CN101021476A - 毛细管电泳－多光子激发荧光柱上检测仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛细管电泳—多光子激发荧光柱上检测仪，该检测仪包括半导体激光器、物镜、计算机、采集卡、光电倍增管、二向色镜、带通滤光片、全反射镜、铂电极、直流高压电源、第一、第二缓冲池和柱上检测器。柱上检测器采用特氟龙管，将方形毛细管和圆形毛细管连接起来，其中圆形毛细管用来分离(实验证明方形毛细管分离效果没有圆形的好)，而方形毛细管用于柱上检测。荧光柱上探测的方形毛细管与用于分离的圆形毛细管结合起来，实现柱上检测，不但简化了传统实验设备，降低实验设备成本，简化了复杂操作的柱后检测方式，而且提高了探测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于高灵敏度多光子荧光检测技术，具体涉及一种毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪。
背景技术
毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)作为分离分析技术，具有分离效率高、分析时间短和进样量小等优点，且操作简单，容易实现自动化。随着分离模式的多元化和探测技术的创新，使得毛细管电泳在生命科学、环境卫生和药物等领域得到了广泛应用。
多光子荧光(Multi-photon Excited fluorescence，MPF)技术作为新的检测技术，具有激发体积小(10-18L)、光损伤和光毒性小(采用近红外激光)、灵敏度高(zmol-ymol水平探测限)和背景噪声低等特点。近几年来，多光子激发荧光技术在细胞化学成像和氨基酸、蛋白质、神经递质等生命活性物质分析应用中倍受重视。
Shear和Song等人最先将毛细管电泳和多光子荧光技术结合在一起。Song通过该技术在amol(10-18mol)检测了Coumarine和DDCS(见Song JM，Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excited fluorescence incapillary electrophoresis.Journal of chromatography A，1997，765：351-319)，Shear等人用多光子系统研究荧光标记的神经递质，探究囊泡的分泌，探测极限在1000个分子以下(Shear J，Brown E B Webb W.Mutiphoton-excited fluorescence offluoregen-labeled neurotransmitters.Analytical Chemistry，1996，68(10)：1778--1783)。
由于多光子荧光过程是指在一个分子极短的时间内相继吸收长波长两个光子，一般两个光子吸收的时间差小于0.1飞秒(1飞秒＝10-15秒)，然后发射一个短波长的荧光光子，因此，要实现多光子激发荧光，在激发点必须有足够大的光子密度，故一般采用大数值孔径的物镜。而大数值孔径的物镜的焦距大概只有150微米左右，对圆形毛细管，考虑到圆形毛细管壁对激发光路和荧光收集光路的影响，所以一般采用柱后检测。柱后检测存在的困难是：i)、柱后检测存在对焦点问题，将物镜的焦点对准毛细管出口中心，采用CCD检测，增加了检测系统的设备成本，而且实验操作变得复杂；ii)、柱后检测存在杂物堆积问题，实验中毛细管中流出的物质，很容易堆积在检测窗口处，不利于激发和荧光检测；iii)、柱后检测存在清洗问题，由于毛细管一端是检测窗口，使得毛细管清洗工作复杂，必须将毛细管检测端移离到清洗池，存在二次对焦难题。总之，传统的检测装置采用复杂的柱后检测，实验操作繁琐，成本高，而且重复性较差，灵敏度也受影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪，该检测仪具有系统结构简单、成本低和操作简便的特点。
本发明提供的毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪，包括半导体激光器、物镜、计算机、采集卡、光电倍增管、二向色镜、带通滤光片、全反射镜、铂电极、直流高压电源和第一缓冲池，其特征在于：该检测仪还包括第二缓冲池和柱上检测器，该柱上检测器由圆形毛细管、方形毛细管和特氟龙管构成，特氟龙管通过嫁接将方形毛细管和圆形毛细管连接起来；方形毛细管和圆形毛细管的另一端部分别位于第一、第二缓冲池内；半导体激光器发出的光束由依次二向色镜和全反射镜两次反射后，进入物镜，聚焦到柱上检测器，实现双光子激发荧光，荧光同时被物镜收集，经过全反射镜反射，依次透过二向色镜和带通滤光片，被光电倍增管探测并实现放大，并通过采集卡送入计算机，由计算机完成荧光信号数据处理；直流高压电源的二个铂电极分别位于第一、第二缓冲池内，直流高压直接加在柱上检测器的两端，样品在柱上检测器内实现分离和多光子荧光检测。
本发明通过嫁接的方法，采用特氟龙管，将方形毛细管和圆形毛细管连接起来，其中圆形毛细管用于分离，方形毛细管用于柱上检测。采用毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪，省去了用于聚焦的CCD监控装置，不但简化了传统实验设备，降低实验设备成本，简化了复杂操作的柱后检测方式，而且提高了探测灵敏度。本发明提供一种经济的检测手段，适合多光子荧光检测，特别适合于生物体内荧光基团的多光子激发荧光检测。它改变传统的多光子激发荧光信号柱后检测法，实验表明，采用本发明检测仪既保留了圆形毛细管分离的效果，又简化了实验装置和实验操作，同时提高了探测灵敏度。具体的试验数据说明见具体实施方式部分。
附图说明
图1为本发明毛细管电泳-多光子激发荧光柱后检测仪的结构示意图；
图2为图1中柱上检测器的局部结构放大示意图；
图3为圆形柱后检测多光子荧光毛细管电泳分离图；
图4为方形柱上检测多光子荧光毛细管电泳分离图；方形100微米；柱上检测，长度57/50厘米；电压20kV；其他同上；
图5为本发明的毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪得到的多光子荧光毛细管电泳分离图。75微米圆形-100微米方形-75微米圆形；柱上检测，长度57/50厘米；电压20 kV；其他同上。
具体实施方式
本发明毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪采用的是柱上检测，它包括光路和电泳二部分。下面结合附图和实例对本发明作进一步详细的说明。
如图1所示，光路部分包括半导体激光器1、物镜3、计算机9、采集卡10、光电倍增管11、二向色镜12、带通滤光片15和全反射镜13。半导体激光器1发出的光束由二向色镜12和全反射镜13两次反射后，进入物镜3，聚焦到柱上检测器14，实现双光子激发荧光后，荧光同时被物镜3收集，经过全反射镜13反射，透过二向色镜12和带通滤光片15，荧光被光电倍增管11探测并实现放大，送给采集卡10，由计算机9完成荧光信号数据处理，实现定性和定量分析；
电泳部分包括铂电极8、直流高压电源2、第一41、第二缓冲池42和柱上检测器14。直流高压通过插在二个缓冲池41，42的铂电极8，直接加在柱上检测器14的两端，样品在柱上检测器14内实现分离和多光子荧光检测。
如图2所示，柱上检测器14由圆形毛细管5、方形毛细管6和特氟龙管7构成。通过嫁接的方法，采用特氟龙管7，将方形毛细管6和圆形毛细管5连接起来。柱上检测器14的功能如下：i)圆形毛细管：用于电泳分离；圆形毛细管具有中心对称性，在高压电场下，各个部分的电荷分布要均匀，减少了分离物质的附着，有利于分离；ii)特氟龙管：用于圆形和方形毛细管连接；特氟龙管将圆形毛细管和方形毛细管结合起来，使之连接处死体积几乎为零，保证电泳分离的连续性；iii)方形毛细管：用于荧光探测；方形毛细管是内外都是平面，高倍物镜可以直接将激发光束聚焦到方形毛细管中间。与圆形毛细管不同，方形毛细管因为管壁是一个平面结构，对聚焦光束和聚焦点几乎没有影响，可以实现多光子荧光激发和收集。
本发明采用方形毛细管柱上检测代替传统的圆形毛细管柱后检测。实验操作简单，不需要添加任何其他辅助设备，降低了实验设备成本；特别是实验过程中方便清洗，而且从管口流出的杂质也不会造成检测窗口污染，有利于荧光的探测和收集。
实例
为了实验论证本发明的可行性和科学性，我们实验选择多种苯胺(9种，具体见表1)混和衍生后，采用多光子激发荧光方法，在三种不同的分离和检测状态下，实现苯胺的分离和检测：采用传统的圆形毛细管分离柱后检测和方形毛细管分离柱上检测；采用本发明的毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测的分离检测。
上述对比实验如下，实验证明，圆形毛细管分离效果要优于方形毛细管，而它的检测灵敏度不于方形毛细管，实验具体如下：
1.圆形毛细管柱后检测电泳图谱如图3，物镜将近红外光束聚焦在毛细管阴极端的出口中心，通过CCD实现对焦。实验参数：圆形75微米；长度50厘米；电压18kV；缓冲液：25mmol/L硼砂，用1mol/L NaOH溶液调节到pH 11；FITC和苯胺分子数比为10比1混和，漩涡混匀，于暗处室温25℃衍生反应12小时；苯胺浓度依次是：2.69、3.43、2.39、2.49、2.63、2.74、3.36、2.64、2.95×10-5mol/L；虹吸进样：15cm，60s。
2.方形毛细管柱上检测如电泳图谱如图4，物镜直接透过方形毛细管管壁，聚焦在方形毛细管中心。实验参数：方形毛细管的管壁厚度为130微米，其内腔的边长为100微米；柱上检测，长度57/50厘米；电压20kV；其他同图3。
3.方圆结合的柱上检测——毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测电泳图谱如图5。它采用特氟龙管将圆形毛细管和方形毛细管连接起来，圆形毛细管用来分离待测物，方形毛细管作为探测窗口，物镜将近红外光束直接透过方形毛细管的方形平面，聚焦在方形毛细管中央，实现多光子激发荧光和荧光收集。实验参数：75微米圆形-100微米方形-75微米圆形；柱上检测，长度57/50厘米；电压20kV；其他同上。
实验电泳图谱比较说明，采用本发明能够提高分离效率和灵敏度。
表1 苯胺中英文对照及其编号
| 编号 | 名称 | 英文名称 |
| 1 | 对甲苯胺 | p-Toludine |
| 2 | 苯胺 | Aniline |
| 3 | 对氯苯胺 | p-Chloroaniline |
| 4 | 对乙氧基苯胺 | p-ethoxyaniline |
| 5 | 4-溴苯胺 | 4-Bromoaniline |
| 6 | 3-溴苯胺 | 3-Bromoaniline |
| 7 | 间氨基苯酚 | m-aminopheol |
| 8 | 邻氨基苯酚 | o-aminopheol |
| 9 | 对苯二胺 | 1，4-diaminobenzene |
备注：编号按照其电泳图谱中峰次顺序标定
Claims (1)
1、一种毛细管电泳-多光子激发荧光柱上检测仪，包括半导体激光器(1)、物镜(3)、计算机(9)、采集卡(10)、光电倍增管(11)、二向色镜(12)、带通滤光片(15)、全反射镜(13)、铂电极(8)、直流高压电源(2)和第一缓冲池(41)，其特征在于：该检测仪还包括第二缓冲池(42)和柱上检测器(14)，该柱上检测器14由圆形毛细管(5)、方形毛细管(6)和特氟龙管(7)构成，特氟龙管(7)通过嫁接将方形毛细管(6)和圆形毛细管(5)连接起来；方形毛细管(6)和圆形毛细管(5)的另一端部分别位于第一、第二缓冲池(41、42)内；
半导体激光器(1)发出的光束由依次二向色镜(12)和全反射镜(13)两次反射后，进入物镜(3)，聚焦到柱上检测器(14)，实现双光子激发荧光，荧光同时被物镜(3)收集，经过全反射镜(13)反射，依次透过二向色镜(12)和带通滤光片(15)，荧光被光电倍增管(11)探测并实现放大，并通过采集卡(10)传送给计算机，由计算机(9)完成荧光信号数据处理；
直流高压电源(2)的二个铂电极(8)分别位于第一、第二缓冲池(41、42)内，直流高压直接加在柱上检测器(14)的两端，样品在柱上检测器(14)内实现分离和多光子荧光检测。
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