JP2002267934A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】複雑な特性で高価な光学部品を削減して、安価
で高性能に複数の波長域の蛍光画像を取得する。 【解決手段】標本２から発せられた波長域λ１’、λ
２’の蛍光と標本２からの励起光波長λ１、λ２のレー
ザ光の反射光とのうち励起光波長λ１のレーザ光を遮断
し、かつ波長域λ１’、λ２’の蛍光を透過する光学フ
ィルタ１１を、励起光波長λ２のレーザ光と波長域λ
１’の蛍光とを反射し、かつ波長域λ２’の蛍光を透過
する分光フィルタ１４の前方側に配置し、この分光フィ
ルタ１４により分離された励起光波長λ２のレーザ光及
び波長域λ１’の蛍光と、波長域λ２’の蛍光とをそれ
ぞれ各バリアフィルタ１７、２１により制限して各光検
出器１８、２２に入射する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多重染色された標
本を複数のスペクトル領域の励起光により露光し、標本
から発する複数の波長域の蛍光を検出して標本の画像を
取得するレーザ顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】かかるレーザ顕微鏡では、多重染色され
た標本を複数のスペクトル領域の励起光により露光し、
標本から発する複数の波長域の蛍光を検出器で検出する
が、この検出器で検出される蛍光の光強度は、励起光の
光強度に比べて微量であるため励起光の反射光が微量で
あっても蛍光の検出ノイズとなっていた。

【０００３】このように励起光の反射光が微量光強度で
も蛍光を検出するための検出ノイズとなるが、励起光の
波長とその蛍光波長とは波長が異なるので、その対策の
一つとして励起光を透過せず、蛍光だけを透過させるよ
うに設計した波長選択フィルタを使用している。この波
長選択フィルタを使用することにより、標本に励起光を
導いて照射し、これにより励起された蛍光を検出器に導
きその光量を検出し、その検出信号を演算装置により演
算処理して観察画像を形成している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、励起光
の光強度が大きいために、途中の光路や標本からの励起
光の光強度（反射強度）が大きく、波長選択の性能に十
分注意する必要がある。励起光の反射強度は、大きく検
出ノイズとして無視できないため、例えば検出器の前方
に配置する波長選択フィルタには、励起光の透過率を充
分に小さくなるように設計、製造されたものを使用して
いる。２波長励起２波長蛍光観察では、検出器の前に配
置する波長選択フィルタは励起光の２波長とも殆ど完全
に遮断し、かつ観察蛍光波長を最大限透過するように設
計しなければならない。４波長励起４波長蛍光観察で
は、該波長選択フィルタの製造は技術的に難易度も高
く、製造も困難となり、高価なものとなってしまう。

【０００５】このため、多重染色された標本を複数のス
ペクトル領域の励起光により露光し、標本から発せられ
る複数の波長域の蛍光を検出しようとした場合、複数の
波長別の複数のチャンネルを持った装置や、多くの蛍光
色素別に励起される複数の蛍光に対応した各波長別の複
数の波長選択フィルタが必要になり、これらを全て満足
する装置を構成することは困難である。

【０００６】そこで本発明は、高価な光学部品を削減し
て、安価で高性能に複数の波長域の蛍光画像を取得でき
るレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１記載による本発
明は、多重染色された標本を複数のスペクトル域の励起
光により励起し、前記標本から発せられる複数のスペク
トル域の蛍光を検出器で検出して前記標本の画像を取得
するレーザ顕微鏡において、前記複数のスペクトル域の
励起光から検出したい蛍光に対応する励起光のスペクト
ル域を選択的に導くための選択手段と、この選択手段で
選択的に前記標本に導かれた励起光を照射したときに、
前記標本側から前記検出器側に向かって発せられる光の
うち、少なくとも短波長側の励起光のスペクトル域を除
去し、かつ前記標本側からの光を透過する分光特性を有
した光学フィルタと、この光学フィルタを切り替え可能
な光学フィルタ切替え手段と、前記選択手段により選択
的に前記標本に導かれた励起光に対応して前記光学フィ
ルタ切替え手段を制御する制御手段と、前記光学フィル
タを透過したスペクトル域の光を少なくとも２つ以上の
検出したい前記蛍光のスペクトル域の検出光路にそれぞ
れ分離するスペクトル分離手段と、このスペクトル分離
手段により分離された前記２つ以上の検出器にそれぞれ
設けられ、各検出光路で検出したい前記蛍光のスペクト
ル域のみを透過するバリアフィルタと、このバリアフィ
ルタを透過したスペクトル域の前記標本からの蛍光をそ
れぞれ検出する光検出器とを具備したことを特徴とする
レーザ顕微鏡である。

【０００８】請求項２記載による本発明は、請求項１記
載のレーザ顕微鏡において、前記光学フィルタは、ロー
カットフィルタであることを特徴とする。

【０００９】請求項３記載による本発明は、請求項１記
載のレーザ顕微鏡において、前記光学フィルタは、ロー
パスフィルタであることを特徴とする。

【００１０】請求項４記載による本発明は、請求項１記
載のレーザ顕微鏡において、前記光学フィルタは、前記
光検出器の前に配置されたパンドパスフィルタとを組み
合わせて、光検出器に所望のスペクトル域の蛍光を導く
ことを特徴とする。

【００１１】請求項５記載による本発明は、多重染色さ
れた標本を複数のスペクトル域の励起光により励起し、
前記標本から発せられる複数のスペクトル域の蛍光を検
出器で検出して前記標本の画像を取得するレーザ顕微鏡
において、１光子励起観察用の１光子励起光を発する第
１の光源と、２光子励起観察用の２光子励起光を発する
第２の光源と、これら第１、第２の光源からの前記複数
の励起光から検出したい蛍光に対応する励起光のスペク
トル域を選択的に前記標本に導くための選択手段と、こ
の選択手段で選択的に前記標本に導かれる前記第１の光
源からの１光子励起光により前記標本から発せられる光
のうち、少なくとも短波長側の励起光のスペクトル域を
除去した前記標本からの光を透過するローカットフィル
タと、前記選択手段で選択的に前記標本に導かれる前記
第２の光源からの２光子励起光により前記標本から発せ
られる光のうち、少なくとも短波長側の励起光のスペク
トル域を除去した前記標本からの光を透過するローパス
フィルタと、前記ローカットフィルタを切り替え可能な
第１の光学フィルタ切替え手段と、前記ローパスフィル
タを切り替え可能な第２の光学フィルタ切替え手段と、
前記選択手段により選択的に前記標本に導かれる前記第
１、第２の光源からの励起光に対応して前記第１、第２
の光学フィルタ切替え手段を制御する制御手段と、前記
光学フィルタを透過したスペクトル域の光を少なくとも
２つ以上の検出したい蛍光のカペクトル域の検出光路に
それぞれ分離するスペクトル分離手段と、このスペクト
ル分離手段により分離された前記２つ以上の検出光路に
それぞれ設けられ、各検出光路で検出したい蛍光のスペ
クトル域のみを透過するバリアフィルタと、このバリア
フィルタを透過したスペクトル域の前記標本からの蛍光
をそれぞれ検出する光検出器とを具備したことを特徴と
するレーザ顕微鏡である。

【００１２】請求項６記載による本発明は、請求項５記
載のレーザ顕微鏡において、前記制御手段は、前記第
１、第２の光源からの１光子励起光と２光子励起光とと
が同時に前記標本に導かれる場合、前記第１、第２の光
学フィルタ切替え手段を制御して、光路中に前記ローカ
ットフィルタとローパスフィルタとを挿入させることを
特徴とする。

【００１３】

【発明の実施の形態】（１）以下、本発明の第１の実施
の形態について図面を参照して説明する。

【００１４】図１は本発明のレーザ顕微鏡を適用した走
査型光学顕微鏡の構成図である。１光子光源としてのレ
ーザ光源１ａ、１ｂは、多重染色された標本２の励起に
必要な複数の異なる励起光波長、例えば励起光波長λ
１、λ２（λ１＜λ２）のレーザ光をそれぞれ出力する
ものである。標本２が２重染色の場合、これらレーザ光
源１ａ、１ｂの出力光路上にそれぞれシャッタ３ａ、３
ｂを配置し、このうちシャッタ３ａを通るレーザ光源１
ａの出力光路上にミラー４を配置し、波長合成用のダイ
クロイックミラー５により各レーザ光源１ａ、１ｂから
出力された各レーザ光を同一光軸に合成して走査型光学
顕微鏡本体Ａに直接導くようになっている。

【００１５】なお、走査型光学顕微鏡本体Ａにレーザ光
を導く方法は、上記の如く直接導く方法の他に、シング
ルモードファイバに集光レンズとコリメータレンズとを
組み合わせて導入してもよい。

【００１６】走査型光学顕微鏡本体Ａ内には、励起ダイ
クロイックミラー６が配置され、合成されたレーザ光
は、励起ダイクロイックミラー６により反射され、互い
に直交する２つの偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、対物レ
ンズ８を通して標本２を走査照射して励起するものとな
っている。

【００１７】励起ダイクロイックミラー６は、合成され
たレーザ光を反射し、かつ標本２から発せられる波長域
λ１’、λ２’の蛍光及び励起光波長λ１、λ２のレー
ザ光の反射光（波長λ１、λ２）を透過する特性を持っ
ている。この励起ダイクロイックミラー６は、図２に示
すように回転可能な円盤９上の円周上に複数設けられ、
モータ１０の駆動によりレーザ光の励起光波長及び蛍光
波長に応じた励起ダイクロイックミラー６が選択的に切
り替えられて光路に挿脱されるものとなっている。

【００１８】この励起ダイクロイックミラー６の透過光
路上には、光学フィルタ１１が挿入されている。この光
学フィルタ１１は、標本２からの波長域λ１’、λ２’
の蛍光及び励起光波長λ１、λ２のレーザ光のうち最も
短波長側の励起光波長λ１のレーザ光を遮断し、かつ励
起光波長λ２のレーザ光及び波長域λ１’、λ２’の蛍
光を透過する特性を持っている。なお、励起光波長λ
１、λ２と波長域λ１’、λ２’との波長の長さの関係
は、λ１＜λ１’＜λ２＜λ２’である。この光学フィ
ルタ１１は、図３に示すように光軸上に対して挿脱可能
な移動体１２に複数設けられ、モータ１３の駆動により
レーザ光の励起光波長λ２及び蛍光の波長域λ１’、λ
２’に応じた光学フィルタ１１が選択的に切り替えられ
て光路に挿脱されるものとなっている。

【００１９】この光学フィルタ１１の透過光路上には、
分光フィルタ１４が配置されている。この分光フィルタ
１４は、光学フィルタ１１を透過した励起光波長λ２の
レーザ光と波長域λ１’、λ２’の蛍光のうち励起光波
長λ２のレーザ光と波長域λ１’の蛍光とを反射し、か
つ波長域λ２’の蛍光を透過してそれぞれの波長に分離
するスペクトル分離手段としての分光透過特性を持って
いる。

【００２０】この分光フィルタ１４の反射光路上には、
集光レンズ１５、共焦点開口１６、バリアフィルタ１７
を介して光検出器１８が配置され、かつ透過光路上に
は、集光レンズ１９、共焦点開口２０、バリアフィルタ
２１を介して光検出器２２が配置されている。

【００２１】このうちバリアフィルタ１７及び２１は、
分光フィルタ１４により分離された波長域λ１’、λ
２’の各蛍光をそれぞれ制限するもので、一方のバリア
フィルタ１７は励起光波長λ２のレーザ光を透過させず
に波長域λ１’の蛍光を透過させる特性を有し、他方の
バリアフィルタ２１は波長域λ２’の蛍光のみを透過さ
せる特性を有している。

【００２２】ここで、光学フィルタ１１、分光フィルタ
１４及び各バリアフィルタ１７、２１の波長特性につい
て図４を参照して説明する。同図に示す波長特性は縦軸
に分光透過率Ｔ、横軸に波長λを取っている。光学フィ
ルタ１１の波長特性は、励起光波長λ１の波長だけを例
えば透過率０．０１％以下に設定し、それ以外の検出す
べき波長域λ１’、λ２’の蛍光の透過率を例えば８０
％以上で製造できうる最大限に設定されている。このと
きのバリアフィルタ１７の特性は、波長域λ１’の蛍光
の透過率を最大限にして、励起光波長λ２のレーザ光の
透過率を例えば０．０１％以下に設定されている。バリ
アフィルタ２１の特性は、波長域λ１’の蛍光の透過率
にはそれほど注意はしないが、励起光波長λ２のレーザ
光の透過率を例えば０．０１％以下に設定し、波長域λ
２’の蛍光の透過率を例えば８０％以上で製造できうる
最大限に設定されている。

【００２３】これら光学フィルタ１１、分光フィルタ１
４及び各バリアフィルタ１７、２１の構成は、１枚の基
板上に形成してもよいし、複数の基板に形成した波長特
性の異なる基板を組み合わせることによっても可能であ
る。具体的な励起波長、蛍光中心波長は、例えばλ１＝
３５１ｎｍ、λ２＝５４３ｎｍ、λ１’＝４４２ｎｍ、
λ２’＝５９０ｎｍの組み合わせである。

【００２４】画像形成装置２３は、標本２の２重染色観
察を行うための画像を作像するためのソフトウエアを有
し、このソフトウエアを実行することにより両光検出器
１８、２２から出力される各蛍光強度信号を入力して蓄
積し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同期
して図示しない直交座標上に配置された２枚の２次元画
像を形成し、これら画像を合成して２重染色観察を行う
ための合成画像を作像し、これら画像を表示装置に表示
したり、印刷装置等により印刷出力する機能を有してい
る。

【００２５】又、画像形成装置２３は、各偏向素子７
ｘ、７ｙなどにより各レーザ光を標本２の厚さ方向に一
定間隔で送りながら走査してその画像を取得し、この画
像を用いて標本２の３次元画像を構築したり、２画面像
を連続又は間欠に取得して時間経過観察、解析を行う機
能を有している。

【００２６】又、画像形成装置２３は、シャッタ３ａ、
３ｂを開閉動作する機能と、励起ダイクロイックミラー
６を選択するためのモータ１０を駆動制御する機能と、
光学フィルタ１１を選択するためのモータ１３を駆動制
御する機能と、各偏向素子７ｘ、７ｙを駆動制御する機
能などを有している。

【００２７】次に、上記の如く構成された走査型光学顕
微鏡の作用について説明する。

【００２８】各レーザ光源１ａ、１ｂは、多重染色され
た標本２の励起に必要な複数の異なる励起光波長、例え
ば励起光波長λ１、λ２のレーザ光をそれぞれ出力す
る。これらレーザ光は、波長合成用のダイクロイックミ
ラー５により同一光軸に合成され、走査型光学顕微鏡本
体Ａに直接導かれる。

【００２９】この合成されたレーザ光は、励起ダイクロ
イックミラー６により反射され、互いに直交する２つの
偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、対物レンズ８を通して標
本２に走査照射して励起する。

【００３０】この励起された標本２から発せられた波長
域λ１’、λ２’の蛍光と標本２からの励起光波長λ
１、λ２のレーザ光の反射光とは、同時に戻り光として
再び、各偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、励起ダイクロイ
ックミラー６を透過し、光学フィルタ１１に入射する。

【００３１】この光学フィルタ１１では、標本２からの
波長域λ１’、λ２’の蛍光及び励起光波長λ１、λ２
のレーザ光のうち最も短波長側の励起光波長λ１のレー
ザ光を遮断し、かつ励起光波長λ２のレーザ光及び波長
域λ１’、λ２’の蛍光が透過し、これらが分光フィル
タ１４に入射する。

【００３２】この分光フィルタ１４では、光学フィルタ
１１を透過した励起光波長λ２のレーザ光と波長域λ
１’、λ２’の蛍光のうち励起光波長λ２のレーザ光と
波長域λ１’の蛍光とを反射し、かつ波長域λ２’の蛍
光を透過する。

【００３３】このうち分光フィルタ１４で反射した励起
光波長λ２のレーザ光と波長域λ１’の蛍光とは、集光
レンズ１５から共焦点開口１６を介してバリアフィルタ
１７に入射する。このバリアフィルタ１７では励起光波
長λ２のレーザ光を透過させずに波長域λ１’の蛍光を
透過させるので、この波長域λ１’の蛍光が光検出器１
８に入射する。

【００３４】これと共に、分光フィルタ１４を透過した
波長域λ２’の蛍光は、集光レンズ１９から共焦点開口
２０を介してバリアフィルタ２１に入射する。このバリ
アフィルタ２１では波長域λ２’の蛍光のみを透過させ
るので、この波長域λ２’の蛍光が光検出器２２に入射
する。

【００３５】このうち一方の光検出器１８は、波長域λ
１’の蛍光を受光し、その蛍光強度信号を出力する。他
方の光検出器２２は、波長域λ２’の蛍光を受光し、そ
の蛍光強度信号を出力する。

【００３６】画像形成装置２３は、各光検出器１８、２
２から出力された各蛍光強度信号を入力して蓄積し、そ
れぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同期して図示
しない直交座標上に配置された２枚の２次元画像を形成
し、これら画像を合成して２重染色観察を行うための合
成画像を作像し、これら画像を不図示の表示装置に表示
したり、印刷装置等により印刷出力する機能を有してい
る。

【００３７】そして、画像形成装置２３は、各偏向素子
７ｘ、７ｙなどにより各レーザ光を標本２の厚さ方向に
一定間隔で送りながら走査してその画像を取得し、この
画像を用いて標本２の３次元画像を構築したり、２画面
像を連続又は間欠に取得して時間経過観察、解析を行
う。

【００３８】このように上記第１の実施の形態において
は、標本２から発せられた波長域λ１’、λ２’の蛍光
と標本２からの励起光波長λ１、λ２のレーザ光の反射
光とのうち励起光波長λ１のレーザ光を遮断し、かつ波
長域λ１’、λ２’の蛍光を透過する光学フィルタ１１
を、励起光波長λ２のレーザ光と波長域λ１’の蛍光と
を反射し、かつ波長域λ２’の蛍光を透過する分光フィ
ルタ１４の前方側に配置し、この分光フィルタ１４によ
り分離された励起光波長λ２のレーザ光及び波長域λ
１’の蛍光と、波長域λ２’の蛍光とをそれぞれ各バリ
アフィルタ１７、２１により制限して各光検出器１８、
２２に入射するようにしたので、各バリアフィルタ１
７、２１の透過率特性を単純化でき、これらバリアフィ
ルタ１７、２１の特性の設計が容易となり、その性能が
安定化できると共に、その製造も経済的にかつ容易にで
きる。

【００３９】従って、複雑な特性で高価な光学部品を削
減でき、小型化が可能で、安価で高性能に波長域λ
１’、λ２’の蛍光画像を取得できる。

【００４０】特に励起光を遮断する光学フィルタ１１の
設計においては、励起光波長の透過率を例えば０．０１
％にすることが要求されるが、一つのフィルタにいくつ
もの遮断性能を要求するような設計が困難であるので、
かかる走査型光学顕微鏡では、使用する多数のダイクロ
イックフィルタの分光特性の設計を単純化でき、製造上
も容易になり、性能も向上できる。

【００４１】（２）次に、本発明の第２の実施の形態に
ついて図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分
には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

【００４２】図５は２光子励起観察を行うための走査型
光学顕微鏡の構成図である。２光子励起用の光源として
のレーザ光源３０ａ、３０ｂは、標本２を２光子励起に
必要な複数の異なる励起光波長、例えば励起光波長λ
３、λ４（λ３＜λ４）の極超短パルスレーザ光をそれ
ぞれ出力するものである。シャッタ３ｂを通るレーザ光
源３０ｂから出力された極超短パルスレーザ光と、シャ
ッタ３ａを通りミラー４で反射されたレーザ光源３０ａ
からの極超短パルスレーザ光とは、波長合成用のダイク
ロイックミラー３１により同一光軸に合成されて走査型
光学顕微鏡本体Ａに直接導かれるようになっている。

【００４３】走査型光学顕微鏡本体Ａ内には、ダイクロ
イックミラー３２が配置され、合成された極超短パルス
レーザ光はダイクロイックミラー３２により反射され、
２つの偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、対物レンズ８を通
して標本２に走査照射して２光子励起するものとなって
いる。

【００４４】励起ダイクロイックミラー３２は、合成さ
れた極超短パルスレーザ光を反射し、かつ標本２から発
せられる２光子励起による波長域λ３’、λ４’の蛍光
及び励起光波長λ３、λ４の極超短パルスレーザ光の反
射光（波長λ３、λ４）を大きく減衰して透過する特性
を持っている。

【００４５】この励起ダイクロイックミラー３２の透過
光路上には、光学フィルタ系であるバリアフィルタ３３
が挿入されている。このバリアフィルタ３３は、標本２
からの２光子励起による波長域λ３’、λ４’の蛍光及
び励起光波長λ３、λ４の極超短パルスレーザ光のう
ち、波長域λ３’、λ４’の蛍光のみを透過する特性を
持っている。具体的にバリアフィルタ３３は、図６に示
すように励起光波長λ３よりも短波長での透過率ができ
るだけ高く、かつ励起光波長λ３以上の透過率を例えば
０．０１％以下になるように設計、製造されたもので、
波長域λ３’、λ４’の蛍光のみが透過する分光特性を
持っている。

【００４６】このバリアフィルタ３３の分光透過率Ｔの
フィルタ特性について図６を参照して説明する。具体的
な励起波長、蛍光中心波長、分光波長は、例えばλ３＝
９８０ｎｍ、λ４＝１０６３ｎｍ、λ３’＝５２０ｎ
ｍ、λ４’＝５９０ｎｍ、λｓ＝５６０ｎｍである。こ
のバリアフィルタ３３の特徴は、励起波長λ３、λ４の
うち短波長側より長い波長の透過率を例えば０．０１％
以下にし、かつ励起波長λ３より短波長側の透過率をで
きるだけ高くなるように単純に設計したものである。こ
のバリアフィルタ３３の構成は、１枚の基板上に形成し
てもよいし、複数の基板に形成した波長特性の異なる基
板を組み合わせることによっても可能である。

【００４７】このバリアフィルタ３３の透過光路上に
は、スペクトル分離手段としての分光ダイクロイックミ
ラー３４が配置されている。この分光ダイクロイックミ
ラー３４は、図６に示す点線のように取得すべき波長に
応じて適当な波長λｓを境とし、この境以下の波長の光
を反射し、かつそれ以上の波長の光を透過する特性を有
している。従って、この分光ダイクロイックミラー３４
は、波長λｓ以下となる波長域λ３’の蛍光を反射し、
波長λｓ以上となる波長域λ４’の蛍光を透過するもの
となる。

【００４８】この分光ダイクロイックミラー３４の反射
光路上には、集光レンズ１５、共焦点開口１６、バンド
パスフィルタ３５を介して光検出器１８が配置され、か
つ透過光路上には、集光レンズ１９、共焦点開口２０、
バンドパスフィルタ３６を介して光検出器２２が配置さ
れている。

【００４９】このうち一方のバンドパスフィルタ３５は
波長域λ３’の蛍光のみを透過し、他方のバンドパスフ
ィルタ３６は波長域λ４’の蛍光のみを透過する特性を
有している。

【００５０】画像形成装置３７は、標本２の２光子励起
観察を行うための画像を作像するためのソフトウエアを
有し、このソフトウエアを実行することにより両光検出
器１８、２２から出力される各蛍光強度信号を入力して
蓄積し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同
期して図示しない直交座標上に配置された２枚の２次元
画像を形成し、これら画像を合成して２光子励起観察を
行うための合成画像を作像し、これら画像を不図示の表
示装置に表示したり、印刷装置等により印刷出力する機
能を有している。

【００５１】又、画像形成装置３７は、各偏向素子７
ｘ、７ｙなどにより各レーザ光を標本２の厚さ方向に一
定間隔で送りながら走査してその画像を取得し、この画
像を用いて標本２の３次元画像を構築したり、２画面像
を連続又は間欠に取得して時間経過観察、解析を行う機
能を有している。

【００５２】又、画像形成装置３７は、シャッタ３ａ、
３ｂを開閉動作する機能と、ダイクロイックミラー３２
を選択するためのモータ１０を駆動制御する機能と、バ
リアフィルタ３３を選択するためのモータ１３を駆動制
御する機能と、各偏向素子７ｘ、７ｙを駆動制御する機
能などを有している。

【００５３】次に、上記の如く構成された走査型光学顕
微鏡の作用について説明する。

【００５４】各レーザ光源３０ａ、３０ｂは、標本２の
２光子励起に必要な励起光波長λ３、λ４の極超短パル
スレーザ光をそれぞれ出力する。これら極超短パルスレ
ーザ光は、波長合成用のダイクロイックミラー３１によ
り同一光軸に合成され、走査型光学顕微鏡本体Ａに直接
導かれる。

【００５５】この合成された極超短パルスレーザ光は、
励起ダイクロイックミラー３２により反射され、互いに
直交する２つの偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、対物レン
ズ８を通して標本２に走査照射して２光子励起する。

【００５６】この２光子励起された標本２から発せられ
た波長域λ３’、λ４’の蛍光と標本２からの励起光波
長λ３、λ４のレーザ光の反射光とは、同時に戻り光と
して再び、各偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、ダイクロイ
ックミラー３２を透過し、バリアフィルタ３３に入射す
る。

【００５７】このバリアフィルタ３３では、標本２から
の２光子励起による波長域λ３’、λ４’の蛍光及び励
起光波長λ３、λ４の極超短パルスレーザ光のうち波長
域λ３’、λ４’の蛍光のみが透過し、分光ダイクロイ
ックミラー３４に入射する。

【００５８】この分光ダイクロイックミラー３４では、
図６の点線に示すように取得すべき波長に応じて適当な
波長λｓを境とし、この境以下の波長の光すなわち波長
域λ３’の蛍光を反射し、かつそれ以上の波長の光すな
わち波長域λ４’の蛍光を透過する。

【００５９】このうち分光ダイクロイックミラー３４で
反射した波長域λ３’の蛍光は、集光レンズ１５から共
焦点開口１６を介してバンドパスフィルタ３５に入射す
る。このバンドパスフィルタ３５は波長域λ３’の蛍光
のみを透過させるので、この波長域λ３’の蛍光が光検
出器１８に入射する。

【００６０】これと共に、分光ダイクロイックミラー３
４を透過した波長域λ４’の蛍光は、集光レンズ１９か
ら共焦点開口２０を介してバンドパスフィルタ３６に入
射する。このバンドパスフィルタ３６は波長域λ４’の
蛍光のみを透過させるので、この波長域λ４’の蛍光が
光検出器２２に入射する。

【００６１】一方の光検出器１８は、波長域λ３’の蛍
光を受光し、その蛍光強度信号を出力する。他方の光検
出器２２は、波長域λ４’の蛍光を受光し、その蛍光強
度信号を出力する。

【００６２】画像形成装置３７は、各光検出器１８、２
２から出力される各蛍光強度信号を入力して蓄積し、そ
れぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同期して図示
しない直交座標上に配置された２枚の２次元画像を形成
し、これら画像を合成して２光子励起観察を行うための
合成画像を作像し、これら画像を不図示の表示装置に表
示したり、印刷装置等により印刷出力する。

【００６３】又、画像形成装置３７は、各偏向素子７
ｘ、７ｙなどにより各レーザ光を標本２の厚さ方向に一
定間隔で送りながら走査してその画像を取得し、この画
像を用いて標本２の３次元画像を構築したり、２画面像
を連続又は間欠に取得して時間経過観察、解析を行う。

【００６４】このように上記第２の実施の形態によれ
ば、２光子励起観察を行うための走査型光学顕微鏡にお
いて、標本２からの２光子励起による波長域λ３’、λ
４’の蛍光及び励起光波長λ３、λ４の極超短パルスレ
ーザ光のうち波長域λ３’、λ４’の蛍光のみを透過す
るバリアフィルタ３３を、波長λｓ以下となる波長域λ
３’の蛍光を反射し、波長λｓ以上となる波長域λ４’
の蛍光を透過する分光ダイクロイックミラー３４の前方
側に配置することにより、上記第１の実施の形態と同様
の効果を奏することができる。

【００６５】又、コンフォーカルレンズの前にバリアフ
ィルタ３３を配置することにより、フィルタの着脱、差
し替え等による光学的影響が少なくなる。

【００６６】（３）次に、本発明の第３の実施の形態に
ついて図面を参照して説明する。なお、図１及び図５と
同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略す
る。

【００６７】図７は２重染色観察と２光子励起観察とを
行うための走査型光学顕微鏡の構成図である。具体的に
は、上記第１と第２の実施の形態の各走査型光学顕微鏡
を組み合わせた構成である。

【００６８】レーザ光源１ａ，１ｂからそれぞれ出力さ
れる多重染色された標本２の励起に必要な励起光波長λ
１、λ２の各レーザ光は、上記の如く波長合成用のダイ
クロイックミラー５において同一光軸に合成されて走査
型光学顕微鏡本体Ａに導かれる。又、レーザ光源３０
ａ，３０ｂからそれぞれ出力される標本２の２光子励起
に必要な励起光波長λ３、λ４の各極超短パルスレーザ
光は、波長合成用のダイクロイックミラー３１により同
一光軸に合成され、走査型光学顕微鏡本体Ａに導かれ
る。

【００６９】これら励起光波長λ１、λ２の各レーザ光
と励起光波長λ３、λ４の各極超短パルスレーザ光と
は、互いに光軸、傾きが同一になるように調整されてい
る。なお、４ａ，４ｂはミラーであり、４ｃはダイクロ
イックミラーである。

【００７０】これにより、励起光波長λ１、λ２のレー
ザ光が合成されたレーザ光は、励起ダイクロイックミラ
ー３２により反射され、互いに直交する２つの偏向素子
７ｘ、７ｙを経由し、対物レンズ８を通して標本２に走
査照射して励起する。この励起された標本２から発せら
れた波長域λ１’、λ２’の蛍光と標本２からの励起光
波長λ１、λ２のレーザ光の反射光とは、同時に戻り光
として再び、各偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、ダイクロ
イックミラー３２を透過する。

【００７１】これと同様に、合成された極超短パルスレ
ーザ光は、ダイクロイックミラー３２により反射され、
互いに直交する２つの偏向素子７ｘ、７ｙを経由し、対
物レンズ８を通して標本２に走査照射して２光子励起す
る。

【００７２】この２光子励起された標本２から発せられ
た波長域λ３’、λ４’の蛍光と標本２からの励起光波
長λ３、λ４の極超短パルスレーザ光の反射光とは、同
時に戻り光として再び、各偏向素子７ｘ、７ｙを経由
し、ダイクロイックミラー３２を透過する。

【００７３】このダイクロイックミラー３２の透過光路
上には、光学フィルタ１１とバリアフィルタ３３とが直
列に挿入されている。図７にはこれら光学フィルタ１１
とバリアフィルタ３３との分光透過率Ｔのフィルタ特性
が示されている。具体的な励起波長、蛍光中心波長、分
光波長は、例えばλ１＝３５１ｎｍ、λ２＝４８８ｎ
ｍ、λ３＝９８０ｎｍ、λ４＝１０６３ｎｍ、λ１’＝
４４２ｎｍ、λ２’＝５２０ｎｍ、λ４’＝５９０ｎｍ
等であり、標本２に使用される蛍光試薬により検出フィ
ルタの励起、蛍光波長がそれぞれ異なるので、それぞれ
のダイクロイックフィルタは連動するようにしている。

【００７４】光学フィルタ１１は、図８に示すように励
起光波長λ１、λ２のレーザ光のうち波長の短い方の励
起光波長λ１より長い波長の透過率をできるだけ高く
し、かつ励起光波長λ１よりも短波長側の透過率が例え
ば０．０１％以下になるように単純に設計されている。

【００７５】バリアフィルタ３３は、図８に示すように
励起光波長λ３の極超短パルスレーザ光より長い波長の
透過率を例えば０．０１％以下にし、かつ励起光波長λ
３より短波長側の透過率ができるだけ高くなるように単
純に設計されている。

【００７６】これら光学フィルタ１１とバリアフィルタ
３３との透過光路上には、スペクトル分離手段としての
各分光ダイクロイックミラー４０、４１、４２が直列に
挿入されている。これら分光ダイクロイックミラー４
０、４１、４２は、波長域λ１’、λ２’、λ３’、λ
４’の蛍光をそれぞれ分光するもので、分光ダイクロイ
ックミラー４０は、励起光波長λ１より短い波長のレー
ザ光を遮断すると共に波長域λ２’、λ３’、λ４’の
蛍光を透過し、かつ波長域λ１’の蛍光を反射する特性
を有している。分光ダイクロイックミラー４１は、励起
光波長λ２より短い波長のレーザ光を遮断すると共に波
長域λ３’、λ４’の蛍光を透過し、かつ波長域λ２’
の蛍光を反射する特性を有している。分光ダイクロイッ
クミラー４２は、波長域λ３’、λ４’の蛍光のうち波
長域λ３’の蛍光を反射し、かつ波長域λ４’の蛍光を
反射する特性を有している。

【００７７】上記分光ダイクロイックミラー４０の反射
光路上は、集光レンズ１５ａ、共焦点開口１６ａ、バン
ドパスフィルタ１７ａを介して光検出器１８ａが配置さ
れている。このうちバンドパスフィルタ１７ａは、図８
に示すように波長λ２を遮って波長域λ１’の蛍光を透
過する特性を有している。

【００７８】上記分光ダイクロイックミラー４１の反射
光路上は、集光レンズ１５ｂ、共焦点開口１６ｂ、バン
ドパスフィルタ１７ｂを介して光検出器１８ｂが配置さ
れている。このうちバンドパスフィルタ１７ｂは、波長
域λ２’の蛍光のみを透過する特性を有している。

【００７９】上記分光ダイクロイックミラー４２の反射
光路上は、集光レンズ１５ｃ、共焦点開口１６ｃ、バン
ドパスフィルタ１７ｃを介して光検出器１８ｃが配置さ
れている。このうちバンドパスフィルタ１７ｃは、波長
域λ３’の蛍光のみを透過する特性を有している。

【００８０】又、上記分光ダイクロイックミラー４２の
透過光路上は、集光レンズ１５ｄ、共焦点開口１６ｄ、
バンドパスフィルタ１７ｄを介して光検出器１８ｄが配
置されている。このうちバンドパスフィルタ１７ｄは、
波長域λ４’の蛍光のみを透過する特性を有している。

【００８１】なお、分光ダイクロイックミラー４０、４
１、４２は、それぞれ図９に示すように回転可能な円盤
４３上の円周上に複数設けられ、各モータ４４ａ、４４
ｂ、４４ｃの駆動によりレーザ光の励起光波長及び蛍光
波長に応じたダイクロイックミラー４０、４１、４２が
選択的に切り替えて光路に挿脱されるものとなってい
る。

【００８２】又、バンドパスフィルタ１７ａ、１７ｂ、
１７ｃ、１７ｄは、それぞれ図１０に示すように回転可
能な円盤４５上の円周上に複数設けられ、各モータ４６
ａ、４６ｂ、４６ｃ、４６ｄの駆動によりレーザ光の励
起光波長及び蛍光波長に応じたバンドパスフィルタ１７
ａ、１７ｂ、１７ｃ、１７ｄが選択的に切り替えて光路
に挿脱するようにすることができる。

【００８３】画像形成装置４７は、標本２の２重染色観
察を行うための画像を作像するためのソフトウエアを有
し、このソフトウエアを実行することにより各光検出器
１８ａ、１８ｂから出力される各蛍光強度信号を入力し
て蓄積し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に
同期して図示しない直交座標上に配置された２枚の２次
元画像を形成し、これら画像を合成して２重染色観察を
行うための合成画像を作像し、これら画像を不図示の表
示装置に表示したり、印刷装置等により印刷出力する機
能を有している。

【００８４】又、画像形成装置４７は、標本２の２光子
励起観察を行うための画像を作像するためのソフトウエ
アも有し、このソフトウエアを実行することにより各光
検出器１８ｃ、１８ｄから出力される各蛍光強度信号を
入力して蓄積し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動
信号に同期して図示しない直交座標上に配置された２枚
の２次元画像を形成し、これら画像を合成して２光子励
起観察を行うための合成画像を作像し、これら画像を不
図示の表示装置に表示したり、印刷装置等により印刷出
力する機能を有している。

【００８５】又、画像形成装置４７は、各偏向素子７
ｘ、７ｙなどにより各レーザ光を標本２の厚さ方向に一
定間隔で送りながら走査してその画像を取得し、この画
像を用いて標本２の３次元画像を構築したり、２画面像
を連続又は間欠に取得して時間経過観察、解析を行う機
能を有している。

【００８６】又、画像形成装置４７は、各シャッタ３
ａ、３ｂ、３０ａ、３０ｂを開閉動作する機能と、ダイ
クロイックミラー３２を選択するためのモータ１０を駆
動制御する機能と、光学フィルタ１１を選択するための
モータ１３を駆動制御する機能と、バリアフィルタ３３
を選択するためのモータ１３ｂを駆動制御する機能と、
各分光ダイクロイックミラー４０、４１、４２をそれぞ
れ選択するための各モータ４４を駆動制御する機能と、
各バンドパスフィルタ１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ
をそれぞれ選択するための各モータ４６を駆動制御する
機能と、各偏向素子７ｘ、７ｙを駆動制御する機能など
を有している。

【００８７】このような構成であれば、励起光波長λ
１、λ２のレーザ光がそれぞれ出力され、標本２から波
長域λ１’、λ２’の蛍光が発せられると、これら蛍光
と標本２からの励起光波長λ１、λ２のレーザ光の反射
光とは、同時に戻り光として再び、各偏向素子７ｘ、７
ｙを経由し、励起ダイクロイックミラー６を透過し、光
学フィルタ１１に入射する。

【００８８】この光学フィルタ１１では最も短波長側の
励起光波長λ１のレーザ光を遮断し、かつ励起光波長λ
２のレーザ光及び波長域λ１’、λ２’の蛍光を透過す
る。そして、分光ダイクロイックミラー４０では、励起
光波長λ１より短い波長のレーザ光を遮断すると共に波
長域λ２’の蛍光を透過し、かつ波長域λ１’の蛍光を
反射する。分光ダイクロイックミラー４１では、励起光
波長λ２より短い波長のレーザ光を遮断すると共に波長
域λ２’の蛍光を反射する。

【００８９】そして、分光ダイクロイックミラー４０で
反射した波長域λ１’の蛍光は、集光レンズ１５ａ、共
焦点開口１６ａ、バリアフィルタ１７ａを通って光検出
器１８ａに入射する。これと共に、分光ダイクロイック
ミラー４１で反射した波長域λ２’の蛍光は、集光レン
ズ１５ｂ、共焦点開口１６ｂ、バリアフィルタ１７ｂを
通って光検出器１８ｂに入射する。

【００９０】画像形成装置４７は、各光検出器１８ａ、
１８ｂから出力される各蛍光強度信号を入力して蓄積
し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同期し
て図示しない直交座標上に配置された２枚の２次元画像
を形成し、これら画像を合成して２重染色観察を行うた
めの合成画像を作像し、これら画像を不図示の表示装置
に表示したり、印刷装置等により印刷出力する。

【００９１】一方、各レーザ光源３０ａ、３０ｂから励
起光波長λ３、λ４の極超短パルスレーザ光がそれぞれ
出力されると、標本２は２光子励起され、この２光子励
起された標本２から発せられた波長域λ３’、λ４’の
蛍光と標本２からの励起光波長λ３、λ４のレーザ光の
反射光とが同時に戻り光として再び、各偏向素子７ｘ、
７ｙを経由し、励起ダイクロイックミラー３２を透過
し、バリアフィルタ３３に入射する。このバリアフィル
タ３３では、波長域λ３’、λ４’の蛍光のみを透過す
る。

【００９２】これら波長域λ３’、λ４’の蛍光は、各
分光ダイクロイックミラー４０、４１を透過し、分光ダ
イクロイックミラー４２に入射する。この分光ダイクロ
イックミラー４２では、波長域λ３’の蛍光を反射し、
かつそれ以上の波長域λ４’の蛍光を透過する。

【００９３】そして、波長域λ３’の蛍光は、集光レン
ズ１５ｃ、共焦点開口１６ｃ、バリアフィルタ１７ｃを
通って光検出器１８ｃに入射する。これと共に、分光ダ
イクロイックミラー４２を透過した波長域λ４’の蛍光
は、集光レンズ１５ｄ、共焦点開口１６ｄ、バリアフィ
ルタ１７ｄを通って光検出器１８ｄに入射する。

【００９４】画像形成装置４７は、各光検出器１８ｃ、
１８ｄから出力される各蛍光強度信号を入力して蓄積
し、それぞれ各偏向素子７ｘ、７ｙの駆動信号に同期し
て図示しない直交座標上に配置された２枚の２次元画像
を形成し、これら画像を合成して２光子励起観察を行う
ための合成画像を作像し、これら画像を不図示の表示装
置に表示したり、印刷装置等により印刷出力する。

【００９５】又、以上のような走査型光学顕微鏡であれ
ば、レーザ光源１ａ，１ｂからそれぞれ出力される励起
光波長１、λ２の各レーザ光と、レーザ光源３０ａ，３
０ｂからそれぞれ出力される励起光波長λ３、λ４の各
極超短パルスレーザ光とのうち観察に必要な励起光波長
のレーザ光を組み合わせて出力し、標本２を励起してそ
の画像を取得できる。例えば、レーザ光の励起光波長の
組み合わせは、励起光波長λ１とλ３、λ１とλ４、又
はλ２とλ４であり、互いの蛍光が影響し合わないよう
に互いの励起光波長の間隔が離れているものが適切であ
る。

【００９６】このように上記第３の実施の形態によれ
ば、２重染色観察と２光子励起観察とを行うために上記
第１と第２の実施の形態の各走査型光学顕微鏡を組み合
わせた構成なので、上記第１と第２の実施の形態と同一
の効果を奏することは言うまでもない。

【００９７】（４）次に、本発明の第４の実施の形態に
ついて図面を参照して説明する。なお、図７と同一部分
には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

【００９８】図１１は２重染色観察と２光子励起観察と
を行うための走査型光学顕微鏡の構成図である。この走
査型光学顕微鏡の上記第３の実施の形態と異なるところ
は、上記第３の実施の形態では１光子励起波長λ１、λ
２の遮断を励起ダイクロイックミラー３２と分光ダイク
ロイックミラー４０との間に配置された光学フィルタ１
１により行っているが、これを各光検出器１８ａ、１８
ｂのそれぞれの前方に配置した各バリアフィルタ５０、
５１にその特性を備えたものとしたところである。図１
２はこれらバリアフィルタ５０、５１のフィルタ分光特
性を示している。

【００９９】このような構成であれば、１光子励起観察
の場合、２光子励起波長λ３、λ４を使用せずにバリア
フィルタ３３を光路から外す。又、２光子励起波長λ
３、λ４を用いた２光子励起観察の場合には、バリアフ
ィルタ３３を光路に挿入する。

【０１００】なお、この走査型光学顕微鏡の作用は、上
記第３の実施の形態と同一になるので、その説明の重複
を避けるために省略する。

【０１０１】従って、上記第４の実施の形態によれば、
２重染色観察と２光子励起観察とを行うために上記第１
と第２の実施の形態の各走査型光学顕微鏡を組み合わせ
た構成なので、上記第１と第２の実施の形態と同一の効
果を奏することは言うまでもない。

【０１０２】なお、本発明は、上記第１乃至第４の実施
の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨
を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。

【０１０３】さらに、上記実施形態には、種々の段階の
発明が含まれており、開示されている複数の構成要件に
おける適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出でき
る。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾
つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとす
る課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で
述べられている効果が得られる場合には、この構成要件
が削除された構成が発明として抽出できる。

【０１０４】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、高
価な光学部品を削減して、安価で高性能に複数の波長域
の蛍光画像を取得できるレーザ顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。

【図２】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第１の実施の形態におけるダイクロイック
ミラーの挿脱機構を示す図。

【図３】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第１の実施の形態における光学フィルタの
挿脱機構を示す図。

【図４】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第１の実施の形態における光学フィルタ、
分光フィルタ及び各バリアフィルタの波長特性図。

【図５】本発明に係わる２光子励起観察を行うための走
査型光学顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。

【図６】本発明に係わる２光子励起観察を行うための走
査型光学顕微鏡の第２の実施の形態におけるバリアフィ
ルタ及び分光ダイクロイックミラーの特性図。

【図７】本発明に係わる２重染色観察及び２光子励起観
察を行うための走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態を
示す構成図。

【図８】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第３の実施の形態における光学フィルタと
バリアフィルタ

【図９】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査型
光学顕微鏡の第３の実施の形態におけるダイクロイック
ミラーの挿脱機構を示す図。

【図１０】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査
型光学顕微鏡の第３の実施の形態におけるバンドパスフ
ィルタの挿脱機構を示す図。

【図１１】本発明に係わる２重染色観察及び２光子励起
観察を行うための走査型光学顕微鏡の第４の実施の形態
を示す構成図。

【図１２】本発明に係わるレーザ顕微鏡を適用した走査
型光学顕微鏡の第４の実施の形態におけるバリアフィル
タのフィルタ分光特性を示す図。

【符号の説明】

Ａ：走査型光学顕微鏡本体 １ａ，１ｂ：レーザ光源 ２：標本 ３ａ，３ｂ：シャッタ ５：波長合成ダイクロイックミラー ６：励起ダイクロイックミラー ７ｘ，７ｙ：偏向素子 ８：対物レンズ ９：円盤 １０：モータ １１：光学フィルタ １２：移動体 １３：モータ １４：分光フィルタ １５，１９：集光レンズ １６，２０：共焦点開口 １７，２１：バリアフィルタ １８，２２：光検出器 ２３：画像形成装置 ３０ａ，３０ｂ：レーザ光源 ３１：波長合成ダイクロイックミラー ３２：励起ダイクロイックミラー ３３：バリアフィルタ ３４：分光ダイクロイックミラー ３５，３６：バンドパスフィルタ ３７：画像形成装置 ４０，４１，４２：分光ダイクロイックミラー ４７：画像形成装置 ５０，５１：バリアフィルタ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多重染色された標本を複数のスペクトル
   域の励起光により励起し、前記標本から発せられる複数
   のスペクトル域の蛍光を検出器で検出して前記標本の画
   像を取得するレーザ顕微鏡において、 前記複数のスペクトル域の励起光から検出したい蛍光に
   対応する励起光のスペクトル域を選択的に導くための選
   択手段と、 この選択手段で選択的に前記標本に導かれた励起光を照
   射したときに、前記標本側から前記検出器側に向かって
   発せられる光のうち、少なくとも短波長側の励起光のス
   ペクトル域を除去し、かつ前記標本側からの光を透過す
   る分光特性を有した光学フィルタと、 この光学フィルタを切り替え可能な光学フィルタ切替え
   手段と、 前記選択手段により選択的に前記標本に導かれた励起光
   に対応して前記光学フィルタ切替え手段を制御する制御
   手段と、 前記光学フィルタを透過したスペクトル域の光を少なく
   とも２つ以上の検出したい前記蛍光のスペクトル域の検
   出光路にそれぞれ分離するスペクトル分離手段と、 このスペクトル分離手段により分離された前記２つ以上
   の検出器にそれぞれ設けられ、各検出光路で検出したい
   前記蛍光のスペクトル域のみを透過するバリアフィルタ
   と、 このバリアフィルタを透過したスペクトル域の前記標本
   からの蛍光をそれぞれ検出する光検出器と、を具備した
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記光学フィルタは、ローカットフィル
   タであることを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微
   鏡。
3. 【請求項３】 前記光学フィルタは、ローパスフィルタ
   であることを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記光学フィルタは、前記光検出器の前
   に配置されたパンドパスフィルタとを組み合わせて、光
   検出器に所望のスペクトル域の蛍光を導くことを特徴と
   する請求項１記載のレーザ顕微鏡。
5. 【請求項５】 多重染色された標本を複数のスペクトル
   域の励起光により励起し、前記標本から発せられる複数
   のスペクトル域の蛍光を検出器で検出して前記標本の画
   像を取得するレーザ顕微鏡において、 １光子励起観察用の１光子励起光を発する第１の光源
   と、 ２光子励起観察用の２光子励起光を発する第２の光源
   と、 これら第１、第２の光源からの前記複数の励起光から検
   出したい蛍光に対応する励起光のスペクトル域を選択的
   に前記標本に導くための選択手段と、 この選択手段で選択的に前記標本に導かれる前記第１の
   光源からの１光子励起光により前記標本から発せられる
   光のうち、少なくとも短波長側の励起光のスペクトル域
   を除去した前記標本からの光を透過するローカットフィ
   ルタと、 前記選択手段で選択的に前記標本に導かれる前記第２の
   光源からの２光子励起光により前記標本から発せられる
   光のうち、少なくとも短波長側の励起光のスペクトル域
   を除去した前記標本からの光を透過するローパスフィル
   タと、 前記ローカットフィルタを切り替え可能な第１の光学フ
   ィルタ切替え手段と、 前記ローパスフィルタを切り替え可能な第２の光学フィ
   ルタ切替え手段と、 前記選択手段により選択的に前記標本に導かれる前記第
   １、第２の光源からの励起光に対応して前記第１、第２
   の光学フィルタ切替え手段を制御する制御手段と、 前記光学フィルタを透過したスペクトル域の光を少なく
   とも２つ以上の検出したい蛍光のカペクトル域の検出光
   路にそれぞれ分離するスペクトル分離手段と、 このスペクトル分離手段により分離された前記２つ以上
   の検出光路にそれぞれ設けられ、各検出光路で検出した
   い蛍光のスペクトル域のみを透過するバリアフィルタ
   と、 このバリアフィルタを透過したスペクトル域の前記標本
   からの蛍光をそれぞれ検出する光検出器と、を具備した
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
6. 【請求項６】 前記制御手段は、前記第１、第２の光源
   からの１光子励起光と２光子励起光ととが同時に前記標
   本に導かれる場合、前記第１、第２の光学フィルタ切替
   え手段を制御して、光路中に前記ローカットフィルタと
   ローパスフィルタとを挿入させることを特徴とする請求
   項５記載のレーザ顕微鏡。