CN102636473A - 激发光偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能有效避免杂散光的干扰、消除背景噪声、具有高灵敏度的激发光偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法。激发光偏离共线型光学系统检测装置，沿光路依次设置激发光路、样品检测池和荧光收集光路，所述激发光路发出的激发光与荧光收集光路的角度α为5-50°。本发明的激发光路发出的激发光以小角度偏离荧光收集光路，使杂散光的干扰被有效消除，背景噪声极低，具有高的检测灵敏度，仪器体积小，分析速度快，适合于微升至纳升的样品分析分离和检测，特别适合于氨基酸、蛋白质、DNA、RNA分析，以及单个生物细胞的研究。

Description

激发光偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测分析仪器，特别是涉及一种激发光以小角度偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法。

背景技术

为了适应化学分析设备分析速度快、微型化的发展趋势，各种分析仪器应运而生。高效液相色谱(HPLC)具有分析速度快、色谱柱可以反复使用、不受热稳定性及挥发性的限制等特点，广泛应用于生命科学和生物工程等方面。毛细管电泳(CE)将电泳技术和色谱理论相结合，是分析科学中继HPLC后的又一重大进展。CE是高效、快速、样品和试剂消耗少的一种分离技术，CE以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，样品中的组分按迁移速度的不同而得以分离。常用的毛细管材料是弹性涂层熔融石英管，内径一般为25～100μm，外径为25～100μm。其可广泛满足生物化学各领域中对蛋白质(包括酶、抗体)、氨基酸，、核苷酸、药物等方面的分离分析。

CE的出现为微流控芯片(Microfluidic Chip)的发展奠定了基础，微流控芯片是微全分析系统(Micro Total Analysis System，μ-TAS)研究的核心技术。目前的微流控芯片是CE的合理集成和发展。微流控芯片电泳是一种通过采用微细加工技术，在数平方厘米大小的基片上，制作出电泳微流通道结构及其它功能单元，以实现集微量样品分离、检测于一体的快速、高效、低耗的微型电泳分析实验装置。近年来，随着毛细管电泳技术在生命科学、生物医药工程、环境保护、食品检验等领域的迅速普及和应用，更加微型化、功能化的微流控芯片电泳的制备和发展倍受关注。以先进的微机械加工技术、激光技术、微电子技术等高新技术和分析化学、生物化学的最新研究成果相结合，将传统毛细管电泳的进样、分离和检测系统高度集成在各种材质的基片上形成微流控芯片电泳，可完成进样、柱上浓缩、柱前衍生、电泳分离、柱后反应、收集等多步分析操作，并实现秒级乃至毫秒级的超高速分离。

目前，高效液相色谱、毛细管电泳和微流控芯片被学术界公认为是分离技术的核心。通常采用的检测方法有质谱、电化学、化学发光和荧光检测等方法。激光诱导荧光(Laser induced fluorescence，LIF)是目前毛细管电泳和微流控芯片检测中使用最为广泛的检测体系，也是灵敏度最高的检测方法之一，甚至可以达到单分子检测水平。

传统的激光诱导荧光检测技术中的激发光源主要以氩离子激光器为主的气体激光器。这类气体激光器存在体积大，成本高等缺点，限制了激光诱导荧光的广泛应用。半导体泵浦固体激光器及染料激光器作为理想激光光源，具有体积小、输出功率稳定和价格低等优点，具有广泛的应用前景。

激光诱导荧光的光路系统主要包括非共聚焦型、共线型和正交型。非共聚焦型是激发光以一定的入射角度照射芯片的检测点，激发产生的荧光在垂直于样品检测池的方向被物镜收集，该模式结构简单，易于制作，但是激发光和杂散光的干扰非常大，导致信噪比差，目前已经很少使用该模式。共线型是激发光束经过透镜聚焦到样品，激发的荧光被该透镜收集且激发光与发射的荧光成一条直线，该结构简单，但样品检测池及通道内壁界面产生的散射、反射和折射等杂散光会导致较高的背景噪声。而传统的正交模式是激发光路与荧光收集光路相互垂直，但是荧光收集效率有限，空间体积大，且不易采用短焦距透镜。这三种光路模式中，激发光的干扰，样品检测池自身的反射等杂散光都能被垂直于样品检测池方向的光电检测器检测到，导致背景噪声大，影响检测系统的灵敏度。并且，这类组装仪器在不同程度上均存在着需要昂贵的进口滤光光学元件、维护费用高及兼容性差等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能有效避免杂散光的干扰、消除背景噪声、具有高灵敏度的激发光偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：激发光偏离共线型光学系统检测装置，沿光路依次设置激发光路、样品检测池和荧光收集光路，所述激发光路发出的激发光与荧光收集光路的角度α为5-50°。

进一步的，所述样品检测池是微流控芯片、毛细管或比色皿。

进一步的，所述激发光路包括依次设置的激发光源、衰减片、第一孔光阑、半反半透镜和透镜。

进一步的，所述激发光源采用半导体泵浦固体激光器或染料激光器。

进一步的，所述激发光源发出的激发光经过衰减片和第一孔光阑后，其输出功率为3-7mW。

进一步的，所述激发光源发出的激发光经过衰减片和第一孔光阑后，其直经为50-500μm。

进一步的，所述半反半透镜与水平面之间的角度β为大于15°且小于45°。

进一步的，所述荧光收集光路沿光路依次设置透镜、半反半透镜、高通滤光片、带通滤光片、第二孔光阑、光电检测器。

进一步的，所述光电检测器采用光电倍增管、雪崩二极管、CCD或二极管阵列检测器。

激发光偏离共线型光学系统检测装置的检测方法，所述激发光源发出的激发光经半反半透镜反射后，通过透镜的非中心部位的折射，再经过样品检测池的折射，激发光经一系列梯度折射后照射在样品检测池的检测点上，实现待测物质荧光激发，发射的荧光经过透镜的中心被收集。

本发明的有益效果是：本发明的激发光路发出的激发光经过透镜的非中心部位的折射及微流控芯片、毛细管或比色皿的折射，激发光源经过不同介质的梯度折射以小角度准直地会聚到微流控芯片、毛细管或比色皿的检测点，实现待测物质荧光激发，发射的荧光经过该透镜的中心被收集。激发光以小角度偏离荧光收集光路，使杂散光的干扰被有效消除，背景噪声极低，具有高的检测灵敏度，仪器体积小，分析速度快，适合于微升至纳升的样品分析分离和检测，特别适合于氨基酸、蛋白质、DNA、RNA分析，以及单个生物细胞的研究；可与微流控芯片、毛细管电泳、高效液相色谱和荧光光谱仪等分析仪器联用。

附图说明

图1是本发明用于微流控芯片的结构示意图。

图2是本发明用于毛细管的结构示意图。

图3是本发明用于比色皿的结构示意图。

图4是当半反半透镜与水平面之间为不同的角度时，对硼砂缓冲溶液所产生的背景信号强度的谱图。

图5是图4的A处的局部放大图。

图6是采用本发明分离异硫氰酸荧光素衍生氨基酸的电泳谱图。

图7是本发明检测以萘-2，3-二缩醛衍生后的单个小鼠成纤维细胞内谷胱甘肽电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

如图1-图3所示，本发明沿光路依次设置激发光路、样品检测池和荧光收集光路，所述样品检测池可以是微流控芯片11、毛细管17或比色皿20。其中激发光路包括依次设置的激发光源5、衰减片6和第一孔光阑7、半反半透镜8和透镜9，所述荧光收集光路包括依次设置的透镜9、半反半透镜8、高通滤光片12、带通滤光片13、第二孔光阑14、光电检测器15。

激发光源5发出的激发光经过衰减片6和第一孔光阑7后，使输出的激发光源的功率和直经分别为3-7mW、50-500μm，以优化激发光源的功率和激光束的尺寸，从而提高激发光束中心区域的利用效率，减少激发光源杂散光的干扰。经激发光路优化后的激发光1到达半反半透镜8，经半反半透镜8反射后的激发光通过透镜9的非中心部位的折射，再经过微流控芯片11、毛细管17或比色皿20的折射，激发光经一系列梯度折射后照射在微流控芯片11、毛细管17或比色皿20的检测点上，实现待测物质的荧光激发，发射的荧光经过透镜9的中心被收集。激发光经过透镜和微流控芯片11、毛细管17或比色皿20的梯度折射不仅可以使激发光路偏离荧光收集光路，并且能使光束聚焦到微流控芯片11、毛细管17或比色皿20的检测点。上述半反半透镜8与水平面之间的角度β为大于15°且小于45°，激发光与荧光收集光路的角度α为5-50°，从而使激发光以小角度偏离于传统的共线型(激发光与发射光共线)，这样可以有效避免反射光19及其他杂散光的干扰，能提高检测灵敏度。

上述产生的荧光信号2通过透镜9的中心，发射的荧光方向不会改变且可以最大化荧光的收集效率。收集到的荧光信号再通过半反半透镜8、高通滤光片12、带通滤光片13、孔光阑14，以消除激发光的背景干扰，最后利用光电检测器15将光信号转换成电信号，然后利用色谱工作站16对所得信号进行数据处理，实现荧光检测。上述光电检测器15可采用光电倍增管、雪崩二极管、CCD或二极管阵列检测器。

相对于传统的非共聚焦型、共线型和正交型荧光激光诱导荧光检测模式，本发明的这种小角度偏离共线型的模式，避免了传统荧光检测模式中存在的障碍问题，即避免了微流控芯片11、毛细管17或比色皿20本身的反射和折射等一系列的杂散光干扰，有利于提高检测灵敏度并且整个光学结构简单、紧凑、体积小，不需要昂贵的滤光系统，仪器总成本价格仅需6000元左右，比现有仪器价格低几十倍。激发光路和荧光收集光路的组件可以安装在30cm×20cm×15cm的暗箱内，体积小，便于携带，可以用于户外分析检测。

改变半反半透镜8与水平面之间的角度β分别为25°、35°、45°，同时激发光偏离荧光收集光路的角度α也随之改变，导致α值分别为30°、20°、0°，检测不同的β角度产生的背景信号值。在相同的条件下，检测同一浓度的硼砂缓冲溶液(pH 9.2)，得到如图4所示的三种β角度的信号值，图中，a代表β为45°得到的谱图，b代表β为25°角得到的谱图，c代表β为35°角得到的谱图。从图中可以看出，采用45°得到的背景信号噪声较大，实际上采用这一角度就等同于传统意义的共线型，激发光与荧光收集光路共线，芯片的反射光及其他杂散光的干扰严重；采用25°得到的背景信号噪声也比较大；采用35°得到的检测信号稳定，从c的放大图可知，基线噪声仅为0.002mV，背景噪声基本完全消除，信噪比大大提高，如图5所示。

实施例1：

采用本发明的微流控芯片检测装置测试异硫氰酸荧光素(FITC)衍生后的精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phen)的分离，得到如图6所示的电泳图谱。其中，A为FITC衍生后的精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phen)的电泳图；B为FITC的标准溶液。从图中可知，精氨酸和苯丙氨酸得到基线分离。

实施例2：

采用本发明的微流控芯片检测装置测试以萘-2，3-二缩醛(NDA)衍生后的单个3T3细胞内谷胱甘肽(GSH)。对NDA衍生后的单个3T3细胞的检测中，其电泳条件为：(1)柱前衍生条件：将3T3细胞用PBS缓冲溶液(pH7.4)清洗四次后，在1.5mL的塑料离心管中用PBS稀释到1mL，然后往细胞悬浮液中加入100μL的NDA乙腈溶液，充分摇匀，在室温下10min即可完成衍生过程。(2)单个细胞的操纵将上述衍生后的细胞液加入样品池，在储液池中加入硼砂缓冲溶液，由于液面高度差，利用液体静压力，在倒置荧光显微镜下观察样品池中的细胞往样品废液池流动的情况，控制单个细胞停留在微芯片的双T交叉口处，与此同时，阻止其余细胞继续往样品废液池方向流动。单细胞被定位后，立即施加电压溶胞和分离检测细胞内容物。(3)电泳条件：缓冲溶液为10mM的硼砂缓冲溶液(pH 9.2)，微流控芯片的有效分离长度是2.8cm，细胞溶胞的电压为V1＝550V、V2＝1000V、V3＝V4＝0V，分离电压为V1＝1500V、V2＝0V、V3＝V4＝200V。

如图7所示为萘-2，3-二缩醛(NDA)衍生后的单个3T3细胞内谷胱甘肽(GSH)的电泳谱图，其中，A为NDA衍生的3T3细胞的单个细胞电泳图；B为10μM NDA-GSH标准品，由于AnalChem，1995，67，4261-4268文献报道的NDA对GSH特异性标记，图中A对单个细胞的检测只有一个最明显的GSH的峰，与GSH标准品电泳图迁移时间完全一致。

Claims (10)

1.激发光偏离共线型光学系统检测装置，沿光路依次设置激发光路、样品检测池和荧光收集光路，其特征在于：所述激发光路发出的激发光与荧光收集光路的角度α为5-50°。

2.如权利要求1所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述样品检测池是微流控芯片(11)、毛细管(17)或比色皿(20)。

3.如权利要求1或2所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述激发光路包括依次设置的激发光源(5)、衰减片(6)、第一孔光阑(7)、半反半透镜(8)和透镜(9)。

4.如权利要求3所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述激发光源(5)采用半导体泵浦固体激光器或染料激光器。

5.如权利要求3所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述激发光源(5)发出的激发光经过衰减片(6)和第一孔光阑(7)后，其输出功率为3-7mW。

6.如权利要求3所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述激发光源(5)发出的激发光经过衰减片(6)和第一孔光阑(7)后，其直经为50-500μm。

7.如权利要求3所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述半反半透镜(8)与水平面之间的角度β为大于15°且小于45°。

8.如权利要求1或2所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述荧光收集光路沿光路依次设置透镜(9)、半反半透镜(8)、高通滤光片(12)、带通滤光片(13)、第二孔光阑(14)、光电检测器(15)。

9.如权利要求8所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置，其特征在于：所述光电检测器(15)采用光电倍增管、雪崩二极管、CCD或二极管阵列检测器。

10.权利要求3所述的激发光偏离共线型光学系统检测装置的检测方法，其特征在于：所述激发光源(5)发出的激发光经半反半透镜(8)反射后，通过透镜(9)的非中心部位的折射，再经过样品检测池的折射，激发光经一系列梯度折射后照射在样品检测池的检测点上，实现待测物质荧光激发，发射的荧光经过透镜(9)的中心被收集。

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