CN107209120B - 多色荧光分析装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的多色荧光分析装置(1)具备：照射部(41)，向试样(s)照射具有多个激发波长带的激发光；第一光纤板(424)，对含有利用照射激发光而从试样(s)发出的荧光的光进行导光，并且从第一射出部(425b)射出；第二光纤板(431)，从第二入射部(434a)接受从第一射出部(425b)射出的光，并进行导光，并且从第二射出部(434b)射出上述光；单一的电介体多层膜干涉滤光片(432)，设于第二射出部(434b)的端面上，透射上述荧光的至少一部分且透射不含上述激发波长带的多个透射波长带的光；以及二维检测部(433)，以紧贴电介体多层膜干涉滤光片(432)的方式设置，对透射了上述电介体多层膜干涉滤光片(432)的光进行检测。

Description

多色荧光分析装置
技术领域
本发明涉及多色荧光分析装置。
背景技术
已知一种分析装置，在例如生物学试验中，向用荧光色素标注过的多个微小的试样一并照射激发光，检测上述荧光色素发出的荧光，从而指定各试样(例如，参照专利文献1)。
在上述分析装置中，具备用于分离激发光而仅输出指定波长的荧光的交换式的干涉滤光片，用以与上述各试样对应的方式配设的多个光纤对透射了该干涉滤光片的荧光进行导光，使用安装于这些光纤的另一端的图像传感器进行分析。
在这种分析装置中，作为对荧光进行导光的方案，使用捆扎多个光纤的光纤板，将由被捆扎的光纤传送的荧光在图像传感器作为二维图像一并处理，判断有无荧光，因此能够同时对多个试样进行荧光分析。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11－241947号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，以使用了例如Sequence by synthesis(以下，也称为“SBS”)法的DNA的碱基序列分析为代表的对含有多个荧光色素的试样进行分析，该多个荧光色素具有不同的荧光波长，该情况下，在类似于上述的现有的分析装置中，必须根据作为分析对象的荧光色素更换干涉滤光片，若在反复进行的碱基延伸反应时更换干涉滤光片，则分析需要较长的时间，不能满足分析迅速化的需求。
本发明基于以上的情况而做成，其目的在于提供一种多色荧光分析装置，能够一并且准确地检测从试样含有的多种荧光色素发出的荧光。
用于解决课题的方案
本发明涉及以下的多色荧光分析装置，
(1)一种多色荧光分析装置，检测利用照射激发光而从试样含有的具有不同的荧光波长的多种荧光色素中发出的荧光，
上述多色荧光分析装置的特征在于，具备：
照射部，其向上述试样照射具有互不相同的多个激发波长带的激发光；
第一光纤板，其与上述试样的至少一部分抵接，从第一入射部接受含有利用照射上述激发光而从上述试样发出的荧光的光，并进行导光，并且从与上述第一入射部相反的一侧的第一射出部射出上述光；
第二光纤板，其从第二入射部接受从上述第一射出部射出的光，并进行导光，并且从与上述第二入射部相反的一侧的第二射出部射出上述光；
单一的电介体多层膜干涉滤光片，其设于上述第二射出部的端面上，透射上述荧光的至少一部分且透射不含上述激发波长带的多个透射波长带的光；以及
二维检测部，其设置成紧贴在上述电介体多层膜干涉滤光片，对透射了上述电介体多层膜干涉滤光片的光进行检测。
(2)根据上述(1)记载的多色荧光分析装置，其中，上述(1)所述的电介体多层膜干涉滤光片是第一电介体多层膜干涉滤光片，照射部具有光源和第二电介体多层膜干涉滤光片，该第二电介体多层膜干涉滤光片从上述光源发出的光中使具有预定的激发波长带的激发光选择性地透射。
(3)根据上述(2)记载的多色荧光分析装置，其中，第一电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带中的满足光的透射率α1比预定值α小的关系的上升波长λ1i、和第二电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带中的满足光的透射率α2比上述预定值α小的关系的下降波长λ2j满足下记式(1)表示的关系，
[式1]
Figure BDA0001354909430000021
式(1)中，i及k分别是1以上的整数，θmax是向第一电介体多层膜干涉滤光片入射的光的最大入射角，neff是第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率。
(4)根据上述(3)记载的多色荧光分析装置，其中，预定值α是0.1％。
(5)根据上述(3)或(4)记载的多色荧光分析装置，其中，第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率neff是1.5以上且2.2以下。
(6)根据上述(3)～(5)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，向第一电介体多层膜干涉滤光片入射的光的最大入射角θmax是30°。
(7)根据上述(1)～(6)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，构成第二光纤板的光纤的外径比构成第一光纤板的光纤的外径小。
(8)根据上述(1)～(7)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，依次照射各激发波长带的激发光。
(9)根据上述(3)～(7)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，同时照射至少具有两个激发波长带的激发光。
(10)根据上述(1)～(7)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，试样是含有荧光色素的DNA断片，用于上述DNA断片的碱基序列的分析。
(11)根据上述(10)记载的多色荧光分析装置，其中，荧光色素是Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5。
(12)根据上述(11)记载的多色荧光分析装置，其中，
第二电介体多层膜干涉滤光片具有第一滤光片、第二滤光片、第三滤光片以及第四滤光片，
第一滤光片的透射率在380～396nm的波长带为85％以上，且在380～396nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第二滤光片的透射率在474～497nm的波长带为85％以上，且在474～497nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第三滤光片的透射率在561～575nm的波长带为85％以上，且在561～575nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第四滤光片的透射率在641～657nm的波长带为85％以上，且在641～657nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
上述第一滤光片、上述第二滤光片、上述第三滤光片以及上述第四滤光片切换使用。
(13)根据上述(11)记载的多色荧光分析装置，其中，
第二电介体多层膜干涉滤光片是单一的滤光片，上述第二电介体多层膜干涉滤光片的透射率在380～396nm、474～497nm、561～575nm以及641～657nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
(14)根据上述(12)或(13)记载的多色荧光分析装置，其中，第一电介体多层膜干涉滤光片的透射率在436～462nm、536～548nm、620～632nm以及713～800nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
(15)根据上述(10)～(14)中任一项记载的多色荧光分析装置，其中，在第一光纤板的试样抵接的一侧的面，对光纤的芯部端面实施了氨基硅烷处理，对上述光纤的上述芯部端面以外的面实施了HMDS处理。
此外，在本说明书中，光纤板(Fiber Optic Plate，以下也称为“FOP”)是多根光纤捆扎成一体且该光纤的轴向的两端部做成平面形状而成的，是指能够将从上述光纤的一端入射的光传导至上述光纤的另一端的设备。该光纤板是含有光纤锥(Fiber Optic Taper、以下也称为“FOT”)的概念。
发明的效果
本发明能够提供一种多色荧光分析装置，能够一并且准确地检测从试样含有的多种荧光色素发出的荧光。因此，该多色荧光分析装置例如能够合适地用于使用了类似同时使用多个荧光色素的SBS法的DNA的碱基序列分析等。
附图说明
图1是表示本发明的多色荧光分析装置的一实施方式的概要图。
图2是表示图1的多色荧光分析装置的荧光检测机构的概要图，(a)表示试样为一个的状态，(b)表示试样为多个的状态。
图3是图2的流体检测片的概要立体图，(a)表示分解后的状态，(b)表示装配好的状态。
图4是表示图2的荧光检测机构的概要图，(a)表示装配流体检测片前的状态，(b)表示装配流体检测片后的状态。
图5是表示图2的荧光检测机构的荧光的传播状态的概要图，(a)表示第一及第二光纤板内的传播状态，(b)表示第一及第二光纤内的传播状态。
图6是表示在图2的荧光检测机构中，以荧光向第一光纤板的入射角为参数的荧光与激发光的关系的概要图，(a)表示入射角为0°的状态，(b)表示入射角变化时的状态，(c)表示入射角为30°的状态，(d)表示入射角为0°且考虑了短波长移动的状态。
图7是具体化地表示图2的荧光检测机构的照射部的一形态的概要图。
图8是图7的荧光检测机构的照射部的各滤光片的概要透射特性图，(a)表示第一滤光片的透射率，(b)表示第二滤光片的透射率，(c)表示第三滤光片的透射率，(d)表示第四滤光片的透射率，(e)表示第一电介体多层膜干涉滤光片的透射率。
图9是用于说明图2的荧光检测机构的二维检测部的一形态的概要图。
图10是图9的荧光检测机构的概要分光特性图，(a)表示在第一及第二电介体多层膜干涉滤光片中未考虑短波长移动的特性，(b)表示在第一及第二电介体多层膜干涉滤光片中考虑了短波长移动的特性，(c)表示各荧光色素的荧光光谱。
图11是图2的荧光检测机构中的二维检测部的概要特性图，(a)表示透射第一电介体多层膜干涉滤光片的荧光光谱，(b)表示二维检测部的各传感器的波长特性。
图12是表示图2的荧光检测机构的二维检测部的其它形态的概要图。
图13是图12的荧光检测机构的二维检测部的概要特性图，(a)表示透射第一电介体多层膜干涉滤光片的荧光光谱，(b)表示二维检测部的各传感器的波长特性。
图14是采用光纤锥作为图2的荧光检测机构的第二光纤板的概要图。
图15是表示使用LED作为图2的荧光检测机构的照射部的光源的一形态的概要图。
图16是表示使用光导管作为图15的荧光检测机构的照射部的一形态的概要图。
图17是表示使用多组照射部作为图15的荧光检测机构的照射部的一形态的概要图，(a)表示主视图，(b)表示俯视图。
图18是表示将图15的荧光检测机构的照射部做成斜光照明的一形态的概要图。
图19是表示图2的荧光检测机构的第一及第二光纤板的其它形态的概要图，(a)表示第一及第二光纤板的剖视图，(b)表示第一及第二光纤的剖视立体图。
图20是表示在图2的荧光检测机构的第一电介体多层膜干涉滤光片与二维光传感器之间设有光隔壁的形态的概要图。
图21是表示使用了物镜的多色荧光分析装置的荧光检测机构的一形态的概要图。
具体实施方式
本发明的多色荧光分析装置是检测利用照射激发光而从试样含有的具有不同的荧光波长的多种荧光色素发出的荧光的多色荧光分析装置，其特征在于，具备：
照射部，其向上述试样照射具有互不相同的多个激发波长带的激发光；
第一光纤板，其与上述试样的至少一部分抵接，从第一入射部接受含有利用照射上述激发光而从上述试样发出的荧光的光，并进行导光，并且从与上述第一入射部相反的一侧的第一射出部射出上述光；
第二光纤板，其从第二入射部接受从上述第一射出部射出的光，并进行导光，并且从与上述第二入射部相反的一侧的第二射出部射出上述光；
单一的电介体多层膜干涉滤光片，其设于上述第二射出部的端面上，透射上述荧光的至少一部分且透射不含上述激发波长带的多个透射波长带的光；以及
二维检测部，其设置成紧贴在上述电介体多层膜干涉滤光片，对透射了上述电介体多层膜干涉滤光片的光进行检测。
如上所述，该多色荧光分析装置具备上述照射部、第一及第二光纤板、电介体多层膜干涉滤光片、以及二维检测部，因此能够一并且准确地检测从试样含有的多个荧光色素发出的荧光。如后述，可以推测为，这是因为能够抑制激发光的波长带和检测用的荧光的波长带重叠，其结果，仅对荧光进行分光，从而能够提高分析精度。
本发明的多色荧光分析装置如上所述地用作对从试样含有的具有不同的荧光波长的多种荧光色素发出的荧光进行检测的分析装置，成为其分析对象的试样只要满足上述条件就不特别限定，优选的是，试样是含有荧光色素的DNA断片，用于上述DNA断片的碱基序列的分析。由此，能够迅速且准确地识别用荧光色素标注过的四种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，能够效率良好地解读DNA的碱基序列。
以下，基于附图，对本发明对多色荧光分析装置进行说明，但是本发明不被仅限定于该附图记载的实施方式。此外，在以下的实施方式中，示例性地说明试样是含有荧光色素的DNA断片，且用于使用了SBS反应方式的DNA断片的碱基序列的分析的多色荧光分析装置(以下，也称为“DNA测序仪”)。另外，在以下对实施方式中，使用第一光纤板作为流体检测片的基板。另外，在以下示出的实施方式中，将设于第二射出部的端面上的单一的电介体多层膜干涉滤光片称为第一电介体多层膜干涉滤光片。
图1是表示本发明的多色荧光分析装置的一实施方式的概要图。如图1所示，该多色荧光分析装置1大致由试剂保管机构10、送液机构20、废液保管机构30、以及荧光检测机构40构成。
试剂保管机构10是保管DNA测序仪使用的试剂等的机构。试剂保管机构10具备试剂筒101，在试剂筒101内收纳有多个试剂保管容器102，独立收纳引物试剂、聚合酶、含有四种具有荧光色素的核苷酸的延伸试剂、保护基切断试剂、清洗试剂、成像试剂等。
送液机构20是将试剂等供给至后述的流体检测片42内，并且将从流体检测片42排出的试剂等输送至后述的废液保管机构30的机构。送液机构20具备：选择性地切换从多个试剂保管容器102中向流体检测片42供给的试剂等的切换阀201；将试剂等输送至流体检测片42的流路202；以及将从流体检测片42排出的试剂等输送至废液保管机构30的流路203。另外，在流路203设有注射器204和两个双通阀205、206，使用它们进行向流体检测片42的试剂等的供给和从流体检测片42的试剂等的排出。
废液保管机构30是保管从流体检测片42排出的试剂等的废液的机构。具体而言，废液保管机构30包括：接收从送液机构20的流路203端部排出的废液的废液箱301；成为废液从废液箱301漏出的情况下的接收容器的盛液托盘302；防止废液挥发的盖303；以及监视废液箱301的有无的微型光学传感器304。
荧光检测机构40具备照射部41、流体检测片42、以及荧光检测部43。
照射部41向试样s照射具有互不相同的多个激发波长带的激发光。如图2(a)所示，照射部41具有光源411、抛物面镜412、第一蝇眼透镜413、第二蝇眼透镜414、重叠透镜415、场透镜416、以及第二电介体多层膜干涉滤光片417。
光源411是激发用光源。该光源411发射用于生成激发光的光。作为光源411，通常采用短弧氙气灯。该短弧氙气灯通过在氙气中的放电而在可见光区域具有良好的连续光谱，因此作为用于产生多个激发波长带的光的光源，是优选的放电灯。
抛物面镜412将从光源411发出的光反射，变换成平行光。第一蝇眼透镜413、第二蝇眼透镜414、重叠透镜415以及场透镜416协同动作，将在抛物面镜412变换成的平行光变换成具有均匀性的平行光。在此，重叠透镜415使第一蝇眼透镜413的各透镜单元的像在场透镜416上重合，使第一蝇眼透镜413的各透镜单元的照度分布重合，从而实现照度的均匀化。
第二电介体多层膜干涉滤光片417选择性地从光源411发出的光中透射使具有预定的激发波长带的激发光。具体而言，第二电介体多层膜干涉滤光片417包括：相对于可见光透明的玻璃基板(未图示)；以及形成于该玻璃基板上的电介体多层膜(未图示)。
作为构成上述电介体多层膜的材料，例如，可以列举SiO2、TiO2、Ta2O5、Nb2O5等。该电介体多层膜通过从上述材料中选择高折射率材料和低折射率材料，将它们交替层叠10～40层程度而形成。各层的膜厚等基于使该电介体多层膜干涉滤光片417透射的期望的波长带而适当决定。上述电介体多层膜的整个厚度通常为10μm左右。作为上述电介体多层膜的形成方法，优选真空蒸镀法、离子辅助法、离子镀法、喷溅法以及离子辅助/离子束喷溅法，更优选为真空蒸镀法。通过采用上述形成方法，能够赋予针对温度、湿度良好的稳定性、急剧地上升特性等优异的光学特性。
如上所述，具有第二电介体多层膜干涉滤光片417，从而例如相比一直以来使用的色素滤光片，能够严加区别激发波长带的波长范围，能够通过后述的第一电介体多层膜干涉滤光片可靠地遮断激发光，提高二维检测部的荧光检测精度。
在该多色荧光分析装置1中，使用上述的第二电介体多层膜干涉滤光片417，向试样s依次照射各激发波长带的激发光。具体而言，如图7所示，第二电介体多层膜干涉滤光片417具有第一滤光片417a、第二滤光片417b、第三滤光片417c以及第四滤光片417d，这些第一～第四滤光片417a～417d依次切换使用，选择性地透射预定的激发波长带的光，从而能够将透射的光作为激发光照射至试样s。构成第二电介体多层膜干涉滤光片417的第一～第四滤光片417a～417d安装于滤光片轮418，该滤光片轮418通过使用未图示的驱动装置而高速(例如，能够在50ms以内移动至不同的滤光片的程度的高速)旋转。因此，通过依次照射各激发波长带的激发光，从而能够可靠地识别从各荧光色素发出的荧光。
适用于本实施方式的碱基序列的分析的荧光色素为Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5四种。Alexa405结合于dCTP，FAM结合于dATP，Texas Red结合于dGTP，Cy5.5结合于dTTP。因此，通过照射能够激发上述荧光色素的激发光，从而从该荧光色素结合的核苷酸(以下，也称为“荧光核苷酸”)发出对应的荧光，通过检测该荧光来解读碱基。因此，通过荧光色素为上述色素，能够可靠地识别四种核苷酸，能够准确地指定与之对应的DNA断片中的碱基。
为了激发上述四种荧光色素，第一滤光片417a的透射率在380～396nm的波长带为85％以上，且在380～396nm的波长带以外的波长带低于0.1％，第二滤光片417b的透射率在474～497nm的波长带为85％以上，且在474～497nm对波长带以外的波长带低于0.1％，第三滤光片417c的透射率在561～575nm的波长带为85％以上，且在561～575nm的波长带以外的波长带低于0.1％，第四滤光片417d的透射率在641～657nm的波长带为85％以上，且在641～657nm的波长带以外的波长带低于0.1％。其结果，通过从第一～第四滤光片417a～417d中选择适当的滤光片，从而能够适当地得到380～396nm(主要激发Alexa405)、474～497nm(主要激发FAM)、561～575nm(主要激发Texas Red)以及641～657nm(主要激发Cy5.5)各激发波长带的激发光。此外，在图8(a)～(d)中，符号601～604分别表示第一～第四滤光片417a～417d的透射波长带。另外，图8(e)表示使用上述第一～第四滤光片417a～417d的情况下的第一电介体多层膜干涉滤光片432(后述)的透射波长带605。如上所述，第二电介体多层膜干涉滤光片417具有第一～第四滤光片417a～417d，各滤光片的透射率满足上述条件，从而能够效率良好地激发及检测上述四种荧光色素。
此外，还优选同时照射至少具有两个激发波长带的激发光。由此，能够同时效率良好地激发与上述激发波长带对应的多个荧光色素，能够迅速地进行荧光分析。具体而言，在使用的荧光色素为Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5的情况下，第二电介体多层膜干涉滤光片417为单一滤光片，如图10(a)、(b)的符号701所示地，优选该第二电介体多层膜干涉滤光片417的透射率在380～396nm、474～497nm、561～575nm及641～657nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。因此，通过第二电介体多层膜干涉滤光片417为单一的滤光片，且第二电介体多层膜干涉滤光片417使上述多个波长带透射，从而能够同时效率更良好地激发上述四种荧光色素，能够更迅速地进行荧光分析。
图3是图2的流体检测片的概要立体图。如图3所示，流体检测片42具备盖片421、衬垫422、以及基板423。
盖片421具有光透射性，尤其透射400nm以上且800nm以下的波长的可见光。作为盖片421的材质，例如可以列举玻璃、石英、蓝宝石等。盖片421具有向流体检测片42内的流路注入试剂等液体的注入口421a及排除使用完的液体的排出口421b。
衬垫422残留镜框状的周缘部而形成冲孔422a。该衬垫422被夹在盖片421与后述的基板423之间，与它们一起形成将上述液体供给至试样s的流路。衬垫422通常使用聚二甲硅氧烷(PDMS)而形成。从使试剂等液体顺滑地流通的观点出发，衬垫422的厚度通常为30～100μm，优选为40～60μm，更优选为45～55μm。
基板423固定成为试样s的DNA断片。基板423由第一光纤板424构成。如图5(a)所示，该第一光纤板424与试样s的至少一部分抵接，从第一入射部425a接收利用照射激发光而从试样s发出的荧光，并进行导光，并且从与第一入射部425a相反的一侧的第一射出部425b射出上述光。
第一光纤板424包括：引导光的呈格子状配设的多个光纤(以下，也称为“第一光纤425”)；以及覆盖这些第一光纤425且吸收从该第一光纤425泄露的光的吸收体玻璃(未图示)。如图5(b)所示，第一光纤425包括芯部426和覆盖该芯部426的包层部427。这些芯部426及包层部427分别由芯玻璃及包层玻璃形成，这两个玻璃的折射率不同。因此，通过适当选择构成芯部426及包层部427的玻璃的折射率，从而能够在两者的界面产生全反射，能够使从第一入射部425a接收的光在第一光纤425的光轴方向上传导而引导至第一射出部425b(参照图5(a))。
另外，各光纤425在第一光纤板424的与试样s抵接的一侧的面，对第一光纤425的芯部426端面实施了氨基硅烷处理，对第一光纤425的芯部426端面以外的面实施了HMDS处理(六甲基二硅氮烷处理)。通过如上所述地实施氨基硅烷処理及HMDS处理，从而能够使DNA断片牢固地吸附于在第一光纤425的芯部426端面所形成的由氨基硅烷构成的膜(以下，将形成有由氨基硅烷构成的膜的区域也称为“定点部”)上，并且抑制DNA断片向形成于第一光纤425的芯部426端面以外的面的由1，1，1，3，3，3－六甲基二硅氮烷构成的膜上，能够将DNA断片选择性地固定于芯部426端面上。其结果，能够经由芯部426端面而可靠地获取从DNA断片发出的荧光。此外，作为形成上述定点部及定点部以外的区域的方法，例如，能够应用美国专利申请公开第2009/0270273号说明书记载的方法。
在本实施方式中，第一光纤425的直径(包层部427的外径)为约1.4μm，上述定点部的直径为约0.3μm。因此，通过将成为试样s的DNA断片做成适当的大小，从而能够在一根第一光纤425的芯部426端面配置一个DNA断片，能够使一个DNA断片(试样s)和一根第一光纤425对应。
本实施方式中使用的芯玻璃及包层玻璃的折射率分别为1.80、1.67。因此，通常成为单个纤维的集光能力的指标的数值孔径(Numerical Aperture)能够使用下记式(2)算出为0.67。
[式2]
Figure BDA0001354909430000111
上述式(2)中，NA是数值孔径。n2及n3分别是芯玻璃及包层玻璃的折射率。
在此，本实施方式使用的试剂等水溶液的折射率(n1)为1.33。因此，使用下记式(3)，第一入射部425a的光的最大入射角算出为30°。此外，在下记式(3)中，θmax是最大入射角。NA的意思与上述式(2)相同。
[式3]
θmax＝Arc sin(NA/n1) (3)
因此，在本实施方式中，为了使入射到第一光纤425内的光一边全反射，一边引导而到达第一射出部425b，需要满足第一入射部425a的入射角(θ1)(参照图5(b))为θ1≤30°的条件。另一方面，第一入射部425a的入射角(θ1)为θ1＞30°的光线因为超过了作为最大入射角(θmax)的30°，所以不能在芯部426与包层部427的界面进行全反射，会通过包层部427而被吸收体玻璃吸收，不能到达第一射出部425b。
如图2(a)所示，荧光检测部43具备第二光纤板431、第一电介体多层膜干涉滤光片432、以及二维检测部433。
第二光纤板431从第二入射部434a接收从第一射出部425b射出的光，并进行导光，并且从与第二入射部434a相反的一侧的第二射出部434b射出上述光(参照图5(a))。该第二光纤板431与第一光纤板424同样地包括由芯部435及包层部436构成的光纤(以下，也称为“第二光纤434”)和吸收体玻璃(未图示)。另外，如图5(a)所示，第一及第二光纤425、434的外径相同，这些第一及第二光纤425、434彼此的光轴一致，而且配置为第一射出部425b和第二入射部434a抵接或接近。在此，接近的意思是在从第一射出部425b射出的光不漏光地被接收到第二入射部434a的范围内，第一射出部425b和第二入射部434a分离的状态。此外，第二光纤板431称为用于载置流体检测片42的台座。
此外，在本实施方式中，如上所述，第一及第二光纤425、434的外径相同，但是也优选为构成第二光纤板431的光纤(第二光纤434)的外径比构成第一光纤板424的光纤(第一光纤425)的外径小。由此，能够抑制从相邻的多个第一光纤425射出的光入射至单一的第二光纤434，能够提高荧光检测中的空间分辨率。
另外，如图19(b)所示，优选第一光纤425的芯部426的直径比第二光纤434的芯部435的直径小。由此，能够将从第一射出部425a的第一光纤425的芯部426射出的光可靠地传递至第二入射部434a的第二光纤434的芯部435内，能够更准确地进行荧光检测。
另外，作为上述的第一及第二光纤板，也能够分别采用光纤锥(FOT)。图14是使用光纤锥作为图2的荧光检测机构的第二光纤板的概要图。如图14所示，FOT437是捆扎第二入射部和第二射出部的大小不同的第二光纤而成，能够放大或缩小第二入射部的像。上述像的放大率单纯地为一根第二光纤的两端面的直径的比。该比通常为最大五倍左右。此外，FOT虽然第二入射部和第二射出部的大小不同，但是第二光纤的根数相同。
FOT例如能够如下制造。对圆柱状的FOP的中央部加热，向该FOP的两末端施加相反方向的力，从而轧制该FOP的中央部。然后在将轧制后的FOP的中央部切断后，研磨切断面，做成FOT的一面，从而制作两个面的大小不同的FOT。此外，FOT的光纤的形状能够通过控制上述轧制而自如地例如从圆形变更为圆形、从圆形变更为正方形、从正方形变更为正方形、从正方形变更为长方形等。
如上所述，FOT的第二入射部和第二射出部的大小不同，因此例如能够用于将图像增强器(光放大光学装置)等具有大口径的摄像面直接结合于具有小的摄像面的CMOS图像传感器的各元件时。由此，能够不降低结合分辨率地将明亮的图像传递至摄像元件。另外，在第二光纤的截面积朝向第二射出部逐渐变大(参照图14)的情况下，根据光的全反射的反复而缩小向第一电介体多层膜干涉滤光片的入射角。由此，能够缩小随着向第一电介体多层膜干涉滤光片的入射角的透射分光特性的向短波长侧的移动(以下，也称为“短波长移动”)，相比第二入射部和第二射出部为相同的截面积的情况下，能够扩大第一电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带。
第一电介体多层膜干涉滤光片432设于第二射出部434b的端面上，且为透射荧光的至少一部分且透射不含激发波长带的多个透射波长带的光的单一的滤光片。第一电介体多层膜干涉滤光片432与上述的第二电介体多层膜干涉滤光片417同样地包括：相对于可见光透明的玻璃基板(未图示)；以及形成于该玻璃基板上的电介体多层膜(未图示)。但是，构成上述电介体多层膜的各层的膜厚、层数以能够遮断激发光且透射期望的波长带的光(荧光的一部分或者全部)的方式适当决定。由此，能够抑制因激发光而引起的噪声，更准确地进行荧光检测。
此外，为了使第一及第二电介体多层膜干涉滤光片432、417的各波长带的透射性能充分发挥，向上述各滤光片的入射角通常寻求的规格为相对于滤光片面为0±5°。这是因为，当向上述滤光片的入射角增大时，透射该滤光片的波长带向短波长侧移动。该现象能够用下记式(4)表示的数式表达。
[式4]
Figure BDA0001354909430000141
上述式(4)中，θ是入射角。neff是实际折射率，对于各个滤光片为固有的值。λ0是光线以入射角0°入射时的波长。λ(θ)/λ0是向滤光片入射的光线的入射角为θ时产生的短波长移动的比例。
上述式(4)中，当滤光片的实际折射率neff为1.5时，在例如入射角为30°(θ＝30°)的情况下，短波长移动的比例(λ(θ)/λ0)为0.94左右。这是指，相比入射角0°(θ＝0°)的情况，透射电介体多层膜干涉滤光片的波长带向短波长侧移动了0.06波长(0.06λ0)。
图6是表示在图2的荧光检测机构中以荧光向第一光纤板的入射角为参数的荧光与激发光的关系的概要图。该图示出了使用Cy3作为荧光色素的情况下的关系。此外，用符号503表示的特性表示Cy3的荧光光谱。
在本实施方式中，为了使入射到第一光纤425内的光在芯部426、435内进行全反射而传播，需要以具有最大30°的入射角的方式向第一电介体多层膜干涉滤光片432入射。该情况下，如图6(b)所示，相比入射角0°的光，透射波长带向短波长侧移动(例如，入射角0°下的透射波长带502在入射角30°下向透射波长带504移动，在入射角40°下向透射波长带505移动)。因此，例如，在使用具有上述入射角0°下的透射波长带502的第一电介体多层膜干涉滤光片432的情况下，如图6(c)所示，由于上述的短波长移动，第二电介体多层膜干涉滤光片417的透射波长带501与最大入射角为30°的第一电介体多层膜干涉滤光片432的透射波长带504重叠，由于第一电介体多层膜干涉滤光片432的激发光的一部分透射，因此存在微弱的荧光被强大的激发光掩埋而不能检测上述荧光的担忧。
因此，优选预先考虑上述短波长移动后决定第一及第二电介体多层膜干涉滤光片432、417的透射波长带。作为上述两电介体多层膜干涉滤光片432、417的关系，优选第一电介体多层膜干涉滤光片432的透射波长带中的满足光的透射率(α1)比预定值(α)小的关系的上升波长(λ1i)、和第二电介体多层膜干涉滤光片417的透射波长带中的满足光的透射率(α2)比上述预定值(α)小的关系的下降波长(λ2j)满足上述式(1)表示的关系。
上述式(1)中，i及k分别为1以上的整数。θmax是向第一电介体多层膜干涉滤光片入射的光的最大入射角。neff是第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率。
这样，通过第一及第二电介体多层膜干涉滤光片432、417的透射波长带满足上述关系，从而即使产生了短波长移动，也能够防止两透射波长带重合，能够可靠地区分荧光和激发光。
在此，优选预定值(α)为0.1％。通过这样设定预定值(α)，即使透射光向短波长侧移动，也能够有效地防止两透射波长带重合，能够更可靠地区分荧光和激发光。
作为上述预定值(α)为0.1％且满足上述式(1)的关系的一例，例如，如图6(d)所示，可以列举第一电介体多层膜干涉滤光片432的入射角0°下的透射波长带的上升波长为600nm(参照符号506)，且第二电介体多层膜干涉滤光片417的激发光的透射波长带的下降波长为560nm。
在上述一例中，在入射光以入射角0°向第一电介体多层膜干涉滤光片432入射的情况下，透射波长带的上升波长为600nm，在入射光为入射角30°的情况下，上述上升波长根据上述式(1)的右边算出为564nm(按照neff＝1.5进行计算)。在此，在将激发光的透射波长带的下降波长(λ2j)设定为560nm的情况下，上述上升波长满足上述式(1)的关系，因此即使在产生了短波长移动的情况下，第一及第二电介体多层膜干涉滤光片432、417的透射波长带也不重叠，通过遮断激发光，OD(光学密度：Optical Density)维持6以上，能够可靠地检测微弱的荧光。
此外，本实施方式中对第一电介体多层膜干涉滤光片432的实际折射率(neff)为1.5的例进行了说明，但是，在本发明的多色荧光分析装置中，优选第一电介体多层膜干涉滤光片432的实际折射率(neff)为1.5以上且2.2以下。因此，通过将第一电介体多层膜干涉滤光片432的实际折射率(neff)设定为上述范围，从而即使产生了短波长移动，也能够有效地防止第一及第二电介体多层膜干涉滤光片432、417的透射波长带重合，能够更可靠地区分荧光和激发光。从降低短波长移动的观点出发，上述实际折射率更优选为1.7以上且2.2以下，还优选为2.0以上且2.2以下。
另外，向第一电介体多层膜干涉滤光片432入射的光的最大入射角(θmax)优选为30°。因此，通过将第一电介体多层膜干涉滤光片432的最大入射角设定为上述值，从而能够抑制用第一及第二光纤425、434进行导光的光的损失，能够更可靠地检测荧光。此外，从抑制进行导光的光的损失的观点出发，将最大入射角设定为上述值比为了分析本实施方式的DNA断片的碱基序列而以第一入射部425a接触水溶液、纯水等含有水的液体的方式进行分析更有效。上述最大入射角更优选为20°，还优选为10°。
另外，在荧光分析使用的荧光色素为Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5，第二电介体多层膜干涉滤光片417的透射率在380～396nm、474～497nm、561～575nm以及641～657nm的波长带为85％以上且在上述波长带以外的波长带低于0.1％的情况下，如图10(b)所示，优选第一电介体多层膜干涉滤光片432的透射率在436～462nm、536～548nm、620～632nm以及713～800nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
这种优选的结构的基础在于：上述Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5的最大吸收波长及最大荧光波长分别对于Alexa405为401nm、421nm，对于FAM为494nm、518nm，对于Texas Red为596nm、615nm，对于Cy5.5为675nm、694nm(对于荧光波长，参照图10(c)的符号704～707)；以及考虑向第一电介体多层膜干涉滤光片432的最大入射角为30°的情况，使图10(a)所示的第一电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带702的上升波长向长波长侧移动0.06波长(0.06λ0)(参照符号703)。
这样，通过将第一电介体多层膜干涉滤光片432的透射率设置为上述波长带，从而即使在使用了上述荧光色素及第二电介体多层膜干涉滤光片417的情况下，例如，即使在入射光以最大30°的入射角向第一电介体多层膜干涉滤光片432入射的情况下(产生短波长移动的情况)，也能够利用OD6的光学密度可靠地遮断激发光，能够更可靠地识别各荧光色素。
其结果，如图11(a)所示，透射第一电介体多层膜干涉滤光片432的荧光光谱成为激发光被切除。此外，该图所示的荧光光谱为，任意的DNA断片获取上述四种荧光色素中的指定种类的荧光色素的概率为25％，且各DNA断片含有的荧光色素的个数(荧光分子数)相同，而且加入了吸光系数、量子效率等。
二维检测部433以紧贴第一电介体多层膜干涉滤光片432的方式设置，对透射了第一电介体多层膜干涉滤光片432的光(荧光)进行检测。作为二维检测部433，例如，构能够检测入射的光(荧光)的二维光传感器构成，将上述光(荧光)作为二维图像来检测。作为上述二维光传感器，从能够进行该二维光传感器的受光面方向的同一位置的色分离的点出发，优选在光轴方向具有波长分辨率的多层方式的CMOS图像传感器。从低价格化及小型化的观点出发，也优选该CMOS图像传感器。在本实施方式中，以最大限度地提高空间分辨率的目的，形成为CMOS图像传感器的像素的大小和光纤的大小(外径)相同。此外，上述二维光传感器通过粘接剂而与第一电介体多层膜干涉滤光片432接合。
如图9所示，作为上述二维光传感器，例如具备三层传感器(第一层传感器433a、第二层传感器433b以及第三层传感器433c)。这些各层的传感器使用与检测的荧光的波长对应的检测灵敏度。例如，在本实施方式的使用上述四种荧光色素的情况下，作为上述第一～第三层传感器433a～433c，如图11(b)所示，检测灵敏度能够分别采用在500nm、585nm以及675nm具有峰值。
在使用这些第一～第三层传感器433a～433c来检测具有上述的图11(a)所示的荧光光谱的荧光的情况下，由各传感器检测的信号构成表1所示的强度比。根据表1可知，作为各信号的强度比，例如，在第一层传感器433a为83％的情况下，能够判断为Alexa405，在第一层传感器433a及第二层传感器433b分别为43％、49％的情况下，能够判断为FAM，在第二层传感器433b及第三层传感器433c分别为46％、46％的情况下，能够判断为Texas Red，在第二层传感器433b及第三层传感器433c分别为14％、66％的情况下，能够判断为Cy5.5。
[表1]
荧光色素 第一层传感器 第二层传感器 第三层传感器
Alexa405 0.83 0.10 0.07
FAM 0.43 0.49 0.07
Texas Red 0.08 0.46 0.46
Cy5.5 0.20 0.14 0.66
另外，作为上述二维光传感器，如图12所示，例如，也可以采用以下构件：具备四层传感器(第一层传感器433a’、第二层传感器433b’、第三层传感器433c’以及第四层传感器433d’)，且第一～第四层传感器433a’～433d’的检测感度如图13(b)所示地分别在450nm、550nm、625nm以及725nm具有峰值。
在使用这些第一～第四层传感器433a’～433d’检测图13(a)所示的荧光光谱(与图11(a)所示的荧光光谱同样的荧光光谱)的荧光的情况下，由各传感器检测的信号构成表2所示的强度比。根据表2可知，作为各信号的强度比，例如，在第一层传感器433a’为98％的情况下，能够判断为Alexa405，在第二层传感器433b’为83％的情况下，能够判断为FAM，在第三层传感器433c’为78％的情况下，能够判断为Texas Red，在第四层传感器433d’为98％的情况下，能够判断为Cy5.5。
[表2]
荧光色素 第一层传感器 第二层传感器 第三层传感器 第四层传感器
Alexa405 0.98 0.02 0.00 0.00
FAM 0.04 0.83 0.13 0.00
Texas Red 0.00 0.11 0.78 0.11
Cy5.5 0.00 0.00 0.02 0.98
此外，如图20所示，荧光检测部43也可以在第一电介体多层膜干涉滤光片432与二维检测部433之间的相邻的像素彼此的边界部设置反射光的光隔壁438。由此，在二维检测部433，能够防止光环绕至相邻的其它像素，并且能够提高聚光效率，作为结果，能够实现信号检测的S/N提高、DNA测序的色分离能的提高、因像素间的混合降低而引起的在一次反应中能够检测的试样数的降低抑制。
作为光隔壁438，从可得到高反射率的观点出发，优选由铝、银、金、铜及钨、以及它们的合金构成的薄膜，从可靠性及提高加工性的观点出发，优选铝薄膜。作为光隔壁438的尺寸，从提高制作简易性的观点出发，优选为高度为500nm以上且1000nm以下，宽度为200nm以上且500nm以下。这种光隔壁438例如能够通过使用CVD法、喷溅法等在第一电介体多层膜干涉滤光片432上蒸镀上述材料而形成。
接下来，对判断荧光色素的种类的方法进行说明。为了判断荧光色素的种类，首先进行串音去除。串音去除例如在上述表2所示的Texas Red的情况下，由第一层～第四层传感器433a’～433d’检测的信号量分别为0.00、0.11、0.78、0.11。这是指，Texas Red单色荧光的主要成分基本上能够由第三层传感器433c’检测，但是在第一层传感器433a’、第二层传感器433b’、第四层传感器433d’也会作为串音而检测到Texas Red对荧光。这四种荧光色素的荧光强度与四层传感器433a’～433d’检测的信号量的关系如下记式(5)表示的行列式。
[式5]
Figure BDA0001354909430000191
上述式(5)中，S1、S2、S3、S4分别是第一层传感器、第二层传感器、第三层传感器以及第四层传感器检测的信号量。另外，Dye1、Dye2、Dye3以及Dye4分别是Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5发出的荧光强度。W是以wij(i＝1、2、3、4、j＝1、2、3、4)为要素的矩阵，是关联上述荧光强度和信号量的矩阵。
在此，去除了上述的串音的荧光强度通过使作为W的逆矩阵的W－1从左开始相乘而如下记式(6)所示地求出。
[式6]
Figure BDA0001354909430000201
上述式(6)中，Dye1～Dye4及S1～S4与上述式(5)意思相同。W－1是W的逆矩阵。
然后，使得到的荧光强度正规化，对每个荧光色素以使不同的荧光强度相等的方式进行变换。通过如上所述地进行串音去除等，从而能够效率良好地识别被获取到试样中的荧光色素。
接下来，对使用该多色荧光分析装置1(DNA测序仪)来进行DNA测序的方法进行说明。此外，在此说明的多色荧光分析装置1做成为，二维光传感器是具有41兆像素的CMOS图像传感器，该CMOS图像传感器在光轴方向上具有四层传感器433a’～433d’，分别具有波长分辨率。另外，做成为，对于基板423的一根第一光纤425，仅吸附一个成为试样s的DNA断片，且由一根第一光纤425和一根第二光纤434形成一个光波导管，并且对于一个该光波导管，对应CMOS图像传感器的一个像素(在图14所示的二维光传感器中为一个像素组)。
首先，为了解析成为试样s的DNA断片的碱基序列，在基板423上进行SBS反应。上述反应所需的试剂为引物试剂、聚合酶、含有具有四种荧光色素的核苷酸的延伸试剂、保护基切断试剂、清洗试剂、成像试剂。这些试剂收纳于试剂筒101内的试剂保管容器102。另外，试剂筒101设置于试剂架103，冷却为4℃。
作为冷却方法，例如，使用珀尔帖元件104来冷却加热块105及散热器106，用风扇107将被这些散热器106等冷却的空气输送至试剂架103内，从而将试剂冷却至4℃。此外，使用风扇108对珀尔帖元件104进行散热。
然后，将在试剂架103内冷却至4℃的试剂导入流路202。此时，通过利用切换阀201进行切换，从而能够将任意的试剂导入流路202。通过使配置于比流体检测片42靠下游侧的流路203的注射器204驱动，从而输送导入流路202的试剂。具体而言，在流路203设置有两个双通阀205、206，在注射器204吸引试剂等(向流体检测片42供给试剂等及从流体检测片42排出使用完的试剂等)时，以打开双通阀205且关闭双通阀206的状态使注射器204驱动。
另一方面，在将注射器204内的试剂等(废液)排出到废液箱301时，以关闭双通阀205且打开双通阀206的状态使注射器204驱动。由此，能够通过一个注射器204进行试剂的吸引及排出。成为废液的试剂等输送至废液箱301，并储存。该废液箱301是为了防止因废液洒落而产生的触电、装置生锈、恶臭的产生等而设置。废液箱301的有无通过微型光学传感器304监视。
在此，对在供给了试剂等的流体检测片42进行SBS反应进行说明。在该反应方式中，向流体检测片42内输送延伸试剂。该延伸试剂含有用荧光色素标注过的四种核苷酸及聚合酶。上述四种荧光核苷酸是Alexa405－dCTP、FAM－dATP、Texas Red－dGTP以及Cy5.5－dTTP，上述延伸试剂中分别以200nM的浓度含有各荧光核苷酸。该延伸试剂以效率良好地进行延伸反应的方式使碱浓度、镁浓度以及pH最佳化。另外，利用延伸试剂含有的聚合酶的作用，DNA断片内的引物杂交的部位获取一碱基的与成为分析对象的碱基相应的荧光核苷酸。此外，不一次延伸两碱基的荧光核苷酸是因为，在第一碱基的荧光色素中含有阻碍第二碱基的荧光核苷酸的延伸的部位。
然后，向流体检测片42内输送清洗试剂。通过输送该清洗试剂，从而去除在流体检测片42内浮游的不参与反应的荧光核苷酸。然后，向流体检测片42内输送成像试剂，置换上述清洗试剂，然后进行荧光检测。在荧光检测后，向流体检测片42内输送保护基切断试剂。通过输送该保护基切断试剂，从而从荧光核苷酸切断荧光色素,能够进行接下来的延伸反应(第二碱基的荧光核苷酸的延伸反应)。之后，反复上述的操作，从而能够进行DNA测序，能够从一个DNA断片解析超过500碱基的碱基序列。
在此，参照图2(a)，对上述荧光检测进行说明。在该多色荧光分析装置1的荧光检测机构中，从光源发出的白色光被抛物面镜412反射而变换成平行光。变换成平行光的光通过第一蝇眼透镜413而在第二蝇眼透镜414上形成光源像，经由重叠透镜415及场透镜416而成为均匀的平行光。该平行光使用第二电介体多层膜干涉滤光片417而变换成具有互相不同的多个激发波长带的激发光(参照图10(b)的实线的特性)，分别独立地激发被成为试样s的DNA断片获取到的四种荧光核苷酸。此时，获取与DNA断片的碱基相应的荧光核苷酸，因此发出与各荧光核苷酸含有的荧光色素的种类对应的荧光(参照图10(c))。此外，从DNA断片发出的光除了含有上述荧光外，还含有被上述DNA断片等反射的激发光。
含有该荧光的光在上述的光波导管内一边进行全反射一边进行，从而到达第一电介体多层膜干涉滤光片432。在该光通过第一电介体多层膜干涉滤光片432时，因为近能够透射该第一电介体多层膜干涉滤光片432的波长带的光透射，所以激发光被遮断，仅荧光到达二维检测部433。到达该二维检测部433的荧光被设于二维光传感器的四层传感器433a’～433d’进行荧光检测。此时，与荧光色素的种类相应地发出的荧光的波长不同，因此能够根据由第一～第四层传感器433a’～433d’检测的光的强度比的差异而辨别荧光核苷酸的种类，其结果，能够决定DNA断片的碱基。
此外，在使用上述方法进行DNA测序的情况下，为了使二维光传感器的各像素对应一个DNA断片，例如，当一个DNA断片具有500碱基，对它们使用41M像素的CMOS图像传感器进行分析时，作为结果，总读取碱基数为20Gbase。另外，若将每一碱基的获取花费的SBS化学时间设为3分/base、将成像时间设为3秒，则能够约一天完成500碱基量的延伸反应。
此外，本发明不限定于上述的实施方式的结构，意在包括由权利要求书示出的与权利要求书等价的意思及范围内的所有的变更。
例如，在上述的实施方式中，作为多色荧光分析装置1，示例性地说明了由试剂保管机构10、送液机构20、废液保管机构30、以及荧光检测机构40构成的DNA测序仪，但是该多色荧光分析装置1不限定于DNA测序仪用，例如，不具有试剂保管机构10、送液机构20以及废液保管机构30的多色荧光分析装置也在本发明希望的范围内。
另外，在上述的实施方式中，为了得到激发光，使用了第二电介体多层膜干涉滤光片417，但是，只要不损害本发明的效果，也可以采用色素滤光片等其它机构。
另外，在上述的实施方式中，说明了荧光色素为Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5这四种，但是使用的荧光色素的种类、其数量能够根据试样而适当决定。此外，互不相同的荧光色素吸收的峰值波长彼此优选分离50nm以上，更优选分离80nm以上，还优选分离120nm以上。另外，互相不同的荧光色素发出的荧光的峰值波长彼此优选分离50nm以上，更优选分离80nm以上，还优选分离120nm以上。
另外，在上述的第二电介体多层膜干涉滤光片417中，说明了主要透射380～396nm、474～497nm、561～575nm以及641～657nm的波长带的光，但是只要能够发出可激发成为分析对象的所有的荧光色素的激发光且能够由第一电介体多层膜干涉滤光片432遮断上述激发光，就不限定于上述波长带。此外，就透射第二电介体多层膜干涉滤光片417的互不相同的波长带而言，优选它们的带域分离50nm以上，更优选分离80nm以上，还优选分离120nm以上。
另外，在上述的第一电介体多层膜干涉滤光片432中，作为合适的滤光片，说明了其透射率在436～462nm、536～548nm、620～632nm以及713～800nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％，但是只要能够遮断激发光，就不限定于上述波长带。此外，就透射第一电介体多层膜干涉滤光片432的互不相同的波长带而言，优选它们的带域分离50nm以上，更优选分离80nm以上，还优选分离120nm以上。
另外，在上述的实施方式中，作为二维检测部433，对由多层构成的二维光传感器进行了说明，但是也能够采用由单层构成的二维光传感器。作为这种二维光传感器，例如，如图14所示，可以列举配置为相对于一根第二光纤434，对应做成2×2像素的正方阵列(例如拜耳阵列(bayer array)等)的一个像素组439的构件。该情况下，构成上述一个像素组439的四个像素439a～439d例如能够分别使用具有与图13(b)所示的第一～第四层传感器433a’～433d’的波长特性相同的波长特性的元件。作为上述二维光传感器，例如，采用公知的单板方式的彩色CMOS图像传感器等。
另外，在上述的实施方式中，对使用短弧氙气灯作为光源411的多色荧光分析装置1进行了说明，但是也可以使用高亮度LED等LED作为光源。上述短弧氙气灯的寿命为500～1000小时，与之相对，上述LED的寿命超过20000小时，由于超过了多色荧光分析装置1的终生工作时间，因此无需进行光源随着寿命的更换。另外，能够实现无需机械性的快门及低耗电化。此外，相对于短弧氙气灯为点光源，在这种使用LED的情况下，该LED是面光源，因此如图15所示地，为了得到平行光，采用非球面透镜4191。
另外，在使用LED作为光源411的情况下，如图16所示，也可以使用光导管4192及非球面透镜4193、4194来作为图15图示的非球面透镜4191等的替代。光导管4192通过使从该光导管4192的端面入射的光在内部进行全反射而具有将光均匀化的作用。具体而言，例如，使光导管4192的供光入射的一侧的端面与上述LED的发光面的间隔以成为1mm以内的方式接近，在光导管4192的与上述LED相反的一侧配设第一及第二非球面透镜4193、4194。由此，能够效率良好地聚集从LED发出的光，而且变换成平行光，并将光传导至第二电介体多层膜干涉滤光片417。
另外，在上述的实施方式中，对具备一组照射部41的多色荧光分析装置1进行了说明，但是也可以为具备多组照射部的多色荧光分析装置。具体而言，如图17(a)、(b)所示，例如，列举一种多色荧光分析装置1a，呈半球面状地配设九个成为光源的LED411a，设置具有上述各LED411a的九组照射部41a，通过这些照射部41a，能够对试样s照射激发光。由此，能够使向试样s照射的激发光的强度增加，能够得到与该激发光对应的较大的强度的荧光(在该例中，强度增加为9倍)。此外，在类似于图21所示的使用了物镜的荧光分析装置2中，需要使物镜21和流体检测片22接近至0.5mm～5mm程度，因此难以如上所述地配设多组照射部。
另外，在上述的实施方式中，对照射部41位于与流体检测片42的基板423的板面垂直的方向的多色荧光分析装置1进行了说明，但是也可以为以能够倾斜地对上述基板423照射激发光的方式配置有一组或多组照射部的多色荧光分析装置。具体而言，如图18(a)、(b)所示，例如，列举一种多色荧光分析装置1b，呈环带状地配设八个LED411b，设置含有上述各LED411b的八组照射部41b，通过这些照射部41b能够以激发光对基板423以预定的角度θ3入射的方式照射。
在如本实施方式所示地使用多色荧光分析装置1作为DNA测序仪的情况下，需要向构成第一光纤板424的第一光纤425入射的光线的入射角θ1满足θ1≤30°。因此，通过将激发光向流体检测片42入射的角度θ3设定为θ3＞30°，从而能够抑制入射至第一光纤425的激发光在第一及第二光纤425、434内进行全反射，能够可靠地检测荧光。
这种照明称为斜光照明。该斜光照明对于以一分子荧光测量等为代表的微弱的荧光的计量尤其有效。即，一分子的荧光色素发出的总光子数为104～105个。另一方面，作为二维光传感器，若使用公知的高灵敏度摄像机，则如果背景充分低，如果能够接受100个光子，就能够检测上述一分子。因此，可知通过使用上述高灵敏度摄像机，一分子荧光测量所需的光子数已经确保了充分的个数，需要的只是降低背景(背景光)。在本发明中，激发光成为背景光。因此，通过做成上述多色荧光分析装置1b，能够去除成为背景光的激发光，能够可靠地检测荧光。
生产上的可利用性
本发明能够提供一种多色荧光分析装置，能够一并且准确地检测从试样含有的多种荧光色素发出的荧光。因此，该多色荧光分析装置例如能够合适地用于类似于使用了同时使用多个荧光色素的SBS法的DNA的碱基序列分析等。
符号的说明
s—试样，1、1a、1b—多色荧光分析装置，10—试剂保管机构，20—送液机构，30—废液保管机构，40—荧光检测机构，41—照射部，42—流体检测片，43—荧光检测部，411—光源，417—第二电介体多层膜干涉滤光片，417a—第一滤光片，417b—第二滤光片，417c—第三滤光片，417d—第四滤光片，423—基板，424—第一光纤板，425—第一光纤，425a—第一入射部，425b—第一射出部，426—芯部，427—包层部，431—第二光纤板，432—电介体多层膜干涉滤光片(第一电介体多层膜干涉滤光片)，433—二维检测部，434—第二光纤，434a—第二入射部，434b—第二射出部，435—芯部，436—包层部。

Claims (19)

1.一种多色荧光分析装置，检测利用照射激发光而从试样含有的具有不同的荧光波长的多种荧光色素中发出的荧光，
上述多色荧光分析装置的特征在于，具备：
照射部，其向上述试样照射具有互不相同的多个激发波长带的激发光；
第一光纤板，其与上述试样的至少一部分抵接，从第一入射部接受含有利用照射上述激发光而从上述试样发出的荧光的光，并进行导光，并且从与上述第一入射部相反的一侧的第一射出部射出上述光；
第二光纤板，其从第二入射部接受从上述第一射出部射出的光，并进行导光，并且从与上述第二入射部相反的一侧的第二射出部射出上述光；
单一的电介体多层膜干涉滤光片，其设于上述第二射出部的端面上，透射上述荧光的至少一部分且透射不含上述激发波长带的多个透射波长带的光；以及
二维检测部，其设置成紧贴在上述电介体多层膜干涉滤光片，对透射了上述电介体多层膜干涉滤光片的光进行检测。
2.根据权利要求1所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
权利要求1所述的电介体多层膜干涉滤光片是第一电介体多层膜干涉滤光片，
照射部具有光源和第二电介体多层膜干涉滤光片，该第二电介体多层膜干涉滤光片从上述光源发出的光中使具有预定的激发波长带的激发光选择性地透射。
3.根据权利要求2所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第一电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带中的满足光的透射率(α1)比预定值(α)小的关系的上升波长(λ1i)、和第二电介体多层膜干涉滤光片的透射波长带中的满足光的透射率(α2)比上述预定值(α)小的关系的下降波长(λ2j)满足下记式(1)表示的关系，
[式1]
Figure FDA0002231332680000021
式(1)中，i及k分别是1以上的整数，θmax是向第一电介体多层膜干涉滤光片入射的光的最大入射角，neff是第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率。
4.根据权利要求3所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
预定值(α)是0.1％。
5.根据权利要求3所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率(neff)是1.5以上且2.2以下。
6.根据权利要求4所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第一电介体多层膜干涉滤光片的实际折射率(neff)是1.5以上且2.2以下。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
向第一电介体多层膜干涉滤光片入射的光的最大入射角(θmax)是30°。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
构成第二光纤板的光纤的外径比构成第一光纤板的光纤的外径小。
9.根据权利要求7所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
构成第二光纤板的光纤的外径比构成第一光纤板的光纤的外径小。
10.根据权利要求3～6中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
依次照射各激发波长带的激发光。
11.根据权利要求3～6中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
同时照射至少具有两个激发波长带的激发光。
12.根据权利要求1～6中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
试样是含有荧光色素的DNA断片，用于上述DNA断片的碱基序列的分析。
13.根据权利要求12所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
荧光色素是Alexa405、FAM、Texas Red以及Cy5.5。
14.根据权利要求13所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第二电介体多层膜干涉滤光片具有第一滤光片、第二滤光片、第三滤光片以及第四滤光片，
第一滤光片的透射率在380～396nm的波长带为85％以上，且在380～396nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第二滤光片的透射率在474～497nm的波长带为85％以上，且在474～497nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第三滤光片的透射率在561～575nm的波长带为85％以上，且在561～575nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
第四滤光片的透射率在641～657nm的波长带为85％以上，且在641～657nm的波长带以外的波长带低于0.1％，
上述第一滤光片、上述第二滤光片、上述第三滤光片以及上述第四滤光片切换使用。
15.根据权利要求13所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第二电介体多层膜干涉滤光片是单一的滤光片，
上述第二电介体多层膜干涉滤光片的透射率在380～396nm、474～497nm、561～575nm以及641～657nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
16.根据权利要求14所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第一电介体多层膜干涉滤光片的透射率在436～462nm、536～548nm、620～632nm以及713～800nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
17.根据权利要求15所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
第一电介体多层膜干涉滤光片的透射率在436～462nm、536～548nm、620～632nm以及713～800nm的波长带为85％以上，且在上述波长带以外的波长带低于0.1％。
18.根据权利要求12所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
在第一光纤板的试样抵接的一侧的面，对光纤的芯部端面实施了氨基硅烷处理，对上述光纤的上述芯部端面以外的面实施了HMDS处理。
19.根据权利要求13～17中任一项所述的多色荧光分析装置，其特征在于，
在第一光纤板的试样抵接的一侧的面，对光纤的芯部端面实施了氨基硅烷处理，对上述光纤的上述芯部端面以外的面实施了HMDS处理。
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