ES2942213T3

ES2942213T3 - Métodos y dispositivos para determinar una estructura huésped en una estructura anfitriona

Info

Publication number: ES2942213T3
Application number: ES19714865T
Authority: ES
Inventors: Iddo Heller; Anna Elisabeth Christina Meijering; Gijs Jan Lodewijk Wuite; Erwin Johannes Gerard Peterman; Andreas Sebastian Biebricher
Original assignee: Lumicks DSM Holding BV
Current assignee: Lumicks DSM Holding BV
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2019-02-05
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2039-02-05
Also published as: NL2020377B1; US11187656B2; US20210080394A1; WO2019151864A1; US20220057326A1; EP3749958A1; EP3749958B1; WO2019151864A8; US11885809B2

Abstract

Un aspecto de esta divulgación se refiere a un método para determinar la presencia de al menos una estructura huésped en una estructura anfitriona. El método comprende un sistema sensible a la luz que recibe luz de la estructura anfitriona. La estructura anfitriona alberga una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona. Aquí, la al menos una parte no aloja la al menos una estructura huésped. Además, las entidades ópticamente activas provocan la emisión de luz desde dicha al menos una parte. El método también comprende el sistema sensible a la luz que emite una señal basada en la luz recibida. El método comprende además determinar un valor de luz basado en la señal de salida. El valor de luz indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que incide sobre el sistema sensible a la luz. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y dispositivos para determinar una estructura huésped en una estructura anfitriona

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos, sistemas y programas informáticos para determinar la presencia de una estructura huésped biológica, tal como una proteína o un complejo de proteínas, en una estructura anfitriona biológica, tal como molécula de DNA. Esta invención también se refiere a métodos para permitir la determinación de al menos una de una cantidad y una posición de al menos una estructura huésped en una estructura anfitriona. Antecedentes

El análisis de las interacciones estructura anfitriona-estructura huésped es cada vez más importante, por ejemplo, para desentrañar los detalles de una amplia gama de procesos asociados con el DNA. Candelli, Wuite y Peterman, Phys. Chem. Chem. Phys., 2011, 13, 7263-7272) proporciona un método para tal análisis. En la presente memoria, se visualizan enzimas EcoRV etiquetadas de manera fluorescente que se unen de manera estable a una molécula de dsDNA. Con este fin, se usa microscopía de fluorescencia de campo amplio epiiluminada. Además, la molécula de dsDNA se mantiene entre dos microesferas ópticamente atrapadas en una configuración estirada, a una tensión de 40 pN. Este método permite determinar las posiciones de unión de la enzima de restricción EcoRV, una estructura huésped, sobre la molécula de dsDNA, la estructura anfitriona.

No obstante, de manera desventajosa, este método requiere el uso de estructuras huésped etiquetadas, en este caso enzimas etiquetadas. De este modo, las estructuras huésped han de ser etiquetadas antes de que se puedan estudiar. Desafortunadamente, etiquetar una estructura huésped puede ser desafiante y engorroso, por ejemplo, porque puede incluir una preparación de muestras que requiere mucha mano de obra o una modificación genética de la estructura huésped.

También, el método descrito anteriormente, en principio, solamente se puede aplicar para estudiar estructuras huésped etiquetadas. No obstante, el etiquetado no es, por definición, posible para cualquier estructura huésped dada. Por lo tanto, el método descrito anteriormente solamente se puede aplicar para estudiar un número limitado de estructuras huésped biológicas.

Además, etiquetar una estructura huésped puede impedir un análisis preciso. Etiquetar una estructura huésped puede influir en las propiedades de la estructura huésped bajo escrutinio. En un ejemplo, etiquetar una proteína o un complejo de proteínas con una entidad fluorescente puede cambiar sus propiedades de unión con respecto a una molécula de DNA, lo que impide un análisis preciso de estas propiedades de unión. El etiquetado también puede alterar la forma de la estructura huésped o su actividad. Además, a menudo el etiquetado no es completo en el sentido de que no se etiquetan todas las estructuras huésped implicadas en un experimento, como resultado de lo cual las estructuras huésped pueden pasar desapercibidas cuando están residiendo en la estructura anfitriona. Cell Reports, (2 de octubre de 2017), vol.18, páginas 2845-2853, Brouwer I et al: “Human RAD52 captures and holds DNA strans, increase DNA flexibility and prevents melting of duplex DNA: Implications for DNA recombination” describe la visualización de complejos RAD52 fluorescentes individuales que interactúan con moléculas de DNA únicas.

Nature, (28 de junio de 2016), vol. 535, páginas 566-568, Brouwer I et al: “Sliding sleeves of XRCC4-XLF bridge DNA and connect fragments of broken DNA” muestra, usando pinzas ópticas de doble y cuádruple trampa combinadas con microscopía de fluorescencia, cómo los complejos humanos XRCC4, XLF y XRCC4-XLF interactúan con el DNA en tiempo real.

El documento WO 97/22848 A1 describe un método de formación de imágenes espectrales dirigido a detectar y analizar hibridaciones fluorescentes in situ empleando numerosas pinturas cromosómicas y/o sondas específicas de lucus cada una etiquetada con un fluoróforo diferente o una combinación de fluoróforos.

El documento WO 93/10266 A1 describe un dispositivo y un método para la detección y cuantificación de compuestos que interactúan con ácidos nucleicos.

De este modo, existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados para analizar las interacciones de estructura anfitriona-estructura huésped que alivien al menos algunos de los problemas identificados anteriormente.

Compendio

Con ese fin, un aspecto de esta descripción se refiere a un método, opcionalmente implementado por ordenador, para determinar la presencia de al menos una estructura huésped biológica en una estructura anfitriona biológica. El método comprende un sistema sensible a la luz que recibe luz de la estructura anfitriona. La estructura anfitriona aloja una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona. En la presente memoria, la al menos una parte no aloja la al menos una estructura huésped. Además, las entidades ópticamente activas causan la luz emisión desde dicha al menos una parte. El método también comprende el sistema sensible a la luz que emite una señal en base a la luz recibida. El método comprende además determinar un valor de luz en base a la señal de salida. El valor de luz indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz. El método también comprende determinar sobre la base del valor de luz al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

La estructura huésped y la estructura anfitriona son estructuras biológicas, tales como una estructura microbiológica y/o una estructura celular y/o subcelular. La estructura huésped, por ejemplo, es una proteína o un complejo de múltiples proteínas y la estructura anfitriona es una molécula de DNA. Las entidades ópticamente activas pueden comprender moléculas intercaladoras de DNA. Alternativamente, la estructura anfitriona puede ser una membrana celular que comprende moléculas de lípidos y la una o más entidades ópticamente activas pueden comprender una molécula de lípido etiquetada de manera fluorescente que se puede mover en/a través de la membrana celular. La estructura anfitriona que no aloja localmente entidades ópticamente activas puede ser una consecuencia de que la estructura anfitriona aloja localmente estructuras huésped. La estructura anfitriona que aloja la estructura huésped se puede entender que comprende la estructura anfitriona que está unida a la estructura huésped, por ejemplo, con uno o más enlaces químicos, tales como enlaces covalentes y/o enlaces de hidrógeno y/u otras interacciones fuertes, tales como enlaces iónicos, enlaces polares y/o interacciones débiles, tales como fuerzas de VanderWaals , fuerzas electrostáticas, fuerzas debidas a hidrofobicidad/hidrofilicidad. Tal enlace puede cambiar localmente las propiedades de unión de la estructura anfitriona como resultado de lo cual la estructura anfitriona puede alojar un número reducido de entidades ópticamente activas. En un ejemplo, tal enlace puede evitar que la estructura anfitriona aloje cualquier entidad ópticamente activa en la posición del enlace.

Las entidades ópticamente activas pueden causar la emisión de luz desde la al menos una parte que no está alojando la al menos una estructura huésped, como resultado de las entidades ópticamente activas que se colocan en la al menos una parte además de las entidades ópticamente activas que emiten luz. Las entidades ópticamente activas pueden emitir luz en respuesta a la absorción de luz de excitación. En un ejemplo, las entidades ópticamente activas son entidades fluorescentes que emiten luz fluorescente. Dado que la presencia de una estructura huésped en una posición particular puede reducir al mínimo el número de entidades ópticamente activas en la posición particular, la estructura anfitriona puede emitir, en esta posición particular, menos luz hacia el sistema sensible a la luz.

Ópticamente activo se puede entender que se relaciona con cualquier proceso que comprenda una interacción luzmateria, por ejemplo, absorción, fluorescencia, cambio de polarización, fosforescencia, bioluminiscencia, retardo de fase, emisión estimulada.

El valor de luz puede indicar una cantidad de luz en el sentido de que indica un número de fotones incidentes sobre el sistema sensible a la luz y/o una intensidad de luz incidente sobre al menos parte del sistema sensible a la luz. El método permite estudiar con más precisión las interacciones entre una estructura huésped y una estructura anfitriona. Ventajosamente, el método descrito no requiere ningún etiquetado de la estructura huésped. Por lo tanto, se alivian los inconvenientes asociados con el etiquetado de estructuras huésped. Se reduce el número de pasos de etiquetado bioquímico y tales pasos, incluso, se pueden evitar por completo. Además, el método descrito permite estudiar una amplia variedad de estructuras huésped, por ejemplo, proteínas de tipo salvaje en lugar de proteínas etiquetadas, lo que no solamente aumenta la precisión de los análisis porque sus propiedades no se ven influenciadas por una etiqueta, sino que también realza la relevancia biológica de tales estudios. Además, el método no requiere etiquetar permanentemente la estructura anfitriona o huésped, lo que evita problemas asociados con el fotoblanqueo y/o el fotodaño de las etiquetas permanentes implicadas.

El método no requiere el etiquetado de la estructura huésped, porque la estructura anfitriona aloja entidades ópticamente activas en partes que no están alojando una estructura huésped. Las estructuras huésped y las entidades ópticamente activas se puede entender que están en competencia por posiciones en la estructura anfitriona en el sentido de que la estructura anfitriona no puede, al menos en menor medida, alojar simultáneamente una estructura huésped y una entidad ópticamente activa en la misma posición. Esto puede ser consecuencia de que la estructura huésped ocupa sitios de unión en las estructuras anfitrionas y/o de interacciones estéricas entre la estructura huésped y al menos una de las entidades ópticamente activas en la estructura anfitriona. De este modo, la emisión de luz de la estructura anfitriona, cuya luz se causa por las entidades ópticamente activas, puede distinguir, de este modo, entre partes de la estructura anfitriona que alojan una estructura huésped y partes que no alojan una estructura huésped. En este método, las partes que no alojan una estructura huésped se etiquetan en lugar de las estructuras huésped en sí mismas, no obstante, todavía se puede determinar la presencia de las estructuras huésped. Además, dado que las estructuras huésped no se etiquetan, las estructuras huésped no unidas no causan luz de fondo. Por lo tanto, se pueden usar altas concentraciones de estructuras huésped en experimentos sin una disminución significativa de las relaciones señal a ruido. También, las estructuras huésped etiquetadas pueden adoptar estados oscuros y blanqueados, lo que impacta negativamente en la capacidad de observar estas estructuras huésped etiquetadas, por ejemplo, porque impide usar tiempos prolongados de formación de imágenes. De este modo, el método también permite la formación de imágenes de las estructuras huésped durante períodos de tiempo más largos sin ser obstaculizado por el blanqueamiento de estructuras huésped o la adopción de un estado oscuro. Estos períodos más largos permiten estudiar mejor la dinámica, tal como la movilidad y/o las tasas de enlace de las estructuras huésped.

En una realización, el método comprende determinar una propiedad de unión de al menos una estructura huésped con respeto a la estructura anfitriona sobre la base del valor de luz.

El sistema sensible a la luz puede emitir continuamente la señal, lo que permite determinar una pluralidad de valores de luz, en donde la pluralidad de valores de luz indica la cantidad de luz de la estructura anfitriona incidente sobre el sistema sensible a la luz en los tiempos respectivos. Entonces, en base a estos valores de luz, se pueden determinar las cantidades respectivas de la al menos una estructura huésped en diferentes momentos.

Una propiedad de unión puede comprender determinar la tasa a la que cambia en el tiempo la cantidad de la al menos una estructura huésped alojada por la estructura anfitriona.

Esta realización permite medir propiedades físicas adicionales de la estructura huésped en relación con la estructura anfitriona.

En una realización, el sistema sensible a la luz es parte de un microscopio, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia. En esta realización, el método comprende determinar el valor de luz en base a la señal de salida en el sentido de que el método comprende determinar datos de imagen en base a la señal de salida, los datos de imagen que representan una imagen de al menos parte de la estructura anfitriona y que comprenden una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona. Cada valor de píxel de imagen indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona incidente sobre el sistema sensible a la luz. Además, en esta realización, el método comprende determinar sobre la base del valor de luz la posición de la estructura huésped en la estructura anfitriona en el sentido de que el método comprende determinar al menos una región de interés (ROI) que comprende al menos un valor de píxel de imagen en la imagen sobre la base de los valores de píxeles de imagen. La al menos una ROI en la imagen indica la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

De este modo, la ROI puede representar parte de la estructura anfitriona, cuya parte está alojando una estructura huésped. Típicamente, si, por ejemplo, se usan entidades ópticamente activas fluorescentes, la ROI en la imagen aparece como una región relativamente “oscura” o sombra en la imagen y típicamente la ROI comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen.

Preferiblemente, las entidades ópticamente activas se pueden alojar en la estructura anfitriona en sitios de unión estrechamente separados simultáneamente al mismo tiempo o distribuir en una pluralidad de tiempos de manera que la densidad de muestreo sobre la estructura anfitriona sea alta. Una densidad de muestreo más alta permite una localización más precisa y/o más probable de estructuras huésped y/o permite la detección de estructuras huésped más pequeñas.

Esta realización permite determinar con precisión la posición de al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona usando técnicas de procesamiento de imágenes. La precisión depende, entre otros, de la resolución del microscopio empleado.

En una realización, determinar la al menos una ROI en la imagen comprende determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen de la ROI es indicativo de una cantidad de luz que es menor que una cantidad de luz umbral.

En esta realización, el método puede comprender comparar el al menos un valor de píxel de imagen con un valor de píxel umbral que indica dicha cantidad de luz umbral. En la presente memoria, el valor de píxel umbral puede estar predeterminado.

En caso de que la ROI comprenda una pluralidad de valores de píxeles de imagen, cada uno de estos valores de píxeles de imagen puede indicar una cantidad de luz que es menor que una cantidad de luz umbral.

Esta realización permite un procesamiento eficiente de los datos de imagen para determinar la posición de la estructura huésped.

En una realización, el método comprende determinar un valor de píxel umbral que indica la cantidad de luz umbral sobre la base de los datos de imagen. En esta realización, determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen es indicativo de la cantidad de luz menor que la cantidad de luz umbral comprende comparar el al menos un valor de píxel de imagen con el valor de píxel umbral.

Esta realización puede comprender determinar que el al menos un valor de píxel de imagen de la ROI es más bajo o más alto que el valor de píxel umbral y, en respuesta, determinar la ROI.

Esta realización permite determinar la ROI en los datos de imagen sustancialmente en base a los datos de imagen. Se pueden identificar valores de píxeles de imagen aberrantes, por ejemplo, valores de píxeles de imagen relativamente bajos, en los datos de imagen para determinar la ROI.

En una realización, determinar el valor de píxel umbral comprende determinar un promedio y una variación de los valores de píxeles de imagen que están asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona que no aloja una estructura huésped. Esta realización comprende además, en base al promedio y la variación determinados, determinar el valor de píxel umbral. Esta realización permite determinar fácilmente el valor de píxel umbral.

En una realización, determinar los datos de imagen en base a la señal de salida comprende determinar, durante una pluralidad de periodos de tiempo respectivos, subconjuntos de datos de imagen en base a la señal de salida. Cada subconjunto de datos de imagen representa una imagen de al menos parte de la estructura anfitriona durante períodos de tiempo respectivos y cada subconjunto de datos de imagen comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona. Además, cada valor de píxel de imagen en un subconjunto de datos de imagen indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz durante su período de tiempo asociado. Esta realización comprende además determinar los datos de imagen en base a los subconjuntos de datos de imagen.

En una realización, cada subconjunto de valores de píxeles de imagen comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con un evento de emisión de luz durante el período de tiempo. En esta realización, determinar los datos de imagen en base a los subconjuntos de los datos de imagen comprende, para cada evento de emisión de luz en los subconjuntos de datos de imagen, ajustar una función de dispersión de puntos, por ejemplo, la función de dispersión de puntos asociada con el sistema sensible a la luz, a su pluralidad de valores de píxeles de imagen para determinar una posición de cada evento de emisión de luz. El ajuste comprende opcionalmente seleccionar una amplitud y/o anchura de la función de dispersión de puntos.

En una realización adicional, el método comprende, para cada evento de emisión de luz en los subconjuntos de datos de imagen, determinar sobre la base de la función de dispersión de puntos ajustada, en particular sobre su amplitud y/o anchura, una curva de localización de eventos que indica una posición del evento de emisión de luz. En esta realización, determinar los datos de imagen comprende sumar las curvas de localización de eventos determinadas.

Determinar una curva de localización de eventos puede comprender determinar una anchura de la curva de localización de eventos sobre la base de la amplitud seleccionada. En la presente memoria, la anchura puede estar relacionada con la precisión con la que se pueden determinar la posición del evento de emisión de luz. Se debería apreciar que una mayor amplitud de las funciones de dispersión de puntos ajustadas indica que se capturaron más fotones asociados con el evento de emisión de luz. De este modo, las amplitudes más grandes se pueden asociar con relaciones señal a ruido más altas. Por lo tanto, mayores amplitudes pueden justificar determinar una anchura más pequeña de la curva de localización de eventos y, de este modo, determinar con más precisión la posición de un evento de emisión de luz y, de este modo, de una estructura huésped. Esta realización permite usar microscopía de localización de súper resolución.

En una realización, el método comprende determinar una primera y segunda ROI en la imagen sobre la base de los valores de píxeles de imagen, la primera y segunda ROI que comprende, cada una, al menos un valor de píxel de imagen y la primera ROI en la imagen que indica una posición de un primera estructura huésped en una estructura anfitriona y la segunda ROI en la imagen que indica una posición de la segunda estructura huésped en una estructura anfitriona. La primera y segunda estructuras huésped no necesitan estar alojadas necesariamente en la misma estructura huésped. En principio, una pluralidad de estructuras anfitrionas se puede visualizar simultáneamente, cada una de las estructuras anfitrionas que aloja al menos una estructura huésped. Esta realización permite de este modo determinar las posiciones de múltiples estructuras huésped en una o más estructuras anfitrionas.

En una realización, una ocupación fraccional, por ejemplo, una cobertura fraccional, de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas se mantiene por debajo del 20%, preferiblemente por debajo del 15%, más preferiblemente por debajo del 10%, lo más preferiblemente por debajo del 5%. La cobertura fraccional se puede mantener por debajo de cierto nivel con el objetivo de limitar la perturbación de una interacción estructura anfitrionaestructura huésped por la presencia de las entidades ópticamente activas en la estructura anfitriona.

La ocupación fraccional de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas puede estar por debajo de un cierto porcentaje preferiblemente al menos mientras que el sistema sensible a la luz está recibiendo la luz de la estructura anfitriona.

La cobertura fraccional se puede definir como una relación entre una cantidad de entidades ópticamente activas 224 que se alojan por la estructura anfitriona 210 y una cantidad de entidades ópticamente activas 224 que la estructura anfitriona 210 puede alojar (aproximadamente) al máximo.

La ocupación fraccional de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas puede estar por debajo de un porcentaje particular preferiblemente al menos mientras que el sistema sensible a la luz está recibiendo la luz de la estructura anfitriona, por ejemplo, durante un experimento.

Esta realización permite determinar con más precisión las propiedades de unión de la estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona. Limitando la ocupación fraccional de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas, se puede asegurar que haya espacio suficiente en la estructura anfitriona para que las estructuras huésped de interés se coloquen a ellas mismas, sin que se vean demasiado influenciadas por la presencia de las entidades ópticamente activas. En un ejemplo, la ocupación fraccional se relaciona con una cobertura fraccional, que se mantiene por debajo de un porcentaje específico de manera que estén disponibles suficientes sitios de unión a los que se puedan unir las estructuras huésped de interés. Por lo tanto, las propiedades de unión de la estructura huésped de interés se ven influenciadas en menor medida por las entidades ópticamente activas que ya están unidas a la estructura anfitriona.

En una realización, el método comprende realizar una medición de la línea de base. Con este fin, el método comprende el sistema sensible a la luz que recibe luz de referencia de la estructura anfitriona que aloja una o más entidades ópticamente activas, en donde las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde la estructura anfitriona y en donde la estructura anfitriona aloja una cantidad de referencia de estructuras huésped. En un ejemplo, la estructura anfitriona no aloja ninguna estructura huésped. En esta realización, el método comprende el sistema sensible a la luz que emite una señal de referencia en base a la luz de referencia recibida y que determina un valor de luz de referencia en base a la señal de salida. El valor de luz de referencia indica una cantidad de luz desde la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz. En esta realización, el método comprende además determinar sobre la base del valor de luz y del valor de luz de referencia al menos una de la cantidad y la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

La medición de la línea de base puede reducir el número de falsos positivos. Una estructura anfitriona puede comprender, concretamente, partes que exhiben inherentemente una baja emisión de luz, independientemente de si tales partes alojan o no una estructura huésped. Tales partes se pueden identificar durante la medición de la línea de base, lo que evita identificar de manera falsa una estructura huésped en tales partes de la estructura anfitriona. Esta realización permite análisis más precisos de las estructuras huésped, porque la cantidad y/o la posición de la al menos una estructura huésped se realiza en base a tanto el valor de luz como el valor de luz de referencia.

En una realización, la estructura anfitriona se coloca al menos parcialmente en un fluido que comprende entidades ópticamente activas. Las entidades ópticamente activas que se configuran para unirse transitoriamente a la estructura anfitriona.

Las entidades ópticamente activas pueden exhibir una constante de unión de disociación con respecto a la estructura anfitriona que es preferiblemente igual o mayor que la tasa a la que ocurren los eventos de un proceso bajo escrutinio.

Como resultado de la unión transitoria de las entidades, las entidades no ocupan permanentemente un sitio de unión, como resultado de lo cual se pueden determinar con más precisión las tasas de unión de las estructuras huésped con respecto a la estructura anfitriona, así como un movimiento de la estructura huésped sobre la estructura anfitriona.

En una realización, el método comprende controlar un sistema de aplicación de fuerza para aplicar una tensión a la estructura anfitriona para al menos uno de

- controlar la señal que se emite por el sistema sensible a la luz

- suprimir un movimiento de la estructura anfitriona, y

- colocar, por ejemplo, orientar, la estructura anfitriona.

Esta realización permite afinar la señal que se emite por el sistema sensible a la luz. Las propiedades de unión de las entidades ópticamente activas y, por lo tanto, la emisión de luz por estas entidades pueden depender concretamente de la tensión de la estructura anfitriona. Por lo tanto, la cantidad de luz que llega al sistema sensible a la luz se puede afinar controlando la tensión. Por lo tanto, esta realización permite optimizar la señal según se emite por el sistema sensible a la luz para procesamiento adicional y, de este modo, permite un control fino sobre la relación señal a ruido con relación a la cantidad de perturbación de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas. Como resultado, se puede afinar la resolución espacial y temporal.

Además, suprimir el movimiento de la estructura anfitriona suprime la borrosidad de los datos de imagen debido a este movimiento.

Además, el sistema de aplicación de fuerza se puede utilizar para forzar la estructura anfitriona en una geometría conocida. En un ejemplo, el sistema de aplicación de fuerza comprende dos trampas ópticas que contienen dos cuentas respectivas entre las que se conecta una molécula de DNA como estructura anfitriona. Entonces, el sistema de aplicación de fuerza se puede controlar para colocar las cuentas de manera que se sepa que la molécula de DNA está en una línea recta entre las cuentas. Esto permite ventajosamente, por ejemplo, escanear eficientemente un haz de excitación a lo largo de esta línea recta unidimensional sin necesidad de obtener primero una imagen de la estructura anfitriona en dos dimensiones para encontrar su orientación. Por lo tanto, se puede evitar el blanqueo no deseado de los fluoróforos.

Un aspecto de esta descripción se relaciona con un sistema óptico para determinar la presencia de al menos una estructura huésped biológica, por ejemplo, una proteína o un complejo de proteínas, en una estructura anfitriona biológica, por ejemplo, una molécula de DNA. El sistema óptico comprende un sistema sensible a la luz configurado para recibir luz de la estructura anfitriona que aloja uno o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped. Las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde dicha al menos una parte. El sistema sensible a la luz está configurado además para emitir una señal en base a la luz recibida. El sistema óptico comprende además un sistema de procesamiento de datos configurado para realizar el paso de determinar un valor de luz en base a la señal de salida. El valor de luz indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz. El sistema de procesamiento de datos está configurado además para realizar el paso de determinar sobre la base del valor de luz al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona. Un aspecto de esta descripción se refiere a un programa informático que comprende instrucciones que, cuando el programa se ejecuta por un ordenador, hacen que un sistema óptico como se describe en la presente memoria ejecute uno o más de los pasos del método como se describe en la presente memoria.

Un aspecto de esta descripción se relaciona con un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo uno o más de los pasos del método como se describe en la presente memoria.

Un aspecto de esta descripción se relaciona con un método para permitir la determinación de al menos una de una cantidad y una posición de al menos una estructura huésped biológica en una estructura anfitriona biológica. El método comprende combinar la estructura anfitriona que aloja la al menos una estructura huésped con un fluido y una pluralidad de entidades ópticamente activas para hacer que la estructura anfitriona aloje una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped, en donde las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde dicha al menos una parte. Un aspecto de esta descripción se relaciona con un programa informático según la reivindicación 16.

Como se apreciará por un experto en la técnica, los aspectos de la presente invención se pueden incorporar como un sistema, un método o un producto de programa informático. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención pueden tomar la forma de una realización totalmente de hardware, una realización totalmente de software (incluyendo microprograma, software residente, microcódigo, etc.) o una realización que combina aspectos de software y hardware a la que se puede hacer referencia en general en la presente memoria como “circuito”, “módulo” o “sistema”. Las funciones descritas en esta descripción se pueden implementar como un algoritmo ejecutado por un procesador/microprocesador de un ordenador. Además, los aspectos de la presente invención pueden tomar la forma de un producto de programa informático incorporado en uno o más medios legibles por ordenador que tienen un código de programa legible por ordenador incorporado, por ejemplo, almacenado en el mismo.

Se puede utilizar cualquier combinación de uno o más medios legibles por ordenador. El medio legible por ordenador puede ser un medio de señal legible por ordenador o un medio de almacenamiento legible por ordenador. Un medio de almacenamiento legible por ordenador puede ser, por ejemplo, pero no se limita a, un sistema, aparato o dispositivo electrónico, magnético, óptico, electromagnético, de infrarrojos o semiconductor, o cualquier combinación adecuada de los precedentes. Más ejemplos específicos de un medio de almacenamiento legible por ordenador pueden incluir, pero no se limitan a, los siguientes: una conexión eléctrica que tiene uno o más cables, un disquete de ordenador portátil, un disco duro, una memoria de acceso aleatorio (RAM), un dispositivo de memoria de solo lectura (ROM), una memoria de solo lectura programable y borrable (EPROM o memoria rápida), una fibra óptica, una memoria de solo lectura de disco compacto portátil (CD-ROM), un dispositivo de almacenamiento óptico, un dispositivo de almacenamiento magnético o cualquier combinación adecuada de los precedentes. En el contexto de la presente invención, un medio de almacenamiento legible por ordenador puede ser cualquier medio tangible que pueda contener o almacenar un programa para su uso por o en conexión con un sistema, aparato o dispositivo de ejecución de instrucciones.

Un medio de señal legible por ordenador puede incluir una señal de datos propagada con un código de programa legible por ordenador incorporado en el mismo, por ejemplo, en banda base o como parte de una onda portadora. Tal señal propagada puede tomar cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, pero no limitado a, electromagnética, óptica o cualquier combinación adecuada de las mismas. Un medio de señal legible por ordenador puede ser cualquier medio legible por ordenador que no es un medio de almacenamiento legible por ordenador y que puede comunicar, propagar o transportar un programa para su uso por o en conexión con un sistema, aparato o dispositivo de ejecución de instrucciones.

El código de programa incorporado en un medio legible por ordenador se puede transmitir usando cualquier medio apropiado, incluyendo, pero no limitado a, inalámbrico, cableado, de fibra óptica, de cable, de RF, etc., o cualquier combinación adecuada de los precedentes. Un código de programa informático para llevar a cabo operaciones para aspectos de la presente invención se puede escribir en cualquier combinación de uno o más lenguajes de programación, incluyendo un lenguaje de programación orientado a objetos, tal como Java(TM), Smalltalk, C++ o similar y lenguajes de programación de procedimientos convencionales, tales como el lenguaje de programación “C” o lenguajes de programación similares. El código del programa puede ejecutarse completamente en el ordenador del usuario, parcialmente en el ordenador del usuario, como un paquete de software independiente, parcialmente en el ordenador del usuario y parcialmente en un ordenador remoto, o completamente en el ordenador o servidor remoto. En este último escenario, el ordenador remoto se puede conectar al ordenador del usuario a través de cualquier tipo de red, incluyendo una red de área local (LAN) o una red de área extensa (WAN), o la conexión se puede hacer a un ordenador externo (por ejemplo, a través de Internet usando un Proveedor de Servicios de Internet).

Los aspectos de la presente invención se describen a continuación con referencia a ilustraciones de diagramas de flujo y/o diagramas de bloques de métodos, aparatos (sistemas) y productos de programas informáticos según las realizaciones de la presente invención. Se entenderá que cada bloque de las ilustraciones del diagrama de flujo y/o diagramas de bloques, y combinaciones de bloques en las ilustraciones de diagramas de flujo y/o diagramas de bloques, se pueden implementar mediante instrucciones de programas informáticos. Estas instrucciones de programas informáticos se pueden proporcionar a un procesador, en particular, un microprocesador y/o una unidad central de procesamiento (CPU) y/o una unidad de procesamiento de gráficos (GPU), de un ordenador de propósito general, un ordenador de propósito especial u otro aparato de procesamiento de datos programable para producir una máquina, de manera que las instrucciones, que se ejecutan a través del procesador del ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programable u otros dispositivos, creen medios para implementar las funciones/actos especificados en el diagrama de flujo y/o el bloque o bloques del diagrama de bloques.

Estas instrucciones de programa informático también se pueden almacenar en un medio legible por ordenador que puede dirigir a un ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programables u otros dispositivos a que funcionen de una manera particular, de manera que las instrucciones almacenadas en el medio legible por ordenador produzcan un artículo de fabricación, incluyendo las instrucciones que implementan la función/acto especificado en el diagrama de flujo y/o el bloque o bloques del diagrama de bloques.

Las instrucciones de programa informático también se pueden cargar en un ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programable o otros dispositivos para hacer que se realicen una serie de pasos operativos en el ordenador, otro aparato programable u otros dispositivos para producir un proceso implementado por ordenador de manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable proporcionen procesos para implementar las funciones/actos especificados en el diagrama de flujo y/o bloque o bloques del diagrama de bloques.

El diagrama de flujo y los diagramas de bloques de las figuras ilustran la arquitectura, la funcionalidad y la operación de posibles implementaciones de sistemas, métodos y productos de programa informático según diversas realizaciones de la presente invención. A este respecto, cada bloque en el diagrama de flujo o diagramas de bloques puede representar un módulo, segmento o parte de código, que comprende una o más instrucciones ejecutables para implementar la función o funciones lógicas especificadas. También se debería observar que, en algunas implementaciones alternativas, las funciones señaladas en los bloques pueden ocurrir fuera del orden señalado en las figuras. Por ejemplo, dos bloques mostrados en sucesión, de hecho, se puede ejecutar sustancialmente de manera concurrente, o los bloques, algunas veces, se pueden ejecutar en el orden inverso, dependiendo de la funcionalidad implicada. También se observará que cada bloque de los diagramas de bloques y/o ilustraciones de diagramas de flujo, y combinaciones de bloques en los diagramas de bloques y/o ilustraciones de diagramas de flujo, se pueden implementar mediante sistemas basados en hardware de propósito especial que realizan las funciones o actos especificados, o combinaciones de hardware de propósito especial e instrucciones de ordenador. Además, se proporcionan un programa informático para llevar a cabo los métodos descritos en la presente memoria, así como un medio de almacenamiento legible por ordenador no transitorio que almacena el programa informático. Un programa informático, por ejemplo, se puede descargar (actualizar) en el sistema de procesamiento de datos existente o almacenar tras la fabricación de estos sistemas.

Las realizaciones de la presente invención se ilustrarán adicionalmente con referencia a los dibujos adjuntos, que mostrarán esquemáticamente realizaciones según la invención. Se entenderá que la presente invención no se restringe de ninguna forma a estas realizaciones específicas.

Breve descripción de los dibujos

Los aspectos de la invención se explicarán con mayor detalle con referencia a las realizaciones ejemplares mostradas en los dibujos, en los que:

la FIG. 1A muestra esquemáticamente una realización de un sistema óptico según una realización,

la FIG. 1B ilustra un método según una realización,

la FIG. 2 ilustra una estructura anfitriona que aloja una estructura huésped y una entidad ópticamente activa según una realización,

la FIG. 3 ilustra un método para determinar la posición de una estructura huésped según una realización,

la FIG. 4A muestra una imagen real y datos de imagen obtenidos mientras que se realiza un método según una realización,

la FIG. 4B ilustra una manera para localizar una estructura huésped,

la FIG. 5 muestra imágenes reales de una estructura anfitriona obtenidas mientras que se realiza un método según una realización,

la FIG. 6 muestra esquemáticamente determinar datos de imagen en base a curvas de localización de eventos, la FIG. 7 ilustra una serie de aplicaciones para el método,

la FIG. 8 ilustra un método que implica un experimento de la línea de base según una realización,

la FIG. 9 representa un diagrama de bloques que ilustra un sistema de procesamiento de datos ejemplar según una realización.

Descripción detallada de los dibujos

La FIG. 1A ilustra esquemáticamente un sistema óptico 100 según una realización. El sistema 100 se puede incorporar como un microscopio, por ejemplo, al menos uno de un microscopio de campo amplio, un microscopio de barrido láser, un microscopio confocal, un microscopio de fluorescencia, un microscopio de Reducción de Emisión Estimulada (STED) y un microscopio de Reflexión Interna Total (TIRF). El sistema óptico 100 comprende un sistema sensible a la luz 102 y un sistema de procesamiento de datos 104. El sistema sensible a la luz 102 puede comprender un fotodetector y/o un sistema de formación de imágenes, tal como una cámara, en particular una cámara de CCD tal como una cámara de EMCCD y/o un sensor de luz dependiente de la posición.

El sistema óptico 100 puede comprender además un sistema óptico de excitación que comprende una fuente de luz de excitación 101, tal como un láser de excitación, en particular un láser de 491 nm, cuyo sistema óptico de excitación está configurado para dirigir la luz de excitación 103 hacia la estructura anfitriona 110 a través de los espejos dicroicos DM1 y DM2. La luz de excitación 103 puede excitar las entidades ópticamente activas que está alojando la estructura anfitriona biológica en partes que no alojan la estructura huésped biológica. Estas entidades ópticamente activas excitadas pueden decaer posteriormente y emitir un fotón. Además o alternativamente, las entidades ópticamente activas pueden emitir luz como resultado de la electroluminiscencia y/o quimioluminiscencia. Además o alternativamente, las entidades ópticamente activas interactúan con la luz de excitación y, por ello, alteran las propiedades y/o la intensidad de la luz transmitida y/o reflejada.

El sistema sensible a la luz 102 está configurado para recibir la luz 106 desde la estructura anfitriona 110 a través de los espejos dicroicos DM2 y DM1. Con este fin, el sistema sensible a la luz 102 se coloca, por ejemplo, de manera que una parte sensible a la luz, tal como un plano de formación de imágenes, se dirija hacia la estructura anfitriona 110. El sistema óptico 100 puede comprender una lente objetivo 107 para enfocar la luz de excitación 103 sobre la estructura anfitriona 110 y para recoger la luz 106 de la estructura anfitriona 110.

La estructura anfitriona 110 puede ser una molécula de DNA y se puede colocar en un portamuestras 108. El sistema óptico 100 puede comprender tal portamuestras en forma de célula de flujo. La célula de flujo 108 puede ser una célula de flujo laminar multicanal que no tenga una barrera física entre los canales que permita un intercambio de tampón rápido entre los flujos de fluidos, respectivamente que comprende cuentas, estructuras anfitrionas, tales como DNA, estructuras huésped, tales como proteínas y/o complejos de proteínas, y entidades ópticamente activas, tales como moléculas intercaladoras de DNA.

La estructura anfitriona 110 puede ser una estructura unidimensional, tal como DNA, DNA monocatenario, RNA, un microtúbulo, actina, un nanotubo de carbono. La estructura anfitriona 110 también puede ser una estructura bidimensional, tal como una membrana, por ejemplo, una membrana celular.

La estructura anfitriona 110 está alojando una o más entidades ópticamente activas (mostradas en la FIG. 2), tales como moléculas intercaladoras de DNA, en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja una estructura huésped. Las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz 106 desde dicha al menos una parte. El sistema sensible a la luz 102 está configurado además para emitir una señal en base a la luz 106 recibida. Las entidades ópticamente activas pueden ser ópticamente activas en el sentido de que son fluorescentes y/o fosforescentes y/o luminiscentes y/o absorbentes de luz, etc.

Preferiblemente, el sistema óptico 100 comprende un sistema de trampa 109 para establecer una trampa, por ejemplo, una trampa óptica, acústica, magnética o trampa electroforética, que puede contener una cuenta a la que se conecta la estructura anfitriona. Las trampas ópticas son conocidas en la técnica anterior. Un ejemplo de una trampa óptica se describe en Ashkin A, Dziedzic JM, Bjorkholm JE, Chu S (1986) Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett 11:288. doi: 10.1364/OL.11.000288. Un ejemplo de una trampa acústica se describe en el documento WO2014200341A1 con el título “Molecular manipulation system and method”.

En una realización, el sistema de trampa 109 comprende una fuente de luz de trampa 109a para generar luz de captura. La fuente de luz de trampa 109a puede ser un láser de fibra CW de 10 W y 1064 nm. Además, el sistema de trampa 109 puede comprender un módulo 109b para rotar la polarización de la luz de captura y un divisor de haz de polarización 109c para dividir la luz de captura en dos haces de luz, uno para establecer una primera trampa y un segundo para establecer una segunda trampa. El sistema de trampa 109 puede comprender un módulo 109d para controlar la posición de la primera trampa y un módulo 109e para controlar la posición de la segunda trampa. En particular, la dirección de trampa independiente se puede hacer a través de un espejo paso a paso piezoeléctrico de posicionamiento tosco y un espejo piezoeléctrico preciso para las trampas respectivas. Se puede usar un divisor de haz de polarización 109f para recombinar los haces de captura controlados individualmente. Si el sistema de trampa 109 está configurado para establecer dos trampas, ventajosamente la estructura anfitriona 110 se puede mantener fija entre dos cuentas atrapadas ópticamente.

Preferiblemente, el sistema óptico 100 comprende un sistema de detección de fuerza 111, que está configurado para detectar una fuerza ejercida por al menos una de las trampas establecidas por el sistema de trampa 109 en una entidad atrapada. El sistema mostrado comprende un módulo de detección de fuerza 111a para detectar una fuerza ejercida por la primera trampa y un módulo de detección de fuerza 111b para detectar una fuerza ejercida por la segunda trampa. Como se sabe en la técnica, estos módulos 111a y 111b pueden ser sensores dependientes de la posición en la medida que la fuerza se puede determinar en base a una desviación de la luz de captura y usando interferometría de plano focal posterior.

El sistema de procesamiento de datos 104 está configurado para realizar una serie de pasos que se explicarán con referencia a la FIG. 1B, que permiten que el sistema óptico 100 determine la presencia de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona 110. Además, el sistema de procesamiento de datos 104 se puede configurar para controlar al menos uno del sistema sensible a la luz 102, el portamuestras 108, el sistema óptico de excitación, en particular la fuente de luz de excitación 101, y el sistema de trampa 109, en particular al menos uno de la fuente de luz de trampa 109a, el módulo 109b, 109c, 109d y 109e y un sistema de detección de fuerza.

La FIG. 1B ilustra un método según una realización. El sistema de procesamiento de datos 104 está configurado para realizar al menos los pasos 118 y 120. Además, el sistema de procesamiento de datos 104 se puede configurar para controlar el sistema sensible a la luz 102 para realizar los pasos 114 y 116. Con este fin, el sistema de procesamiento de datos puede transmitir señales de control al sistema sensible a la luz 102.

El paso 112 representa un paso opcional en una realización del método que comprende los pasos 114 - 120. No obstante, en un aspecto distinto, esta descripción se relaciona con el paso 112, no necesariamente en combinación con cualquiera de los otros pasos 114 -120.

El paso 112 permite la determinación de al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped biológica en la estructura anfitriona 110 biológica y comprende combinar la estructura anfitriona 110 que aloja la al menos una estructura huésped con un fluido y una pluralidad de entidades ópticamente activas para hacer que la estructura anfitriona aloje una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped. Como se indicó anteriormente, las entidades ópticamente activas causan una emisión de luz desde dicha al menos una parte.

En una realización particular, la célula de flujo 108 comprende una pluralidad de flujos laminares, un primer flujo que comprende cuentas, un segundo flujo que comprende moléculas de DNA, un tercer flujo que comprende proteínas o complejos proteínicos, y un cuarto flujo que comprende moléculas intercaladoras de ^dN^a. En esta realización, el paso 112 puede comprender establecer dos trampas ópticas con el fin de capturar dos de las cuentas que fluyen en el primer flujo laminar. Luego, las cuentas atrapadas se pueden mover al segundo flujo laminar, donde una molécula de DNA presente en el segundo flujo se ata entre las dos cuentas. Luego, la construcción bicircular creada de la molécula de DNA atada entre dos cuentas atrapadas ópticamente se mueve hacia el tercer flujo laminar, donde una o más proteínas como estructuras huésped se unen a la molécula de DNA. Finalmente, el ensayo se mueve al cuarto flujo laminar donde las entidades ópticamente activas en este flujo se unen transitoriamente a partes de la molécula de DNA que no están cubiertas por las proteínas o complejos proteínicos. Mientras que el ensayo está en el cuarto flujo laminar, se puede obtener una imagen, por ejemplo, usando formación de imágenes de campo amplio y/o microscopía de barrido confocal, en donde se usa un haz confocal como luz de excitación para excitar las entidades ópticamente activas alojadas en la estructura anfitriona 110, cuyas entidades, en respuesta, emiten luz hacia el sistema sensible a la luz 102.

Los pasos 114 -120 ilustran esquemáticamente el método según una realización. El paso 114 comprende el sistema sensible a la luz 102 que recibe la luz 106 de la estructura anfitriona 110 que aloja una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped. Las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz 106 desde dicha al menos una parte.

El paso 116 comprende que el sistema sensible a la luz emita una señal en base a la luz recibida. En un ejemplo, el sistema sensible a la luz es un sistema de formación de imágenes que comprende una pluralidad de píxeles, y en el paso 116 emite, para cada píxel, una señal que es indicativa de una cantidad de luz 106 que es incidente sobre él. El sistema sensible a la luz puede emitir una señal de voltaje y/o corriente en base a la luz recibida. Con este fin, el sistema sensible a la luz puede comprender un sistema fotomultiplicador para una alta precisión. El sistema sensible a la luz puede comprender alternativamente o además un fotodiodo de avalancha y/o una cámara, tal como una cámara de CCD o CMOS.

El paso 118, que se puede realizar por el sistema de procesamiento de datos 104, comprende determinar un valor de luz en base a la señal de salida. El valor de luz que indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz. Determinar un valor de luz puede comprender los pasos de determinar, en base a una señal de salida de voltaje, un valor y almacenar este valor en un almacenamiento de datos del sistema de procesamiento de datos.

El paso 120, que se puede realizar por el sistema de procesamiento de datos 104 comprende determinar sobre la base del valor de luz al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona. Por lo tanto, con el paso 120 se determina la presencia de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

El método se puede realizar como una medición masiva en el sentido de que el valor de luz no transporta ninguna información espacial. En un ejemplo, el valor de luz indica una cantidad de luz total que está viniendo de la estructura anfitriona 110 en su totalidad. Entonces, en base a este valor de luz se puede determinar cuántas estructuras huésped están presentes en la estructura anfitriona 110, por ejemplo en el sentido de que se puede determinar una cobertura media de la estructura anfitriona por la estructura huésped. Después de todo, cuantas más estructuras huésped 122 estén alojadas en la estructura anfitriona 110, quedan menos partes de la estructura anfitriona 110 desde las que puede ocurrir una emisión de luz. De este modo, se puede entender que determinar una cantidad de estructuras huésped en la estructura anfitriona se relaciona con determinar una cobertura fraccional de la estructura anfitriona y no implica necesariamente determinar el número total de estructuras huésped que se alojan en la estructura anfitriona. La medición masiva descrita anteriormente se puede implementar en un experimento de volumetría para determinar una afinidad de unión de la estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona. Luego, se puede determinar una cobertura fraccional de la estructura anfitriona con condiciones de solución variables de la solución en la que se coloca el ensayo.

El valor de luz se puede resolver espacialmente en el sentido de que está asociado con una parte específica de la estructura anfitriona. Típicamente, un valor de luz resuelto espacialmente es parte de los datos de imagen que comprenden una pluralidad de valores de luz resueltos espacialmente, en donde los datos de imagen representan al menos una parte de la estructura anfitriona 110.

En una realización, el método comprende determinar una propiedad de unión de la al menos una estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona sobre la base del valor de luz. Determinar una propiedad de unión puede requerir la cantidad y/o la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

La propiedad de unión se puede determinar, por ejemplo, determinando la tasa a la que cambia en el tiempo la cantidad de la al menos una estructura huésped. En una realización, la estructura anfitriona se mueve de una primera solución a una segunda solución. La primera solución puede comprender estructuras huésped y la segunda solución puede no comprender una estructura huésped y puede ser una solución de tampón. Cuando la estructura anfitriona se coloca en la primera solución, en algún punto puede alojar una primera cantidad de estructuras huésped. La primera cantidad puede ser conocida y, por ejemplo, es una cantidad máxima que la estructura anfitriona puede alojar. Luego, cuando la estructura anfitriona se coloca en la segunda solución, las estructuras huéspedes que están presentes en las estructuras anfitrionas y que, de este modo, también han sido traídas a la segunda solución, pueden retirarse posteriormente de la estructura anfitriona, por ejemplo, porque las estructuras huésped se desunen de la estructura anfitriona. Como resultado, la estructura anfitriona puede alojar más entidades ópticamente activas, que se puede entender que están presentes en la primera solución así como en la segunda solución y, de este modo, se puede emitir más luz por la estructura anfitriona. En este método, cuanto más rápido se retiren las estructuras huésped de la estructura anfitriona, más rápido cambiará la cantidad de luz emitida desde la estructura anfitriona tras mover la estructura anfitriona de la primera a la segunda solución. La tasa a la que las estructuras huésped se retiran de las estructuras anfitrionas puede corresponder a una constante de disociación de las estructuras huésped con respecto a la estructura anfitriona. En esta realización, la cantidad de estructuras huésped se determina en el sentido que se determina un cambio de la cantidad.

Esta realización permite además determinar una isoterma de unión, que se puede entender que es la cantidad de estructuras huésped alojadas por la estructura anfitrión en función de una concentración de las estructuras huésped en un fluido a una temperatura fija. Además, se puede estudiar la dependencia de la propiedad de unión de las estructuras huésped con respecto a la estructura anfitriona sobre al menos uno de los siguientes parámetros: (i) la tensión de la estructura anfitriona, (ii) la concentración de sal de un fluido en donde se colocan la estructura anfitriona y la estructura o estructuras huésped, (iii) una temperatura, por ejemplo, de un fluido en donde se colocan las estructuras anfitriona y huésped.

La FIG. 2 ilustra esquemáticamente una estructura anfitriona 210 que aloja al menos una estructura huésped 222. En un ejemplo, la estructura anfitriona 210 es una molécula de DNA de doble cadena y la estructura huésped 222 es una proteína unida a la molécula de DNA. La estructura anfitriona comprende al menos una parte 228 que no aloja la estructura huésped y una parte 230 que aloja la estructura huésped.

La estructura anfitriona 210 puede alojar la estructura huésped 222 en el sentido de que la estructura anfitriona 210 comprende sitios de unión, a los que puede unirse la estructura huésped, y se ha unido en uno o más de sus sitios de unión al menos una estructura huésped 222. Además, la estructura anfitriona 222 aloja una entidad ópticamente activa 224, que puede ser una molécula intercaladora de DNA.

La estructura anfitriona 210 se puede colocar al menos parcialmente en un fluido que comprende entidades ópticamente activas 226 que no están unidas a la estructura anfitriona 210, pero que pueden unirse a la estructura anfitriona, al menos en partes en las que no se une una estructura huésped 222. El fluido, por ejemplo, está presente en el portamuestras 108. En particular, las entidades ópticamente activas 226 se pueden configurar para unirse transitoriamente a la estructura anfitriona 210. Además, las entidades ópticamente activas, que, de este modo, pueden ser moléculas intercaladoras de DNA, pueden exhibir un rendimiento cuántico significativamente mayor cuando se unen que cuando se desunen, causando por ello una cantidad muy limitada de fluorescencia de fondo. En un ejemplo, la fluorescencia de las entidades ópticamente activas aumenta con un factor que oscila entre 500 - 1000 cuando se aloja en la estructura anfitriona 210.

En una realización, las entidades exhiben una disociación con respecto a la al menos parte de la estructura anfitriona, cuya disociación es igual o mayor que una tasa a la que ocurren los eventos de un proceso bajo escrutinio. En un ejemplo, el proceso concierne a la separación de dos cadenas de una molécula de DNA por una helicasa que realiza repetidamente un paso de separación de al menos un par de bases a la vez. En la presente memoria, la tasa a la que ocurre el evento puede relacionarse luego con el número de veces que se realiza este paso de separación por unidad de tiempo. La constante de unión de equilibrio se puede definir como una relación entre una asociación y la disociación con respecto a la al menos una parte de la estructura anfitriona. La disociación se puede afinar a través de la elección de la fuerza iónica del fluido que comprende la estructura anfitriona. Esta realización reduce ventajosamente las perturbaciones de la estructura y/o reduce las perturbaciones de los procesos dinámicos que implican la estructura, tales como el procesamiento de enzimas a lo largo del DNA, porque las entidades solamente se unen brevemente a la al menos parte de la estructura. Ventajosamente, el tiempo de unión puede ser (afinado para que sea) más corto que el tiempo característico del proceso bajo estudio con el fin de reducir la perturbación de este proceso. La disociación es preferiblemente al menos igual a, más preferiblemente mayor que, lo más preferiblemente al menos diez veces mayor que la tasa a la que ocurren los eventos del proceso de interés. Por ejemplo, si una polimerasa avanza a una tasa de 100-1000 Hz, entonces sería ventajoso si la disociación fuera mayor que 1000 a 10000 Hz para dejar cada paso relativamente imperturbable. En otro caso, por ejemplo, en el la tasa de translocación promedio de esta polimerasa sería de interés, entonces se considera preferiblemente que la cobertura de intercalador promedio corrija la posibilidad de encontrar un intercalador. Para ilustrar, si una polimerasa puede viajar en promedio ~ 10 bases antes de encontrar un intercalador, entonces la disociación debería ser igual o mayor que la tasa de escalonamiento de la polimerasa para que el impacto del intercalador sobre la tasa sea menor que ~10%.

En una realización, las entidades ópticamente activas están configuradas para unirse a partes de la estructura anfitriona 210 que no están cubiertas por la una o más estructuras huésped 222 y para, cuando se une a la estructura anfitriona 210, emitir luz. Por lo tanto, las entidades ópticamente activas unidas a la estructura anfitriona causan la emisión de luz desde partes de la estructura anfitriona que no están cubiertas por la al menos una estructura huésped.

En una realización particular, las entidades ópticamente activas 224 son colorantes fluorescentes que se unen al DNA simple, pero no a las regiones de DNA unidas a proteínas. Las entidades ópticamente activas pueden ser colorantes de ácidos nucleicos, en particular colorantes de ácidos nucleicos de carbocianina y/o colorantes de ácidos nucleicos de cianina monoméricos, tales como YO-PRO1 y YO-PRO3 mostrados en la FIG. 2 y/o moléculas de SYTOX, por ejemplo SYTOX™ Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYTOX AADvanced, SYTOX Red, que se ofrecen por la firma ThermoFisher. Las entidades ópticamente activas, por ejemplo, son monointercaladores YO-PRO (YO-PRO) que tienen disociaciones relativamente altas (>> 100 s-1, por ejemplo, 1100 s_1) y suficiente fotoestabilidad. Además o alternativamente, las entidades ópticamente activas son intercaladores Sytox Orange (SxO). SxO exhibe disociaciones (kapagado) en el rango de 1 s_1 a una tensión de 15 pN aplicada a la estructura anfitriona, lo que proporciona suficiente tiempo para adquirir en promedio 100 - 600 fotones de un único evento de unión con el fin de hacer microscopía de localización. Para la optimización de los parámetros experimentales, estas tasas de unión cinética se pueden afinar hasta en 7 órdenes de magnitud dependiendo del tipo de entidad ópticamente activa, fuerza iónica del fluido que comprende la estructura anfitriona, y la tensión aplicada a la estructura anfitriona. Las entidades ópticamente activas también pueden ser proteínas y/o especies de unión transitoria etiquetadas de manera fluorescente que se difunden a lo largo de la estructura anfitriona, tales como XLF. Las interacciones transitorias, tales como la unión transitoria pueden perturbar, al menos en menor medida, la estructura anfitriona 210.

En una realización (no mostrada), la estructura anfitriona 210 comprende o es una membrana, tal como una membrana celular. Como se sabe, una membrana puede comprender una doble capa de moléculas de lípidos. En de esta realización, se puede entender que la membrana aloja una estructura huésped, por ejemplo, una proteína o un complejo proteínico, teniendo la estructura huésped incrustada y/o unida a la membrana. Las entidades ópticamente activas 226 pueden ser moléculas de lípidos etiquetadas de manera fluorescente, que se pueden introducir en la membrana y que son, como es típico para las moléculas de lípidos en una membrana, capaces de difundirse rápidamente a través de la membrana. No obstante, tal molécula de lípido etiquetada de manera fluorescente que se difunde rápidamente no es capaz de moverse a través de partes de la membrana que están alojando una estructura huésped, tal como una proteína o complejo proteínico. Si la molécula de lípido etiquetada de manera fluorescente se excita continuamente y, de este modo, emite luz continuamente, la molécula de lípido etiquetada causa emisión de luz solamente desde partes de la membrana que no están alojando una estructura huésped.

En una realización, una ocupación fraccional, por ejemplo, una cobertura fraccional de la estructura anfitriona 210 por las entidades ópticamente activas 224 está por debajo del 20%, preferentemente por debajo del 15%, más preferentemente por debajo del 10%, lo más preferentemente por debajo del 5%.

Una entidad ópticamente activa 224, mientras que está alojada por la estructura anfitriona 210, puede poseer o bien un estado ENCENDIDO, en el que causa emisión de luz desde la parte en la que está alojada, o un estado APAGADO, en el que no causa emisión de luz aunque está alojada en la estructura anfitriona 210.

La cobertura fraccional se puede definir como una relación entre una cantidad de entidades ópticamente activas 224 que están alojadas por la estructura anfitriona 210 y una cantidad de entidades ópticamente activas 224 que la estructura anfitriona 210 puede alojar (aproximadamente) al máximo. En la presente memoria, la cantidad de entidades ópticamente activas 224 alojadas se puede entender que incluye tanto entidades en el estado ENCENDIDO como en el estado APAGADO. En un ejemplo particular, la cobertura fraccional se puede definir como una relación entre una cantidad de sitios de unión de las estructuras anfitrionas que se han unido a una entidad ópticamente activa y una cantidad total de sitios de unión en la estructura anfitriona.

La cobertura fraccional se puede controlar controlando al menos una de (i) una concentración de entidades ópticamente activas en un fluido en el que se coloca la estructura anfitriona y (ii) una tensión en la estructura anfitriona y (iii) una concentración de sal del fluido en el que se coloca la estructura anfitriona. En caso de que las entidades ópticamente activas comprendan moléculas intercaladoras, se observa con respecto al control de la tensión que una tensión más alta corresponde a una mayor unión de intercalador y con respecto al control de la concentración de sal, que una concentración de sal más alta corresponde a una menor unión de intercalador.

Se puede realizar un experimento de la línea de base con el fin de permitir la determinación y el control de la cobertura fraccional. Este experimento puede comprender saturar la estructura anfitriona 210 con entidades ópticamente activas, en donde la estructura anfitriona 210 no comprende ninguna estructura huésped. Posteriormente, se puede determinar un valor de luz indicativo de la cantidad de luz de la estructura huésped saturada. Cuando se determina el valor de luz, se puede realizar una corrección para la luz de fondo, cuya corrección puede comprender restar una intensidad de fondo. Entonces, se puede suponer que las escalas de cobertura fraccional linealmente con la cantidad de luz medida, especialmente cuando no hay extinción automática. Como resultado, la concentración de las entidades ópticamente activas y/o la tensión de la estructura anfitriona y/o la concentración de sal se pueden variar mientras que se monitoriza la cobertura fraccional (monitorizando la cantidad de luz de la estructura anfitriona). Por lo tanto, se puede determinar la influencia de estos parámetros en la cobertura fraccional, lo que permite controlar la cobertura fraccional durante los métodos descritos en la presente memoria para mantenerla por debajo de un porcentaje deseado y/o cerca de un porcentaje deseado.

Como se indicó, el sistema sensible a la luz puede ser parte de un microscopio, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia. La FIG. 3 ilustra el método según una realización. En la presente memoria, los pasos 312, 314 y 316 son similares a los respectivos pasos 112, 114 y 116 descritos con referencia a la FIG. 2. Además, los pasos 318 y 320 son realizaciones específicas de los respectivos pasos 218 y 220 descritos con referencia a la FIG. 2.

El paso 318 comprende determinar los datos de imagen en base a la señal de salida. Los datos de imagen representan una imagen de al menos parte de la estructura anfitriona y comprenden una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona. Cada valor de píxel de imagen indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona incidente sobre el sistema sensible a la luz.

La FIG. 4 muestra una imagen 432 de una estructura anfitriona 410, en particular una molécula de DNA 410, que se mantiene entre dos microesferas atrapadas ópticamente 438a y 438b, por ejemplo, cuentas de poliestireno, formando con las mismas una construcción bicircular. La producción de tal construcción bicircular puede comprender producir una construcción de DNA biotinilado a partir del DNA A bacteriófago y colocarlo en una célula de flujo donde ocurre una unión espontánea del DNA biotinilado a las microesferas de poliestireno recubiertas de estreptavidina (4,65 |jm de diámetro).

Las dos trampas ópticas que contienen las microesferas respectivas se pueden generar usando un láser de fibra CW de 10 W y 1064 nm. La separación y recombinación de trampas se puede lograr usando dos cubos divisores de haz de polarización. La dirección de trampa independiente se puede hacer a través de un espejo paso a paso piezoeléctrico de posicionamiento tosco y un espejo piezoeléctrico preciso. Se pueden usar dos lentes de 300 mm para acoplar los rayos láser en un objetivo de inmersión en agua.

El gráfico 440 muestra los datos de imagen determinados y en particular en el eje vertical la intensidad de luz en unidades arbitrarias y en el eje horizontal la posición en micrómetros, en donde la posición de cero micrómetros corresponde al punto en el que la estructura huésped, la molécula de DNA 410, se conecta a la microesfera 438a. La imagen 432 se capturó usando un láser de 491 nm como fuente de luz de excitación y las moléculas intercaladoras YO-PRO se usaron como entidades ópticamente activas.

El paso 320 comprende determinar al menos una región de interés (ROI) 430 que comprende al menos un valor de píxel de imagen en la imagen sobre la base de los valores de píxeles de imagen, en donde la al menos una ROI 430 en la imagen indica la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona 410. Como se muestra, la ROI aparece como un área relativamente oscura en la imagen 432 a lo largo de la molécula de DNA 410. Esta realización permite determinar las tasas de unión y desunión de moléculas individuales (kencendido/kapagado) en base a las distribuciones de los tiempos de unión y desunión.

Esta realización también permite identificar si una estructura huésped cubre una estructura anfitriona de una manera continua o discontinua.

Además, esta realización puede comprender determinar una propiedad de unión de la estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona en el sentido de que esta realización puede comprender al menos uno de determinar la movilidad de la estructura huésped en la estructura anfitriona, determinar la procesabilidad de la estructura huésped en la estructura anfitriona, la velocidad de la estructura huésped que se mueve con respecto a la estructura anfitriona, las tasas de unión de encendido/apagado de las estructuras huésped, una huella de una única molécula en la estructura anfitriona, filamentos de estructuras huésped, un grado de cooperatividad entre dos estructuras huésped con respecto a la estructura anfitriona.

En la FIG. 4, la imagen comprende tres regiones de interés 430a, 430b y 430c como se indica por las áreas circulares en posiciones de aproximadamente 1 micrómetro, 2 micrómetros y 10,5 micrómetros, respectivamente. En estas posiciones, las estructuras huésped respectivas están presentes de este modo. Por lo tanto, el paso 320 puede comprender determinar una primera (430a) y segunda (430b) ROI en la imagen sobre la base de los valores de píxeles de imagen. La primera y segunda ROI comprenden, cada una, al menos un valor de píxel de imagen y la primera ROI (430a) en la imagen indica una posición de una primera estructura huésped en la estructura anfitriona 410 y la segunda ROI (430b) en la imagen indica una posición de la segunda estructura huésped en la estructura anfitriona 410.

Opcionalmente, el paso 320 comprende determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen de la ROI es indicativo de una cantidad de luz que es menor que una cantidad de luz umbral. Las regiones de interés 430a, 430b y 430c, por ejemplo, aparecen en la imagen 432 como puntos relativamente oscuros, o sombras, en la estructura anfitriona 410 y aparecen como picos negativos en gráfico 440. Un ajuste, por ejemplo, un ajuste gaussiano del pico negativo asociado con la ROI 430c tiene una desviación estándar de 114 nanómetros.

La imagen 432 se puede considerar como una imagen inversa de las posiciones en las que la estructura anfitriona 410 está alojando estructuras huésped en el sentido de que estas posiciones aparecen como puntos oscuros en lugar de puntos brillantes, como puede ser el caso cuando se etiqueten las estructuras huésped.

Opcionalmente, el paso 320 comprende determinar un valor de píxel umbral que indica la cantidad de luz umbral sobre la base de los datos de imagen. En la presente memoria, el paso de determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen es indicativo de la cantidad de luz menor que la cantidad de luz umbral comprende comparar el al menos un valor de píxel de imagen con el valor de píxel umbral.

El valor de luz umbral se puede determinar determinando un promedio y una variación de los valores de píxeles de imagen que se asocian con partes respectivas de la estructura anfitriona que no alojan una estructura huésped y luego, en base al promedio y la variación determinados, determinar el valor de píxel umbral. En una realización, el valor de píxel umbral se puede calcular como:

Th = avg - N * stdev, en donde

Th es el valor de píxel umbral, avg y stdev son indicativos del promedio y la desviación estándar respectivamente de los valores de píxeles de imagen asociados con la estructura anfitriona simple (que no aloja una estructura huésped) y N es una constante que se puede seleccionar, en un ejemplo N es igual a 3. En esta realización, los valores de píxeles de imagen que son menores que el valor de píxel umbral se identifican como pertenecientes a una Región de Interés. La elección de un valor alto para N reduce ventajosamente el número de falsos positivos, pero aumenta el tamaño mínimo de la estructura huésped que se puede detectar. En la presente memoria, un falso positivo se puede entender que es una identificación de una región de interés que indica incorrectamente una parte de la estructura anfitriona que aloja una estructura huésped.

Además, determinar el promedio, avg, y la variación, por ejemplo, stdev, de valores de píxeles de imagen asociados con partes de la estructura anfitriona que no aloja una estructura huésped se puede realizar de varias maneras. Una manera comprende primero determinar un promedio preliminar, avg_ prelim, y una variación preliminar, por ejemplo, una desviación estándar preliminar, stdev_ prelim, de los valores de píxeles de imagen obtenidos y determinar un valor de píxel de imagen umbral preliminar, Th_prelim, en base a estos valores, por ejemplo según la fórmula:

Th_prelim = avg_ prelim - N prelim * stdev prelim.

Entonces, en base a este valor de píxel de imagen umbral preliminar, se descartan uno o más valores de píxeles de imagen, por ejemplo, los que tienen valores más bajos que el valor de píxel de imagen umbral preliminar. Posteriormente, determinando el promedio y la variación de los valores de píxeles de imagen restantes, el promedio, avg, y la variación, stdev, se determinan en base a los cuales se puede determinar el valor de píxel umbral, Th, como anteriormente.

Preferiblemente, N es mayor que N_prelim y/o el umbral Th es menor que el umbral preliminar Th_prelim, porque, preferiblemente, se descartan todos los valores de píxeles de imagen asociados con partes que alojan una estructura huésped. Descartar algunos valores de píxeles de imagen asociados con partes que no alojan una estructura huésped no impacta gravemente a la determinación del valor de píxel umbral Th. Para determinar el valor de píxel umbral, se puede elegir un N mayor con el fin de reducir el número de falsos positivos, es decir, el número de veces que se determina erróneamente una ROI, que sería el caso cuando una ROI se determinase sin una estructura huésped que esté alojada en la posición indicada por esta ROI.

Otra manera de determinar el promedio y la variación de los valores de píxeles de imagen asociados con partes de la estructura anfitriona que no aloja una estructura huésped comprende realizar una medición de la línea de base que se explicará con más detalle con referencia a la FIG. 8.

En una realización, el método comprende determinar la movilidad de la estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona sobre la base de una pluralidad de posiciones determinadas de una estructura huésped. En la presente memoria, la movilidad puede ser una medida de la capacidad de la estructura huésped para moverse a lo largo, sobre y/o a través de la estructura anfitriona. Con este fin, el método puede comprender determinar sobre la base a una pluralidad de valores de luz, cada valor que es indicativo de una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz en una pluralidad de instancias de tiempo, una posición móvil de al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona y determinar la movilidad en base a la posición de movimiento de la al menos una estructura huésped. Esta realización comprende opcionalmente asociar una primera posición determinada de una estructura huésped en una primera instancia de tiempo a una segunda posición determinada de la estructura huésped en una segunda instancia de tiempo, por ejemplo en el sentido de determinar que tanto la primera posición como la segunda posición se relacionan con la misma estructura huésped. Además, se puede determinar la agrupación de estructuras huésped, por ejemplo, el método puede comprender determinar si las estructuras huésped se unen individualmente o forman agrupaciones y/o filamentos.

En una realización, el método comprende determinar la región de interés identificando valores de píxeles de imagen en los datos de imagen que están por debajo o por encima del valor umbral determinado. Luego, para determinar la ubicación de la región de interés y, de este modo, de la estructura huésped en la estructura anfitriona, los valores de píxeles de imagen en la región de interés se ajustan con una curva de localización de estructura huésped, que puede ser una curva gaussiana.

La FIG. 4B muestra una selección de los valores de píxeles de imagen de los datos de imagen 440 como puntos. La figura en particular muestra valores de píxeles de imagen 431a asociados con la región de interés 430c que están por debajo de un valor umbral Th determinado y valores de píxeles de imagen 431b también asociados con la región de interés 430c, pero que están por encima del valor de píxel umbral determinado. En este ejemplo, la región de interés 430c se ha determinado identificando que los valores de píxeles de imagen 431a están por debajo de los valores de píxeles de imagen de umbral. Luego, estos valores de píxeles de imagen 431a, así como el valor de píxel de imagen vecino 431b, se han ajustado a una curva de localización de estructura huésped 433, en este ejemplo, una curva gaussiana. Luego, se puede determinar que la estructura huésped en la estructura anfitriona esté colocada en la posición de la punta de la curva de localización de estructura huésped 433. Esto permite determinar con precisión la posición de la estructura huésped. Ejecutando este método una pluralidad de veces, se puede determinar con precisión un movimiento de la estructura huésped sobre la estructura anfitriona.

En una realización, el método comprende controlar un sistema de aplicación de fuerza para aplicar una tensión a la estructura anfitriona 210 para controlar la señal que se emite por el sistema sensible a la luz. La resolución efectiva del método se puede realzar aplicando tensión a la estructura anfitriona para suprimir, por ejemplo, sus fluctuaciones térmicas. En particular, para mejorar la resolución efectiva de las imágenes de la estructura anfitriona a un valor mejor que el límite de difracción (por ejemplo, por microscopía de localización), los inventores encuentran que se prefiere una fuerza de tracción. Se observa que FWHM eficaz (=resolución) de las curvas de localización de huésped puede disminuir con la tensión aplicada, mejorando la precisión del método. El sistema de aplicación de fuerza puede comprender un sistema para establecer una trampa, tal como una trampa óptica, tal como una trampa óptica holográfica, una trampa acústica y una trampa eléctrica tal como una trampa Electrocinética Anti-Browniana. También puede comprender un sistema de Espectroscopia de Fuerza Acústica (^aF^s) para crear ondas estacionarias acústicas con el fin de atraer objetos a los nodos de esta onda estacionaria y, por ello, aplicar fuerzas sobre los objetos. La estructura anfitriona 410 se puede conectar a al menos una cuenta 438a, 438b que se asienta en tal trampa establecida por el sistema de aplicación de fuerza. En un ejemplo, la estructura 410 se conecta a dos cuentas atrapadas 438a, 438b. En estos casos, el control del sistema de aplicación de fuerza puede comprender controlar las posiciones relativas de las trampas que sujetan las cuentas. Se debería entender que el sistema de aplicación de fuerza puede ser cualquier tipo de sistema que pueda causar una fuerza o un cambio de fuerza que actúe sobre la estructura anfitriona 410. De este modo, un ejemplo de un sistema de aplicación de fuerza sería un sistema de manipulación para deformar la al menos parte de la estructura. Además o alternativamente, se pueden usar pinzas magnéticas y/o estiramiento por flujo para aplicar una fuerza.

La estructura anfitriona 410 se puede colocar al menos parcialmente en una célula de flujo. El sistema de aplicación de fuerza puede comprender entonces la célula de flujo (no mostrada). Además, controlar el sistema de aplicación de fuerza puede comprender, en tal caso, controlar al menos uno de un flujo de fluido y una solución de un fluido en la célula de flujo, por ejemplo, para controlar una fuerza de arrastre que actúa sobre la estructura anfitriona 410. La solución del fluido se puede controlar en el sentido de que se controla la fuerza iónica de la solución.

En una realización, controlar el sistema de aplicación de fuerza comprende controlar el sistema de aplicación de fuerza para cambiar una fuerza que actúa sobre la estructura 410. Se puede lograr un cambio de la fuerza mediante un cambio de posición de las trampas acústicas/ópticas/eléctricas unas con relación a otras. Se puede lograr un cambio de fuerza variando la amplitud o longitud de onda de una onda estacionaria acústica. Se puede lograr un cambio de la fuerza cambiando al menos uno de un flujo de fluido y una solución del fluido.

Como se discutió anteriormente, la cinética de unión de entidades ópticamente activas, tales como las moléculas intercaladoras, depende de la estructura anfitriona 410. Cuando las entidades ópticamente activas se unen muy brevemente a la estructura anfitriona, se puede obtener una resolución temporal relativamente alta en el sentido de que puede ser más fácil determinar un movimiento de una estructura huésped. En un ejemplo se obtiene una resolución temporal de 190 ms, que es suficiente para observar el movimiento de deslizamiento de 1D de complejos proteínicos a lo largo de una molécula de DNA. No obstante, los tiempos de enlace más largos pueden causar una resolución espacial relativamente alta en el sentido de que se emiten más fotones por la estructura anfitriona por entidad ópticamente activa única. De este modo, el método puede comprender controlar el sistema de aplicación de fuerza para aplicar una tensión a la estructura anfitriona 210 para controlar la señal con el fin de controlar la resolución espacial y/o temporal del método.

Además, aplicar una tensión a la estructura anfitriona puede disminuir las fluctuaciones de la estructura anfitriona y, de este modo, de las entidades ópticamente activas presentes en la estructura anfitriona, lo que puede producir una resolución espacial más alta.

El control del sistema de aplicación de fuerza se puede realizar en base a una medición de fuerza que indique una tensión actual de la fuerza aplicada a la estructura anfitriona. Si la tensión actual es mayor o menor que una tensión deseada, entonces el sistema de aplicación de fuerza se puede controlar para disminuir o aumentar la fuerza aplicada respectivamente. La medición de fuerza se puede realizar usando interferometría de plano focal posterior y puede comprenden recoger la luz usando una lente condensadora y separar las dos rutas de captura con un cubo divisor de haz de polarización y dos detectores sensibles a la posición.

Además, la concentración de sal y el tipo de entidad ópticamente activa se pueden adaptar para controlar la resolución espacial y temporal del método, porque estos parámetros también influyen en la cinética de unión como se discutió.

Estas tasas de unión cinética se pueden voltear hasta en 7 órdenes de magnitud dependiendo del tipo op de entidad ópticamente activa, fuerza iónica del fluido que comprende la estructura anfitriona y la tensión aplicada a la estructura anfitriona.

La FIG. 5A muestra tres imágenes 542a, 542b y 542c que representan la estructura anfitriona 510 durante tres períodos de tiempo t1, t2 y t3. En este caso, la estructura anfitriona es una molécula de DNA de 15,8 micrómetros capturada entre dos cuentas. Los eventos de unión única de entidades ópticamente activas (intercaladores de DNA SYTOX Orange) son visibles como puntos entre las cuentas. Se usó un láser de excitación de 532 nm para excitar las moléculas de Sytox Orange.

La FIG. 6 muestra esquemáticamente una realización para determinar datos de imagen 640, representados como datos de imagen 440 en la FIG. 4. En el lado izquierdo se muestran tres subconjuntos de datos de imagen 644a, 644b y 644c. El eje horizontal de estos gráficos indica la posición y el eje vertical indica la intensidad de luz. Estos subconjuntos de datos de imagen se determinan en base a la señal de salida para diferentes periodos de tiempo t1, t2 y t3. Cada punto en el gráfico representa un valor de píxel de imagen e indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona en el sentido de que cada punto indica un número de fotones incidentes en el sistema sensible a la luz durante el período de tiempo del subconjunto por posición a lo largo de la molécula de DNA. Los datos de imagen 640 se pueden determinar en base a estos subconjuntos de datos de imagen 644a, 644b y 644c como se explicará con más detalle a continuación.

Cada subconjunto 644a, 644b y 644c de valores de píxeles de imagen comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con un evento de emisión de luz durante el período de tiempo. Un evento de emisión de luz puede comprender la unión transitoria de una entidad ópticamente activa y la excitación repetida de la entidad seguida por la emisión de un fotón. Para ilustrar, el subconjunto 644a comprende valores de píxeles de imagen asociados con un evento de emisión de luz 648a y valores de píxeles de imagen asociados con un evento de emisión de luz 648b. Además, el subconjunto 644b comprende valores de píxeles de imagen asociados con el evento de emisión de luz 648c y valores de píxeles de imagen asociados con el evento de emisión de luz 648d. El subconjunto 644c comprende valores de píxeles de imagen asociados con el evento de emisión de luz 648e y valores de píxeles de imagen asociados con el evento de emisión de luz 648f.

Luego, para cada evento de emisión de luz 648a - 648f en los subconjuntos de datos de imagen, se ajusta una función de dispersión de puntos a los valores de píxeles de imagen asociados. El ajuste comprende seleccionar una amplitud de la función de dispersión de puntos. En la FIG. 6, los valores de píxeles de imagen asociados con los eventos de emisión de luz 648a - 648f se equipan con una función de dispersión de puntos particular. En la presente memoria, la anchura de esta función de dispersión de puntos no se adaptó para el ajuste, meramente la amplitud de la función de dispersión de puntos. Como se muestra, el evento de emisión de luz 648a se ajusta con la función de dispersión de puntos que tiene una amplitud mucho mayor que la función de dispersión de puntos que se ajusta al evento de emisión de luz 648e.

Luego, como se indica por las flechas, para cada evento de emisión de luz en los subconjuntos de datos de imagen, en base a la amplitud seleccionada para ajustar la función de dispersión de puntos y, opcionalmente, en base a una anchura seleccionada para ajustar la función de dispersión de puntos, se determina una curva de localización de eventos 650. La curva de localización 650 indica una posición del evento de emisión de luz. La curva de localización de eventos puede indicar la posición del evento de emisión de luz en el sentido de que indica una posición media y una varianza asociada. En una realización, las curvas de localización de eventos son perfiles gaussianos normalizados. Entonces, la varianza de los gaussianos se puede calcular usando una fórmula para la incertidumbre de localización como, por ejemplo, se describe en (Mortensen et al., Nature Methods, 2010, 7, 377-381)

^t _V ⁱ _ar ^s _(¡ux ^\ _{) = —} ^{o 2} _(— ¹⁶ _{+ -} ⁸ _-- ^m _-- ^j _N ^2ab-² ₎

x N 9 Na 2

Donde o 2 = O2 a2 /12 con a dada por la desviación estándar de la función de dispersión de puntos y a el tamaño de píxel. N es el número de fotones recopilados y b es el ruido de fondo. Esta fórmula estipula que cuantos más fotones se detecten para un evento de emisión de luz, menor es la varianza. Esto se refleja por las curvas de localización de eventos 650 en la FIG. 6. Obsérvese, por ejemplo, que la curva de localización de eventos 650a es más estrecha, es decir, tiene una varianza menor que la curva de localización de eventos 650e, lo que está de acuerdo con que la amplitud de la función de dispersión de puntos ajustada sea mayor para el evento de emisión de luz 648a que para el evento de emisión de luz 648e.

Entonces, como se indica por el signo más, los datos de imagen 640 se determinan sumando las curvas de localización de eventos determinadas. Como los datos de imagen determinados se basan en ajustes (gaussianos), en principio se puede elegir cualquier resolución para los valores de píxeles de imagen (mostrados como puntos en la FIG. 4B) en los datos de imagen.

Alternativamente, determinar los datos de imagen 640 comprende sumar los valores de píxeles de imagen en los subconjuntos de datos de imagen 644a, 644b y 644c. Entonces, no se necesitan determinar las curvas de localización de eventos, lo que permite un procesamiento más rápido. La precisión puede ser suficiente para medir la cinética de la estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona.

Los datos de imagen 640 también se pueden determinar de la siguiente manera (no mostrado). En un primer paso, se elige una cuadrícula de píxeles que tiene píxeles de un tamaño particular que es más pequeño que la mejor precisión de localización esperada. Luego, en base a la ubicación determinada por la curva de localización de eventos, se activa el píxel más cercano a ese evento. Opcionalmente, en lugar de activar un píxel, para cada localización, se puede añadir un recuento al píxel más cercano a esa ubicación. Aún más, para cada localización se puede trazar una curva gaussiana predeterminada, que tiene una anchura predeterminada, sobre los píxeles predeterminados de los datos de imagen.

Para determinar los datos de imagen 440 mostrados en la FIG. 4, a = 130 nm y b = 5,2. La desviación estándar de la función de dispersión de puntos se puede calcular por s = 0,25 A/NA, donde A es la longitud de onda de la luz (A = 570nm para emisión SxO) y NA la apertura numérica del objetivo (NA = 1,2).

Los datos de imagen 440 mostrados en la FIG. 4 se adquirieron sobre un periodo de 1 hora y 40 minutos. En este experimento en particular 5,0104 eventos de emisión de luz se localizaron en una longitud de DNA de 15,8 micrómetros, correspondiente a una densidad de localización de 3 nm-1. Un evento de emisión de luz se puede entender que es una unión de una entidad ópticamente activa a la estructura anfitriona.

Con el fin de mejorar la resolución espacial del método, la tasa de cobertura se puede mantener baja. Para ilustrar, si dos eventos de emisión de luz ocurren simultáneamente y muy cerca uno del otro, los ajustes de la función de dispersión de puntos de estos dos eventos se solaparían. Simultáneamente se puede entender como durante un período de tiempo único asociado con un subconjunto particular de datos de imagen. En tal caso, puede haber un valor de píxel de imagen en el subconjunto particular de datos de imagen que está asociado con ambos eventos de emisión de luz, lo evita un ajuste preciso de la función de dispersión de puntos a cualquiera de los eventos de emisión de luz. Por lo tanto, la tasa de cobertura se puede mantener lo suficientemente baja de modo que sea poco probable que dos eventos de emisión de luz ocurran simultáneamente dentro de una distancia particular uno de otro. La distancia particular puede corresponder a una anchura de la función de propagación de puntos del sistema sensible a la luz, por ejemplo, 300 nm, lo que asegura que la función de dispersión de dos puntos se ajuste en un subconjunto de datos de imagen no se solapan significativamente. En caso de que la estructura anfitriona sea una molécula de DNA, elegir que la distancia particular sea 300 nm significaría que ocurre menos de un evento de unión por cada 1000 pares de bases, lo que correspondería a una cobertura fraccional de menos del 0,1%. Preferiblemente, la cobertura fraccional es incluso más baja porque cuando la cobertura fraccional en este ejemplo fuese 0.1%, los eventos de unión se deben distribuir espacialmente de manera uniforme, de otro modo, las funciones de dispersión de puntos aún se solaparían.

La Fig. 7 ilustra que los métodos descritos en la presente memoria permiten una gama de otras aplicaciones interesantes. La huella estrecha de los (mono) intercaladores de alrededor de 2 pares de bases permite la detección de pequeños huecos o discontinuidades en los filamentos de proteínas (las estructuras huésped) incluso en el DNA casi saturado (la estructura anfitriona). La unión del intercalador entre medias de los filamentos de proteínas se puede usar, de este modo, para estimar la longitud del filamento ininterrumpida promedio. Para la FIG. 7A un DNA como estructura anfitriona estaba casi completamente saturado con una proteína RAD51 como estructura huésped. Cuando el DNA saturado con RAD51 se expuso a la unión de YO-PRO, se observó un patrón de unión escaso claro del intercalador, como se muestra en la FIG. 7A, que es consistente con la proteína que forma una estructura discontinua en el DNA. La distancia pico a pico en el perfil de intensidad proporcionó una estimación de la longitud máxima del filamento de RAD51 de 1 kbp, que concuerda con las estimaciones anteriores de los datos de AFM (Ristic et al. 2005). La formación de imágenes de las proteínas en sí mismas no produciría en este caso ninguna información, dado que las fluctuaciones en la señal fluorescente serían demasiado pequeñas para dar estimaciones para la longitud del filamento. De esta forma, el método produce información acerca de la arquitectura de la proteína que era inaccesible para formar imágenes de las proteínas en sí mismas.

Además, los métodos descritos en la presente memoria se pueden emplear para visualizar la dinámica de proteínas en dsDNA. En particular, la FIG. 7C es un quimógrafo que muestra manchas oscuras causadas por multímeros XLF blanqueados que se mueven a lo largo de un DNA con una resolución de tiempo de 190 ms.

La FIG. 8 ilustra un método según una realización. En la presente memoria, los pasos 814, 816, 818 y 820 son similares a los pasos 114, 116, 118 y 120 como se describió anteriormente. Los pasos 860, 862 y 864 se pueden realizar antes o después de que se realicen los pasos 814, 816 y 818.

El paso 860 comprende que el sistema sensible a la luz reciba la luz de referencia de la estructura anfitriona que aloja una o más entidades ópticamente activas. Las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde la estructura anfitriona y la estructura anfitriona aloja una cantidad de referencia de estructuras huésped, por ejemplo, no aloja ninguna estructura huésped.

El paso 862 comprende que el sistema sensible a la luz emita una señal de referencia en base a la luz de referencia recibida y el paso 864 comprende determinar un valor de luz de referencia en base a la señal de salida. El valor de luz de referencia indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz.

Por supuesto, en caso de que el sistema sensible a la luz comprenda un sistema de formación de imágenes, el paso 864 puede comprender determinar datos de imagen de referencia en base a la señal de referencia, en donde los datos de imagen de referencia representan una imagen de al menos parte de la estructura anfitriona y que comprenden una pluralidad de valores de píxeles de imagen de referencia asociados con partes respectivas de la estructura anfitriona. Cada valor de píxel de imagen de referencia entonces indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona incidente sobre el sistema sensible a la luz. En tal realización, el promedio y la variación de los valores de píxeles de imagen descritos anteriormente se pueden determinar en base a estos valores de píxeles de imagen de referencia determinados. Después de todo, estos valores de píxeles de imagen de referencia están asociados con partes de la estructura anfitriona que no alojan una estructura huésped.

En esta realización, el paso 820 comprende determinar sobre la base del valor de luz y del valor de luz de referencia al menos una de la cantidad y la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

Puede ser que una estructura anfitriona en sí misma, sin alojar una estructura huésped, comprenda partes que no pueden alojar ninguna entidad ópticamente activa, independientemente de si una estructura huésped está presente o no en estas partes. En un ejemplo, la estructura anfitriona tiene una estructura particular que impide que las estructuras huésped se unan en ciertas partes. Si no fuera por tal medición de la línea de base, tales partes se pueden identificar falsamente como que alojan una estructura huésped, lo que impactaría negativamente en la precisión de determinar la cantidad y/o posición de las estructuras huésped en la estructura anfitriona.

La Fig. 9 representa un diagrama de bloques que ilustra un sistema de procesamiento de datos ejemplar que puede comprender el sistema óptico como se describió en la presente memoria.

Como se muestra en la Fig. 9, el sistema de procesamiento de datos 970 puede incluir al menos un procesador 972 acoplado a los elementos de memoria 978 a través de un bus de sistema 976. Como tal, el sistema de procesamiento de datos puede almacenar código de programa dentro de los elementos de memoria 978. Además, el procesador 972 puede ejecutar el código de programa al que se accede desde los elementos de memoria 978 a través de un bus de sistema 976. En un aspecto, el sistema de procesamiento de datos se puede implementar como un ordenador que es adecuado para almacenar y/o ejecutar código de programa. Se debería apreciar, no obstante, que el sistema de procesamiento de datos 970 se puede implementar en forma de cualquier sistema que incluya un procesador y una memoria que sea capaz de realizar las funciones descritas dentro de esta especificación.

Los elementos de memoria 978 pueden incluir uno o más dispositivos de memoria física tales como, por ejemplo, la memoria local 980 y uno o más dispositivos de almacenamiento masivo 982. La memoria local puede referirse a la memoria de acceso aleatorio u otro dispositivo o dispositivos de memoria no persistente generalmente usados durante la ejecución real del código del programa. Un dispositivo de almacenamiento masivo se puede implementar como un disco duro u otro dispositivo de almacenamiento de datos persistente. El sistema de procesamiento 970 también puede incluir una o más memorias caché (no mostradas) que proporcionan almacenamiento temporal de al menos algún código de programa con el fin de reducir el número de veces que el código de programa se debe recuperar del dispositivo de almacenamiento masivo 982 durante la ejecución.

Los dispositivos de entrada/salida (I/O) representados como un dispositivo de entrada 984 y un dispositivo de salida 986 opcionalmente se pueden acoplar al sistema de procesamiento de datos. Los ejemplos de dispositivos de entrada pueden incluir, pero no se limitan a, un teclado, un dispositivo de apuntamiento, tal como un ratón o similar. Los ejemplos de dispositivos de salida pueden incluir, pero no se limitan a, un monitor o un visualizador, altavoces o similares. Los dispositivos de entrada y/o salida se pueden acoplar al sistema de procesamiento de datos, o bien directamente o bien a través de controladores de I/O intermedios.

En una realización, los dispositivos de entrada y salida se pueden implementar como un dispositivo combinado de entrada/salida (ilustrado en la Fig. 9 con una línea discontinua que rodea el dispositivo de entrada 984 y el dispositivo de salida 986). Un ejemplo de tal dispositivo combinado es una pantalla sensible al tacto, a la que también se hace referencia algunas veces como “visualizador de pantalla táctil” o simplemente “pantalla táctil”. En tal realización, la entrada al dispositivo se puede proporcionar por un movimiento de un objeto físico, tal como, por ejemplo, un lápiz o un dedo de un usuario, en o cerca del visualizador de pantalla táctil.

También se puede acoplar un adaptador de red 988 al sistema de procesamiento de datos para permitirle que llegue a ser acoplado a otros sistemas, sistemas informáticos, dispositivos de red remotos y/o dispositivos de almacenamiento remoto a través de redes privadas o públicas intermedias. El adaptador de red puede comprender un receptor de datos para recibir datos que se transmiten por dichos sistemas, dispositivos y/o redes al sistema de procesamiento de datos 970, y un transmisor de datos para transmitir datos desde el sistema de procesamiento de datos 970 a dichos sistemas, dispositivos y/o redes. Los módems, los módems de cable y las tarjetas de Ethernet son ejemplos de diferentes tipos de adaptadores de red que se pueden usar con el sistema de procesamiento de datos 970.

Como se ilustra en la Fig. 9, los elementos de memoria 978 pueden almacenar una aplicación 990. En diversas realizaciones, la aplicación 990 se puede almacenar en la memoria local 980, el uno o más dispositivos de almacenamiento masivo 982, o aparte de la memoria local y los dispositivos de almacenamiento masivos. Se debería apreciar que el sistema de procesamiento de datos 970 puede ejecutar además un sistema operativo (no mostrado en la Fig. 9) que puede facilitar la ejecución de la aplicación 990. La aplicación 990, que se implementa en forma de código de programa ejecutable, se puede ejecutar por el sistema de procesamiento de datos 970, por ejemplo, por el procesador 972. En respuesta a ejecutar la aplicación, el sistema de procesamiento de datos 970 se puede configurar para realizar una o más operaciones o pasos del método descritos en la presente memoria.

Diversas realizaciones de la invención se pueden implementar como un producto de programa para usar con un sistema informático, donde el programa o programas del producto de programa definen funciones de las realizaciones (incluyendo los métodos descritos en la presente memoria). En una realización, el programa o programas pueden estar contenidos en una variedad de medios de almacenamiento legibles por ordenador no transitorios, donde, como se usa en la presente memoria, la expresión “medios de almacenamiento legibles por ordenador no transitorios” comprende todos los medios legibles por ordenador, con la única excepción que es una señal de propagación transitoria. En otra realización, el programa o programas pueden estar contenidos en una variedad de medios de almacenamiento legibles por ordenador transitorios. Los medios de almacenamiento legibles por ordenador ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: (i) medios de almacenamiento no escribibles (por ejemplo, dispositivos de memoria de solo lectura dentro de un ordenador, tales como discos CD-ROM legibles por una unidad de CD-ROM, chips de ROM o cualquier tipo de memoria de semiconductores no volátil de estado sólido) en la que la información se almacena permanentemente; y (ii) medios de almacenamiento escribibles (por ejemplo, memoria rápida, discos flexibles dentro de una unidad de disquete o unidad de disco duro o cualquier tipo de memoria de semiconductores de acceso aleatorio de estado sólido) en los que se almacena información alterable. El programa informático se puede ejecutar en el procesador 972 descrito en la presente memoria.

La terminología usada en la presente memoria es con el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que sea limitante de la invención. Como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” se pretende que incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entenderá además que los términos “comprende” y/o “que comprende”, cuando se usan en esta especificación, especifican la presencia de características, números enteros, pasos, operaciones, elementos y/o componentes establecidos, pero no excluyen la presencia o adición de una o más de otras características, números enteros, pasos, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia de al menos una estructura huésped biológica en una estructura anfitriona biológica, el método que comprende

un sistema sensible a la luz que recibe luz de la estructura anfitriona que aloja una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped, en donde las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde dicha al menos una parte, y

el sistema sensible a la luz que emite una señal en base a la luz recibida, y

determinar un valor de luz en base a la señal de salida, el valor de luz que indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz, y

determinar sobre la base del valor de luz al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende

determinar una propiedad de unión de la al menos una estructura huésped con respecto a la estructura anfitriona sobre la base del valor de luz.

3. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema sensible a la luz es parte de un microscopio, el método que comprende:

determinar datos de imagen en base a la señal de salida, los datos de imagen que representan una imagen de al menos parte de la estructura anfitriona y que comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona, en donde cada valor de píxel de imagen indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona incidente sobre el sistema sensible a la luz;

determinar al menos una región de interés (ROI) que comprende al menos un valor de píxel de imagen en la imagen sobre la base de los valores de píxeles de imagen, en donde al menos una ROI en la imagen indica la posición de la al menos un estructura huésped en la estructura anfitriona.

4. El método según la reivindicación anterior, en donde determinar la al menos una ROI en la imagen comprende determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen de la ROI es indicativo de una cantidad de luz que es menor que una cantidad de luz umbral.

5. El método según la reivindicación anterior,

determinar un valor de píxel umbral que indica la cantidad de luz umbral sobre la base de los datos de imagen, y en donde el paso de determinar que dicho al menos un valor de píxel de imagen es indicativo de la cantidad de luz menor que la cantidad de luz umbral comprende comparar el al menos un valor de píxel de imagen con el valor de píxel umbral, en donde determinar el valor de píxel umbral comprende

determinar un promedio y una variación de valores de píxeles de imagen que están asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona que no alojan una estructura huésped;

en base al promedio y a la variación determinados, determinar el valor de píxel umbral.

6. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde determinar los datos de imagen en base a la señal de salida comprende

determinar, para una pluralidad de periodos de tiempo, subconjuntos respectivos de datos de imagen en base a la señal de salida, en donde cada subconjunto de datos de imagen representa una imagen (542a, 542b y 542c) de al menos parte de la estructura anfitriona durante periodos de tiempo respectivos, cada subconjunto de datos de imagen que comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con las partes respectivas de la estructura anfitriona, en donde cada valor de píxel de imagen en un subconjunto de datos de imagen indica una cantidad de luz de su parte asociada de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz durante su período de tiempo asociado,

determinar los datos de imagen en base a los subconjuntos de datos de imagen.

7. El método según la reivindicación 6, en donde

cada subconjunto de valores de píxeles de imagen comprende una pluralidad de valores de píxeles de imagen asociados con un evento de emisión de luz durante el período de tiempo, y en donde

determinar los datos de imagen en base a los subconjuntos de datos de imagen comprende además:

para cada evento de emisión de luz en los subconjuntos de datos de imagen, ajustar una función de dispersión de puntos a su pluralidad de valores de píxeles de imagen para determinar una posición de cada evento de emisión de luz, en donde, opcionalmente, el ajuste comprende seleccionar una amplitud y/o anchura de la función de dispersión de puntos;

para cada evento de emisión de luz en los subconjuntos de datos de imagen, opcionalmente en base a la amplitud seleccionada, determinar sobre la base de la función de dispersión de puntos ajustada una curva de localización de eventos que indica una posición del evento de emisión de luz, y

determinar los datos de imagen que comprenden sumar las curvas de localización de eventos determinadas.

8. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde una ocupación fraccional de la estructura anfitriona por las entidades ópticamente activas está por debajo del 20 %, preferiblemente por debajo del 15 %, más preferiblemente por debajo del 10 %, lo más preferiblemente por debajo del 5 %.

9. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además

el sistema sensible a la luz que recibe la luz de referencia de la estructura anfitriona que aloja uno o más entidades ópticamente activas, en donde las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde la estructura anfitriona y en donde la estructura anfitriona aloja una cantidad de referencia de estructuras huésped y el sistema sensible a la luz que emite una señal de referencia en base a la luz de referencia recibida, y determinar un valor de luz de referencia en base a la señal de salida, el valor de luz de referencia que indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz, y

determinar sobre la base del valor de luz y del valor de luz de referencia al menos una de la cantidad y la posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.

10. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde

la estructura anfitriona se coloca, al menos parcialmente, en un fluido que comprende entidades ópticamente activas, las entidades ópticamente activas que están configuradas para unirse transitoriamente a la estructura anfitriona.

11. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además controlar un sistema de aplicación de fuerza para aplicar una tensión a la estructura anfitriona para al menos uno de

- controlar la señal que se emite por el sistema sensible a la luz, y

- suprimir un movimiento de la estructura anfitriona.

12. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde

la al menos una estructura huésped comprende una proteína y/o un complejo proteínico, y/o

la estructura anfitriona es una molécula de DNA, y/o

las entidades ópticamente activas son moléculas intercaladoras de DNA y/o

el sistema sensible a la luz comprende un sistema de formación de imágenes.

13. Un sistema óptico para determinar la presencia de al menos una estructura huésped biológica en una estructura anfitriona biológica, el sistema óptico que comprende

un sistema sensible a la luz configurado para recibir luz de la estructura anfitriona que aloja una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped, en donde las entidades ópticamente activas causan una emisión de luz desde dicha al menos una parte, y emitir una señal en base a la luz recibida, el sistema óptico que comprende además

un sistema de procesamiento de datos configurado para realizar los pasos de

14. El sistema óptico según la reivindicación 13, que comprende además al menos uno de

una fuente de luz de excitación para generar luz de excitación para excitar la una o más entidades ópticamente activas alojadas por la estructura anfitriona,

un portamuestras para sujetar la estructura anfitriona, opcionalmente el portamuestras que comprende una célula de flujo,

un primer sistema óptico para dirigir la luz de excitación hacia la estructura anfitriona, opcionalmente el primer sistema óptico sistema que comprende una lente condensadora para enfocar la luz de excitación sobre la estructura anfitriona,

un segundo sistema óptico para dirigir la luz desde dicha al menos una parte de la estructura anfitriona al sistema sensible a la luz, opcionalmente el segundo sistema óptico que comprende una lente objetivo,

un sistema de trampa para atrapar al menos un cuerpo en una trampa unida a la estructura anfitriona, en donde, opcionalmente, la trampa es una trampa óptica y/o acústica, y en donde, opcionalmente, el sistema de trampa comprende medios para colocar la trampa,

un sistema de detección de fuerza para determinar una fuerza ejercida por la trampa sobre el cuerpo atrapado.

15. Un método para permitir la determinación de al menos una de una cantidad y una posición de al menos una estructura huésped biológica a la estructura de anfitriona biológica, el método que comprende

combinar la estructura anfitriona que aloja la al menos una estructura huésped con un fluido y una pluralidad de entidades ópticamente activas para hacer que la estructura anfitriona aloje una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja la al menos una estructura huésped, en donde las entidades ópticamente activas causan la emisión de luz desde dicha al menos una parte.

16. Un programa informático que comprende instrucciones que, cuando el programa se ejecuta por un ordenador, hacen al ordenador

- determinar un valor de luz en base a una señal que se emite por un sistema sensible a la luz de un sistema óptico sobre la base de la luz recibida de una estructura anfitriona biológica que aloja una o más entidades ópticamente activas en al menos una parte de la estructura anfitriona que no aloja al menos una estructura huésped biológica, las entidades ópticamente activas que causan la emisión de luz desde dicha al menos una parte, en donde el valor de luz indica una cantidad de luz de la estructura anfitriona que es incidente sobre el sistema sensible a la luz, y - determinar sobre la base del valor de luz al menos una de una cantidad y una posición de la al menos una estructura huésped en la estructura anfitriona.