CN108169192A - 毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置 - Google Patents

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余方志
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Abstract

本发明涉及一种毛细管电泳‑连续波长双光子荧光偏振检测装置，主要由毛细管电泳分离单元、可调连续波长双光子荧光激发单元、荧光信号采集转换单元和数据处理单元等四部分组成。其基本工作原理为：在高压电场作用下，荧光物质在毛细管中进行迁移、分离；当其到达检测窗口时，荧光信号被飞秒激光器发射的高强度脉冲激光激发，并经过荧光偏振分光光学器件被分为垂直偏振光和水平偏振光，分别被高灵敏荧光探测器采集。在该装置中，荧光激发限定在飞升级小体积内，可实现对单粒子荧光的分辨与分析；另外，双光子激发产生的荧光偏振可以更为精细地反映生物分子构象和运动状态，为生物分子相互作用等前沿问题的研究提供了先进而有效的技术支撑。

Description

毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置
技术领域
本发明涉及一种毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，本装置将高效的毛细管电泳分离技术、高灵敏飞升体积双光子激光诱导荧光检测技术和荧光偏振检测技术结合为一体。采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为荧光激发光源，实现了电场分离中飞升体积选择性激发，可实现对单颗粒荧光的分辨分析。本装置为化学分析和生物分析提供了先进而有效的技术支撑。
背景技术
毛细管电泳-激光诱导荧光检测是一种将高灵敏荧光检测与高效率微分离相结合的现代先进分析技术，应用范围广，涉及环境科学、医药学、生物学等多个重要学科领域；其分析对象包括小分子药物、核苷、激素、多肽、蛋白质、核苷酸。即使不采用任何分离介质(如凝胶、线性聚合物等)，利用溶质在自由溶液中电迁移的不同也可实现分离。除此之外，毛细管电泳-激光诱导荧光技术还可应用于细胞和亚细胞器的分离分析。
荧光偏振是指当荧光分子受到平面偏振光激发时，荧光分子发射偏振光。荧光偏振响应与分子转动相关，而分子转动又与分子的大小相关。因此，可以简化为：荧光偏振是分子大小的函数；大体积分子转动慢，荧光偏振响应高，小体积分子转动快，荧光偏振响应低。利用这一原理，荧光偏振可应用于荧光免疫分析、生物分子相互作用研究。将毛细管电泳-激光诱导荧光检测与荧光偏振技术相结合，不仅保留了高效、快速分离和高灵敏检测等优点，同时还提供了荧光偏振信息，为研究生物大分子之间的相互作用提供了一种新的分析方法。
在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，这两个光子的能量可以加起来，使得荧光分子的电子跃迁至激发态，其荧光激发效果与短波长单光子激发效果相当。但是相对于传统单光子激发，双光子激发具有光漂白区域小、光毒性小、穿透力强和信噪比高等优点。为了达到很高的光子密度而又不损伤样品，双光子激发需要使用高能量超快脉冲激光器。
本发明在毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置的基础上，采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为激发光，从而在保留原来装置高效分离、高灵敏检测等优点的基础上，实现了电场分离中飞升小体积选择性激发，可实现对单颗粒荧光的分辨分析。本装置为化学分析和生物分析提供了先进而有效的技术支撑。
发明内容
本发明涉及一种毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，主要由毛细管电泳分离单元、双光子荧光激发单元、荧光信号采集转换单元和数据处理单元等四部分组成；其包含飞秒脉冲激光器、导致荧光显微镜、光学聚焦透镜、高压电源、铂电极、缓冲液瓶、石英毛细管、绝缘载物台、荧光偏振分光光学器件、滤光片、高灵敏荧光探测器、光电倍增管、电光调制器、科研级互补金属氧化物半导体相机等关键器件(见附图1)。其基本工作原理为：在高压电场作用下，荧光物质在毛细管中进行迁移、分离，当其到达飞升体积检测窗口时，荧光信号被飞秒激光器发射的高强度脉冲激光激发，并经过光学聚焦透镜和滤光片进入荧光检测系统，荧光偏振分光光学器件将荧光分为垂直偏振光和水平偏振光，分别被两个高灵敏荧光探测器采集，再经过光电倍增管转换为电信号，记录在计算机中以进行后期数据分析处理。
本装置采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为激发光(见附图1)，具有双光子激发所具有的光漂白区域小、光毒性小、穿透力强和信噪比高等优点。另外，双光子吸收对分子的转动状态更为敏感，因而其产生的荧光偏振更为精细地反映生物分子构象和运动状态，为解决生物化学分析和生物分子相互作用中等前沿问题提供了先进而有效的技术支撑。通过软件和电光调制器(见附图1)，可以调节激发光的波长和强度(功率)，从而使本装置适用范围更广。
本装置采用倒置荧光显微镜的二向色镜防止激发光进入荧光检测系统(见附图1)，从而能有效避免激发光造成的干扰，提高检测灵敏度。
通过光路选择调控元件可以选择科研级互补金属氧化物半导体相机或光电倍增管作为荧光检测器；通过科研级互补金属氧化物半导体相机相机可以观察检测窗口的位置，从而将其调节至焦平面，提高检测灵敏度和检测限。
本装置将毛细管电泳分离装置置于绝缘载物台上(见附图1)，从而有效避免高压放电危险，极大程度提高操作安全性。
附图说明
图1为毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置结构示意图。
图2为羟基荧光素(FAM)标记的DNA在科研级互补金属氧化物半导体相机中的成像照片。
图3为大肠杆菌同源重组酶RecA与单链DNA相互作用的毛细管电泳图。
具体实施方式
本发明所涉及的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置基本结构如图1所示。图中1为飞秒激光器；2位激光功率调控元件；3为聚焦透镜；4为二向色镜；5为物镜；6为绝缘载物台；7为缓冲液瓶；8为铂电极；9为石英毛细管；10为检测窗口；11为高压电源；12为计算机；13为电光调制器；14为光路选择调控元件；15为科研级互补金属氧化物半导体相机；16为滤光片；17为荧光偏振分光光学器件；18为高灵敏荧光探测器；19为信号转换器。
其工作原理为：石英毛细管(9)和铂电极(8)分别插入两端的缓冲液瓶(7)中，在高压电源(11)提供的高压作用下，荧光物质在毛细管中迁移、分离，由此构成毛细管电泳分离单元。为了避免高压放电危险，确保操作安全，毛细管电泳分离单元应置于绝缘载物台(6)上。飞秒激光器发射的高强度脉冲激光(1)经由二向色镜(4)反射到毛细管检测窗口(10)，通过计算机软件(12)和电光调制器(13)可调节激光的波长和强度(功率)，由此构成双光子荧光激发单元。当荧光物质迁移到检测窗口(10)时，其荧光信号被高强度脉冲激光激发，并经过光学聚焦透镜(3)和滤光片(16)进入荧光检测系统，荧光偏振分光光学器件(17)将荧光分为垂直偏振光(Iv)和水平偏振光(Ih)，分别被两个高灵敏荧光探测器(18)采集，再经过信号转换器(19)记录在计算机(12)中以进行后期数据分析处理，由此构成荧光信号采集转换单元和数据处理单元。在荧光信号采集单元中，激发光不能透过二向色镜(4)，被截留在荧光检测系统外面，从而能有效避免激发光造成的干扰，提高检测灵敏度。另外，通过光路选择调控元件(14)可以选择科研级互补金属氧化物半导体相机(15)作为荧光检测器，用以观察检测窗口(10)的位置，将其调节至焦平面，从而提高检测灵敏度和检测限。在数据处理单元，通过垂直偏振光(Iv)和水平偏振光(Ih)的信号强度，可以计算出荧光偏振(P)响应的值：
实施案例1：
图2为羟基荧光素(FAM)标记的DNA在本发明中的成像照片。实验条件：将1uM FAM标记的DNA(20碱基长度)注入内径边长为50微米的方形石英毛细管(总长度18cm，有效长度11cm)，调节物镜位置直至可清晰看见光斑，由此确定焦平面的位置以提高检测灵敏度和检测限。FAM在本发明的激发波长为790纳米。
实施案例2：
图3为大肠杆菌同源重组酶RecA与单链DNA相互作用的毛细管电泳图，上层为单链DNA的电泳图，下层为单链DNA与RecA反应后产物的毛细管电泳图。实验条件：50nM四甲基罗丹明标记的单链DNA(ssDNA,83碱基长度)与2uM RecA在反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2)反应10min后，采取电动进样(3千伏，5秒)将其注入方形毛细管(总长度18cm，有效长度11cm，外径360um，内径50um)中进行分离。分离电压为5千伏，分离电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，pH＝8.3)。应用本发明装置，可以在高灵敏检测的同时，得到不同峰的荧光偏振值，为研究生物分子间的相互作用提供了有效数据。如图所示，峰1-1、2-1为TMR内标的峰；峰1-2、2-2为游离单链DNA的峰，其偏振响应为0.09；峰2-3为RecA-单链DNA复合物的峰，其偏振响应为0.33。FAM在本发明的激发波长为840纳米。

Claims (6)

1.提出搭建毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测联用装置，主要由毛细管电泳分离单元、连续波长双光子荧光激发单元、荧光信号采集转换单元和数据处理单元等四部分组成；其包含飞秒脉冲激光器、倒置荧光显微镜、光学聚焦透镜、高压电源、铂电极、缓冲液瓶、石英毛细管、绝缘载物台、荧光偏振分光光学器件、滤光片、高灵敏荧光探测器、光电倍增管、电光调制器、科研级互补金属氧化物半导体相机等关键器件；其基本工作原理为：在高压电场作用下，荧光物质在毛细管中进行迁移、分离，当到达飞升体积检测窗口时，其荧光信号被飞秒激光器发射的高强度脉冲激光激发，并经过光学聚焦透镜和滤光片进入荧光检测系统，荧光偏振分光光学器件将荧光分为垂直偏振光和水平偏振光，分别被两个高灵敏荧光探测器采集，再经过光电倍增管转换为电信号，记录在计算机中以进行后期数据分析处理。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，其特征在于：与传统毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置不同，该装置采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为激发光，激发范围可限制在特定的飞升级小体积内，因而能够实现对单粒子的荧光检测及偏振分析；另外，双光子吸收对分子的转动状态更为敏感，因而其产生的荧光偏振更为精细地反映生物分子构象和运动状态。
3.根据权利要求1所述的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，其特征在于：采用飞秒脉冲激光器作为激发光源，可以调节激发光的红外波长，从而扩大可被检测物质的范围，使该装置的适用范围更广；通过电光调制器还可以调节激发光的强度(功率)。
4.根据权利要求1所述的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，其特征在于：激发光(飞秒脉冲激光)经过倒置荧光显微镜的二向色镜反射至检测窗口激发荧光信号；被激发的荧光透过二向色镜经聚焦透镜和滤光片进入荧光检测系统，被荧光偏振分光光学器件分离为垂直偏振光和水平偏振光后再分别由两个灵敏荧光探测器进行采集和记录，进而得到荧光物质的荧光偏振信息；而激发光不能透过二向色镜，被截留在荧光检测系统外面，从而能有效避免激发光造成的干扰，提高检测灵敏度。
5.根据权利要求1所述的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，其特征在于：通过光路选择调控元件可以选择科研级互补金属氧化物半导体相机或光电倍增管作为荧光检测器；通过科研级互补金属氧化物半导体相机相机可以观察检测窗口的位置，从而将其调节至焦平面，提高检测灵敏度和检测限。
6.根据权利要求1所述的毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，其特征在于：将毛细管分离装置置于绝缘载物台上，从而避免高压放电危险，极大程度提高操作安全性。
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