CN100547383C - 一种激光多模式微体积样品分析方法及所用装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于激光诱导荧光、激光热透镜和激光回射干涉技术的激光多模式微体积样品分析方法及所用装置，通过对经液相分离后的各组份，在所用激光波长下，激光诱导荧光检测模式检测具有荧光特性物质的信号，激光热透镜检测模式检测具有吸光特性物质的信号，激光回射干涉检测模式检测不具有荧光和吸光特性物质的信号，并使其光学构型和信号采集模式对液相分离组份达到同时获取激光热透镜和激光回射干涉的光信号。本发明无须对样品进行任何样品衍生、富集处理步骤。由于待测样品池为微检测池，所需样品量极少，最低可至纳升级。本发明所用装置操作简单，日常维护费用低，测试速度快，结果准确，可以广泛应用于包含有各类不同化学物质的待测体系的定性、定量检测。

Description

一种激光多模式微体积样品分析方法及所用装置
背景技术
本发明涉及一种激光多模式微体积样品分析方法及所用装置，具体地说是一种利用激光诱导荧光、激光热透镜和激光回射干涉技术同时进行检测的微检测池检测器，属于光学领域，也属于分析化学仪器领域。
技术领域
液相分离分析仪器是近年来发展最为迅速的一类分析仪器，它包括高效液相色谱(HPLC)，毛细管电泳(CE)，离子色谱，超临界流体色谱(SFC)和微流控芯片等仪器，这类仪器具有高效、快速、样品用量和试剂消耗量少等特点。可用于无机、有机和生物大分子的分离分析，在科学研究和生产领域得到了广泛的应用。
分离效率和灵敏度是衡量这类仪器的重要技术指标，这些指标既取决于所用色谱柱或毛细管柱的性质，同时也受制于检测器的性能。研究和开发适用于液相分离分析仪器的微检测池检测器已成为这类仪器研制的热门领域。紫外吸收检测器是这类仪器中使用最为广泛的一类微检测池检测器，由于采用二极管阵列或CCD器件作光探测器，可实现紫外/可见光谱的快速扫描，在色谱或电泳分离的同时得到从190到800nm的实时紫外/可见光谱，从而实现对未知成分的定性和已知物的测定。由于微检测池检测器的光程较短，使得紫外吸收检测器的灵敏度难以提高，而且很难用于目前蓬勃发展的芯片电泳检测。电化学检测器也是在液相分离分析商品仪器中使用较广的一类检测器，它可避免紫外吸收检测器光程较短的不足，在电活性组分的检测上具有灵敏度高，选择性好和线性范围宽等优点，其局限性在于被检测物质必须具有良好的电化学活性，应用于电泳检测时难以消除分离电流对检测电流的干扰，仅能进行柱后和离柱检测，因而成为一种实用性强的商品化电泳仪器的在柱检测器尚待时日。与其它检测技术相比，质谱检测(MS)与液相分离分析仪器联用可获得分离组分的结构信息，一直是众多仪器厂商青睐的对象。目前HPLC-MS、CE-MS、SFC-MS联用商品化仪器已推向市场，但仪器复杂和昂贵，其联用接口和灵敏度仍需进一步完善和提高。基于物质折射指数变化进行检测的折射指数检测器已用作HPLC等仪器的检测器，这种检测器通用性好，但灵敏度不高。已见文献报道的化学发光、核磁共振、毛细管共振等各种检测器也都不同程度的存在灵敏度不足的问题。因而发展灵敏度高和通用性强的检测器仍是液相分离分析仪器研制的重要课题。
一般来说，激光相干性好，易聚焦成微束，特别适用于微体积样品的测定，因而基于激光优良特性的各类激光检测器的研制和应用已成为液相分离分析仪器检测器研究的热门领域。激光诱导荧光检测器是激光类检测器中灵敏度最高并已成为商品化毛细管电泳仪器的一种微检测池检测器。它的灵敏度比紫外吸收检测器高2～3个数量级，但只有极少数化合物在激光激发下可产生自身荧光，大多数化合物需采用荧光标记或衍生后方可分析。基于弱光吸收检测的激光热透镜检测器测量的不是透射，反射或散射光，而是直接测量光的吸收，与紫外吸收检测器相比，灵敏度可提高2个数量级以上，在非荧光和弱吸收物质的检测中体现出高灵敏，高空间分辨率的优点。激光拉曼光谱检测器也见报道，但检测灵敏度不高仍是这类检测器面临的严峻现实。目前，激光类检测器多为单信号检测，尚未见多信号同时检测器用于液相分离分析的仪器的报道，并且除激光诱导荧光检测器外，其它激光光信号检测器尚未成为液相分离分析商品仪器的检测器。
液相分离分析仪器的分析对象(特别是生物样品)，往往是含有多种物质的复杂系统。这类样品既含有蛋白质、核酸等生物大分子，又含有多巴胺、氨基酸等小分子，并且这些分子的荧光和吸收特性各异。准确测定它们的种类和含量，对于生命科学研究和临床诊断意义十分重大。然而由于商品检测器的限制，难以同时获取大分子和小分子以及具有和不具有荧光和吸光特性物质的信息。因此，探索同时对具有和不具有荧光和吸光特性的各类物质进行灵敏检测的多信号检测器将极大拓展液相分离分析商品仪器的应用的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种利用激光诱导荧光、激光热透镜、激光回射干涉技术同时进行检测的微体积样品的方法及所用装置。通过对液相分离后的各组份进行检测，在所用激光波长下，激光诱导荧光检测模式检测具有荧光特性物质的信号，激光热透镜检测模式检测具有吸光特性物质的信号和激光回射干涉检测模式检测不具有荧光和吸光特性物质的信号，设计光学构型和信号采集模式实现对激光诱导荧光检测模式、激光热透镜检测模式和激光回射干涉检测模式信号的同时获取。
实现本发明目的采用的技术方案：一种激光多模式微体积样品分析方法包括以下步骤：
1)将毛细管电泳仪的去除外保护层的一段毛细管作为微检测池10，将毛细管17的两端分别浸没于缓冲溶液承载池19和缓冲溶液承载池21的缓冲溶液液面下，直流高压电源18的正负极分别通过圆柱形铂电极分别浸没于缓冲溶液承载池19和缓冲溶液承载池21的缓冲溶液液面下，进样时用装有样品的样品池20取代其中一个缓冲溶液承载池，然后利用电驱动或者压差进行进样操作，进样完毕后将原缓冲溶液承载池还原至原本位置，然后打开直流高压电源18输出一定的直流高压，使毛细管电泳仪通电，在直流高压电源的作用下，不同的微体积样品电泳趟度不同，导致不同的微体积样品将以不同速度向毛细管17运动，不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域即微检测池10；
2)泵浦激光器射出的激光光束经过斩光器2和偏振片3的调制后，在分束器4处与热透镜检测激光器5所射出的激光光束耦合成同一激光束，所得的耦合光束在透过分束器6后被聚焦透镜9聚焦于微检测池10的中心处，透过微体积样品样品池20的耦合激光束由高通滤光片11滤去泵浦激光束，再由光电检测器件12进行检测得到激光热透镜检测模式原始信号；微体积样品由泵浦激光所激发的荧光由显微物镜13所收集，经过光阑14和带通滤光片15的调制后，由光电检测器件16进行检测得到激光诱导荧光检测模式原始信号；微体积样品检测池处由于散射所产生的回射散射光经分束器6反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹，经光阑7的调制后由光电检测器件8进行检测得到激光回射干涉检测原始信号，通过计算机附带的数字采集卡对激光热透镜检测模式原始信号、激光诱导荧光检测信号和激光回射干涉检测信号进行采集，得到实时变化的数据图线，根据实时变化的数据图线实现对微体积样品的分析。
激光多模式微体积样品分析所用装置至少包括光学调制检测部分、毛细管电泳仪和信号采集处理部分，光学检测调制部分的泵浦激光器1、斩光器2、偏振片3、分束器4、分束器6、聚焦透镜9、微检测池10、高通滤光片11、光电检测器件12依次排列，且中心均位于同一水平线，分束器4垂直方向设有热透镜检测激光器5，分束器6垂直方向依次设有光阑7和光电检测器件8，微检测池10垂直方向依次设有显微物镜13、光阑14、带通滤光片15和光电检测器件16，其中微检测池10为毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管；信号采集处理部分中的计算机26与光电检测器件8之间设有锁相放大器23，计算机26和光电检测器件12之间设有锁相放大器24，计算机26与光电检测器件16之间设有锁相放大器25，斩光器2上设有斩光器控制器22，且斩光器控制器22通过锁相放大器19、锁相放大器24和锁相放大器25与计算机21连接。
所述微检测池10由光透过率高的材质如玻璃、有机玻璃、石英等制成，其形状为立方体或圆柱体，且内径大于75微米。
所述光电检测器件8和光电检测器件12为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列等，光电检测器件16为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列等。
所述泵浦激光器1为各波段激光器，光束光能大于20毫瓦。
所述热透镜检测激光器5为各波段激光器，光束波长大于泵浦激光束波长。
所述光电检测器件12与毛细管电泳仪中的样品池20之间的距离大于或等于150毫米。
所述光电检测器件16和微检测池10分别位于显微物镜13的焦平面上。
所述聚焦透镜9为双凸透镜，其焦距大于9毫米且小于15.4毫米，最佳焦距为11毫米。
使用本发明所提供的激光多模式微体积样品分析方法与液相分离手段相结合对待测样品进行分离检测，无须对样品进行任何样品衍生、富集处理步骤。由于待测样品池为微检测池，所需样品量极少，最低可至纳升级。本发明操作过程简单，日常维护费用低，测试速度快，结果准确，可以广泛应用于包含有各类不同化学物质的待测体系的定性、定量检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明激光多模式微体积样品分析方法所用装置的光学结构示意图。
图2是本发明激光多模式微体积样品分析方法所用毛细管电泳仪结构示意图。
图3是本发明激光多模式微体积样品分析方法所用装置的信号采集部分结构示意图。
图中：1.泵浦激光器，2.斩光器，3.偏振片，4.分束器，5.热透镜检测激光器6.分束器，7.光阑，8.光电检测器件，9.聚焦透镜，10.微检测池，11.高通滤光片，12.光电检测器件，13.显微物镜，14.光阑，15.带通滤光片，16.为光电检测器件，17.毛细管，18.直流高压电源，19.缓冲溶液承载池，20.样品池，21.缓冲溶液承载池，22.斩光器控制器，23.锁相放大器、24.锁相放大器、25.锁相放大器，26.计算机。
具体实施方式
本发明激光多模式微检测池检测器之光学结构如图1所示，泵浦激光器1所射出的激光光束经过斩光器2和偏振片3的调制后，在分束器4处与热透镜检测激光器5所射出的激光光束耦合成同一激光束，所得的耦合光束在透过另一个分束器6后被聚焦透镜9聚焦于微检测池10的中心处；样品池中由泵浦激光所激发的荧光由显微物镜13所收集，经过光阑14和带通滤光片15的调制，由光电检测器件16进行检测得到激光诱导荧光检测模式原始信号；透过样品池的耦合激光束由高通滤光片11滤去泵浦激光束，再由光电检测器件12进行检测得到激光热透镜检测模式原始信号；微检测池10处由于散射所产生的回射散射光经分束器6反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹，经光阑7的调制后由光电检测器件8进行检测得到激光回射干涉检测原始信号。其中泵浦激光器1可选用各波段激光器，光束光能应大于20毫瓦；斩光器2工作频率应覆盖5Hz至1000Hz的范围；分束器4和分束器6的分束比为5∶5，其分束波段应分别对应于泵浦激光和热透镜检测激光的波段；热透镜检测激光器5可选用各波段激光器，其光束波长应大于泵浦激光束波长；光电检测器件8和光电检测器件12为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列，光电检测器件16为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。聚焦透镜9双凸透镜，其焦距应大于9毫米而小于15.4毫米，最佳焦距为11毫米；微检测池10为光透过率高的材质(如玻璃、有机玻璃、石英等)制成，其形状可为立方体或圆柱体，其内径大于75微米；11为高通滤光片，15为带通滤光片，其波段应根据泵浦激光和热透镜检测激光的波段情况予以选择，截止波段应高于泵浦激光的波段而低于热透镜检测激光的波段；激光诱导荧光检测模式中的光电检测器件16和样品池20分别位于显微物镜13的焦平面上；激光热透镜检测信号的光电检测器件12与样品池20之间的距离大于或等于150毫米。
使用激光多模式微体积样品分析方法所用毛细管电泳仪如图2所示。毛细管17，各种外径参数的毛细管皆可，内径大于等于75微米；高压直流电源18，其最高输出电压应大于20千伏；缓冲溶液承载池19、缓冲溶液承载池21和样品池20，其材质选用绝缘体；待测微检测池10为毛细管电泳仪的毛细管17去除外保护层的一段。毛细管17的两端分别浸没于缓冲溶液承载池19和缓冲溶液承载池21的缓冲溶液液面下。直流高压电源18的正负极分别与圆柱形铂电极相连，两支电极分别浸没于缓冲溶液承载池的缓冲溶液液面下。进样时用样品池20取代其中一个缓冲溶液承载池，利用电驱动或者压差进行进样操作。在毛细管17上适当的位置处将毛细管的外保护层除去(采用明火烧蚀或利刃刮除的方式皆可)，将剥离外防护层的毛细管作为微检测池10。
具体检测过程：
首先将毛细管17依次用0.1mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水及缓冲溶液冲洗，在缓冲溶液承载池19和缓冲溶液承载池21中充满缓冲溶液，并将毛细管17的两端分别浸没于缓冲溶液承载池19和缓冲溶液承载池21的缓冲溶液液面下。直流高压电源18的正负极分别与圆柱形铂电极相连，两支电极分别浸没于缓冲溶液承载池19、21的缓冲溶液液面下。
在开始电泳过程前大约半小时，将泵浦激光器1、斩光器2、热透镜检测激光器5、光电检测器件、锁相放大器、斩光器控制器22、计算机26通电直至所输出信号相对稳定。
进样时用样品池20取代其中一个缓冲溶液承载池19，然后利用电驱动或者压差进行进样操作若干时间。进样完毕后将原缓冲溶液承载池19还原至原来位置，然后打开直流高压电源18输出一定的直流电压。通电后，在直流高压电源18的作用下，不同的化学物质电泳趟度不同，导致不同的化学物质将以不同速度向毛细管17末端运动。经过一定时间，不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域10，从光电检测器件8、12、16处分别得到对应于各不同化学物质的激光回射干涉检测模式原始信号、激光热透镜检测模式原始信号、激光诱导荧光检测模式原始信号(皆为数百毫伏大小的电压数据)。然后经过锁相放大处理过程，分别为数据采集卡采集导入计算机，从而实现了对待测体系实时电泳分离过程的检测。所得图线中各峰对应的出现顺序是各不同化学物质定性测量的依据，各峰对应的峰高或者峰面积是各不同化学物质定量测量的依据。
以下公开一组实施测试结果：
泵浦激光器1选用半导体激光器激光波段532nm，分束器4选用分束器波段532nm，分束比为5∶5，热透镜检测激光器5选用氦氖激光器632.8nm，2毫瓦，分束器6选用分束器波段632.8nm，分束比为5∶5，光电检测器件8和光电检测器件12选用光二极管，聚焦透镜9选用双凸聚焦透镜f＝11毫米，高通滤光片11选用高通滤光片截止波长600nm，截止宽度20nm，带通滤光片15选用带通滤光片中心波长600nm，半宽度15nm，光电检测器件16选用光电倍增管。毛细管17长度40厘米，内径100微米；除去外保护层的一段毛细管(微检测池)10之中心点离毛细管17尾端5厘米。将12.5mol/L硼砂溶液作为缓冲溶液，进样电压和分离电压均为9KV，进样8秒，检测时间15分钟，在除去外保护层的毛细管10处，依次分离出多巴氨、罗丹明B、苋菜红未经任何样品富集或者衍生处理步骤，得到三幅分别对应与激光回射干涉检测模式、激光热透镜检测模式、激光诱导荧光检测模式的图线。依据多巴氨、罗丹明B、苋菜红被分离的顺序和峰面积的大小，检测出待测样品中这些化学物质的浓度，这三种化学物质的检出限为：多巴氨为5.8×10-6mol/L，罗丹明B为1.1×10-8mol/L、苋菜红为1.8×10-8mol/L。

Claims (10)

1.一种激光多模式微体积样品分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管作为微检测池(10)，将毛细管(17)的两端分别浸没于缓冲溶液承载池A(19)和缓冲溶液承载池B(21)的缓冲溶液液面下，直流高压电源(18)的正负极分别通过圆柱形铂电极分别浸没于缓冲溶液承载池A(19)和缓冲溶液承载池B(21)的缓冲溶液液面下，进样时用装有样品的样品池(20)取代缓冲溶液承载池A(19)和缓冲溶液承载池B(21)中一个缓冲溶液承载池，然后利用电驱动或者压差进行进样操作，进样完毕后将原缓冲溶液承载池还原至原本位置，然后打开直流高压电源(18)输出直流高压，使毛细管电泳仪通电，在直流高压电源的作用下，不同的微体积样品电泳趟度不同，导致不同的微体积样品将以不同速度向毛细管(17)运动，不同的化学物质依次通过被剥离外防护层的毛细管区域即微检测池(10)；2)泵浦激光器(1)射出的激光光束经过斩光器(2)和偏振片(3)的调制后，在分束器A(4)处与热透镜检测激光器(5)所射出的激光光束耦合成同一激光束，所得的耦合光束在透过分束器B(6)后被聚焦透镜(9)聚焦于微检测池(10)的中心处，透过微体积样品样品池(20)的耦合激光束由高通滤光片(11)滤去泵浦激光束，再由光电检测器件B(12)进行检测得到激光热透镜检测模式原始信号；微体积样品由泵浦激光所激发的荧光由显微物镜(13)所收集，经过光阑B(14)和带通滤光片(15)的调制后，由光电检测器件C(16)进行检测得到激光诱导荧光检测模式原始信号；微体积样品检测池处由于散射所产生的回射散射光经分束器B(6)反射至垂直方向并产生肉眼可见的规整干涉条纹，经光阑A(7)的调制后由光电检测器件A(8)进行检测得到激光回射干涉检测原始信号，通过计算机附带的数字采集卡对激光热透镜检测模式原始信号、激光诱导荧光检测原始信号和激光回射干涉检测原始信号进行采集，得到实时变化的数据图线，根据实时变化的数据图线实现对微体积样品的分析。
2.根据权利要求1所述的激光多模式微体积样品分析方法，其特征在于：光电检测器件A(8)和光电检测器件B(12)为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列，光电检测器件C(16)为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。
3.激光多模式微体积样品分析所用装置，至少包括光学调制检测部分、毛细管电泳仪和信号采集处理部分，其特征在于：光学检测调制部分的泵浦激光器(1)、斩光器(2)、偏振片(3)、分束器A(4)、分束器B(6)、聚焦透镜(9)、微检测池(10)、高通滤光片(11)、光电检测器件B(12)依次排列，且中心均位于同一水平线，分束器A(4)垂直方向设有热透镜检测激光器(5)，分束器B(6)垂直方向依次设有光阑A(7)和光电检测器件A(8)，微检测池(10)垂直方向依次设有显微物镜(13)、光阑B(14)、带通滤光片(15)和光电检测器件C(16)，其中微检测池(10)为毛细管电泳仪中去除外保护层的一段毛细管；信号采集处理部分中的计算机(26)与光电检测器件A(8)之间设有锁相放大器A(23)，计算机(26)和光电检测器件B(12)之间设有锁相放大器B(24)，计算机(26)与光电检测器件(16)之间设有锁相放大器C(25)，斩光器(2)上设有斩光器控制器(22)，且斩光器控制器(22)通过锁相放大器D(19)、锁相放大器B(24)和锁相放大器C(25)与计算机(26)连接。
4.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：检测激光热透镜检测模式原始信号的光电检测器件B(12)与毛细管电泳仪中的样品池(20)之间的距离需大于或等于150毫米。
5.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：检测激光诱导荧光检测模式原始信号的光电检测器件C(16)和微检测池(10)分别位于显微物镜(13)的焦平面上。
6.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：微检测池(10)由光透过率高的材质玻璃、有机玻璃或或石英制成，其形状为立方体或圆柱体，且内径大于75微米。
7.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：检测激光回射干涉检测原始信号的光电检测器件A(8)和检测激光热透镜检测模式原始信号光电检测器件B(12)为光二极管、光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列；检测激光诱导荧光检测模式原始信号的光电检测器件C(16)为光电倍增管、光电耦合器件或二极管阵列。
8.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：泵浦激光器(1)为各波段激光器，光束光能大于20毫瓦。
9.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：热透镜检测激光器(5)为各波段激光器，光束波长大于泵浦激光束波长。
10.根据权利要求3所述的激光多模式微体积样品分析所用装置，其特征在于：聚焦透镜(9)为双凸透镜，其焦距大于9毫米且小于15.4毫米。
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