CN102159936A - 荧光图像检测装置以及荧光图像检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种荧光图像检测装置以及荧光图像检测方法，为了降低与荧光图像检测装置的检测能力有关的漏光，将荧光侧滤波器部的干涉滤波器和吸收滤波器串行配置在荧光的行进方向上。在此所使用的干涉滤波器和吸收滤波器使相当于荧光的波长频带的光充分透过并且遮蔽相当于照射到试样的激励光的波长频带的光。

Description

荧光图像检测装置以及荧光图像检测方法
技术领域
本发明涉及一种使用荧光检测的生物光学成像(bioluminescence imaging)技术。
背景技术
对生物体中、细胞中的分子种(molecular species)如何分布进行成像的方法是医学、生物学的重要研究方法。在细胞等级广泛应用着如下方法：使用显微镜，利用附着有荧光色素的分子探针、使用基因发现分子探针来将分子种进行图像化。另外，要求如下一种装置：针对比细胞等级更大的脏器、甚至动物个体，在仍存活的状态下观察所关注的分子种分布的样子。
例如如下技术：通过使荧光探针与小鼠等个体中的癌细胞相结合来将所关注的癌细胞增殖的样子进行图像化，观察每天或者每周的随时间变化。在以往的用于细胞等级的测量装置中，为了观察动物个体内部的癌细胞的增殖，通过杀死动物对规定的部分染色或者附着荧光体来进行观察，但是这样就无法对一个个体长时间地观察细胞的随时间增殖。由于该原因，期望开发一种能够在个体仍存活的状态下观察小动物个体的内部信息的分子种的装置。
发明内容
发明要解决的问题
图10是表示典型的荧光图像检测装置的一例的图。
该装置是如下装置：将来自光源16的光中的由激励侧滤波器11(Fex)选择的波长的光作为激励光照射到生物体试样，利用荧光侧滤波器12(Fem)取出来自该生物体试样的散射光中的荧光成分，利用成像透镜32在作为二维检测器的CCD照相机38上成像，由此得到试样的荧光图像。
在这样的装置中，在对试样照射激励光时，从所关注的荧光分子发射波长与激励光不同的、通常波长比激励光长的光，因此，如果安装完全遮断激励光的波长成分的滤波器作为从试样至二维检测器38之间的荧光侧滤波器12，则能够以高灵敏度地检测荧光波长成分。
但是，实际上，照射到试样的激励光的光谱中往往包含较少波长与荧光成分相同的光(还称为杂散光)，该杂散光在试样上进行反射而与从试样发出的荧光重叠，从而使荧光的检测边界恶化。另外，相反如果照射到试样的激励光完全不包含杂散光，荧光侧滤波器的能力不足而也没有完全去除激励光的波长成分，则在试样上反射的激励光成分的一部分透过荧光侧滤波器而与来自试样的荧光成分重叠，从而使荧光的检测边界恶化。当荧光的检测边界较差时微弱的荧光被噪声掩盖，从而无法清楚地捕捉图像。在生物体试样的关注部分附着荧光色素而观察的情况下，当关注部分处于生物体试样的中心附近即从表面远离的位置时，相应地从生物体试样的表面捕捉到的荧光的强度变弱。当荧光的检测边界较差时，无法清楚地捕捉这样微弱的荧光成分。
因此，本发明的目的在于提供一种荧光图像检测装置，提高荧光的检测边界而也能够高灵敏度地检测微弱的荧光。
用于解决问题的方案
图11是表示在图10的荧光图像检测装置中试样所包含的荧光色素的激励光谱45和荧光光谱46以及与这些激励光谱45和荧光光谱46相对应地选择的激励侧滤波器11(Fex)的透过特性41和荧光侧滤波器12(Fem)的透过特性42的图。将激励侧滤波器11的透过波长频带选择为被包含于表示激励光谱45较强的强度的波长范围内。因为荧光光谱46移位到波长比激励光谱45长的波长侧，所以与之相对应地选择荧光侧滤波器12的透过特性42以使其移位到波长比激励侧滤波器11长的波长侧。
图12是表示激励侧滤波器Fex、荧光侧滤波器Fem的具体透过特性的一例的图表。在该图表中，横轴表示波长(nm)，纵轴表示透过率(对数)。纵轴的透过率是指1(表示为1.E+00)最大、即100％的透过。作为激励侧滤波器Fex、荧光侧滤波器Fem而使用的滤波器一般为多层膜干涉滤波器。多层膜干涉滤波器为如下滤波器：通过在透明的支承体上交替层叠几十层折射率不同的两种电介质薄膜的多层膜结构，从而仅使期望波长的光通过而遮挡(反射)剩余波长的光。
在图12中，激励侧滤波器Fex为在630nm～690nm中具有透过波长频带的带通滤波器(透过波长频带的宽度Δλex)。如果针对该激励侧滤波器Fex观察透过波长频带的透过率，则能够达到90％左右而足够高，不存在问题；但是在要遮挡光的波长域中也存在2×10-6(将×10-6表示为E-06)左右的透过率，即在透过波长频带以外的波长域中存在漏光。将该激励侧滤波器Fex的漏透过率设为“tex”。
另一方面，荧光侧滤波器Fem为在730nm～780nm中具有透过波长频带的带通滤波器(透过波长频带的宽度Δλem)。如果针对该荧光侧滤波器Fem观察透过波长频带的透过率，则能够达到90％左右而足够高，不存在问题；但是在要遮挡光的波长域中也存在1×10-5左右的透过率，即在透过波长频带以外的波长域中存在漏光。将该荧光侧滤波器Fem的漏透过率设为“tem”。
参照图13研究在图10的例子中使用图12的滤波器Fex(透过特性41)、Fem(透过特性42)并使用碘钨灯那样的连续波长光源作为光源16的情况。
如图13的(a)所示，将来自光源16的光强度假设为在整个波长上均匀的I(mW/nm)。如果为了简化而将Fex的透过波长频带的透过率视作1(100％)，则从激励侧滤波器Fex的透过波长频带透过的激励光强度在图中相当于面积，因此该强度为
I·Δλex(mW)。
当假设试样是完全不发出荧光而使激励光原样散射的白色散射体时，投向荧光侧滤波器Fem的散射光的强度为
I·Δλex·k
k为投向荧光侧滤波器Fem的散射光的比例。如果将漏光相对于入射到荧光侧滤波器Fem的散射光的比例设为总漏率LF(LF：Leak Factor)，则到达二维检测器38的漏光的强度为
I·Δλex·k·LF
由于假设试样不发出荧光，因此如果LF＝0则CCD照相机38拍摄全黑的图像。由于k是固定的，因此为了估计LF，等同于如下情况：如图13的(b)所示，在来自光源16的光的行进方向上串行排列激励侧滤波器11和荧光侧滤波器12，评价被包含于荧光侧滤波器12的透过光中的漏光的比例。即，考虑设为k＝1即可。
在图13的(b)的配置中，当测量来自荧光侧滤波器12的漏光的光谱时，检测出图13的(c)的两个波长成分的山形Sex、Sem。图左侧的成分Sex是相当于激励光的波长的光由于荧光侧滤波器12的能力不足没有被完全遮挡而漏掉的成分，如果使用荧光侧滤波器12的漏率tem则形成如下公式
Sex＝I·Δλex·tem
图右侧的成分Sem可以说是由于激励侧滤波器11(漏率＝tex)的能力不足而有I·tex的强度的光到达荧光侧滤波器12，而其中处于荧光侧滤波器12的透过波长频带Δλem内的波长的光是原样透过(由于设定为透过波长频带的透过率＝1)荧光侧滤波器12的成分。因而，形成以下公式
Sem＝I·Δλem·tex
入射到二维检测器38的最终漏光的强度为上述激励波长中的Sex与荧光检测波长中的Sem之和。因而，总漏率LF为漏光相对于入射到荧光侧滤波器Fem的散射光的比例，因此能够定义为如下公式
LF＝(Sem+Sex)/(I·Δλex)
＝(tem·Δλex+tex·Δλem)/Δλex     (1)
如果激励侧滤波器11与荧光侧滤波器12的透过波长频带的宽度Δλex与Δλem大致相同，则形成如下公式。
LF＝tem+tex
即，如果两个滤波器11、12的漏率tex、tem都为1×10-5左右，则由于总漏率LF为两个滤波器11、12的漏率之和，因此不会降低到该总和以下。此外，一般作为激励侧滤波器、荧光侧滤波器而使用的多层膜干涉滤波器的漏率通常为1×10-6左右，较佳的为1×10-7左右。
如上所述，在荧光图像检测装置中需要区分滤波器本身的漏率与包含光源的总漏率来进行讨论，但是目前没有根据这样的观点来区分两者的记载。本发明提出一种进行该区分而降低总漏率的方法。即本发明的主要目的在于提供一种荧光图像获取装置，其使用具有与当前得到的性能相同程度的性能的滤波器作为滤波器但与以往相比降低总漏率LF。
本发明的荧光图像获取装置具备：激励光源，其激励试样的荧光；二维检测器，其用于检测从试样发出的荧光；激励侧滤波器，其被配置于光源至试样之间；以及荧光侧滤波器部，其被配置于试样至二维检测器之间，取出从试样发出的荧光来引导到上述二维检测器。并且，激励侧滤波器具有透过波长频带，该透过波长频带阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光。荧光侧滤波器部包括多层膜干涉滤波器和吸收滤波器，将这些多层膜干涉滤波器和吸收滤波器串行排列在荧光的行进方向上。这些多层膜干涉滤波器和吸收滤波器组合成在荧光侧滤波器部的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含激励侧滤波器的透过波长频带。
即，作为确保激励侧滤波器与荧光侧滤波器相互不共用透过波长域的方法，使多层膜干涉滤波器和吸收滤波器作为荧光侧滤波器而双重地发挥功能。
在该荧光图像检测装置中，使用降低由荧光侧滤波器引起的漏光强度Sex的方法。即，除了目前使用的多层膜干涉滤波器以外还使用串行配置吸收形滤波器(还简称为吸收滤波器)来作为荧光侧滤波器部而得到“吸收滤波器备用法”。当设为多层膜干涉滤波器的漏率例如为1×10-5时，如果配置吸收滤波器而漏率降低三位，则能够实现1×10-8总漏率LF。
吸收滤波器例如为市场上销售的廉价“着色玻璃滤波器(colored glass filter)”。该滤波器在透明的玻璃中溶解吸收光的物质而在该吸收部分遮挡光的透过。也可以不使用玻璃而使用透明的树脂或者根据波长在石英中溶解期望的吸收物质并使之凝固来得到该滤波器。
以后说明理由，将相同种类的多层膜干涉滤波器作为备用滤波器而使用，也无法使漏率降低，与此相对，通过将多层膜干涉滤波器与性质不同的吸收滤波器组合，有效利用两者的特征则能够大幅降低由两者漏率的乘法运算而得到的漏率。本发明的特征在于，找出上述特性，实现总漏率LF的大幅降低，提高荧光图像检测装置的荧光检测精度。
在此，优选激励侧滤波器的透过波长频带中的吸收滤波器的透过率为10％以下。这是指吸收滤波器的漏率为0.1(1×10-1)以下，如果吸收滤波器的漏率为0.1以下，则通过与多层膜干涉滤波器进行组合能够降低总漏率一位以上。根据以后的说明可知，即使将漏率为1×10-5左右的多层膜干涉滤波器作为备用滤波器而使用，总漏率仅被降低一位左右。与此相对，与使用多层膜干涉滤波器作为备用滤波器的情况相比，通过使用漏率0.1以下的吸收滤波器能够大幅降低总漏率。
在本发明中，优选还使用与激励侧滤波器的透过波长频带相比发射波长频带更窄的光的单波长光源作为光源。由此，根据以下理由能够实现降低由激励侧滤波器引起的漏光强度Sem。在这种情况下，当处于与激励光的主波长(是指单波长光源的放射能量所集中的波长域)不同的波长域的荧光侧滤波器的透过波长域的光源放射光强度，在将连续光源的放射强度设定为1时例如为1×10-4左右时，即使激励侧滤波器的漏率为1×10-5左右，来自激励侧滤波器的漏率的强度也为1×10-9左右。即，如果代替连续光源而使用单波长激励光源，则在从光源发射的光中几乎不包含荧光侧滤波器的透过波长频带的光，因此从激励侧滤波器漏光的荧光侧滤波器的透过波长频带的光大幅降低，从而实质上漏率降低。
根据图13～图16进一步详细说明能够实现上述情况的理由。
在图13的(c)中，tem相当大，因此Sex显出明显大。追加吸收滤波器13的方法(参照图14的(b))对降低这些具有效果。在吸收滤波器13的透过特性43(参照图14的(a))中在激励侧滤波器11的透过波长频带Δλem中透过率较小。将该透过率设为ta，例如设为ta＝0.001(1×10-3)。于是，通过图14的(c)示出的吸收滤波器13之后的由荧光侧滤波器12、13引起的漏光强度Sex形成如下公式，
Sex＝I·tem·ta·Δλex＝L·tem·ta     (2)
与图13的(c)的漏光强度Sex相比仅减小系数ta的量。在此，设为I·Δλex(光源强度)＝L。
根据图14的(c)可知，通过追加吸收滤波器13，Sex已降低但是Sem几乎没有降低。这是因激励侧滤波器11中存在荧光侧滤波器的透过波长域Δλem内的漏光引起的。在降低Sem时，利用钨丝灯那样的连续光源16代替图15示出的主波长频带较窄的光源(单波长光源)15效果较好。典型的单波长光源可举出发光二极管(LED)、半导体激光器(LD)。以单波长光源15的放射光谱51中的主波长带51a(将波长宽度记述为ΔλLS)进入到激励侧滤波器11的透过波长频带Δλex中的方式选择单波长光源15与激励侧滤波器11的组合。
但是，虽说是单波长光源，但是正确地说不仅在中心部的较强放射部分(主波长带)51a中而且在其拖尾部分中也伴随着微弱发光。该拖尾部分与来自激励侧滤波器11的漏光Sem有关。当将单波长光源的主波长带的放射强度即激励光强度设为L(＝I×ΔλLS)、将系数f乘以I而以[I·f]表示拖尾部分的放射强度时，由激励侧滤波器11引起的漏光强度Sem形成如下公式。
Sem＝L·f·tex      (3)
此外，“f”例如为0.001或者0.0001等较小的值。因而，总漏率LF形成如下公式。
LF＝(Sex+Sem)/L
＝ta·tem+f·tex       (4)
对上述公式(4)进行图示的图为图15的(c)，左侧的山形Sex通过乘以ta而降低，右侧的山形Sem由于f的效果而大大降低。例如，如果tem、tex为10-6的数量级而ta、f为10-3的数量级，则利用上述公式(4)，总漏率LF成为10-9的数量级而大幅降低。
此外，单波长光源15使用激光器(固体激光器、色素激光器、半导体激光器)等，基于小型这一特点特别优选使用半导体激光器(LD)，除此以外还能够使用发光二极管(LED)。作为能够使用于单波长光源15的激光器、LED的特征，放射能量集中在激励侧滤波器11的透过波长频带Δλex内，如果从此向长波长侧发光十分弱则公式(3)的讨论成立。此外，除了使用串行配置多层膜干涉滤波器和吸收滤波器而得到的滤波器作为荧光侧滤波器以外，在降低总漏率LF时使用单波长光源作为光源最有效，但是即使在使用连续光源作为光源的情况下，如图14的(c)所示那样实现降低由荧光侧滤波器引起的漏光强度Sex，其结果，实现降低总漏率LF。特别是，在与tex相比tem相当大的情况下，总漏光强度(Sex+Sem)中所占的由荧光侧滤波器引起的漏光强度Sex的比例较大，因此仅追加吸收滤波器也能够得到很大效果。
例举单波长光源和吸收滤波器的组合。
在此使用的吸收滤波器为所谓锐截止滤波器，具有在短波长侧不使光通过而透过率向长波长侧形成右上升的特性，以在其途中透过率成为50％的波长(下面称为50％透过波长)来记述特性。根据该50％透过波长来列举组合。
在单波长光源的主波长带为接近785nm的情况下优选使用50％透过波长为830nm±20nm的吸收滤波器，在单波长光源的主波长带为接近690nm的情况下优选使用50％透过波长为760nm±20nm的吸收滤波器，在单波长光源的主波长带为接近658nm的情况下优选使用50％透过波长为720nm±20nm的吸收滤波器，在单波长光源的主波长带为接近808nm的情况下优选使用50％透过波长为850nm±20nm以上的吸收滤波器。此外，进一步说明50％透过波长即使并非上述的波长而是接近短波长或者长波长的波长也较有效，也有可能是在后述的表1的“吸收形滤波器的50％透过波长的有效范围”一栏中记述的范围。
另外，包含于作为检测对象的试样中的荧光色素中作为特别重要的物质可举出吲哚花青绿。
在此，验证特定本发明的事项的代替性。
(1)将荧光侧滤波器部的吸收滤波器代替为多层膜干涉滤波器
在荧光侧滤波器部中代替串行配置多层膜干涉滤波器和吸收滤波器而重叠配置两个多层膜干涉滤波器，由此预测荧光侧滤波器部的漏率成为将各多层膜干涉滤波器的漏率进行乘法运算而得到的值，但是，实际上荧光侧滤波器部的漏率不会小到预测的值。
图16A、图16B是表示上述测试结果的图表。图16A为使用钨丝灯作为光源的情况，图16B为使用LD(主波长带接近785nm)作为光源的情况。两个图表都是共用激励侧多层膜干涉滤波器而对在配置一个漏率1×10-5的多层膜干涉滤波器作为荧光侧滤波器部的情况下(＝A)、在串行配置两个漏率1×10-5的多层膜干涉滤波器作为荧光侧滤波器部的情况下(＝B)、在串行配置一个漏率1×10-5的多层膜干涉滤波器以及一个吸收滤波器作为C＝荧光侧滤波器部的情况下(＝C)的漏光的分光光谱进行测量而得到的图表。图16B的右图是放大左图中的主波长带部分的一部分的横轴而得到的图，数据与左图相同。
在光源为钨丝灯、LD中的任一个的情况下，在串行配置一个多层膜干涉滤波器和一个吸收滤波器的情况下(参照图表的C)都能观察到漏光从两位至三位的大幅降低，与此相对，在串行配置两个多层膜干涉滤波器的情况下(参照图表的B)可观察到漏光的降低但是其降低幅度为一位左右。如上所述，如果整体漏率为将各滤波器的漏率进行乘法运算而得到的值，则各滤波器的漏率为1×10-5，因此整体的漏率应该降低到10-10左右，但是实际上仅降低一位。
上述理由之一为，被多层膜干涉滤波器遮挡的波长的光的能量并非在滤波器内部消失而是在表面上进行反射。因此，当重叠两个多层膜干涉滤波器时，被备用滤波器遮挡的光在两个滤波器之间多次往返，每次相当于漏率的量的光透过备用滤波器，因此结果是备用滤波器的漏率以上的光透过备用滤波器。与此相对，吸收滤波器不反射遮挡的光而是吸收到内部，因此即使与多层膜干涉滤波器串行配置也不会产生这样的透过光的往返。
其它理由为，可举出多层膜干涉滤波器对倾斜的光较弱。例如在图1示出的荧光图像测量系统中，需要注意从设置于成像透镜32附近的荧光侧滤波器部Fem注视试样31的视场的中心与视场端处光线通过滤波器12的角度不同。在视场的中心光线的倾斜为0度，在视场角为20度的情况下，视场端的光线在正/负10度的状态下倾斜地通过滤波器。多层膜干涉滤波器相对于倾斜地入射的光线漏光增加是已知的事实。另外，由非常小的粉尘引起的散射光必然存在，该散射光相对于荧光侧滤波器部Fem倾斜地入射并透过，从而提高荧光侧滤波器部Fem的漏率。通过将吸收滤波器与荧光侧滤波器部Fem进行组合，由粉尘引起的散射光的影响也变小。
(2)仅利用吸收滤波器构成荧光侧滤波器部
图17A、图17B示出完全不使用多层膜干涉滤波器而利用单独吸收滤波器或者串行配置两个吸收滤波器构成荧光侧滤波器部的情况下的测试结果。图17A的曲线IR76为吸收滤波器(IR76)的透过率曲线，曲线F689为多层膜干涉滤波器(F689)的透过率特性。纵轴为透过率(％)，横轴为波长(nm)。图17B是使用钨丝灯作为光源并且使用F689作为激励侧滤波器来进行测量而得到的结果的图表。在图17A中，曲线“EX”是仅透过激励侧滤波器F689的来自钨丝灯的光即激励光的光谱曲线，“IR76×1”是仅使用一个吸收滤波器(IR76)作为荧光侧滤波器时的透过吸收滤波器的光的光谱，“IR76×2”是串行配置两个吸收滤波器(IR76)作为荧光侧滤波器时的透过吸收滤波器的光的光谱。
根据图17B，在波长域P中，IR76×1的透过光强度从EX降低近四位，IR76×2的透过光强度还进一步强降三位。由此，通过串行配置两个滤波器，整体漏率接近将各滤波器的漏率进行乘法运算而得到的值。但是，根据吸收滤波器IR76的透过光光谱(参照图17A)可知，吸收滤波器的光透过特性缓和，完全不波及多层膜干涉滤波器那样的尖锐的光透过特性。另外，在从透过率50％的波长760nm较大幅度地分开的690nm附近达到四位的遮挡，但是在要遮挡的激励光波长频带附近仅降低了2～3位左右。并且，通常有时从吸收滤波器发出荧光(图17的B的740nm附近的凸起有可能受到其荧光的影响)。因此，仅吸收滤波器的利用价值较小。为了不发出荧光，在预先利用具有尖锐的光透过特性的多层膜干涉滤波器来降低要遮挡的波长频带的光量之后，优选辅助使用漏率的乘法运算成立的吸收滤波器。
如上所述，多层膜干涉滤波器与作为备用滤波器的吸收滤波器的组合能够最有效地降低荧光侧滤波器部整体的漏率。在该组合中，能够补充多层膜干涉滤波器的“反射光对于较强倾斜光较弱”这种缺点以及吸收滤波器的“光遮挡波长特性过于缓和以及产生荧光”这种缺点，能够得到接近两者的漏率的积的值作为整体的漏率。此前作为典型例的多层膜干涉滤波器而说明了Fex和Fem，但也认识到即使是膜数较少的干涉滤波器重叠吸收滤波器的“遮挡率提高效果”，从而本发明的应用有效。但是当膜数较少时，原来的Fex和Fem的遮挡能力较低，因此重叠吸收滤波器的最终的阻止能力以相同比例下降。
此外，无法将吸收滤波器使用于激励侧滤波器的备用滤波器。例如观察图15的(a)的曲线43可知，吸收滤波器的透过光特性右上升，即形成“长波长侧透过”，适合使用于荧光侧滤波器部，如果使用于激励侧滤波器的备用滤波器则透过光特性右下降，即必须为“短波长透过特性”。然而，不存在这样的吸收滤波器。
另外，还考虑代替滤波器而使用分光器(所谓单色器)。通常，作为使用漏率的乘法运算功能的其它方法，公知一种多级使用单色器来极度缩小杂散光的方法。单色器使用衍射光栅来仅使特定波长的光通过，因此在多级使用该单色器时漏率的乘法运算成立。因此，能够使用单色器两级的双单色器、三级的三单色器来减小杂散光并检测较弱荧光。但是，单色器需要通过狭缝，因此无法将荧光图像检测那样的“面的光”作为图像而取出，因此无法代替为荧光侧滤波器。此外，能够利用单色器代替激励侧滤波器，但是与滤波器相比单色器具有占空间这种缺点。
发明的效果
本发明的荧光图像检测装置包括在荧光的行进方向上串行配置有荧光侧滤波器部的多层膜干涉滤波器和吸收滤波器，因此荧光侧滤波器部整体的漏率成为接近多层膜干涉滤波器的漏率与吸收滤波器的漏率的积的值，能够大幅降低由荧光侧滤波器部引起的漏光。即，使用具有通过一般技术得到的10-5～10-6数量级的漏率或者比该漏率差的漏率的滤波器，通过多层膜干涉滤波器与吸收滤波器的最佳组合，能够实现具有装置整体的良好总漏率的高灵敏度的荧光图像检测装置。
附图说明
图1是将本发明应用于大分子试样的荧光测量系统的实施例。
图2A是表示荧光侧滤波器的结构的说明图。
图2B是吸收滤波器特性选择适当的情况下的波形图。
图2C是吸收滤波器特性选择不适当的情况下的波形图。
图3是表示激励光照射装置的一个实施例的立体图。
图4是将本发明应用于微分子试样的荧光测量系统的实施例的概要结构图。
图5A是表示使用了连续光源的情况下的吸收滤波器的有无以及漏光光谱的图，左图为没有吸收滤波器的情况，右图为有吸收滤波器的情况。
图5B是表示使用了单色光源的情况下的吸收滤波器的有无以及漏光光谱的图，上图为光源光谱，左下图为没有吸收滤波器的情况下的漏光光谱，右下图为有吸收滤波器的情况下的漏光光谱。
图6是表示吸收滤波器的效果的实例的图像数据，(a)是没有吸收滤波器的情况的图，(b)是有吸收滤波器的情况的图，(c)是表示(a)的中央部的横方向截面强度的图，(d)是表示(b)的中央部的横方向截面强度的图，(e)是表示测量出的试样的立体图。
图7是表示荧光色素ICG的波长特性以及以ICG为对象时的光源和滤波器的波长特性的波形图。
图8是表示能够利用的LD的波长与实际的吸收滤波器的组合的波形图。
图9是表示单波长光源光谱和各滤波器的波长特性的波形图。
图10是大分子试样的荧光测量系统的概要结构图。
图11是表示荧光测量的激励光谱以及各滤波器相对于荧光光谱的波长特性的波形图。
图12是表示激励侧、荧光侧各自的多层膜干涉滤波器的典型的透过特性例的波形图。
图13是说明以往方式的情况下的通过多层膜干涉滤波器的典型的漏光的波长分布的图，(a)是表示光源光谱和多层膜干涉滤波器的波长特性的波形图，(b)是表示光源、激励侧滤波器以及荧光侧滤波器的排列的配置图，(c)是表示通过了两个滤波器之后的漏光的波长分布的波形图。
图14是说明将吸收滤波器追加到图13的系统时的漏光的波长分布的图，(a)是表示光源光谱、多层膜干涉滤波器以及吸收滤波器的波长特性的波形图，(b)是表示光源、激励侧滤波器以及荧光侧滤波器的排列的配置图，(c)是表示通过了全部滤波器之后的漏光的波长分布的波形图。
图15是用于说明追加吸收涉滤波器之后还将光源变更为单波长光源时的漏光的减少的图，(a)是表示光源光谱、多层膜干涉滤波器以及吸收滤波器的波长特性的波形图，(b)是表示光源、激励侧滤波器、荧光侧滤波器以及吸收滤波器的排列的配置图，(c)是表示通过了全部滤波器之后的漏光的波长分布的波形图。
图16A是表示使用连续光源而重叠两个多层膜干涉滤波器的情况下的漏光的波长分布的波形图。
图16B是表示使用单色光源而重叠两个多层膜干涉滤波器的情况下的漏光的波长分布的波形图，右图是放大左图的横轴而得到的图。
图17A是表示单独吸收滤波器的透过波长特性的波形图以及用于选择关注波长的多层膜干涉滤波器的透过波长特性的波形图。
图17B是表示激励光光谱以及透过一个或者两个吸收滤波器之后的光谱的波形图。
附图标记说明
11(Fex)：激励侧滤波器；FEM：荧光侧滤波器部；12：荧光侧多层膜干涉滤波器；13：吸收滤波器；15：单波长光源；16：连续波长光源；22：单波长激励光源的测量放射光谱；28：单波长激励光源的主波长带；30：照射单元；31：试样；32：成像透镜；38：二维检测器；41：激励侧多层膜干涉滤波器的透过波长特性；42：荧光侧多层膜干涉滤波器的透过波长特性；42a：荧光侧多层膜干涉滤波器的短波长侧透过频带；43：吸收滤波器的透过波长特性；50：连续光源的放射光谱；51：单波长激励光源的放射光谱；51a：单波长激励光源的中心部光谱；51b：单波长激励光源的测量放射光谱中的荧光检测滤波器的透过波长宽度所包含的部分。
具体实施方式
[实施例1]
图1是表示本发明的荧光图像检测装置的一个实施例的图。
具备照射单元30，该照射单元30用于激励试样31而产生荧光。照射单元30具备光源15和激励侧滤波器11，该激励侧滤波器11用于去除来自光源15的光中的不作为激励光而使用的波长的光。激励侧滤波器11例如为多层膜干涉滤波器，具有如下结构：具有图12示出的光透过特性41，充分良好地通过光源15的主波长带的光，遮挡比该主波长带长的长波长侧、特别是相当于荧光的波长频带的光。激励侧滤波器11的要遮挡的波长域的透过率为10-6左右。
另一方面，从试样发出的荧光通过荧光侧滤波器部Fem利用成像透镜32成像在由CCD照相机等构成的二维检测器38上。在二维检测器38中得到目的生物体材料的荧光图像。荧光侧滤波器部Fem是相对于荧光的行进方向串行配置多层膜干涉滤波器12和吸收滤波器13而构成的。多层膜干涉滤波器12具有如下结构：将具有包含荧光波长的波长频带作为透过波长频带，遮挡除此以外的波长频带、特别是相当于激励光的波长频带的光，其遮挡波长频带的透过率(漏率)为1×10-6左右。吸收滤波器13具有如下结构：使包含相当于荧光的波长频带的长波长侧的光透过，遮挡比长波长侧短的短波长侧的、特别是相当于激励光的波长频带的光，其遮挡波长频带的透过率(漏率)为1×10-3左右。如上所述，通过多层膜干涉滤波器12与吸收滤波器13的串行配置，荧光侧滤波器部Fem的漏率大致成为多层膜干涉滤波器12与吸收滤波器13的漏率的积，因此在荧光侧滤波器部Fem整体中成为10-9数量级的漏率。
如图2A所示，荧光侧滤波器Fem包括多层膜干涉滤波器12和吸收滤波器13，多层膜干涉滤波器12包括透明支承体12a和多层干涉膜12b。优选具有如下结构：来自试样的光按照箭头所示那样依次通过多层干涉膜12b、透明支承体12a以及吸收滤波器13。当设为该顺序时，透明支承体12a、吸收滤波器13即使在发出荧光时，由多层干涉膜12b减光而得到的光也通过透明支承体、吸收滤波器，因此荧光被减弱。当然，透明支承体12a和吸收滤波器13的材质优选使用自身的荧光发出量较少的物质。作为吸收滤波器13如图2B的透过波长特性43示出那样需要光源15的发光光谱51的主波长带28的光透过率足够小。多层膜干涉滤波器12的光透过特性42的主波长带28的光透过率也足够小，利用多层膜干涉滤波器12和吸收滤波器13双重地防止激励光的散射光漏出到二维检测器38侧。此外，在图2中，多层膜干涉滤波器12和吸收滤波器13分开，但是也可以是利用粘接剂粘合而合成的一个滤波器。并且，还能够利用不使用透明支承体12a而对吸收滤波器本身蒸镀多层干涉膜12b的方法。另外，也可以在多层膜干涉滤波器12后重叠两个吸收滤波器。重叠两个的效果与增加吸收滤波器的厚度的情况等效，但是荧光波长的透过率稍微降低。即，为了对调节所需阻止波长的阻止率以及获得的荧光捕捉效率良好的适合点进行选择，能够调节吸收滤波器的厚度和位数。
此外，市场上销售一种将吸收滤波器与多层膜干涉滤波器进行合成而得到的滤波器，该吸收滤波器具有图2C的曲线44那样的透过波长特性，根据曲线44可知，该吸收滤波器几乎不遮挡光源15的主波长带的光。有时在多层膜干涉滤波器中在短波长侧出现图2C的曲线42a那样的透过频带，以“切下”该透过频带为目的而将上述吸收滤波器与多层膜干涉滤波器进行合成。本发明的荧光侧滤波器部Fem所需的吸收滤波器并非这样的短波长侧透过频带的“切下”用滤波器，而是具有与多层膜干涉滤波器一起双重地遮挡单波长光源的放射51a的特性。
此外，说明具有曲线43那样的透过波长特性的吸收滤波器如果将光源15的光谱51进行某种程度的减光而对吸收滤波器的增强能力是否有效。在图16的说明中所说明那样，在串行配置两个多层膜干涉滤波器的情况下，仅降低荧光侧滤波器部Fem整体的漏率一位左右。因而，如果吸收滤波器的增强能力(漏率)为10％以下，则能够得到大于多层膜干涉滤波器的效果。
接着，参照图3说明光源15的例子。
光源装置30在光源安装底座70上具备四个LD 15a～15d。安装光源底座70是在与作为试样的小动物的体轴平行的方向上较长延伸的板状保持件，这四个LD 15a～15d在小动物的体轴方向上排列。在本例中，LD 15a和15c振荡相同波长(例如785nm)的光，其余两个LD 15b和15d振荡相同波长(例如690nm)的光。在这四个LD 15a～15d上分别重叠地安装有激励侧滤波器11a～11d，这些激光二极管和激励侧滤波器四个组能够将各个激励光向试样照射。
如上所述，通常LD在振荡波长带(主波长带)的拖尾波长频带中往往也伴随有较弱强度放射，但是拖尾部分的放射强度与主波长频带的放射强度相比在0.001(10-3)倍(将其称为系数f)以下。如果激励侧滤波器的荧光波长频带中的透过率为1×10-6左右，则在该荧光波长频带中的LD的发光强度为主波长带的f倍以下，因此能够将来自激励侧滤波器的荧光波长频带的漏光强度抑制为主波长频带的透过光强度的10-9倍以下。
另外，图3的照射单元30通过分别控制配置于不同位置的多个LD的点亮，不通过机械性结构而能够自由地选择激励光波长的切换、来自多个方向的激励的切换以及根据需要同时激励等，从而还能够得到欲检测荧光分子存在的新的位置。LD以及与LD成对的激励侧滤波器11的一般大小为1cm见方的方形以下，因此还具有在较狭窄的位置能够配置多个不同的光源这种优点。在图3的照射光源30中，还能够使用廉价的LED代替LD。激光二极管或者发光二极管除了具有抑制激励侧的杂散光的效果以外，还不存在无用波长域的发光，并且针对单位波长宽度的强度较大，因此还能够指出具有如下辅助优点：与将激励滤波器组合到卤光灯来选择波长的情况相比，能够得到较强激励光，从而有助于缩短测量时间、提高测量灵敏度。
接着，使用图7说明使用荧光色素吲哚花青绿(下面称为ICG)作为典型的测量对象的情况下的光源、激励侧滤波器、荧光侧滤波器各自的波长特性的组合。
ICG除了在800nm以上的近红外域中产生荧光的色素而广为人知以外，还正在作为肝功能检查用注射液而出售，预测将来还作为用于观察生物体内行为的荧光标识药物而使用而认知度会进一步提高。在图7中，曲线45为ICG的激励光谱图像化的曲线，曲线46为ICG的荧光光谱图像化的曲线，曲线51以箭头表示为将LD(波长785nm)的振荡光谱图像化的曲线。曲线41为激励侧滤波器的光透过光谱，去除存在于LD的振荡光谱中的800nm以上的测量放射光。另外，曲线42为构成荧光侧滤波器部的多层膜干涉滤波器的光透过光谱，曲线43为构成荧光侧滤波器部的吸收滤波器(备用滤波器)的光透过光谱。通过组合曲线42和43将LD的发光波长的漏光抑制为极小。曲线42和43的合成透过域46c为ICG的荧光光谱整体46中的长波长侧的一部分，是从整体发光光谱的一半起、仅占40％左右的捕捉范围。但是，与捕捉曲线46的荧光整体以提高荧光的检测灵敏度相比，完全去除该范围的漏光非常重要。激光强度、检测器的灵敏度具有足够大(例如两位左右)的余量，因此荧光光谱捕捉率少量降低也能够以它们的能力而被容易地补偿，因此不会成问题。因此，将46c从荧光的发光光谱波长域整体46中划分出来，设为“色素的发光中的利用波长域”。在本例中830nm～880nm。
在表1示出同样地对其它色素进行与图7的ICG相同研究来汇总的“光源、激励侧滤波器、荧光侧滤波器”各自的波长特性的组合。可以说表1是与几个色素有关的本发明的应用例。图8示出本表中的半导体激光器(LD)以及吸收滤波器的波长特性。
[表1]
Figure BPA00001331094000211
LD示出四种(LD658、LD690、LD785、LD808)。这些分别为658nm带、LD690带、LD785带、LD808带的半导体激光器。遗憾的是，无法自由选择实际应用的LD的波长而是提供一种分散波长的LD。其中，658nm±10nm、LD690nm±10nm、LD785nm±10nm、LD 808nm±10nm波长的LD廉价而较多提供，因此以658nm带、690nm带等这种表现记述在表1中。另外，吸收滤波器记述了R70、R72、IR76、IR83、IR85这五种滤波器。这些是由HOYA CANDEO OPTRONICS CORPORATION作为锐截止滤波器而提供的玻璃滤波器。另外，还从德国肖特公司(Schott AG)提供相同的玻璃滤波器。能够将LD658与R72进行组合，将LD690与IR76进行组合，将LD785与IR83进行组合，将LD808与IR85进行组合。还能够选择LD658与R70进行组合。以通常透过率为50％的波长规定这些锐截止滤波器，50％透过波长被指定为XXXnm，因此在表1中以50％透过波长特定吸收滤波器。此外，吸收滤波器的50％透过波长的有效范围有一定幅度，该幅度基于如下条件：短波长侧在能够阻止LD的波长的10％透过的范围内透过率不会极度下降，长波长侧在表的最右栏示出的色素的荧光发光波长内的利用波长范围内透过率不会极度下降。将根据该研究选择的有效范围记载于“50％透过波长的有效范围”一栏。与设为测量目的的荧光色素一起将这些组合进行一栏显示。
图5A以及图5B是关于漏光降低效果将实际测量数据进行图表化的图。图5A是使用钨丝灯作为光源的情况，图5B是使用LD作为光源的情况。图5A的曲线A1为激励光的光谱，曲线A2为在荧光侧滤波器部Fem中没有配置吸收滤波器的情况即透过图13的(b)的滤波器12的光的光谱，曲线A3为在荧光侧滤波器部Fem中配置了吸收滤波器的情况即透过图14的(b)的滤波器13的光的光谱。图5B的曲线B 1为激励光的光谱，曲线B2为在荧光侧滤波器部Fem中没有配置吸收滤波器的情况下透过荧光侧滤波器部Fem的光的光谱，曲线B3为在荧光侧滤波器部Fem中配置了吸收滤波器的情况即透过图15的(b)的滤波器13的光的光谱。
在曲线A2中形成相当于Sex和Sem的山形。Sex的山形与激励光强度相比小4～5位左右，但是即使这样也是相当大的漏量。与此相对，Sem的山形与激励光强度相比小六位左右，为Sex的三十分之一左右。右侧的曲线A3为进一步通过吸收滤波器的相当于图14的情况，吸收滤波器的遮挡能力较好地起作用而Sex降低两位以上而变得非常小。相反Sem变得更明显。因为Sem的波长域中的连续光源的放射强度较强，所以Sem不怎么降低。
曲线B1为激励光的光谱，峰值部分的大小为1010左右大小的值。当该值通过荧光侧多层膜干涉滤波器时，如曲线B2所示成为104左右。即，由于多层膜干涉滤波器而强度下降六位。即使这样Sex的山形大于Sem的山形三位以上。
最后，在追加吸收滤波器来测量的曲线B3中激光的峰值下降到不足10，与原1010相比降低近九位。Sem稍微凸起而比鼓起B2的时刻相比稍微增加，考虑这是因为吸收滤波器本身发出的荧光引起的，但是较低级别。表2表示对图中的各个山形Sex、Sem的面积进行计算而得到的数值，表示漏光强度各自的情况的数值。根据该表可知，没有吸收滤波器时的Sex在钨丝灯激励时为3000、在LD激励时为2200左右而与其它情况相比具有较大的漏率。
[表2]
Figure BPA00001331094000231
表3是进一步从表2求出的漏率的计算例。漏率是将对A1或者B1进行积分而得到的光源的放射强度L设为分母而将各漏光的强度设为分子而求出的比率。
[表3]
钨丝灯激励时，在没有吸收滤波器的情况下的激励波长漏率为5×10-5，放入吸收滤波器后激励波长漏率改善为2×10-7，总漏率中也被改善为1×10-6；LD激励时，在没有吸收滤波器的情况下的激励波长漏率为8×10-7，放入吸收滤波器后激励波长漏率被改善为3×10-9，总漏率也被改善为8×10-9。在将钨丝灯设为光源时总漏率的降低在1×10-6停止是因为荧光侧不会降低。即使这样由于吸收滤波器而总漏率成为五十分之一，因此可以说即使不使用激光时也非常有用。这是因为漏光的最主要因素为“激励侧漏光”。这样，首先吸收滤波器起作用，总漏率下降，当设为单波长光源时进一步下降。
接着，图6示出在获取图像时如实表示吸收滤波器的效果的例子。在使用LD光源降低激励侧引起的漏光Sem的条件下，针对有无吸收滤波器来进行图像性能比较(由荧光侧遮挡能力引起的漏光的比较)。试样是图6的(e)示出的圆筒状的乳白色树脂31a中心的稍左侧埋入了填充有作为荧光色素的ICG液的短管31b的试样，应该检测出乳白色树脂本身的荧光以及中心左侧的ICG的荧光。
图6上部的左图(a)是没有配置吸收滤波器时的图像，右图(b)是配置了吸收滤波器时的图像。如左图(a)所示，在没有配置吸收滤波器时在画面整体上漏光较多而明显地出现凹凸背景，无法清楚地捕捉乳白色树脂的荧光轮廓。另一方面，在右图(b)中，漏光较少因此背景几乎成零，从而能够清楚地捕捉乳白色树脂的荧光以及ICG的荧光。这些图像(a)、(b)下部的图表(c)、(d)是在左右方向上测绘上部图像的中央截面的光检测强度而得到的图表。在左图(a)中背景(漏光)达到中央试样信号的十分之二，与此相对，在右图(b)中背景几乎降到零水平，试样不被背景掩盖而能够进行检测。
[实施例2]
根据图4说明将本发明应用于使用显微镜的微试样的情况。
该图与普通荧光显微镜几乎相同。在荧光显微镜中激励侧和荧光侧的功能主要部分粘贴两个棱镜而得到的方形分束器61，配置有与分束器61的两个面成对的激励侧滤波器11(Fex)和荧光侧滤波器部(Fem)。荧光侧滤波器部(Fem)包括多层膜干涉滤波器12和吸收滤波器13，这与以往的荧光显微镜不同。光源15为单波长光源，但是也可以是连续波长光源。
作为最后的强调点，根据图9说明吸收滤波器所需要的遮挡波长域。吸收滤波器与多层膜干涉滤波器不同，一般利用物质的吸收，因此无法自由地选择波长，难以使贯穿透过域至遮挡域的倾斜尖锐。因此，期望吸收滤波器的波长限制较缓和，因此研究需要的限制。在图9的单波长光源的放射光强度特性51中存在集中了大半的光的主波长带28以及其拖尾部分的波长域29。吸收滤波器的透过特性43的作用在于，通过与多层膜干涉滤波器的透过特性42一起双重遮挡来不使激励光源的光51a通过。
在此，重要点是，双重遮挡不需要在激励侧滤波器的透过域Δλex整体范围内而仅在其中的激励光源的主波长的范围28内即可。吸收滤波器的透过特性43的斜率一般较缓和，因此在图6的例子中从长波长侧(图的右侧)起向左逐渐下降，在比主波长范围28长一点点的波长处透过率几乎成零。仅在该范围内例如实现漏率10-9即可。主波长带拖尾部分的放射强度与开始相比不足f倍(三位以上)，因此该部分的遮挡即使不使用双重遮挡而仅使用荧光侧多层膜干涉滤波器也是足够的。
这样，再次总结本方式的漏光遮挡的方法。对由荧光侧滤波器的缺陷引起的激励侧漏光，根据42和43的特性而进行九位的遮挡，另一方面，对由激励侧滤波器的缺陷引起的荧光检测波长的漏光，将多层膜干涉滤波器特性41的六位遮挡能力以及测量波长域51b的激励光源的与开始相比放射不足三位以上的f效果进行组合而成为九位遮挡，由激励侧、荧光侧两者实现九位遮挡。
接着，在主波长的范围28逐渐扩大而接近多层膜干涉滤波器41的透过幅度λex时(相当于光源为LED的情况)，一部分放射露出到43的特性的外侧。这样一来，所露出的部分从双重遮挡偏离，因此应该成为九位的遮挡能力下降到八位等而形成稍差的遮挡率。当光源进一步扩大而形成连续光源时，在附加在特性42上时，43不再起作用而仅成为干涉滤波器的遮挡特性的六位。因而可以说，对本发明的双重遮挡方式来说，使用主波长的波长幅度ΔλLS较窄的LD时最容易提高效果，使用LED时虽能力有所下降但仍有某种程度的效果，使用连续光源时遮挡效果减小。

Claims (14)

1.一种荧光图像检测装置，具备：
激励光源，其激励试样的荧光；
二维检测器，其用于检测从上述试样发出的荧光；
激励侧滤波器，其被配置在上述光源与试样之间；以及
荧光侧滤波器部，其被配置在上述试样与二维检测器之间，用于取出从试样发出的荧光而引导到上述二维检测器，
上述激励侧滤波器具有阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光的透过波长频带，
上述荧光侧滤波器部包括干涉滤波器和吸收滤波器，上述干涉滤波器和吸收滤波器被串行配置在上述荧光的行进方向上，上述干涉滤波器和吸收滤波器被组合成：在它们组合得到的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含上述激励侧滤波器的透过波长频带。
2.根据权利要求1所述的荧光图像检测装置，其特征在于，
上述吸收滤波器在上述激励侧滤波器的透过波长频带中的透过率为10％以下。
3.一种荧光图像检测装置，
上述激励光源为单色激励光源，
上述激励侧滤波器的透过波长频带使上述单色激励光源的主波长的光透过，
构成上述荧光侧滤波器部的吸收滤波器在上述单色激励光源的主波长的波长域中具有10％以下的低透过率。
4.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，
上述光源为发射以785nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在800nm～860nm的范围内。
5.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，
上述光源为发射以690nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在720nm～780nm的范围内。
6.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，
上述光源为发射以658nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在690nm～740nm的范围内。
7.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，
上述光源为发射以808nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在820nm～870nm的范围内。
8.一种荧光图像检测方法，利用荧光图像检测装置来检测荧光图像，该荧光图像检测装置具备如下部分：激励光源，其激励试样的荧光；二维检测器，其用于检测从上述试样发出的荧光；激励侧滤波器，其被配置在上述光源与试样之间；以及荧光侧滤波器部，其被配置在上述试样与二维检测器之间，用于取出从试样发出的荧光而引导到上述二维检测器，
该方法使用具有如下透过波长频带的滤波器作为上述激励侧滤波器，该透过波长频带阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光，
将干涉滤波器和吸收滤波器串行配置在上述荧光的行进方向上作为上述荧光侧滤波器部，使用如下组合得到的上述干涉滤波器和上述吸收滤波器：在它们组合得到的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含上述激励侧滤波器的透过波长频带。
9.根据权利要求8所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
使用单色激励光源作为上述激励光源，
使用具有如下透过波长频带的滤波器作为上述激励侧滤波器，该透过波长频带使上述单色激励光源的主波长的光透过，
使用在上述单色激励光源的主波长的波长域中的透过率为10％以下的滤波器作为上述荧光侧滤波器部的上述吸收滤波器。
10.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
上述激励光源为发射以785nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在800nm～860nm的范围内。
11.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
上述激励光源为发射以690nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在720nm～780nm的范围内。
12.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
上述激励光源为发射以658nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在690nm～740nm的范围内。
13.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
上述激励光源为发射以808nm±10nm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50％透过波长在820nm～870nm的范围内。
14.根据权利要求9、10或者13所述的荧光图像检测方法，其特征在于，
上述试样包含吲哚花青绿作为荧光色素。
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