CN1226611C - 基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。激光器采用半导体激光器，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜和全反射镜的反射后进入物镜，物镜将光束聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光被物镜所收集，在全反射镜反射，透过二向色镜，经带通滤光片组过滤后，荧光通过并到达光电倍增管，将荧光放大后送给数据采集卡，再传送给计算机加以处理完成。本发明为柱后检测法，特别适合于生物体内荧光基团的检测。具有检测灵敏度高、成本低、噪声低和操作简单的特点，其检测极限从10-6M提高到10-9M。
Description
技术领域
本发明属于生物化学微量检测技术，具体涉及一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。它采用近红外波长的半导体激光器，通过连续光多光子激发待测的微量物质，并实现荧光检测。
背景技术
高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)是近十几年来发现的一种新型分离分析技术，具有分离效率高、分析时间短和进样量小等优点，且容易实现自动化，操作简单，广泛用于多肽和蛋白质、环境食品、DNA序列分析和单细胞检测。
HPCE，由于电泳的有效体积和进样量小，对检测器有更高的要求，故检测技术成为HPCE发展的关键。目前应用较多的检测方法有UV吸收、激光诱导荧光(Laser-induced fluorescence，LIF)、质谱和电化学检测等方法。
LIF是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法，已达到单分子检测极限，LIF成为HPCE分析中的热点之一。同时常用的LIF方法也面临一些问题：大多数生命物质在可见光区激光激发下不产生荧光，需要荧光探针标记；紫外光可以激发生命活性物质产生荧光，但紫外光的光毒性、光降解和光漂白又不利于单细胞分析和在体分离检测。
近年来，多光子激发荧光(Multi-photon Excitation，MPE)技术在细胞化学成像和氨基酸、蛋白质、神经递质等生命活性物质分析中的应用倍受重视。多光子激发具有激发体积小，光损伤和光毒性小，背景噪声低等特点。将多光子荧光激发技术和毛细管电泳技术联用，能发挥多光子激发荧光的优点，在分析化学和生命科学领域开展更多的应用研究。1997年Song等人(见Song J M，Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excitedfluorescence in capillary electrophoresis.Journal of chromatography A，1997，765：351-319)最先将毛细管电泳和多光子激发荧光技术结合起来，在amol(10-18mol)检测了Coumarine(7-anino-4-methyl coymarine)和DDCS(7-Diethy Aminocoumarine-3-acidsuccinimidyl ester)。Shear等人(Shear J，Brown E B Webb W.Mutiphoton-excitedfluorescence of fluoregen-labeled neurotransmitters.Analytical Chemistry，1996，68(10)：1778-1783)曾用多光子系统研究荧光标记的神经递质，探究囊泡的分泌，探测极限在1000个分子以下。他们所用的光源是锁模飞秒激光器。但是，昂贵的飞秒锁模激光器限制了多光子激发荧光技术的推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服现有技术缺陷，基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。它具有检测灵敏度高、成本低和噪声低的特点。
本发明提供的一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，它由激发光源、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理四部分构成，其中毛细管电泳部分由检测池，毛细管、缓冲池和直流高压电源组成。本系统基本工作过程是：激光器采用半导体激光器，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜和全反射镜的两次反射后进入物镜，物镜将光束聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口中心使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光同时被物镜所收集，在全反射镜反射，透过二向色镜，经带通滤光片组过滤后，荧光到达光电倍增管，光电倍增管将荧光信号放大后送给数据采集卡，再传送给计算机加以处理完成。
本发明为生物、医学和化学等学科提供一种经济的检测手段，适合微量物质检测，特别适合于生物体内荧光基团的检测。它采用近红外的连续光光源，实现多光子激发；荧光信号检测方法采用柱后检测法。本发明具有检测灵敏度高、成本低、噪声低和操作简单的特点。实验证明，柱后检测方法更适合连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，并且检测极限从10-6M提高到10-9M，具体的试验数据说明见具体实施方式部分。
附图说明
图1为柱上和柱后检测的比较示意图，(a)柱上检测图(b)柱后检测图；
图2为本发明的结构示意图；
图3为不同的浓度由高到低依次检测所得到荧光峰值结果；图中，(a)10-2mol/l、(b)10-3mol/l、(c)10-4mol/l、(d)10-5mol/l、(e)10-6mol/l、(f)10-7mol/l、(g)10-8mol/l；
图4为丁基Rhodamine B和Rhodamine B的分离图；a)10-3M丁基Rhodamine B的电泳谱图；b)10-4M Rhodamine B的电泳谱图；c)混合样品的分离。
具体实施方式
如图1所示，现有的激发荧光——毛细管电泳检测仪采用的是柱上激发，柱上检测法，见图1(a)；本发明采用柱后激发，柱后检测方法，见图1(b)。
如图2所示，本发明的连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪由激发光源、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理部分构成。各部分分别介绍如下：
激光器：采用半导体激光器5，提供激发光源，实现双光子激发。
毛细管电泳部分：由缓冲池1、毛细管2、检测池4和直流高压电源10构成，其作用是提供电场，驱动待测物质泳动，实现物质的高效分离，本系统检测采用柱后检测。
荧光检测部分：由物镜3，光电倍增管7、二向色镜12、全反射镜11和带通滤光组6构成；二向色镜12功能是对长波长的近红外激光反射，而对于物镜收集的短波长的荧光而言，则完全透射；带通滤光组6则过滤掉反射的近红外光，让短波长的荧光通过；光电倍增管实现探测并放大荧光信号。
数据处理部分：由数据采集卡8和计算机9构成，负责采集和分析荧光信号，实现定性和定量分析。
本发明采用光源是价格低的半导体激光器，发射激光波长是近红外光，经过二向色镜12和全反射镜11的反射后进入物镜3，光束因物镜3的会聚作用而聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口中心。待测的微量物质经过手动进样后，在电场力作用下由高电势流向低电势，由于不同的物质的电荷特性不同，因而所受的电场力不同，故泳动的速度就不同，导致物质到达检测出口的时间不同，进而实现空间上的分离。当待测物质达到检测出口时，在激光的照射下实现双光子激发。激发所产生的荧光同时被物镜3所收集，在全反射镜11反射，透过二向色镜12，经带通滤光片组6过滤后，只让荧光通过并到达光电倍增管7，光电倍增管将荧光放大后送给数据采集卡8，最后传送给计算机加以处理完成。
利用本发明提供的检测仪可以作定性和定量分析。
1定性分析：因为不同物质，其激发荧光波长不同，和它们的电荷特性各异，受到电场力不等，在毛细管中流动速度大小不一，所以到达检测窗口的时间顺序有先有后。只要我们选用合适的带通滤光片，结合对检测时间的分析就可得出待测物质的不同组分。
2定量分析：同一种物质，在毛细管中的运动速度相同，但是它的浓度的不同，导致在检测窗口照射时，浓度高的受激而产生荧光的几率就大(对一定范围内的浓度而言)，最后我们检测到的信号就要强。同一种物质不同浓度我们可以通过比较检测到的信号强度得出：信号强度高的对应浓度高，反之，浓度低的信号强度低。最后与标准样品比较就可以得出该样品浓度的准确值。
实例
上述检测仪的构成部件中，物镜3采用Olympus-CK40倒置荧光显微镜，半导体激光器5采用激光器HTYG-081，其波长为808nm，带通滤光片组6由440DCLP，BP590和D605/90组成，光电倍增管7采用R5070光电倍增管探测器，数据采集卡8采用fNIRI数据采集卡，计算机9采用赛扬800计算机，直流高压电源10采用±30KV/0.3mA直流高压电源。
采用上述实例中的荧光检测仪进行了下列实验，其实验过程、结果及分析如下：：
1配制不同浓度的Rhodamine B溶液：10-2mol/l；10-3mol/l；10-4mol/l；10-5mol/l；10-6mol/l；10-7mol/l；10-8mol/l。分别进行测量，得出本系统的线性工作区间范围：7×10-7-8×10-4mol/L。具体结果如下图3，对不同浓度样品的检测结果表明，浓度高的检测结果值就大。2对10-6mol/l和10-9mol/l样品进行柱上检测和柱后检测，两种检测方式比较得出(如表1)：柱后检测方式的灵敏度较高，背景噪声略低。
表1.对10-6mol/l和10-9mol/l两种浓度样品的柱上和柱后检测比较
柱上检测 柱后检测 柱后检测/柱后检测
峰值(10-6mol/l) 3.4 26.5 7.8
峰值(10-9mol/l) -- 5.4 --
备注：--表示检测不出来
3如图4所示，对10-3M丁基Rhodamine B和10-4M Rhodamine B及其混合后的样品测量结果分析相互比较，我们的实验结果准确可信。图4的试验条件如下：电泳条件：硼砂缓冲溶液(10mM，PH9.0)；丁基Rhodamine B10-3M，Rhodamine B 10-4M；毛细管65cm×75I.D.；分离电压18KV；虹吸进样，高度10cm，10s。其中图a是10-3M丁基Rhodamine B的电泳谱图；图b是10-4M Rhodamine B的电泳谱图；图c是混合样品的分离谱图。
Claims (1)
1、一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，由激光器、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理部分构成，所述毛细管电泳部分由检测池，毛细管、缓冲池和直流高压电源构成，其特征在于：所述激光器采用半导体激光器(5)，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜(12)和全反射镜(11)的反射后进入物镜(3)，物镜(3)将光束聚焦成一点，照射在毛细管(2)的检测出口中心使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光被物镜(3)所收集，在全反射镜(11)反射，透过二向色镜(12)，经带通滤光片组(6)过滤后，荧光通过并到达光电倍增管(7)，光电倍增管(7)将荧光放大后送给数据采集卡(8)，再传送给计算机(9)加以处理完成。
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