容易に得ることができる。

　第１の検出光は、複数の検出光の中で最も大きい光量を有してもよい。ショットノイズ成分は、光量の大きい検出光から光量の小さい検出光の画像に現れやすく、それらの検出光の光量差が大きくなるほど大きくなる。これに対し、上記の観察装置によれば、光量の最も大きい第１の検出光のショットノイズ成分が、光量の小さい第２の検出光の画像に現れる事態を抑制できるので、上述した効果を好適に奏する。

　第１の検出光と第２の検出光との間の光量の違いに基づいて、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比が設定されていてもよい。第２の検出光の画像に現れる第１の検出光のショットノイズ成分は、第１の検出光と第２の検出光との間の光量の違いに起因して変動する。そこで、これらの光量の違いに基づいて、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比が設定されることで、第１の検出光のショットノイズ成分を効果的に低減できる。これにより、第１の検出光のショットノイズ成分が第２の検出光の画像に現れる事態を効果的に抑制できる。

　第１の検出光の光量と第２の検出光の光量との差の絶対値に応じて、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比が設定されていてもよい。第２の検出光の画像に現れる第１の検出光のショットノイズ成分は、第１の検出光の光量と第２の検出光の光量との差の絶対値に応じて大きくなる。そこで、この絶対値に応じて、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比が設定されることで、第１の検出光のショットノイズ成分をより効果的に低減できる。これにより、第１の検出光のショットノイズ成分が第２の検出光の画像に現れる事態をより効果的に抑制できる。

　本開示の一側面に係る観察方法は、互いに異なる波長を有すると共に、互いに異なる変調条件による複数の変調パターンでそれぞれ変調された複数の励起光を、観察対象物に同時に照射するステップと、複数の励起光の照射に伴う観察対象物からの複数の検出光を検出信号として検出するステップと、検出信号を復調することにより、複数の検出光の画像を検出光毎に生成するステップと、を備える。複数の検出光は、第１の検出光と、第１の検出光よりも小さい光量を有する第２の検出光と、を含む。各変調パターンは、励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間と励起光の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが切り替わるように励起光を変調させる変調パターンであり、検出信号が復調される復調タイミングにおいて互いに直交条件を満たすように設定されている。ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比として表した場合に、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比は、第２の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている。

　各検出光の画像が生成される際、光量の大きい第１の検出光のショットノイズ成分が、光量の小さい第２の検出光の画像に偽信号として現れることがある。このようなショットノイズ成分は、一定期間における第１の検出光の光量の積算値が大きくなるほど大きくなる。この積算値は、第１の検出光に対応する励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間が長くなるほど大きくなる。これに対し、上記の観察方法では、第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比は、第２の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている。このように第１の検出光に対応する変調パターンのＯＮ／ＯＦＦ比を低く設定すれば、励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間を短くできるので、第１の検出光のショットノイズ成分を低減できる。これにより、第１の検出光のショットノイズ成分が第２の検出光の画像に現れる事態を抑制できる。更に、復調タイミングにおいて各変調パターンが互いに直交条件を満たすように設定されているので、各変調パターンに対応する各検出光を示す検出信号を正確に復調できる。したがって、上記の観察方法によれば、各検出光の正確な画像を得ることが可能となる。

　本開示によれば、観察対象物の正確な画像を得ることができる。

図１は、観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。図２は、図１に示す各変調信号を示す図である。図３は、各変調信号の生成手順を説明するための図である。図４は、各変調信号が満たす直交条件を説明するための図である。図５は、各変調信号の生成手順を説明するための図である。図６は、観察方法の一実施形態を示すフローチャートである。図７は、実施例及び比較例のシミュレーション条件を説明するための図である。図８は、比較例のシミュレーション条件を示す図である。図９は、比較例のシミュレーション結果を示す図である。図１０は、実施例のシミュレーション結果を示す図である。図１１は、各変調信号の第１の変形例を示す図である。図１２は、各変調信号の第２の変形例を示す図である。図１３は、各変調信号の第３の変形例を示す図である。図１４は、観察装置の変形例を示す概略構成図である。図１５は、観察装置の別の変形例を示す概略構成図である。

　以下、本開示の一実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を用い、重複する説明を適宜省略する。

　図１は、本実施形態に係る観察装置１を示す概略構成図である。観察装置１は、観察対象物である試料Ｔの蛍光観察を行う。試料Ｔは、例えば、互いに異なる複数種類の蛍光物質を含む生体組織等のサンプルである。各蛍光物質は、所定の波長域の励起光が照射された場合に、励起光の波長に応じた波長を有する蛍光等の検出光を発生する。蛍光物質としては、例えば、インドシアニングリーン、メチレンブルー、フルオレセイン、及び５－アミノレブリン酸等の蛍光色素が挙げられる。観察装置１は、試料Ｔの複数の蛍光物質をそれぞれ励起する複数の励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を試料Ｔに同時に照射し、それに伴って試料Ｔから発生する複数の検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を同時に撮像する。

　図１に示すように、観察装置１は、例えば、照射部１０と、検出部４０と、画像処理部７０と、を備える。照射部１０は、互いに異なる波長λ１、λ２、及びλ３を有し、且つ互いに異なる変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３でそれぞれ変調された複数の励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を、試料Ｔに同時に照射する。照射部１０は、複数の光源１１、１２、及び１３と、変調部１５と、導光光学系２０と、を有する。光源１１、１２、及び１３は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３をそれぞれ出力する。変調部１５は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３が互いに異なる変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３でそれぞれ変調されるように光源１１、１２、及び１３を制御する。導光光学系２０は、光源１１、１２、及び１３からそれぞれ出力された励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を試料Ｔに導光する。

　各光源１１、１２、及び１３は、試料Ｔの蛍光物質を励起させる波長を含む光を生成可能なコヒーレント光源又はインコヒーレント光源である。光源１１は、波長λ１を有する励起光Ｌ１を生成可能である。光源１２は、波長λ２を有する励起光Ｌ２を生成可能である。光源１３は、波長λ３を有する励起光Ｌ３を生成可能である。コヒーレント光源としては、例えば、レーザダイオード（ＬＤ）といったレーザ光源等が挙げられる。インコヒーレント光源としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）又はランプ系光源等が挙げられる。

　変調部１５は、各光源１１、１２、及び１３と電気的に接続されている。変調部１５は、互いに異なる変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３をそれぞれ有する複数の変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を用いて、複数の励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３をそれぞれ変調させる。変調部１５は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する変調信号生成部１６（生成部）と、変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３を設定する変調条件設定部１７と、を有する。

　変調条件設定部１７は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３毎に、互いに異なる変調条件（例えば、位相又は周波数）を設定する。本実施形態では、変調条件設定部１７は、変調信号Ｓ１及びＳ２の位相を互いに異なるように設定し、変調信号Ｓ１及びＳ２の周波数を互いに同一に設定する（後述する図２の（ａ）及び図２の（ｂ）参照）。そして、変調条件設定部１７は、変調信号Ｓ３の周波数を変調信号Ｓ１及びＳ２の周波数よりも高く設定する（後述する図２の（ｃ）参照）。図２の（ｃ）に示す例では、変調信号Ｓ３の周波数は、変調信号Ｓ１及びＳ２の周波数の２倍に設定される。変調条件設定部１７は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３毎に互いに異なる周波数を設定してもよいし、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３毎に互いに異なる位相を設定してもよい。変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３は、予め変調条件設定部１７に記憶された値であってもよいし、入出力デバイス等を介して外部から入力された値であってもよい。

　変調信号生成部１６は、変調条件設定部１７によって設定された変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３をそれぞれ有する変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する。変調信号Ｓ１は、光源１１から出力される励起光Ｌ１を時間的に変調させるための変調パターンである。例えば、変調信号Ｓ１は、励起光Ｌ１の照射のＯＮ／ＯＦＦが交互に切り替えられるように、励起光Ｌ１を変調条件Ｍ１で変調させる矩形波状のパルス信号である。変調信号Ｓ２は、光源１２から出力される励起光Ｌ２を時間的に変調させるための変調パターンである。例えば、変調信号Ｓ２は、励起光Ｌ２の照射のＯＮ／ＯＦＦが交互に切り替えられるように、励起光Ｌ２を変調条件Ｍ２で変調させる矩形波状のパルス信号である。変調信号Ｓ３は、光源１３から出力される励起光Ｌ３を時間的に変調させるための変調パターンである。例えば、変調信号Ｓ３は、励起光Ｌ３の照射のＯＮ／ＯＦＦが交互に切り替えられるように、励起光Ｌ３を変調条件Ｍ３で変調させる矩形波状のパルス信号である。各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３のより詳細な説明については、後述する。

　変調信号生成部１６は、生成した変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を光源１１、１２、及び１３にそれぞれ出力する。変調信号Ｓ１に従って、光源１１から出力される励起光Ｌ１が変調される。その結果、変調条件Ｍ１で変調された励起光Ｌ１が光源１１から出力される。変調信号Ｓ２に従って、光源１２から出力される励起光Ｌ２が変調される。その結果、変調条件Ｍ２で変調された励起光Ｌ２が光源１２から出力される。変調信号Ｓ３に従って、光源１３から出力される励起光Ｌ３が変調される。その結果、変調条件Ｍ３で変調された励起光Ｌ３が光源１３から出力される。

　導光光学系２０は、コリメータレンズ２１、２２、及び２３と、ダイクロイックミラー２４、２５、及び２９と、フィルタ２６及び２７と、リレーレンズ２８と、対物レンズ３１と、を含む。コリメータレンズ２１は、光源１１から出力された励起光Ｌ１を平行化する。コリメータレンズ２２は、光源１２から出力された励起光Ｌ２を平行化する。コリメータレンズ２３は、光源１３から出力された励起光Ｌ３を平行化する。ダイクロイックミラー２４は、光源１３の光軸と光源１２の光軸とが交差する位置に配置されている。コリメータレンズ２２を経た励起光Ｌ２と、コリメータレンズ２３を経た励起光Ｌ３とは、ダイクロイックミラー２４に到達する。

　ダイクロイックミラー２４は、波長λ２の励起光Ｌ２を反射し、波長λ３の励起光Ｌ３を透過する。ダイクロイックミラー２４を経た励起光Ｌ２及びＬ３と、コリメータレンズ２１を経た励起光Ｌ１とは、ダイクロイックミラー２５に到達する。ダイクロイックミラー２５は、光源１２の光軸と光源１１の光軸とが交差する位置に配置されている。ダイクロイックミラー２５は、波長λ２の励起光Ｌ２、及び波長λ３の励起光Ｌ３を反射し、波長λ１の励起光Ｌ１を透過する。ダイクロイックミラー２５を経た励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、対物レンズ３１に向かって進行する。

　フィルタ２６及び２７は、ダイクロイックミラー２５と対物レンズ３１との間の光路上に並んで配置されている。フィルタ２６及び２７は、波長λ１の励起光Ｌ１、波長λ２の励起光Ｌ２、及び波長λ３の励起光Ｌ３のみを選択的に透過し、他の波長の光を遮断するバンドパスフィルタである。したがって、ダイクロイックミラー２５を経た励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、フィルタ２６及び２７を透過する。リレーレンズ２８は、フィルタ２６及び２７の間の光路上に配置されている。リレーレンズ２８は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を対物レンズ３１まで効率よく導く役割を有する。

　ダイクロイックミラー２９は、フィルタ２７と対物レンズ３１との間の光路上に配置されている。フィルタ２７を経た励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、ダイクロイックミラー２９に到達する。ダイクロイックミラー２９は、波長λ１の励起光Ｌ１、波長λ２の励起光Ｌ２、及び波長λ３の励起光Ｌ３を反射し、蛍光波長の検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を透過する。ダイクロイックミラー２９を経た励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、対物レンズ３１に到達する。

　対物レンズ３１は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を集光し、集光した励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を試料Ｔに同時に照射する。更に、対物レンズ３１は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射に伴って試料Ｔから発生した検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を導光する。対物レンズ３１は、例えば、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、対物レンズ３１の光軸に沿って移動可能に構成されている。これにより、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の集光位置と、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の検出のための焦点位置と、が調整可能となっている。

　検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射に伴って試料Ｔからそれぞれ発生する蛍光である。本実施形態では、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３のうちの検出光Ｌ１３が最も大きい光量を有しており、検出光Ｌ１１及びＬ１２のそれぞれは、検出光Ｌ１３よりも小さい光量を有している。検出光Ｌ１１の光量は、検出光Ｌ１２の光量よりも小さく、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の中で最も小さくなっている。したがって、本実施形態における「第１の検出光」を検出光Ｌ１３として捉えた場合には、本実施形態における「第２の検出光」を検出光Ｌ１１及びＬ１２として捉えることができる。本実施形態における「第１の検出光」を検出光Ｌ１２として捉えた場合には、本実施形態における「第２の検出光」を検出光Ｌ１１として捉えることができる。検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光量は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射を一度行えば測定できる。したがって、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光量は、観察装置１に予め記憶されていてもよい。

　検出部４０は、試料Ｔから発生した検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を検出する。検出部４０は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を導光する導光光学系３０と、導光光学系３０によって導光された検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を検出するセンサ３５と、を有する。導光光学系３０は、対物レンズ３１と、ダイクロイックミラー２９と、フィルタ３２と、結像レンズ３３と、を有する。対物レンズ３１は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を結像レンズ３３に向けて導光する。ダイクロイックミラー２９及びフィルタ３２は、対物レンズ３１と結像レンズ３３との間の光路上に配置されている。フィルタ３２は、蛍光波長の検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３のみを選択的に透過し、他の波長の光を遮断するバンドパスフィルタである。したがって、対物レンズ３１を経た検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３は、ダイクロイックミラー２９及びフィルタ３２を透過し、結像レンズ３３に到達する。結像レンズ３３は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３をセンサ３５に結像する。

　センサ３５は、２次元的に配列された複数の画素によって構成された受光面を有している。センサ３５は、例えば、ＣＣＤイメージセンサ又はＣＭＯＳイメージセンサ等のエリアイメージセンサである。このようなイメージセンサとして、例えば、モノクロセンサ、カラーセンサ、マルチスペクトルセンサ、又はハイパースペクトルセンサ等を用いることができる。センサ３５は、導光光学系３０により導光された検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３による光像を撮像し、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３のそれぞれの光像を含む画像データとして検出信号Ｓを出力する。

　センサ３５は、所定のフレームレート（例えば、１００ｆｐｓ）で撮像し、各フレームに対応する検出信号Ｓを出力する。センサ３５は、例えば、フレーム周期（フレームレートの逆数）以下の範囲で露光時間を可変に設定可能に構成されている。センサ３５は、変調信号生成部１６と通信可能に構成されている。センサ３５は、センサ３５による撮像と、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３に基づく各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の変調と、が同期するように設定されている。

　画像処理部７０は、例えば、コンピュータであり、物理的には、ＲＡＭ及びＲＯＭ等のメモリ、ＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、並びに、ディスプレイ等の表示部、を備えて構成されている。コンピュータとしては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、又はスマートデバイス（例えば、スマートフォン或いはタブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータは、コンピュータのメモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、画像処理部７０としての機能の他、各構成を制御するコントローラとして機能してもよいし、変調部１５として機能してもよい。

　画像処理部７０は、センサ３５と電気的に接続されており、センサ３５から出力された検出信号Ｓの処理を行う。画像処理部７０は、信号復調部７１と、画像生成部７２と、を有する。信号復調部７１は、変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３に基づいて検出信号Ｓを復調することにより、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３それぞれの光像に対応する画像データである復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を出力する。画像生成部７２は、復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３に基づいて検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３それぞれの光像を示す画像を生成する。信号復調部７１は、所定のフレームレートで出力される検出信号Ｓを復調タイミングで復調する。したがって、信号復調部７１は、復調タイミング毎に、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３に基づいて検出信号Ｓを復調し、復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を生成する。信号復調部７１における復調は、複数回（例えば、Ｎ回（Ｎは正の整数を示す））行われてもよい。この場合、信号復調部７１は、復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３の生成をＮ回行う。そして、画像生成部７２は、生成されたＮ個の復調信号Ｓ１１、Ｎ個の復調信号Ｓ１２、及びＮ個の復調信号Ｓ１３に対して、それぞれ平均処理もしくは加算処理等を行う。これにより、画像生成部７２は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３それぞれの光像に対応する画像を生成する。

　各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３は、各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射に応じて発生する光である。そのため、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を示す各復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３についても、各変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３で変調されている。そこで、信号復調部７１は、変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３に基づいて、検出信号Ｓから復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を復調する。

　具体的には、信号復調部７１は、センサ３５から出力される検出信号Ｓのうち、変調信号Ｓ１のＯＮ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ１の照射がＯＮになる期間）に対応する検出信号Ｓに係数（例えば、“１”）を乗じ、ＯＦＦ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになる期間）に対応する検出信号Ｓに別の係数（例えば、“－１”）を乗じ、これらに対し平均処理もしくは加算処理を行うことで、復調信号Ｓ１１を得る。信号復調部７１は、センサ３５から出力される検出信号Ｓのうち、変調信号Ｓ２のＯＮ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ２の照射がＯＮになる期間）に対応する検出信号Ｓに係数（例えば、“１”）を乗じ、ＯＦＦ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ２の照射がＯＦＦになる期間）に対応する検出信号Ｓに別の係数（例えば、“－１”）を乗じ、これらに対し平均処理もしくは加算処理を行うことで、復調信号Ｓ１２を得る。信号復調部７１は、センサ３５から出力される検出信号Ｓのうち、変調信号Ｓ３のＯＮ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ３の照射がＯＮになる期間）に対応する検出信号Ｓに係数（例えば、“１”）を乗じ、ＯＦＦ期間（すなわち、試料Ｔへの励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになる期間）に対応する検出信号Ｓに別の係数（例えば、“－１”）を乗じ、これらに対し平均処理もしくは加算処理を行うことで、復調信号Ｓ１３を得る。検出信号Ｓに乗じる係数は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の振幅に対応させてもよい。信号復調部７１は、復調タイミング毎に復調信号Ｓ１１，Ｓ１２、及びＳ１３を生成し、これら復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を画像生成部７２に出力する。

　画像生成部７２は、信号復調部７１から出力された復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３に基づいて、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３それぞれに対応する画像を生成する。復調タイミングが複数設定されている場合、信号復調部７１は、復調タイミング毎に復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を生成し、これら復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を画像生成部７２に出力する。そのため、画像生成部７２には、復調タイミング毎に生成された複数の復調信号Ｓ１１が入力される。画像生成部７２は、複数の復調信号Ｓ１１を平均処理もしくは加算処理することにより、検出光Ｌ１１の画像を生成する。同様に、画像生成部７２には、復調タイミング毎に生成された複数の復調信号Ｓ１２が入力される。画像生成部７２は、複数の復調信号Ｓ１２を平均処理もしくは加算処理することにより、検出光Ｌ１２の画像を生成する。同様に、画像生成部７２には、復調タイミング毎に生成された複数の復調信号Ｓ１３が入力される。画像生成部７２は、複数の復調信号Ｓ１３を平均処理もしくは加算処理することにより、検出光Ｌ１３の画像を生成する。

　復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３は復調タイミング毎に復調されるため、復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３に基づいて生成される検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像も、復調タイミング毎に生成されてもよい。この場合、画像生成部７２は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像が生成される度に、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３のそれぞれの画像を更新して表示してもよい。つまり、画像生成部７２は、復調タイミングが到来する度に、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像を更新してもよい。画像生成部７２は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像をそれぞれ並べて表示してもよいし、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像を互いに重ね合わせて表示してもよい。

　ここで、図２、図３、図４、及び図５を参照して、上述した変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３について詳細に説明する。図２の（ａ）は、変調条件Ｍ１を有する変調信号Ｓ１を示している。図２の（ｂ）は、変調条件Ｍ２を有する変調信号Ｓ２を示している。図２の（ｃ）は、変調条件Ｍ３を有する変調信号Ｓ３を示している。図２の（ａ）、図２の（ｂ）、及び図２の（ｃ）において、横軸は時間を示しており、縦軸は変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の出力を示している。

　図２の（ａ）に示す変調信号Ｓ１は、試料Ｔへの励起光Ｌ１の照射がＯＮになるＯＮ期間と、試料Ｔへの励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが交互に繰り返されるように、励起光Ｌ１を変調させる。図２の（ａ）において、四角形のプロットＰ１１は、ＯＮ期間における変調信号Ｓ１の出力を示しており、三角形のプロットＰ１２は、ＯＦＦ期間における変調信号Ｓ１の出力を示している。プロットＰ１１及びＰ１２は、復調信号Ｓ１１に含まれるフレーム（すなわち、検出光Ｌ１１の光像を示す画像データ）を示している。このフレームは、センサ３５から所定のフレームレートで出力される検出信号Ｓに含まれており、検出光Ｌ１１の画像の生成に用いられる。

　画像生成部７２は、復調信号Ｓ１１に含まれるフレームのうち、期間ＴＦ１（すなわち、図２の（ａ）においてドット柄のハッチングで示された期間）内のフレームを用いて、検出光Ｌ１１の画像を生成する。本実施形態では、期間ＴＦ１は、検出光Ｌ１１の画像の生成が開始されてから検出光Ｌ１１の画像の生成が終了するタイミングまでの全期間に設定されている。したがって、画像生成部７２は、期間ＴＦ１内の全フレームを用いて検出光Ｌ１１の画像を生成する。本実施形態では、検出光Ｌ１１の画像の生成が終了するタイミングは、復調信号Ｓ１１に含まれるフレームが規定フレーム数（例えば４０フレーム）に達したタイミングである。

　プロットＰ１１は、励起光Ｌ１の照射がＯＮになるＯＮ期間に得られるフレームに対応している。プロットＰ１２は、励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間に得られるフレームに対応している。このため、プロットＰ１１の総数が多いほどＯＮ期間が長くなり、プロットＰ１２の総数が多いほどＯＦＦ期間が長くなる。つまり、変調信号Ｓ１において、ＯＮ期間の長さは、プロットＰ１１の総数によって示すことができ、ＯＦＦ期間の長さは、プロットＰ１２の総数によって示すことができる。プロットＰ１１の総数とは、規定フレーム数のうちのＯＮ期間に得られるフレームの総数、すなわち、期間ＴＦ１内におけるプロットＰ１１の総数を意味する。プロットＰ１２の総数とは、規定フレーム数のうちのＯＦＦ期間に得られるフレームの総数、すなわち、期間ＴＦ１内におけるプロットＰ１２の総数を意味する。

　したがって、変調信号Ｓ１において、ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１で表した場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、プロットＰ１２の総数に対するプロットＰ１１の総数の比によって表すことができる。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、例えば、ＯＮ期間をＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／ＯＦＦ期間として表すことができる。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、プロットＰ１１の総数をプロットＰ１２の総数で除した、プロットＰ１１の総数／プロットＰ１２の総数として表すことができる。

　図２の（ａ）に示す例では、プロットＰ１１の総数及びプロットＰ１２の総数は共に２０であるので、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、２０／２０と表される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、ＯＮ期間をＯＮ期間＋ＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／［ＯＮ期間＋ＯＦＦ期間］として表されていてもよい。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１は、プロットＰ１１の総数をプロットＰ１１の総数＋プロットＰ１２の総数で除した、プロットＰ１１の総数／［プロットＰ１１の総数＋プロットＰ１２の総数］として表されていてもよい。

　図２の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２は、試料Ｔへの励起光Ｌ２の照射がＯＮになるＯＮ期間と、試料Ｔへの励起光Ｌ２の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが交互に繰り返されるように、励起光Ｌ２を変調させる。図２の（ｂ）において、四角形のプロットＰ２１は、ＯＮ期間における変調信号Ｓ２の出力を示しており、三角形のプロットＰ２２は、ＯＦＦ期間における変調信号Ｓ２の出力を示している。プロットＰ２１及びＰ２２は、復調信号Ｓ１２に含まれるフレーム（すなわち、検出光Ｌ１２の光像を示す画像データ）を示している。このフレームは、センサ３５から所定のフレームレートで出力される検出信号Ｓに含まれており、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられる。

　画像生成部７２は、復調信号Ｓ１２に含まれるフレームのうち、期間ＴＦ２（すなわち、図２の（ｂ）においてドット柄のハッチングで示された期間）内のフレームを用いて、検出光Ｌ１２の画像を生成する。本実施形態では、期間ＴＦ２は、検出光Ｌ１２の画像の生成が開始されてから検出光Ｌ１２の画像の生成が終了するタイミングＴＭまでの期間のうちの一部の期間（具体的には、図２の（ｂ）において、タイミングＴＭまでの期間のうち時間領域ＲＡを除く期間）に設定されている。画像生成部７２は、期間ＴＦ２内のフレームのみを用いて検出光Ｌ１２の画像を生成する。タイミングＴＭは、復調信号Ｓ１２に含まれるフレームが規定フレーム数に達したタイミング（すなわち、図２の（ａ）に示す期間ＴＦ１が経過したタイミング）よりも前である。変調信号Ｓ２において、タイミングＴＭ以降の励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。

　プロットＰ２１は、励起光Ｌ２の照射がＯＮになるＯＮ期間に得られるフレームに対応している。プロットＰ２２は、励起光Ｌ２の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間に得られるフレームに対応している。このため、変調信号Ｓ２において、ＯＮ期間の長さは、プロットＰ２１の総数によって示すことができ、ＯＦＦ期間の長さは、プロットＰ２２の総数によって示すことができる。プロットＰ２１の総数とは、規定フレーム数に達するまでの期間（すなわち、図２の（ａ）に示す期間ＴＦ１に相当する期間）内におけるプロットＰ２１の総数を意味する。プロットＰ２２の総数とは、規定フレーム数に達するまでの期間内におけるプロットＰ２２の総数を意味する。

　したがって、変調信号Ｓ２において、ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２で表した場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、プロットＰ２２の総数に対するプロットＰ２１の総数の比によって表すことができる。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、例えば、ＯＮ期間をＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／ＯＦＦ期間として表すことができる。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、プロットＰ２１の総数をプロットＰ２２の総数で除した、プロットＰ２１の総数／プロットＰ２２の総数として表すことができる。

　図２の（ｂ）に示す例では、プロットＰ２１の総数が１０であり、プロットＰ２２の総数が３０であるので、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、１０／３０と表される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、ＯＮ期間をＯＮ期間＋ＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／［ＯＮ期間＋ＯＦＦ期間］として表されていてもよい。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、プロットＰ２１の総数をプロットＰ２１の総数＋プロットＰ２２の総数で除した、プロットＰ２１の総数／［プロットＰ２１の総数＋プロットＰ２２の総数］として表されていてもよい。

　図２の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３は、試料Ｔへの励起光Ｌ３の照射がＯＮになるＯＮ期間と、試料Ｔへの励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが交互に繰り返されるように、励起光Ｌ３を変調させる。図２の（ｃ）において、四角形のプロットＰ３１は、ＯＮ期間における変調信号Ｓ３の出力を示しており、三角形のプロットＰ３２は、ＯＦＦ期間における変調信号Ｓ３の出力を示している。プロットＰ３１及びＰ３２は、復調信号Ｓ１３に含まれるフレーム（すなわち、検出光Ｌ１３の光像を示す画像データ）を示している。このフレームは、センサ３５から所定のフレームレートで出力される検出信号Ｓに含まれており、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられる。

　画像生成部７２は、復調信号Ｓ１３に含まれるフレームのうち、期間ＴＦ３（すなわち、図２の（ｃ）においてドット柄のハッチングで示された期間）内のフレームを用いて、検出光Ｌ１３の画像を生成する。本実施形態では、期間ＴＦ３は、検出光Ｌ１３の画像の生成が開始されてから検出光Ｌ１３の画像の生成が終了するタイミングＴＭまでの期間のうちの一部の期間に設定されている。当該一部の期間は、タイミングＴＭまでの期間のうち、時間領域ＲＢを含み且つ時間領域ＲＡを含まない期間に設定されている。画像生成部７２は、期間ＴＦ３内のフレームのみを用いて検出光Ｌ１３の画像を生成する。タイミングＴＭは、図２の（ｂ）に示すタイミングＴＭと一致する。変調信号Ｓ３において、タイミングＴＭ以降の励起光Ｌ３の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。

　プロットＰ３１は、励起光Ｌ３の照射がＯＮになるＯＮ期間に得られるフレームに対応しており、プロットＰ３２は、励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間に得られるフレームに対応している。このため、変調信号Ｓ３において、ＯＮ期間の長さは、プロットＰ３１の総数によって示すことができ、ＯＦＦ期間の長さは、プロットＰ３２の総数によって示すことができる。プロットＰ３１の総数とは、規定フレーム数に達するまでの期間（すなわち、図２の（ａ）に示す期間ＴＦ１に相当する期間）内におけるプロットＰ３１の総数を意味する。プロットＰ３２の総数とは、規定フレーム数に達するまでの期間内におけるプロットＰ３２の総数を意味する。

　したがって、変調信号Ｓ３において、ＯＦＦ期間に対するＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２で表した場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、プロットＰ３２の総数に対するプロットＰ３１の総数の比によって表すことができる。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、例えば、ＯＮ期間をＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／ＯＦＦ期間として表すことができる。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、プロットＰ３１の総数をプロットＰ３２の総数で除した、プロットＰ３１の総数／プロットＰ３２の総数として表すことができる。

　図２の（ｃ）に示す例では、プロットＰ３１の総数が２であり、プロットＰ３２の総数が３８であるので、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、２／３８と表される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、ＯＮ期間をＯＮ期間＋ＯＦＦ期間で除した、ＯＮ期間／［ＯＮ期間＋ＯＦＦ期間］として表されていてもよい。この場合、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、プロットＰ３１の総数をプロットＰ３１の総数＋プロットＰ３２の総数で除した、プロットＰ３１の総数／［プロットＰ３１の総数＋プロットＰ３２の総数］として表されていてもよい。

　このように、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１よりも低く設定されており、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３よりも更に低く設定されている。つまり、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３のうち、変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１が最も高く設定されており、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が最も低く設定されている。最も低いＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３を有する変調信号Ｓ３は、最も大きい光量を有する検出光Ｌ１３に対応している。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２を有する変調信号Ｓ２は、検出光Ｌ１３よりも小さい光量を有する検出光Ｌ１２に対応している。最も低いＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１を有する変調信号Ｓ１は、最も小さい光量を有する検出光Ｌ１１に対応している。

　上述したように、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の各変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３で変調されている。したがって、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３による各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射のＯＮ／ＯＦＦの切り替えに応じて、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の発光／非発光が切り替えられる。つまり、各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射がＯＮのときは、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３が発光する一方、各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射がＯＦＦのときは、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３が発光しない。

　変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が上述したように低く設定されると、変調信号Ｓ３に対応する励起光Ｌ３の照射がＯＮになるＯＮ期間が短くなり、それに応じて検出光Ｌ１３の発光期間が短くなる。検出光Ｌ１３の発光期間が短くなれば、後述するように、光量の大きい検出光Ｌ１３のショットノイズ成分が、光量の小さい検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像に現れる事態を抑制する上で有効となる。一方、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるほど、検出光Ｌ１３の画像の光量の積算値が小さくなるので、検出光Ｌ１３の画像の精度が低下することが懸念される。そこで、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、検出光Ｌ１３の画像の精度の低下を抑えつつ、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分を十分に低減可能な範囲内に設定される。

　変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２については、変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１よりも低く設定されているので、光量の大きい検出光Ｌ１２のショットノイズ成分が、光量の小さい検出光Ｌ１１の画像に現れる事態が抑制される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３と同様、検出光Ｌ１２の画像の精度の低下を抑えつつ、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分を十分に低減可能な範囲内に設定される。本実施形態においては、検出光Ｌ１２及びＬ１３の光量は、検出光Ｌ１１と比べて大きいので、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２及びＲＴ３が低く設定されても、検出光Ｌ１２及びＬ１３の光量を十分に確保可能である。その結果、検出光Ｌ１２及びＬ１３の画像の精度が大きく低下する事態が抑制されている。

　ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２及びＲＴ３は、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光量の違いに基づいて設定されている。検出光Ｌ１１の画像に現れる検出光Ｌ１２のショットノイズ成分は、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１２の光量との差に応じて変動する。具体的には、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が大きくなるほど、検出光Ｌ１１の画像に現れる検出光Ｌ１２のショットノイズ成分が大きくなる。

　そこで、例えば、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が低くなるように設定され、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が高くなるように設定される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１２の光量の比に応じて設定されてもよい。この場合、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１２の光量の比が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が低くなるように設定され、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１２の光量の比が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が高くなるように設定されてもよい。

　検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像に現れる検出光Ｌ１３のショットノイズ成分は、検出光Ｌ１１及びＬ１２の光量と検出光Ｌ１３の光量との差に応じて変動する。具体的には、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が大きいほど、検出光Ｌ１１の画像に現れる検出光Ｌ１３のショットノイズ成分が大きくなる。同様に、検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が大きいほど、検出光Ｌ１２の画像に現れる検出光Ｌ１３のショットノイズ成分が大きくなる。

　そこで、例えば、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定され、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定される。本実施形態では、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値は、検出光Ｌ１１の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値よりも大きいので、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２よりも更に低く設定される。ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１３の光量の比に応じて設定されてもよい。この場合、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１３の光量の比が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定され、検出光Ｌ１１の光量に対する検出光Ｌ１３の光量の比が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定されてもよい。

　検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定されてもよく、検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１３の光量との差の絶対値が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定されてもよい。この場合においても、検出光Ｌ１２の光量に対する検出光Ｌ１３の光量の比が大きいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定され、当該比が小さいほど、ＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定されてもよい。

　図２に示す各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の生成は、以下の手順によって行われる。図３は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の生成手順を説明するための図である。まず、図３に示すように、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３に対応する各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３を準備する。図３の（ａ）に示す変調信号Ｓ２１は、励起光Ｌ１の照射がＯＮになる期間と、励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになる期間とを含む期間を一周期Ｔ１として繰り返すように励起光Ｌ１を周期的に変調させるパルス信号である。変調信号Ｓ２１において、検出光Ｌ１１の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間は、検出光Ｌ１１の画像の生成が開始されてから検出光Ｌ１１の画像の生成が終了するまでの全期間（すなわち、図３の（ａ）においてドット柄のハッチングで示された期間）に設定されている。

　図３の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２２は、励起光Ｌ２の照射がＯＮになる期間と、励起光Ｌ２の照射がＯＦＦになる期間とを含む期間を一周期Ｔ２として繰り返すように励起光Ｌ２を周期的に変調させるパルス信号である。変調信号Ｓ２２の周波数は、変調信号Ｓ２１の周波数と同一に設定されるので、変調信号Ｓ２２の一周期Ｔ２は、変調信号Ｓ２１の一周期Ｔ１と同一となる。変調信号Ｓ２２において、復調タイミングＴＭ５以降の励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。変調信号Ｓ２２において、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間は、検出光Ｌ１２の画像の生成が開始されてから復調タイミングＴＭ５に至るまでの全期間（すなわち、図３の（ｂ）においてドット柄のハッチングで示された期間）に設定されている。

　図３の（ｃ）に示す変調信号Ｓ２３は、励起光Ｌ３の照射がＯＮになる期間と、励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになる期間とを含む期間を一周期Ｔ３として繰り返すように励起光Ｌ３を周期的に変調させるパルス信号である。変調信号Ｓ２３の周波数は、例えば、変調信号Ｓ２１及びＳ２２の周波数の２倍に設定されるので、変調信号Ｓ２３の一周期Ｔ３は、一周期Ｔ１の半分（すなわち、一周期Ｔ２の半分）となる。変調信号Ｓ２３において、復調タイミングＴＭ１以降の励起光Ｌ３の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。変調信号Ｓ２３において、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間は、検出光Ｌ１３の画像の生成が開始されてから復調タイミングＴＭ１に至るまでの全期間（すなわち、図３の（ｃ）においてドット柄のハッチングで示された期間）に設定されている。

　各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３は、各復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３が復調される復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…において、互いに直交条件を満たすように設定されている。このように各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３が互いに直交条件を満たす場合、復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…において、各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３に対応する各復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を検出信号Ｓから正確に復調できる。「直交条件を満たす」とは、復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…において変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３の間の内積がゼロになることをいう。この直交条件について、図４を用いてより詳細に説明する。

　図４は、各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３が満たす直交条件を説明するための図である。図４に示す例では、変調信号Ｓ２１及びＳ２３の関係に着目する。図４に示すように、励起光Ｌ１の照射がＯＮになるときの変調信号Ｓ２１の出力（すなわち、プロットＰ１１）を＋１とし、励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになるときの変調信号Ｓ２１の出力（すなわち、プロットＰ１２）を－１とする。同様に、励起光Ｌ３の照射がＯＮになるときの変調信号Ｓ２３の出力（すなわち、プロットＰ３１）を＋１とし、励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになるときの変調信号Ｓ２３の出力（すなわち、プロットＰ３２）を－１とする。そして、各変調信号Ｓ２３の出力が切り替わるタイミングで、時間領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４に分割する。

　図４に示すように、時間領域Ｒ１には、変調信号Ｓ２１のプロットＰ１１と、変調信号Ｓ２３のプロットＰ３１とが含まれている。時間領域Ｒ２には、変調信号Ｓ２１のプロットＰ１１と、変調信号Ｓ２３のプロットＰ３２とが含まれている。時間領域Ｒ３には、変調信号Ｓ２１のプロットＰ１２と、変調信号Ｓ２３のプロットＰ３１とが含まれている。時間領域Ｒ４には、変調信号Ｓ２１のプロットＰ１２と、変調信号Ｓ２３のプロットＰ３２とが含まれている。

　そして、各時間領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４について、変調信号Ｓ２１の出力と変調信号Ｓ２３の出力との積を計算する。時間領域Ｒ１においては、変調信号Ｓ２１の出力が＋１であり、変調信号Ｓ２３の出力も＋１であるので、これらの積は＋１である。一方、時間領域Ｒ２においては、変調信号Ｓ２１の出力が＋１であり、変調信号Ｓ２３の出力が－１であるので、これらの積は－１である。同様に計算すると、時間領域Ｒ３においては、変調信号Ｓ２１及びＳ２３の出力の積は－１となり、時間領域Ｒ４においては、変調信号Ｓ２１及びＳ２３の出力の積は＋１となる。そして、これら時間領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４における上記積の合計はゼロになる。これは、変調信号Ｓ２１及びＳ２３の間の内積がゼロになることを意味する。したがって、時間領域Ｒ４が経過したタイミングである復調タイミングＴＭ１において、変調信号Ｓ２１及びＳ２３が互いに直交条件を満たすこととなる。

　上述した変調信号Ｓ２１及びＳ２３の関係は、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３のいずれの２つの変調信号の間においても成り立つ。したがって、各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３は、復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…において互いに直交条件を満たす。復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…は、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３の中で、最も低い周波数を有する変調信号Ｓ２１の一周期Ｔ１が経過するタイミング（すなわち、変調信号Ｓ２２の一周期Ｔ２が経過するタイミング）に一致する。このタイミングでは、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３の全てが常に互いに直交条件を満たす。直交条件を満たす変調信号の組み合わせのパターンは、センサ３５の規定フレーム数だけ存在する。本実施形態において、例えば、センサ３５の規定フレーム数が１６である場合、直交条件を満たす変調信号の組み合わせは最大で１６パターン存在する。つまり、規定フレーム数分だけ検出光を同時に検出できる。

　再び、図３を参照する。上述したように、図３の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２２では、復調タイミングＴＭ５以降において励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦになるように設定されており、図３の（ｃ）に示す変調信号Ｓ２３では、復調タイミングＴＭ１以降において励起光Ｌ３の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。各変調信号Ｓ２２及びＳ２３において、各励起光Ｌ２及びＬ３の照射が全てＯＦＦに設定されるタイミングは、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光量の違いに基づいて決定されている。

　検出光Ｌ１１よりも大きい光量を有する検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２２では、検出光Ｌ１１の画像の生成が終了するタイミング（すなわち、規定フレーム数に達するタイミング）よりも前の復調タイミングＴＭ５以降に、励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦに設定されている。検出光Ｌ１２よりも大きい光量を有する検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ２３では、励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦに設定される復調タイミングＴＭ５よりも前の復調タイミングＴＭ１以降に、励起光Ｌ３の照射が全てＯＦＦに設定されている。

　つまり、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３において、励起光の照射がＯＦＦになるタイミングは、当該励起光に対応する検出光の光量が大きいほど、早く到来するように設定されている。検出光の光量が大きいと、当該検出光の画像のＳ／Ｎ比が高くなるので、比較的早いタイミングで当該検出光の画像の変化が小さくなる。このように画像の変化が小さくなれば、画像の更新を繰り返しても、画像の精度が向上する余地は小さいと考えられるので、早いタイミングで励起光の照射がＯＦＦに設定されても、十分な精度の画像が得られる。このため、最も光量の大きい検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３では、最も早い復調タイミングＴＭ１以降、励起光Ｌ１の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。検出光Ｌ１３よりも光量の小さい検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２では、復調タイミングＴＭ１よりも後の復調タイミングＴＭ５以降、励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦになるように設定されている。

　各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像について、画像の変化が小さいか否かの判断は、或る復調タイミングに得られた画像と、当該或る復調タイミングよりも前の復調タイミングに得られた画像とを比較することによって行われる。例えば、検出光Ｌ１２の画像の変化が小さいか否かを判断する際、復調タイミングＴＭ５に得られた検出光Ｌ１２の画像と、復調タイミングＴＭ５の直前の復調タイミングＴＭ４に得られた検出光Ｌ１２の画像との差分値（例えば、コントラストの二乗平均誤差）が所定の閾値よりも小さい場合に、検出光Ｌ１２の画像の変化が十分に小さいと判断してもよい。図３の（ｂ）に示す例では、復調タイミングＴＭ５に得られた検出光Ｌ１２の画像と、復調タイミングＴＭ４に得られた検出光Ｌ１２の画像との変化が小さいと判断され、復調タイミングＴＭ５以降の励起光Ｌ２の照射が全てＯＦＦに設定されている。検出光Ｌ１３の画像についても同様に判断され、図３の（ｃ）に示すように、復調タイミングＴＭ１以降の励起光３の照射が全てＯＦＦに設定されている。

　次に、上述した変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３の一部を変更することにより、図２に示す変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を得る。具体的には、図５に示すように、各変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３において、時間領域ＲＡに含まれるプロットと、時間領域ＲＢに含まれるプロットとを入れ替える変更を行う。時間領域ＲＡは、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３における共通の期間を示している。時間領域ＲＢは、変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３において、時間領域ＲＡとは異なる共通の期間を示している。図５の（ａ）に示すように、変調信号Ｓ２１において、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ１２と、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ１１とを入れ替える。その結果、図２の（ａ）に示すように、時間領域ＲＡにプロットＰ１１が含まれ、且つ時間領域ＲＢにプロットＰ１２が含まれる変調信号Ｓ１が得られる。

　図５の（ｂ）に示すように、変調信号Ｓ２２では、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ２２と、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ２２とが入れ替えられる。ここで、変調信号Ｓ２２において、時間領域ＲＡは、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間に属しているので、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ２２（フレーム）は、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられる。一方、時間領域ＲＢは、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間に属していないので、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ２２（フレーム）は、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられない。このため、入れ替え後の変調信号Ｓ２において、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ２２が、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられるように設定され、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ２２が、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられないように設定される（図２の（ｂ）参照）。つまり、図２の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２において、検出光Ｌ１２の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間ＴＦ２が、時間領域ＲＢを含み且つ時間領域ＲＡを含まない期間に設定される。

　図５の（ｃ）に示すように、変調信号Ｓ２３では、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ３１と、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ３２とが入れ替えられる。その結果、図２の（ｃ）に示すように、時間領域ＲＡにプロットＰ３２が含まれ、且つ時間領域ＲＢにプロットＰ３１が含まれる変調信号Ｓ３が得られる。ここで、図５の（ｃ）に示す変調信号Ｓ２３において、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ３１（フレーム）は、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられる一方、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ３２（フレーム）は、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられない。このため、入れ替え後の変調信号Ｓ３において、時間領域ＲＢに含まれるプロットＰ３１が、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられるように設定され、時間領域ＲＡに含まれるプロットＰ３２が、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられないように設定される（図２の（ｃ）参照）。つまり、図２の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３において、検出光Ｌ１３の画像の生成に用いられるフレームが含まれる期間ＴＦ３が、時間領域ＲＢを含み且つ時間領域ＲＡを含まない期間に設定される。

　以上の過程を経て、図２に示す変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が得られる。変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３は、上記入れ替えの結果、非周期的なパルス信号となる。変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３の時間領域の一部を入れ替える変更を行った場合であっても、入れ替え後の各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３において直交性は維持される。この場合、入れ替え後の変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が直交条件を満たす復調タイミングは、入れ替え前の変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３における復調タイミングＴＭ１、ＴＭ２、…からずれることがある。例えば、入れ替え後の変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が直交条件を満たす復調タイミングは、図２の（ｂ）及び図２の（ｃ）に示すタイミングＴＭになることがあるし、別のタイミングになることもある。このように、入れ替え後の各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を用いた場合であっても、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の直交条件が満たされる復調タイミングで検出信号Ｓの復調処理を行えば、検出信号Ｓを正確に復調できる。入れ替え前の変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３と、入れ替え後の変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３とで、励起光の照射がＯＮになるプロットの総数、及び励起光の照射がＯＦＦになるプロットの総数は変化しないので、ＯＮ／ＯＦＦ比も変化しない。

　続いて、上述した観察装置１を用いて実施される観察方法について説明する。図６は、本実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。

　まず、照射部１０は、互いに異なる波長λ１、λ２、及びλ３を有し、且つ互いに異なる変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３でそれぞれ変調された励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を、試料Ｔに同時に照射する（照射ステップＰ１）。照射ステップＰ１では、変調信号生成部１６は、各励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を変調させる各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する。このとき、変調信号生成部１６は、予め測定した検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光量を示すデータを取得する。そして、変調信号生成部１６は、検出光Ｌ１１よりも大きい光量の検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が、検出光Ｌ１１に対応する変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１よりも低くなるように設定する。変調信号生成部１６は、検出光Ｌ１２よりも大きい光量の検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２よりも更に低くなるように設定する。

　その後、変調信号生成部１６は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を各光源１１、１２、及び１３に出力する。その結果、変調条件Ｍ１で変調された励起光Ｌ１が光源１１から出力され、変調条件Ｍ２で変調された励起光Ｌ２が光源１２から出力され、変調条件Ｍ３で変調された励起光Ｌ３が光源１３から出力される。これら励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、導光光学系２０によって試料Ｔに同時に照射される。

　次に、検出部４０は、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射に伴って試料Ｔから発生した検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を同時に検出する（検出ステップＰ２）。具体的には、試料Ｔから発生した検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３が、導光光学系３０によってセンサ３５に導光される。そして、センサ３５は、検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の光像を示す検出信号Ｓを出力する。

　次に、画像処理部７０は、検出信号Ｓに基づいて検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像をそれぞれ生成する（画像処理ステップＰ３）。具体的には、信号復調部７１が、変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３に基づいて、検出信号Ｓから復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３を復調タイミング毎に復調する。そして、画像生成部７２が、各復調信号Ｓ１１、Ｓ１２、及びＳ１３に基づいて、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の画像を生成する。複数の復調タイミングが設定されている場合、検出光Ｌ１１の画像は、復調タイミング毎に生成される複数の復調信号Ｓ１１を平均処理もしくは加算処理することにより生成されてもよいし、復調タイミング毎に生成されてもよい。同様に、検出光Ｌ１２の画像は、復調タイミング毎に生成される複数の復調信号Ｓ１２を平均処理もしくは加算処理することにより生成されてもよいし、復調タイミング毎に生成されてもよい。同様に、検出光Ｌ１３の画像は、復調タイミング毎に生成される複数の復調信号Ｓ１３を平均処理もしくは加算処理することにより生成されてもよいし、復調タイミング毎に生成されてもよい。

　続いて、図７、図８、図９、及び図１０に示すシミュレーションを参照しながら、上述した観察装置１及び観察方法の作用効果について説明する。図７は、実施例及び比較例のシミュレーション条件を説明するための図である。

　図７に示すように、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の照射に伴って試料Ｔから発生する検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３が順に左右に並んで配置されている。本実施形態と同様、検出光Ｌ１３の光量が最も大きく、検出光Ｌ１２の光量が検出光Ｌ１３の光量よりも小さく、検出光Ｌ１１の光量が最も小さくなっている。例えば、検出光Ｌ１３の光量が２００［光子/フレーム］に設定され、検出光Ｌ１２の光量が１０［光子/フレーム］に設定され、検出光Ｌ１１の光量が２［光子/フレーム］に設定される。

　図８は、比較例のシミュレーション条件を示す図である。図８の（ａ）は、変調信号Ｓ１に対応する変調信号Ｓ１０１を示している。図８の（ｂ）は、変調信号Ｓ２に対応する変調信号Ｓ１０２を示している。図８の（ｃ）は、変調信号Ｓ３に対応する変調信号Ｓ１０３を示している。図８の（ａ）に示す変調信号Ｓ１０１は、変調信号Ｓ１に対応する変調信号Ｓ２１（図５の（ａ）参照）と同一である。したがって、変調信号Ｓ１０１において、励起光Ｌ１の照射がＯＮになるプロットＰ１１１の総数、及び励起光Ｌ１の照射がＯＦＦになるプロットＰ１１２の総数は共に、２０である。したがって、変調信号Ｓ１０１のＯＮ／ＯＦＦ比は、変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１と同一となっている。

　図８の（ｂ）に示す変調信号Ｓ１０２は、変調信号Ｓ２とは異なり、全期間において周期的に変動するパルス信号となっている。変調信号Ｓ１０２において、励起光Ｌ２の照射がＯＮになるプロットＰ１２１の総数、及び励起光Ｌ２の照射がＯＦＦになるプロットＰ１２２の総数は共に、２０である。したがって、変調信号Ｓ１０２のＯＮ／ＯＦＦ比は、変調信号Ｓ１０１のＯＮ／ＯＦＦ比と同一となっている。

　図８の（ｃ）に示す変調信号Ｓ１０３は、変調信号Ｓ３とは異なり、全期間において周期的に変動するパルス信号となっている。変調信号Ｓ１０３において、励起光Ｌ３の照射がＯＮになるプロットＰ１３１の総数は２０であり、励起光Ｌ３の照射がＯＦＦになるプロットＰ１３２の総数は１９である。したがって、変調信号Ｓ１０２のＯＮ／ＯＦＦ比は、変調信号Ｓ１０１のＯＮ／ＯＦＦ比、及び変調信号Ｓ１０２のＯＮ／ＯＦＦ比とそれぞれ略同一となっている。このように、比較例では、変調信号Ｓ１０１、Ｓ１０２、及びＳ１０３のＯＮ／ＯＦＦ比は互いに略同一に設定されている。

　図９は、比較例のシミュレーション結果を示す図である。図９の（ａ）は、変調信号Ｓ１０１に対応する検出光Ｌ１１の画像を示している。図９の（ｂ）は、変調信号Ｓ１０２に対応する検出光Ｌ１２の画像を示している。図９の（ｃ）は、変調信号Ｓ１０３に対応する検出光Ｌ１３の画像を示している。図９の（ａ）及び図９の（ｂ）に示すように、検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像には、大きなショットノイズ成分Ｎ１１３がそれぞれ現れていることが分かる。これは、検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像を生成する際に、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１１３が、検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像の生成に用いられる復調信号Ｓ１１及びＳ１２にそれぞれ重畳したことに起因する。

　本シミュレーションのように、検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との間、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との間に差がある場合、光量の大きい検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１１３が、光量の小さい検出光Ｌ１１及び検出光Ｌ１２の画像にそれぞれ現れる傾向がある（図９の（ａ）及び図９の（ｂ）参照）。更に、本シミュレーションのように、検出光Ｌ１２の光量と、検出光Ｌ１１の光量との間に差がある場合、光量の大きい検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１１２が、光量の小さい検出光Ｌ１１の画像に現れる傾向がある（図９の（ａ）参照）。

　一方、図１０は、実施例のシミュレーション結果を示す図である。実施例では、本実施形態と同じ変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が用いられる。このため、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２は、変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１よりも低く設定され、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３は、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２よりも更に低く設定される。その他の条件は比較例と同じである。図１０の（ａ）は、変調信号Ｓ１に対応する検出光Ｌ１１の画像を示している。図１０の（ｂ）は、変調信号Ｓ２に対応する検出光Ｌ１２の画像を示している。図１０の（ｃ）は、変調信号Ｓ３に対応する検出光Ｌ１３の画像を示している。

　図１０の（ａ）及び図１０の（ｂ）に示すように、比較例と同様、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３が検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像にそれぞれ現れている。しかし、実施例では、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３が、比較例のシミュレーション結果（すなわち、図９の（ａ）及び図９の（ｂ）に示すショットノイズ成分Ｎ１１３）と比べて、大きく低減されていることが分かる。これは、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が、比較例の場合よりも低く設定されたことに起因する。図１０の（ａ）に示すように、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２が、比較例のシミュレーション結果（すなわち、図９の（ａ）に示すショットノイズ成分Ｎ１１２）と比べて、大きく低減されていることが分かる。これは、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が、比較例の場合よりも低く設定されたことに起因する。

　検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３は、一定期間における検出光Ｌ１３の光量の積算値が大きくなるほど大きくなる。この積算値は、検出光Ｌ１３に対応する励起光Ｌ３の照射がＯＮになるＯＮ期間が長くなるほど大きくなる。なぜなら、ＯＮ期間が長くなるほど、検出光Ｌ１３の発光期間が長くなるからである。したがって、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３を低減するためには、励起光Ｌ３のＯＮ期間が短くなるように設定すればよい。検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２についても同様に、一定期間における検出光Ｌ１２の光量の積算値が大きくなるほど大きくなり、この積算値は、検出光Ｌ１２に対応する励起光Ｌ２の照射がＯＮになるＯＮ期間が長くなるほど大きくなる。したがって、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２を低減するためには、励起光Ｌ２のＯＮ期間が短くなるように設定すればよい。

　そこで、本実施形態に係る観察装置１及び観察方法では、検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が、検出光Ｌ１１に対応する変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１、及び、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２のそれぞれよりも、低く設定されている。このように変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３を低く設定すれば、励起光Ｌ３の照射がＯＮになるＯＮ期間を短くできるので、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３（図１０の（ａ）及び図１０の（ｂ）参照）を低減できる。更に、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が、検出光Ｌ１１に対応する変調信号Ｓ１のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ１よりも低く設定されている。このように変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２を低く設定すれば、励起光Ｌ２の照射がＯＮになるＯＮ期間を短くできるので、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２（図１０の（ａ）参照）を低減できる。

　更に、本実施形態に係る観察装置１及び観察方法では、復調タイミングにおいて各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が互いに直交条件を満たすように設定されているので、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を示す検出信号Ｓを正確に復調できる。その結果、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の正確な画像を得ることができる。更に、本実施形態に係る観察装置１及び観察方法は、光源１１、１２、及び１３の制御を行うだけで利用可能であるので、本実施形態に係る観察装置１及び観察方法を既存の装置に容易に導入でき、この導入時の費用対効果も高い。

　本実施形態では、照射部１０は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する変調信号生成部１６を有している。この構成によれば、所望の各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を容易に得ることができる。

　本実施形態では、検出光Ｌ１３は、複数の検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３の中で最も大きい光量を有している。ショットノイズ成分は、光量の大きい検出光から光量の小さい検出光の画像に現れやすく、それらの検出光の光量差が大きくなるほど大きくなる。これに対し、本実施形態に係る観察装置１及び観察方法によれば、光量の最も大きい検出光Ｌ１３のショットノイズ成分が、光量の小さい検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像に現れる事態を抑制できるので、上述した効果を好適に奏する。

　本実施形態では、検出光Ｌ１３と検出光Ｌ１１と検出光Ｌ１２との間の光量の違いに基づいて、検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が設定されている。検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像に現れる検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３は、検出光Ｌ１３と検出光Ｌ１１との間の光量の違い、及び検出光Ｌ１３と検出光Ｌ１２との間の光量の違いに起因して変動する。そこで、これらの光量の違いに基づいて、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が設定されることで、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３を効果的に低減できる。これにより、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３が検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像にそれぞれ現れる事態を効果的に抑制できる。本実施形態では、検出光Ｌ１２と検出光Ｌ１１との間の光量の違いに基づいて、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が設定されている。これにより、上述した検出光Ｌ１３の場合と同様に、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２が検出光Ｌ１１の画像に現れる事態を効果的に抑制できる。

　本実施形態では、検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値に応じて、検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が設定されている。検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像に現れる検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３は、検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２との差の絶対値に応じて大きくなる。そこで、これら絶対値に応じて、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が設定されることで、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３をより効果的に低減できる。これにより、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３が検出光Ｌ１１及びＬ１２の画像にそれぞれ現れる事態をより効果的に抑制できる。本実施形態では、検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値に応じて、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が設定されている。これにより、上述したように、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１２が検出光Ｌ１１の画像に現れる事態をより効果的に抑制できる。

　本実施形態では、検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が大きいほど、検出光Ｌ１３に対応する変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定されている。そして、検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が小さいほど、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定されている。検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が大きい場合に、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が低くなるように設定されることにより、検出光Ｌ１３のショットノイズ成分Ｎ１３の低減効果をより効果的に得ることができる。検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値、及び検出光Ｌ１３の光量と検出光Ｌ１２の光量との差の絶対値が小さい場合に、変調信号Ｓ３のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ３が高くなるように設定されることにより、検出光Ｌ１３の光量をより多く確保できるので、検出光Ｌ１２の画像の精度の低下が抑えられる。本実施形態では、検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値が大きいほど、検出光Ｌ１２に対応する変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が低くなるように設定されている。そして、検出光Ｌ１２の光量と検出光Ｌ１１の光量との差の絶対値が小さいほど、変調信号Ｓ２のＯＮ／ＯＦＦ比ＲＴ２が高くなるように設定されている。これにより、上述した検出光Ｌ１３の場合と同様に、検出光Ｌ１２のショットノイズ成分Ｎ１３の低減効果をより効果的に得つつ、検出光Ｌ１２の画像の精度の低下を抑えることができる。

　以上、本開示の一実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されず、種々の変更を行うことができる。

　図１１は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の第１の変形例を示す図である。図１２は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の第２の変形例を示す図である。図１３は、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の第３の変形例を示す図である。図１１の（ａ）に示す変調信号Ｓ１Ａ、図１２の（ａ）に示す変調信号Ｓ１Ｂ、及び図１３の（ａ）に示す変調信号Ｓ１Ｃは、図２の（ａ）に示す変調信号Ｓ１に対応している。図１１の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２Ａ、図１２の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２Ｂ、及び図１３の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２Ｃは、図２の（ｂ）に示す変調信号Ｓ２に対応している。図１１の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３Ａ、図１２の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３Ｂ、及び図１３の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３Ｃは、図２の（ｃ）に示す変調信号Ｓ３に対応している。

　図１１、図１２、及び図１３に示す変調信号は、上述した実施形態に係る変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３と同様、図３に示す変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３において、共通した期間を示す或る時間領域に含まれるプロット（フレーム）と、別の時間領域に含まれるプロット（フレーム）とを入れ替えることによって得られる。このような入れ替えを行うことによって、図１１、図１２、及び図１３のように、様々なパターンの変調信号を得ることができる。入れ替え後の変調信号のパターンは、図１１、図１２、及び図１３に示す例に限られず、多数存在する。入れ替え後の図１１、図１２、及び図１３に示す変調信号と、入れ替え前の変調信号Ｓ２１、Ｓ２２、及びＳ２３とで、上述したようにＯＮ／ＯＦＦ比は変化しないので、図１１、図１２、及び図１３に示す変調信号のＯＮ／ＯＦＦ比は、上述した実施形態に係る変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３のＯＮ／ＯＦＦ比と同一となる。図１１、図１２、及び図１３のいずれの各変調信号においても、上述した実施形態と同様、直交性が保たれている。したがって、このような形態であっても、上記実施形態と同様の効果が得られる。

　図１４は、観察装置１の変形例を示す概略構成図である。図１４に示す観察装置１Ａでは、照射部１０Ａの変調部１５Ａの構成が、上記実施形態に係る観察装置１とは異なる。すなわち、変調部１５Ａは、変調信号生成部１６及び変調条件設定部１７に代えて、変調信号記憶部１６Ａを有している。変調信号記憶部１６Ａは、各変調条件Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３を有する各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を予め記憶しており、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を各光源１１、１２、及び１３に出力可能に構成されている。図１４に示す観察装置１Ａであっても、上述した実施形態に係る観察装置１と同様の効果が得られる。更に、観察装置１Ａによれば、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する処理を行う必要がないので、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を生成する場合と比べて、処理負担を軽減できる。

　図１５は、観察装置１の別の変形例を示す概略構成図である。図１５に示す観察装置１Ｂは、照射部１０Ｂが光源１１、１２、及び１３に加えて、別の光源１８及び１９を有する点で、上記実施形態に係る観察装置１とは異なる。光源１８は、暗視野照明用の光源であり、波長λ８を有する暗視野照明Ｌ８を出力可能に構成されている。光源１９は、明視野照明用の光源であり、波長λ９を有する明視野照明Ｌ９を出力可能に構成されている。光源１８及び１９として、光源１１、１２、及び１３と同種の光源が用いられてもよい。光源１９は、試料Ｔを挟んで対物レンズ３１と対向する位置に配置されており、試料Ｔの背面から明視野照明Ｌ９を出力する。光源１８は、試料Ｔに対して対物レンズ３１側に配置され、対物レンズ３１の光軸に対して傾斜する方向から暗視野照明Ｌ８を出力する。暗視野照明Ｌ８及び明視野照明Ｌ９のそれぞれは、特定の波長帯域を有する光であってもよいし、ブロードな波長帯域を有する光であってもよい。

　光源１８及び１９は、光源１１、１２、及び１３と同様、変調部１５と電気的に接続されている。変調部１５の変調信号生成部１６は、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３に加えて、変調条件Ｍ８を有する変調信号Ｓ８と、変調条件Ｍ９を有する変調信号Ｓ９とを生成する。変調信号Ｓ８は、光源１８から出力される暗視野照明Ｌ８を時間的に変調させるための変調パターンである。例えば、暗視野照明Ｌ８の照射のＯＮ／ＯＦＦを交互に切り替えるように、暗視野照明Ｌ８を変調条件Ｍ８で変調させる矩形波状のパルス信号である。変調信号Ｓ９は、光源１９から出力される明視野照明Ｌ９を時間的に変調させるための変調パターンである。例えば、明視野照明Ｌ９の照射のＯＮ／ＯＦＦを交互に切り替えるように、明視野照明Ｌ９を変調条件Ｍ９で変調させる矩形波状のパルス信号である。

　光源１８及び１９からそれぞれ出力された暗視野照明Ｌ８及び明視野照明Ｌ９は、導光光学系２０によって導光され、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３と共に、試料Ｔに同時に照射される。明視野照明Ｌ９が試料Ｔに照射されると、試料Ｔを透過した明視野照明Ｌ９の透過光が検出光Ｌ１９として検出部４０に検出される。暗視野照明Ｌ８が試料Ｔに照射されると、試料Ｔにおいて生じる暗視野照明Ｌ８の散乱光が検出光Ｌ１８として検出部４０に検出される。検出部４０のセンサ３５は、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１８、及びＬ１９を同時に検出し、検出信号ＳＢを出力する。そして、画像処理部７０は、変調条件Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、及びＭ９に基づいて検出信号ＳＢを同時に復調することにより、各検出光Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１８、及びＬ１９の画像を生成する。このような形態であっても、上述した実施形態と同様の効果が得られる。

　本開示は、他に様々な変形が可能である。例えば、上述した実施形態及び各変形例を、必要な目的及び効果に応じて互いに組み合わせてもよい。上述した実施形態では、検出光Ｌ１２の光量が検出光Ｌ１１の光量よりも大きくなっている場合を説明した。しかし、検出光Ｌ１１及びＬ１２の光量は互いに同一であってもよい。上述した実施形態では、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３が非周期的なパルス信号である例を説明した。しかし、各変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３は、周期的なパルス信号であってもよい。

　上述した実施形態では、３つの励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を試料Ｔに照射し、３つの検出光Ｌ１１、Ｌ１２、及びＬ１３を検出する場合を説明した。しかし、励起光の数、及び検出光の数は、適宜変更可能である。励起光の数、及び検出光の数はそれぞれ、２つであってもよいし、４つ以上であってもよい。励起光を変調させる変調信号の変調条件の設定は、上述した実施形態及び各変形例に限られず、適宜変更可能である。

　上述した実施形態では、光源１１、１２、及び１３が導光光学系２０に直接設置される場合を説明した。しかし、光源１１、１２、及び１３は、装置外部に配置され、光ファイバ等を介して導光光学系２０に光学的に接続される構成であってもよい。照射部１０は、光源１１、１２、及び１３に代えて、多波長の励起光を出力可能な１つの光源を有してもよい。この場合は、当該１つの光源は、互いに異なる波長を有する励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を同時に出力する。

　上述した実施形態では、変調部１５が、変調信号Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３を用いて光源１１、１２、及び１３を制御することによって、励起光Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を変調する場合を説明した。しかし、変調部による励起光の変調方法は上述した例に限られない。例えば、変調部は、励起光を機械的に変調させるオプティカルチョッパーであってもよい。この場合、各光源に対応して各オプティカルチョッパーが設置され、各オプティカルチョッパーによる各励起光の通過又は遮断の繰り返しによって各励起光が時間的に変調されてもよい。オプティカルチョッパーによる励起光の変調パターンは、上述した変調信号に応じたものとなるように設定される。この場合、オプティカルチョッパーは、その変調パターンに従って励起光の照射のＯＮ／ＯＦＦが切り替えられるように、励起光を変調する。

　変調部は、ＤＭＤ（Digital Micro mirror Device）又は空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial light modulator）等の光学的変調デバイスであってもよい。この場合、各光源に対応して各光学的変調デバイスが設置され、各光学的変調デバイスに各変調パターンが表示される。これにより、各光源からの各励起光が時間的に変調される。各変調パターンは、上述した変調信号に応じたものとなるように設定される。この場合、光学的変調デバイスは、その変調パターンに従って励起光の照射のＯＮ／ＯＦＦが切り替えられるように、励起光を変調する。

　１，１Ａ，１Ｂ…観察装置、１０，１０Ａ，１０Ｂ…照射部、１６…変調信号生成部（生成部）、１６Ａ…変調信号記憶部（記憶部）、４０…検出部、７０…画像処理部、Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３…励起光、Ｌ１１，Ｌ１２、Ｌ１３…検出光、Ｌ１８，Ｌ１９…検出光、Ｓ、ＳＢ…検出信号、Ｓ１，Ｓ１Ａ，Ｓ１Ｂ，Ｓ１Ｃ，Ｓ２，Ｓ２Ａ，Ｓ２Ｂ，Ｓ２Ｃ，Ｓ３，Ｓ３Ａ，Ｓ３Ｂ，Ｓ３Ｃ，Ｓ８，Ｓ９…変調信号（変調パターン）、Ｔ…試料（観察対象物）。

Claims

　互いに異なる波長を有すると共に、互いに異なる変調条件による複数の変調パターンでそれぞれ変調された複数の励起光を、観察対象物に同時に照射する照射部と、
　前記複数の励起光の照射に伴う前記観察対象物からの複数の検出光を検出信号として検出する検出部と、
　前記検出信号を復調することにより、前記複数の検出光の画像を前記検出光毎に生成する画像処理部と、を備え、
　前記複数の検出光は、第１の検出光と、前記第１の検出光よりも小さい光量を有する第２の検出光と、を含み、
　各前記変調パターンは、前記励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間と前記励起光の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが切り替わるように前記励起光を変調させる変調パターンであり、前記検出信号が復調される復調タイミングにおいて互いに直交条件を満たすように設定されており、
　前記ＯＦＦ期間に対する前記ＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比として表した場合に、前記第１の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比は、前記第２の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている、観察装置。
　前記照射部は、前記複数の変調パターンを記憶する記憶部を有する、請求項１に記載の観察装置。
　前記照射部は、前記複数の変調パターンを生成する生成部を有する、請求項１に記載の観察装置。
　前記第１の検出光は、前記複数の検出光の中で最も大きい光量を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の観察装置。
　前記第１の検出光と前記第２の検出光との間の光量の違いに基づいて、前記第１の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比が設定されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の観察装置。
　前記第１の検出光の光量と前記第２の検出光の光量との差の絶対値に応じて、前記第１の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比が設定されている、請求項５に記載の観察装置。
　互いに異なる波長を有すると共に、互いに異なる変調条件による複数の変調パターンでそれぞれ変調された複数の励起光を、観察対象物に同時に照射するステップと、
　前記複数の励起光の照射に伴う前記観察対象物からの複数の検出光を検出信号として検出するステップと、
　前記検出信号を復調することにより、前記複数の検出光の画像を前記検出光毎に生成するステップと、を備え、
　前記複数の検出光は、第１の検出光と、前記第１の検出光よりも小さい光量を有する第２の検出光と、を含み、
　各前記変調パターンは、前記励起光の照射がＯＮになるＯＮ期間と前記励起光の照射がＯＦＦになるＯＦＦ期間とが切り替わるように前記励起光を変調させる変調パターンであり、前記検出信号が復調される復調タイミングにおいて互いに直交条件を満たすように設定されており、
　前記ＯＦＦ期間に対する前記ＯＮ期間の比をＯＮ／ＯＦＦ比として表した場合に、前記第１の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比は、前記第２の検出光に対応する前記変調パターンの前記ＯＮ／ＯＦＦ比よりも低く設定されている、観察方法。