CN101196466B - 激光双模式微体积样品分析方法及所用装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于激光诱导荧光和激光回射干涉技术的激光双模式微体积样品分析方法及所用装置,通过对经液相分离后的各组份,在所用激光波长下,激光诱导荧光检测模式检测具有荧光特性物质的信号,激光回射干涉检测模式检测不具有荧光和吸光特性物质的信号。本发明无须对样品进行任何样品衍生、富集处理步骤。由于待测样品池为微检测池,所需样品量极少,最低可至纳升级。本发明所用装置操作简单,日常维护费用低,测试速度快,结果准确,可以广泛应用于包含有各类不同化学物质的待测体系的定性、定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种微体积样品分析方法及所用装置,具体地说是一种利用激光诱导荧光和激光回射干涉技术进行同时检测的微体积样品的分析方法及其所用检测装置,属于光学领域,也属于分析化学仪器领域。
背景技术
液相分离分析仪器是近年来发展最为迅速的一类分析仪器,它包括高效液相色谱(HPLC),毛细管电泳(CE),离子色谱,超临界流体色谱(SFC)和微流控芯片等仪器,这类仪器具有高效、快速、样品用量和试剂消耗量少等特点。可用于无机、有机和生物大分子的分离分析,在科学研究和生产领域得到了广泛的应用。
分离效率和灵敏度是衡量这类仪器的重要技术指标,这些指标既取决于所用色谱柱或毛细管柱的性质,同时也受制于检测器的性能。研究和开发适用于液相分离分析仪器的微检测池检测器已成为这类仪器研制的热门领域。紫外吸收检测器是这类仪器中使用最为广泛的一类微检测池检测器,由于采用二极管阵列或CCD器件作光探测器,可实现紫外/可见光谱的快速扫描,在色谱或电泳分离的同时得到从190到800nm的实时紫外/可见光谱,从而实现对未知成分的定性和已知物的测定。由于微检测池检测器的光程较短,使得紫外吸收检测器的灵敏度难以提高,而且很难用于目前蓬勃发展的芯片电泳检测。电化学检测器也是在液相分离分析商品仪器中使用较广的一类检测器,它可避免紫外吸收检测器光程较短的不足,在电活性组分的检测上具有灵敏度高,选择性好和线性范围宽等优点,其局限性在于被检测物质必须具有良好的电化学活性,应用于电泳检测时难以消除分离电流对检测电流的干扰,仅能进行柱后和离柱检测,因而成为一种实用性强的商品化电泳仪器的在柱检测器尚待时日。与其它检测技术相比,质谱检测(MS)与液相分离分析仪器联用可获得分离组分的结构信息,一直是众多仪器厂商青睐的对象。目前HPLC-MS、CE-MS、SFC-MS联用商品化仪器已推向市场,但仪器复杂和昂贵,其联用接口和灵敏度仍需进一步完善和提高。基于物质折射指数变化进行检测的折射指数检测器已用作HPLC等仪器的检测器,这种检测器通用性好,但灵敏度不高。已见文献报道的化学发光、核磁共振、毛细管共振等各种检测器也都不同程度的存在灵敏度不足的问题。因而发展灵敏度高和通用性强的检测器仍是液相分离分析仪器研制的重要课题。
一般来说,激光相干性好,易聚焦成微束,特别适用于微体积样品的测定,因而基于激光优良特性的各类激光检测器的研制和应用已成为液相分离分析仪器检测器研究的热门领域。激光诱导荧光检测器是激光类检测器中灵敏度最高并已成为商品化毛细管电泳仪器的一种微检测池检测器。它的灵敏度比紫外吸收检测器高2~3个数量级,但只有极少数化合物在激光激发下可产生自身荧光,大多数化合物需采用荧光标记或衍生后方可分析。基于弱光吸收检测的激光热透镜检测器测量的不是透射,反射或散射光,而是直接测量光的吸收,与紫外吸收检测器相比,灵敏度可提高2个数量级以上,在非荧光和弱吸收物质的检测中体现出高灵敏,高空间分辨率的优点。激光拉曼光谱检测器也见报道,但检测灵敏度不高仍是这类检测器面临的严峻现实。目前,激光类检测器多为单信号检测,尚未见多信号同时检测器用于液相分离分析的仪器的报道,并且除激光诱导荧光检测器外,其它激光光信号检测器尚未成为液相分离分析商品仪器的检测器。
液相分离分析仪器的分析对象(特别是生物样品),往往是含有多种物质的复杂系统。这类样品既含有蛋白质、核酸等生物大分子,又含有多巴胺、氨基酸等小分子,并且这些分子的荧光和吸收特性各异。准确测定它们的种类和含量,对于生命科学研究和临床诊断意义十分重大。然而由于商品检测器的限制,难以同时获取大分子和小分子以及具有和不具有荧光和吸光特性物质的信息。因此,探索同时对具有和不具有荧光和吸光特性的各类物质进行灵敏检测的多信号检测器将极大拓展液相分离分析商品仪器的应用的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足,提供一种基于激光诱导荧光和激光回射干涉技术同时进行检测的微体积样品分析方法及其所用检测装置。通过对经液相分离后的各组份进行检测,在所用激光波长下,激光诱导荧光检测模式检测具有荧光特性物质的信号、激光回射干涉检测模式检测不具有荧光和吸光特性物质的信号,使其光学构型和信号采集模式对液相分离组份同时获取激光诱导荧光和激光回射干涉的光信号。并提供兼具高灵敏度和广谱检测特性的基于激光诱导荧光、激光回射干涉双检测模式毛细管电泳仪样机。
实现本发明目的采用的技术方案是:一种基于激光诱导荧光、激光回射干涉技术的激光双模式微体积样品分析方法,包括以下步骤:
1)将毛细管电泳仪的毛细管12去除一段外保护层作为微检测池5,将毛细管12的两端分别浸没于缓冲溶液承载池14和缓冲溶液承载池16的缓冲溶液液面下,直流高压电源13的正负极分别通过圆柱形铂电极分别浸没于缓冲溶液承载池14和缓冲溶液承载池16的缓冲溶液液面下,进样时用毛细管前后壁处样品池15取代其中一个缓冲溶液承载池,然后利用电驱动或者压差进行进样操作,进样完毕后将原缓冲溶液承载池还原至原本位置,然后打开直流高压电源13输出一定的直流高压,使毛细管电泳仪通电,在直流高压电源的作用下,不同的微体积样品电泳趟度不同,导致不同的微体积样品将以不同速度向毛细管12运动,不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域即微检测池5;
2)将泵浦激光器射1出的激光光束经过偏振片2的调制后,经过分束器3后被聚焦透镜4聚焦于微检测池5的中心处,微检测池5中由泵浦激光器所激发的荧光由显微物镜8收集后,经过光阑9和高通滤光片10的调制,由光电检测器件11进行检测得到激光诱导荧光检测信号;样品池15由激光散射所产生的回射散射光经分束器反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹,然后经过光阑6调制后由光电检测器件7进行检测得到激光回射干涉检测信号,通过个人计算机附带的数字采集卡对激光诱导荧光检测信号和激光回射干涉检测信号进行采集,得到实时变化的数据图线,根据实时变化的数据图线实现对微体积样品的分析。
所述激光诱导荧光、激光回射干涉技术的激光双模式微体积样品分析方法所用微体积样品检测装置,至少包括光学检测调制部分、毛细管电泳部分和信号采集处理部分,光学检测调制部分中的半导体激光器1、偏振片2、分束器3、聚焦透镜4、微检测池5、显微物镜8、光阑9、高通滤光片10和光电检测器件11依次排列,且中心均位于同一水平线,分束器3垂直方向设有光阑6与光电检测器件7,其中微检测池5为毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管;信号采集处理部分中的计算机17与光电检测器件7和光电检测器件11连接。
所述光电检测器件和微检测池分别位于显微物镜的焦平面上。
所述微检测池由光透过率高的材质如玻璃、有机玻璃、石英等制成,其形状为立方体或圆柱体,且内径大于75微米。
所述光电检测器件为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列,光电检测器件为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。
所述泵浦激光器为各波段激光器,光束光能大于20毫瓦。
所述聚焦透镜为双凸透镜,其焦距大于9毫米且小于15.4毫米,最佳焦距为11毫米。
使用本发明所述的微体积样品检测装置与液相分离手段相结合对待测样品进行分离检测,无须对样品进行任何样品衍生、富集处理。由于待测样品池为微检测池,所需样品量极少,最低可至纳升级。本发明操作简单,日常维护费用低,测试速度快,结果准确,可以广泛应用于包含有各类不同化学物质的待测体系的定性、定量检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明
图1是本发明激光双模式微体积样品分析方法所用装置结构示意图。
图2是使用本发明激光双模式微体积样品分析方法进行检测的毛细管电泳仪系统构成示意图。
图中:1.半导体激光器,2.偏振片,3.分束器,4.聚焦透镜,5.微检测池(剥离外防护层的一段毛细管),6.光阑,7.光电检测器件,9.光阑,8.显微物镜,10高通滤光片,11.光电检测器件,12.毛细管,13.直流高压电源,14.缓冲溶液承载池,15.样品池,16.缓冲溶液承载池,17.个人计算机。
具体实施方式
本发明基于激光诱导荧光、激光回射干涉技术同时检测的微体积样品检测装置如图1所示。光学检测调制部分中的半导体激光器1、偏振片2、分束器3、聚焦透镜4、微检测池5、显微物镜8、光阑9、高通滤光片10和光电检测器件11依次排列,且中心均位于同一水平线,分束器3正下方设有光阑6与光电检测器件7,其中微检测池5为毛细管电泳仪中去除一段外保护层的毛细管10如图2所示;信号采集处理部分中的计算机17与光电检测器件7和光电检测器件11连接,激光诱导荧光检测模式中的光电检测器件11和样品池5分别位于显微物镜8的焦平面上。其中分束器3的分束比为5∶5,其分束波段应分别对应于泵浦激光波段;检测激光诱导荧光检测信号的光电检测器件7为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列;检测激光回射干涉检测信号的光电检测器件11为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。聚焦透镜9选用双凸透镜,其焦距大于9毫米而小于15.4毫米,最佳焦距为11毫米;微检测池5,由光透过率高的材质如玻璃、有机玻璃、石英等制成,其形状为立方体或圆柱体,其内径大于75微米;高通滤光片10的波段的选择根据泵浦激光的波段情况予以选择,其截止波段高于泵浦激光的波段;
本发明所用毛细管电泳仪构成如图2所示。毛细管12的两端分别浸没于缓冲溶液承载池14和缓冲溶液承载池16的缓冲溶液液面下。直流高压电源13的正负极分别与圆柱形铂电极相连,两支电极分别浸没于缓冲溶液承载池的缓冲溶液液面下。进样时用样品池15取代其中一个缓冲溶液承载池,然后利用电驱动或者压差进行进样操作。在毛细管上适当的位置处将毛细管的外保护层除去(采用明火烧蚀或利刃刮除的方式皆可),将剥离外防护层的毛细管作为微检测池5,从而实现激光诱导荧光、激光回射干涉技术同时进行检测的微检测池检测器对毛细管电泳动态过程的实时检测。
泵浦激光器1射出之激光光束经过偏振片2的调制后,经过在分束器3后被聚焦透镜4聚焦于微检测池5的中心处;微检测池5中由泵浦激光所激发的荧光由显微物镜8所收集,经过光阑9和高通滤光片10的调制,由光电检测器件11进行检测得到激光诱导荧光检测信号;样品池处由于散射所产生的回射散射光经分束器3反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹,经过光阑6的调制后由光电检测器件7进行检测得到激光回射干涉检测信号。
在电泳仪进行电泳分离的过程中从光电检测器件7和光电检测器件11得到流动体系的激光诱导荧光检测信号和激光回射干涉检测信号,通过个人计算机17附带的数字采集卡对上述的两种待采集信号进行采集,从而得到对应于实时变化的数据图线。
具体检测过程如下:
首先将毛细管12依次用0.1mol/LNaOH溶液、二次蒸馏水及缓冲溶液冲洗,在缓冲溶液承载池14和缓冲溶液承载池16中充满缓冲溶液,并将毛细管12的两端分别浸没于缓冲溶液承载池14和缓冲溶液承载池16的缓冲溶液液面下。直流高压电源13的正负极分别与圆柱形铂电极相连,两支电极分别浸没于缓冲溶液承载池14和和缓冲溶液承载池16的缓冲溶液液面下。
在开始电泳过程前约半小时,将泵浦激光器1、光电检测器件7、光电检测器件11、个人计算机17通电直至所得信号相对稳定。进样时用样品池15取代其中一个缓冲溶液承载池14,然后利用电驱动或者压差进行进样进样操作若干时间。进样完毕后将原缓冲溶液承载池14还原至原来位置,打开直流高压电源13输出一定的直流电压。通电后,在直流高压电源13的作用下,不同的化学物质电泳趟度不同,导致不同的化学物质将以不同速度向毛细管12末端运动。经过若干时间,不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域微检测池5,从光电检测器件7和光电检测器件11处分别得到对应于各不同化学物质的激光回射干涉检测信号和激光诱导荧光检测信号(皆为数百毫伏大小的电压)。分别为数据采集卡采集导入个人计算机,从而实现了对待测体系实时电泳分离过程的检测。所得图线中各峰对应的出现顺序是各不同化学物质定性测量的依据,各峰对应的峰高或者峰面积是各不同化学物质定量测量的依据。
以下公开一组实施测试结果:泵浦激光器1选用半导体激光器(激光波段532nm),分束器3选用分束器对应波段532nm,分束比为5∶5,光电检测器件7选用光二极管,聚焦透镜9选用双凸聚焦透镜(焦距f=11毫米),高通滤光片10选用高通滤光片(截止波长600nm,截止宽度20nm),光电检测器件11选用光电倍增管。毛细管12长度40厘米,内径100微米;除去毛细管的外保护层区域微检测池5离毛细管12尾端5厘米。将12.5毫米12.5mol/L硼砂溶液作为缓冲溶液,进样电压和分离电压均为9KV,进样8秒,检测时间15分钟,在除去外保护层的毛细管微检测池5处,依次分离出罗丹明B、多巴氨(未经任何样品衍生或者富集处理步骤),采用本发明所述的方法得到两幅分别对应与激光诱导荧光信号和激光回射干涉检测信号的图线。依据罗丹明B、多巴氨被分离的顺序和峰面积的大小,检测出待测样品中这些化学物质的浓度,这两种化学物质的检出限:罗丹明B为8.5×10-9mol/L,多巴氨为4.6×10-6mol/L。
Claims (10)
1.一种激光双模式微体积样品分析方法,其特征在于包括以下步骤:
1)将毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管作为微检测池(5),将毛细管(12)的两端分别浸没于缓冲溶液承载池A(14)和缓冲溶液承载池B(16)的缓冲溶液液面下,直流高压电源(13)的正负极分别通过圆柱形铂电极分别浸没于缓冲溶液承载池A(14)和缓冲溶液承载池B(16)的缓冲溶液液面下,进样时用装有样品的样品池(15)取代缓冲溶液承载池A(14)和缓冲溶液承载池B(16)其中一个缓冲溶液承载池,然后利用电驱动或者压差进行进样操作,进样完毕后将原缓冲溶液承载池还原至原本位置,然后打开直流高压电源(13)输出一定的直流高压,使毛细管电泳仪通电,在直流高压电源的作用下,不同的微体积样品电泳趟度不同,导致不同的微体积样品将以不同速度向毛细管(12)运动,不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域即微检测池(5);
2)将半导体激光器(1)射出的激光光束经过偏振片(2)的调制后,经过分束器(3)后被聚焦透镜(4)聚焦于微检测池(5)的中心处,微检测池(5)中由半导体激光器所激发的荧光由显微物镜(8)收集后,经过光阑B(9)和高通滤光片(10)的调制,由光电检测器件B(11)进行检测得到激光诱导荧光检测信号;毛细管前后壁处由激光散射所产生的回射散射光经分束器反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹,然后经过光阑A(6)调制后由光电检测器件A(7)进行检测得到激光回射干涉检测信号,通过计算机附带的数字采集卡对激光诱导荧光检测信号和激光回射干涉检测信号进行采集,得到实时变化的数据图线,根据实时变化的数据图线实现对微体积样品的分析。
2.根据权利要求1所述激光双模式微体积样品分析方法,其特征在于:所用检测激光诱导荧光检测信号的光电检测器件A(7)为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列;检测激光回射干涉检测信号的光电检测器件B(11)为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。
3.根据权利要求1所述激光双模式微体积样品分析方法,其特征在于:光电检测器件B(11)和微检测池(5)分别位于显微物镜(8)的焦平面上。
4.权利要求1所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,至少包括光学检测调制部分、毛细管电泳部分和信号采集处理部分,其特征在于:光学检测调制部分中的半导体激光器(1)、偏振片(2)、分束器(3)、聚焦透镜(4)、微检测池(5)、显微物镜(8)、光阑B(9)、高通滤光片(10)和光电检测器件B(11)依次排列,且中心均位于同一水平线,分束器(3)垂直方向设有光阑A(6)与光电检测器件A(7),光电检测器件B(11)和微检测池(5)分别位于显微物镜(8)的焦平面上,其中微检测池(5)为毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管;信号采集处理部分中的计算机(17)与光电检测器件A(7)和光电检测器件B(11)连接。
5.根据权利要求4所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:微检测池(5)由光透过率高的材质制成,其形状为立方体或圆柱体,且内径大于75微米。
6.根据权利要求4或5所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:微检测池(5)为玻璃、有机玻璃或石英制成。
7.根据权利要求4所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:检测激光诱导荧光检测信号的光电检测器件A(7)为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列;检测激光回射干涉检测信号的光电检测器件B(11)为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。
8.根据权利要求4所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:半导体激光器(1)为各波段激光器,光束光能大于20毫瓦。
9.根据权利要求4所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:聚焦透镜(4)为双凸透镜,其焦距大于9毫米且小于15.4毫米。
10.根据权利要求9所述激光双模式微体积样品分析方法所用装置,其特征在于:聚焦透镜(4)焦距为11毫米。
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