CN104880445A - 一种自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断的装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于医疗设备技术领域，具体为一种自体荧光寿命成像和荧光光谱相结合用于癌症早期诊断装置。本发明将荧光寿命成像测量和荧光光谱测量与激光扫描共聚焦显微镜耦合，用于观察生物样本的细胞学形态，结合自体荧光寿命与光谱信息实现癌症早期诊断的新型装置。该装置包括激光扫描共聚焦显微镜装置和两路荧光信号采集装置，分别由不同的探测器接收荧光寿命信息和荧光光谱信息，并利用计算机处理系统对自体荧光寿命信息和荧光光谱信息进行处理。采用该装置能直接检测出被检生物样本的荧光图像、荧光寿命、荧光光谱等多维度信息，实现对多种癌症进行早期检查和诊断，在生物医学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断的装置

技术领域

本发明属于医疗设备技术领域，具体涉及一种用于癌症早期诊断的装置。

背景技术

光学诊断是生物医学光子学的重要内容，它是利用光学的方法来检查和分析疾病。光学诊断的技术可以划分为两类：组织光谱诊断和组织光学成像诊断。激光诱导自体荧光光谱技术是一种有效的光学诊断方法。人体癌变组织和正常组织相比，生物分子组分发生改变，因此发出的荧光存在差异，利用激光诱导荧光光谱适合于收集新陈代谢或结构机能的数据，从而达到诊断癌症的目的。利用荧光光谱技术可以为癌症的早期诊断提供实验依据，并且为肿瘤后续的治疗方法提供参考，目前此技术已有所发展，已逐渐地被应用于人体病变组织的光学诊断。荧光光谱可以提供很重要的信息，但是给出的只是平均化的结果，不能体现生物组织中不同荧光分子物质的来源或相同荧光分子的微环境差异。而荧光寿命仅与荧光分子所处的微环境有关，不受激发光强度变化、光漂白等因素的影响。因此，荧光寿命成像与寿命分析将对分子所处微环境中的许多物理、生物、化学参数如离子浓度、氧含量、pH值等提供信息。将荧光寿命分析和荧光光谱相结合，可以获得关于生物组织的新陈代谢变化、结构功能差异等更多层次的信息，有望对于早期癌症实现高灵敏度诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光寿命成像和荧光光谱测量结合的用于癌症早期诊断的装置，通过对生物样本进行自体荧光寿命和荧光光谱的测量获得与癌变相关的新陈代谢、结构功能异常等信息，从而对癌症进行早期诊断，提高准确性，降低误诊率。

本发明提供的自体荧光寿命成像和荧光光谱相结合用于癌症早期诊断装置，是将荧光寿命成像测量和荧光光谱测量与激光扫描共聚焦显微镜耦合，用于观察生物样本的细胞学形态，结合自体荧光寿命与光谱信息实现癌症早期诊断的新型装置。该装置包括激光扫描共聚焦显微镜装置和两路荧光信号采集装置，分别由不同的探测器接收荧光寿命信息和荧光光谱信息，并利用计算机处理系统对自体荧光寿命信息和荧光光谱信息进行处理。具体结构如图1所示。该装置由激光光源1，XY方向两个振镜2，第一反射镜3，第二反射镜4，双色镜5，第一会聚透镜组6，物镜7，载物台8，针孔9，第三反射镜10，可移动滑块11， 第二会聚透镜组12，第一滤色片13，光电倍增管14，第四反射镜15，第三会聚透镜组16，第二滤色片17，光栅光谱仪18，CCD探测仪19，主计算机20 ，显示屏21，振镜控制模块22，同步信号23组成。其中：

激光光源1，用于产生激发光；

XY方向两个振镜 2，与所述激光光源1连接，用于实现所述激光光源对被检生物样本水平方向的扫描；

振镜控制模块22，与所述的XY方向两个振镜连接，用于控制XY振镜的扫描位置与扫描速度；

第一反射镜3，与所述的XY方向两个振镜 2连接，用于将所述的激发光调整至第二反射镜4；

第二反射镜4，与所述第一反射镜3连接，用于将所述的激发光调整至双色镜5；

双色镜5，与所述第二反射镜4连接；双色镜5将生物样本的自体荧光和激发光进行分离；即双色镜5反射激发光，并透射被检生物样本产生的自体荧光，使其进入荧光采集光路；

第一会聚透镜组6，与所述双色镜5连接，用于会聚所述激发光和自体荧光；

物镜7，与所述第一会聚透镜组6连接，用于将所述会聚后的激发光聚焦于被检生物样本上，激发诱导生物样本内的荧光分子发射荧光；

载物台8，与所述物镜连接，用于放置被检生物样本；

针孔9，与所述双色镜5连接，位于激发光焦点共轭的位置，用于滤掉焦平面外的杂散光；

第三反射镜10，与所述针孔9连接，用于反射被检生物样本发射的自体荧光；

可移动滑块11，与所述第三反射镜10连接，用于控制所述第三反射镜的位置；

第二会聚透镜组12，与所述第三反射镜10连接，用于会聚所述被检生物样本发射的自体荧光；

第一滤色片13，与所述第二会聚透镜组12连接；

光电倍增管14，与所述第一滤色片13连接，用于探测所述的自体荧光信号；

第四反射镜15，与所述针孔9连接，用于反射被检生物样本发射的自体荧光；

第三会聚透镜组16，与所述第四反射镜15连接，用于会聚所述生物样本发射的自体荧光；

第二滤色片17，与所述第三会聚透镜组16连接；

光栅光谱仪18和电荷耦合器CCD19与所述第二滤色片17连接，用于采集所述荧光的光谱信息；

同步信号23从激发光源输出，并送入主计算机20，用于触发时间相关单光子计数器。

本发明中，所述激光光源1可采用高重复频率的皮秒或飞秒脉冲激光器，其中，皮秒脉冲激光器用于对被检生物样本中自体荧光物质的单光子激发，飞秒脉冲激光器用于对被检生物样本中自体荧光物质的多光子激发。

本发明中，所述激光光源1可以采用连续光激光器，也可以采用准连续光激光器，用于对被检生物样本荧光光谱的测量。

本发明中，所用激光器的光谱范围既可以是固定波长的，也可以是可调波长的，波长允许变化范围可从近紫外到近红外（如320nm-1400nm，用于单光子激发或多光子激发），根据被检生物样本不同荧光物质选择不同波长进行检测。

本发明中，采用高灵敏度的光电倍增管14，用于探测自体荧光的单光子信号，实现对弱信号进行高灵敏度的探测。

    本发明中，采用时间相关单光子计数器对光电倍增管探测的信号进行荧光寿命的时域测量。

本发明中，分离出的自体荧光信号通过第一滤色片（截止滤波片）13后输入光电倍增管14，或通过第一滤色片17（截止滤波片）输入光栅光谱仪18。

本发明中， XY方向两个振镜2分别通过振镜控制模块22的控制改变加在两片振镜上的电压，从而改变振镜的扫描速度与位置，获得不同微区生物样品的信息。

本发明中，第三反射镜10为可移动反射镜，用于两路荧光探测光路的选择。所述的第三反射镜10位于激光扫描共聚焦显微镜装置中针孔9的下方，并与可移动滑块11连接，通过简单的推拉控制实现探测光路的选择：当可移动滑块11处于推进位置时，荧光信号经第三反射镜10进入荧光寿命测量光路，进行荧光寿命信息的采集；当可移动滑块11处于拉出位置时，荧光信号经第四反射镜15反射进入荧光光谱测量光路，进行荧光光谱信息的采集。

本发明中，被检生物样本自体荧光寿命图像中每一像素点的荧光寿命信息利用多指数模型进行拟合。

本发明中，所述激光扫描共聚焦显微镜系统中的物镜7可以是低倍镜，也可以是高倍镜，如10倍-100倍物镜，用于满足不同放大倍率观察的要求。

本发明中，所述针孔9大小可以改变，其范围是60μm-300μm，根据选择合适的针孔大小来获得明亮的、噪声低的荧光寿命成像结果。

 本发明中，采用高性能的滤色片对可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，只剩下自体荧光信号进入采集装置，降低背景影响，提高信噪比。

 本发明中，当可移动滑块11处于推进位置时，第三反射镜10进入光路，从而使针孔9透射的自体荧光反射，经第二会聚透镜组12会聚后，传输至第一滤色片13，滤掉生物样本反射的激发光，经光电倍增管14探测后，由时间相关单光子计数系统采集处理并分析被检生物样本的荧光寿命成像数据。当可移动滑块11处于拉出位置时，第三反射镜10远离光路，则针孔9透射的自体荧光传输至第四反射镜15，反射后经第三会聚透镜组16会聚，由第二滤色片17滤掉反射的激发光后，由光栅光谱仪18和电荷耦合器件19采集，最后由配置有荧光光谱处理软件的主计算机20分析其荧光光谱信息。

本发明实施例中，第三反射镜10、可移动滑块11和滑轨24组成可移动反射镜装置，图2所示，第三反射镜10通过连接杆与可移动滑块11连接，可移动滑块11设有把手27。第三反射镜10与针孔9成45°角放置。可移动滑块11处于推进状态即位于位置25 ，可移动滑块11处于拉出状态即处于位置26。

采用本发明装置，能直接检测出被检生物样本的荧光图像、荧光寿命、荧光光谱等多维度信息，实现对多种癌症进行早期检查和诊断。这种早期诊断的方法和装置的优点是：原理明确，设备简单，操作便捷，检查获得的各层面信息多，检测速度快，效率高，可实现对早期癌变的高灵敏检测，在生物医学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明的自体荧光寿命和荧光光谱结合用于癌症早期诊断的装置示意图。

图2是本发明中可移动反射镜的装置示意图。

图3是采用自体荧光寿命成像和荧光光谱结合的测量装置，测量宫颈组织样本的组织细胞形态图。

图4是采用自体荧光寿命成像和荧光光谱结合的测量装置，测量宫颈组织样本的光谱曲线图。

图中标号：1为激光光源，2为XY方向两个振镜， 3为第一反射镜，4为第二反射镜，5为双色镜，6为第一会聚透镜组，7为物镜8：载物台，9为针孔，10为第三反射镜，11为可移动滑块，12为第二会聚透镜组，13为第一滤色片，14为光电倍增管，15为第四反射镜，16为第三会聚透镜组，17为第二滤色片，18为光栅光谱仪，19为CCD探测仪，20为主机，21为显示屏，22为振镜控制模块，23为同步信号；24为滑轨，25为推进状态位置，26为拉出状态位置，27为可推拉滑块11的把手。

具体实施方式

下面结合附图及实施例进一步描述本发明：

实施例1：

按图1和图2所示，制作一台本发明的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合的测量装置。首先进行被检生物样本自体荧光寿命成像的测量：激光器1发出皮秒脉冲激光或飞秒脉冲激光；激光器发出的激光经XY方向两个振镜2实现对XY平面的面扫描；该激发光经过第一反射镜3和第二反射镜4的反射调整至双色镜5；该双色镜5对激发光完全反射；被反射的激发光通过第一会聚透镜组6的会聚进入物镜7；物镜7将会聚后的光聚焦于被检生物样本上；被检生物样本发出的自体荧光通过物镜7，再经过第一会聚透镜组6的会聚于双色镜5；该双色镜5对于自体荧光完全透射；推进可移动滑块11至位置25，经双色镜5透射的自体荧光被第三反射镜10反射；反射后的自体荧光经第二会聚透镜组12会聚；会聚后的自体荧光经第一滤色片13滤掉可能存在的被双色镜5透射的激发光；自体荧光被光电倍增管14探测；与此同时激发光的同步信号23传输到主计算机20的数据采集板中，经光电倍增管14放大后的信号经设有时间相关单光子计数器的主计算机20处理，最后通过荧光寿命处理软件拟合出荧光寿命并获得荧光寿命图像。

对图像上有特征的微小区域再进行自体荧光光谱的测量：激光器1发出连续激光或准连续激光；激光器1发出的激光经XY方向两个振镜2实现对XY平面的面扫描；该扫描光经过第一反射镜3和第二反射镜4的反射调整至双色镜5；该双色镜5对激发光完全反射；被反射的激发光通过第一会聚透镜组6的会聚进入物镜7；物镜7将会聚后的激光聚焦于被检组织上；被检组织发出的自体荧光通过物镜7，再经过第一会聚透镜组6的会聚于双色镜5；该双色镜5对于自体荧光完全透射；拉出可移动滑块11处于位置26，经双色镜5透射的自体荧光被第四反射镜15反射；反射后的自体荧光经第三会聚透镜组16会聚；会聚后的荧光经第二滤色片17滤掉可能存在的被双色镜5透射的激发光；自体荧光经光栅光谱仪18和电荷耦合器件CCD19采集；采集后的信号由设有荧光光谱处理软件的计算机系统20处理，并在显示屏21显示其荧光光谱信息。

实施例2：

按实施例1实施：首先对人体宫颈组织的上皮区域进行荧光寿命成像的测量。将被检宫颈组织切片放置在载物台8上，使用60倍物镜观察宫颈组织表皮细胞形态。推进可移动滑块11至位置25，使用50MHz、405 nm波长的皮秒脉冲激光对被检宫颈组织的荧光物质进行激发，在荧光采集光路中的第一滤色片13和第二滤色片17均为430 nm高通的截止滤波片。经光电倍增管14放大后的信号由设有时间相关单光子计数器的主机20处理后，通过荧光寿命处理软件拟合出荧光寿命并获得荧光寿命图像的结果如图3所示。

通过使用本发明装置对人体宫颈组织进行荧光寿命成像测量的结果如图3所示，图3中的左、右两幅图分别为正常、癌变宫颈上皮组织荧光寿命成像图。使用本发明装置进行荧光寿命成像的测量结果能够清晰的显示出正常宫颈组织上皮细胞和癌变宫颈组织上皮细胞在形态和结构上的区别，癌变组织中的细胞形态趋向于圆形，且核所占的比例大大增加。成像图像清晰、分辨率高，且成像图的每个像素点均包含荧光寿命的信息。通过对比正常宫颈上皮组织和癌变宫颈上皮组织荧光寿命的变化，可以进一步获得正常与癌变宫颈上皮细胞所处微环境改变的情况。使用本发明装置对宫颈上皮组织进行荧光寿命成像的测量，能够准确地判断出细胞形态和结构的改变，同时通过对比正常和癌变宫颈上皮组织的荧光寿命，为癌症的早期诊断提供依据和信息。

基于荧光寿命成像所得的图像，分别对正常和癌变宫颈组织上皮区域进行荧光光谱的测量。拉出可移动滑块11至位置26，改用405nm波长的连续光对被检宫颈组织的荧光物质进行激发。

如图4所示为通过使用本发明装置对人体宫颈组织进行荧光光谱测量的结果。图中虚线为正常宫颈组织的荧光光谱曲线，实线为癌变宫颈组织的荧光光谱曲线。正常宫颈上皮组织的荧光光谱包含440±5 nm和470±4 nm两个峰，而癌变宫颈上皮组织的荧光光谱在440±4 nm、490±5 nm和540±5 nm处有三个峰。通过使用本发明装置对被检宫颈组织进行荧光光谱的测量，可以从光谱曲线的结构上快速准确地判断出正常和癌变宫颈组织的区别，从而为癌症的早期诊断提供一个快捷准确的途径。

Claims (9)

1.一种自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于包括激光扫描共聚焦显微镜装置和两路荧光信号采集装置，分别由不同的探测器接收荧光寿命信息和荧光光谱信息，并利用计算机处理系统对自体荧光寿命信息和荧光光谱信息进行处理；具体由激光光源，XY方向两个振镜，第一反射镜，第二反射镜，双色镜，第一会聚透镜组，物镜，载物台，针孔，第三反射镜，可移动滑块， 第二会聚透镜组，第一滤色片，光电倍增管，第四反射镜，第三会聚透镜组，第二滤色片，光栅光谱仪，CCD探测仪，主计算机，显示屏，振镜控制模块，同步信号组成；其中：

激光光源，用于产生激发光；

XY方向两个振镜，与所述激光光源连接，用于实现所述激光光源对被检生物样本水平方向的扫描；

振镜控制模块，与所述的XY方向两个振镜连接，用于控制XY振镜的扫描位置与扫描速度；

第一反射镜，与所述的XY方向两个振镜连接，用于将所述的激发光调整至第二反射镜； 

第二反射镜，与所述第一反射镜连接，用于将所述的激发光调整至双色镜；

 双色镜，与所述第二反射镜连接；双色镜将生物样本的自体荧光和激发光进行分离；即双色镜反射激发光，并透射被检生物样本产生的自体荧光，使其进入荧光采集光路；

第一会聚透镜组，与所述双色镜连接，用于会聚所述激发光和自体荧光；

物镜，与所述第一会聚透镜组连接，用于将所述会聚后的激发光聚焦于被检生物样本上，激发诱导生物样本内的荧光分子发射荧光；

载物台，与所述物镜连接，用于放置被检生物样本；

针孔，与所述双色镜连接，位于激发光焦点共轭的位置，用于滤掉焦平面外的杂散光；

第三反射镜，与所述针孔连接，用于反射被检生物样本发射的自体荧光；

可移动滑块，与所述第三反射镜连接，用于控制所述第三反射镜的位置；

第二会聚透镜组，与所述第三反射镜连接，用于会聚所述被检生物样本发射的自体荧光；

第一滤色片，与所述第二会聚透镜组连接；

光电倍增管，与所述第一滤色片连接，用于探测所述的自体荧光信号；

第四反射镜，与所述针孔连接，用于反射被检生物样本发射的自体荧光；

第三会聚透镜，与所述第四反射镜连接，用于会聚所述生物样本发射的自体荧光；

第二滤色片，与所述第三会聚透镜组连接；

光栅光谱仪和电荷耦合器CCD与所述第二滤色片连接，用于采集所述荧光的光谱信息；

同步信号从激发光源输出，并送入主计算机，用于触发时间相关单光子计数器。

2.根据权利要求1所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，所述激光光源采用高重复频率的皮秒或飞秒脉冲激光器，其中，皮秒脉冲激光器用于对被检生物样本中自体荧光物质的单光子激发，飞秒脉冲激光器用于对被检生物样本中自体荧光物质的多光子激发。

3.根据权利要求1或2所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，所述激光光源采用连续光激光器，或者采用准连续光激光器，用于对被检生物样本荧光光谱的测量。

4.根据权利要求3所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，所用激光器的光谱范围是固定波长的，或者是可调波长的，波长允许变化范围从近紫外到近红外，根据被检生物样本不同荧光物质选择不同波长进行检测。

5.根据权利要求1、2或4所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，采用时间相关单光子计数器对光电倍增管探测的信号进行荧光寿命的时域测量。

6.根据权利要求1、2或4所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，第三反射镜与可移动滑块连接成为可移动反射镜，用于两路荧光探测光路的选择；当可移动滑块处于推进位置时，荧光信号经第三反射镜进入荧光寿命测量光路，进行荧光寿命信息的采集；当可移动滑块处于拉出位置时，荧光信号经第四反射镜反射进入荧光光谱测量光路，进行荧光光谱信息的采集。

7.根据权利要求1、2或4所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，被检生物样本自体荧光寿命图像中每一像素点的荧光寿命信息利用多指数模型进行拟合。

8.根据权利要求1、2或4所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，物镜为10倍-100的倍物镜，用于满足不同放大倍率观察的要求。

9.根据权利要求1、2所述的自体荧光寿命成像和荧光光谱结合用于癌症早期诊断装置，其特征在于，所述针孔大小可以改变，其范围是60μm-300μm，选择合适的针孔大小来获得明亮的、噪声低的荧光寿命成像结果。