JP2008502910A - 蛍光の多重マーキング式顕微鏡的ファイバ・イメージング方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、検体の蛍光のファイバ画像を形成する方法に関するもので、この方法においては：励起信号を用いて検体を走査し；前記検体から来る蛍光信号を検出し（励起信号と蛍光信号は同一の光路を通る）；前記光路を介して、検体内に含まれる少なくとも２つの蛍光体を励起し；前記光路を介して、前記少なくとも２つの蛍光体の各々の蛍光信号を検出し；前記少なくとも２つの蛍光体に応じて着色された領域を含む最終画像を作り上げる。本発明の多重マーキングは異なる２つの波長帯域内で２つの画像を同時に収集することを可能にする。本発明の装置は蛍光信号をスペクトル量子化するための分光計を有することができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、検体の蛍光の顕微鏡的ファイバ画像（ファイバによる画像）を形成するための方法および装置に関する。目的とする応用分野は、より詳しくは、生体内式（in-vivo）かつその場式（in-situ）イメージングの分野である。

観察される蛍光は外来性の化合物（典型的には投薬されたマーカー）又は生物組織の細胞（トランスジーニック・マーカー型のもの）によって生成された化合物に由来することができる。

組織の自動蛍光システムを記載した文献US 6,148,227が知られている。光線は組織の内生的な蛍光体を励起する。発射された信号は赤色信号と緑色信号とに分離される。次にこれらの信号を電子的に処理して、二色画像を得る。文献US 6,343,228は、反射画像に基づいて蛍光画像を正規化するようになった蛍光のイメージング装置を記載している。この装置は、組織の内生的な蛍光体を励起するための第１の光路と、蛍光と反射によって発射された信号を回収するための第２の光路とを有する。文献WO 0043552は、複数の化学化合物を検出することを目的とする“バイオチップ”と呼ばれる集積回路を記載している。このバイオチップは多数のセンサーを有し、その１つは蛍光センサーである。レーザ又は発光ダイオードはターゲット元素を励起するための光線を発射し、これに応答してこの元素は本来的に又は適当なマーカーの注入により信号を生成する。発射される信号は蛍光信号、燐光信号、又はラマン拡散信号であり得る。入射光束とターゲット元素から発射された信号との間の光路は異なる。

前述した従来技術の難点は、これら３つの文献のいづれも、特に共焦点ファイバ画像を形成することを可能にするものでもないし、高解像度のファイバ画像を形成することを可能にするものでもないということである。

本発明は、１つの光路を介して励起信号を用いて検体を走査し、前記検体から来る蛍光信号を検出するようになった（励起信号と蛍光信号は同一の光路を通る）、顕微鏡的ファイバ・イメージング装置を特に目的とするものである。いわゆる卓上顕微鏡と異なり、この顕微鏡的イメージング装置は、特に本発明の用途に適した内視鏡の分野において、顕微鏡的な解像度を保持するオフセット画像を得るのを可能にする。

従来技術として、最後にWO 2004/008952を引用することができ、これは各画像の品質を最適化すると共に優れた横方向および軸方向解像度を得るべく蛍光の共焦点画像を生体内式その場式に形成する方法を提案している。共焦点画像を形成するためのこの方法の第１の観点によれば、数千本の光ファイバからなるイメージガイドが使用され、この方法は検体の特に表面下の平面内で点から点へと走査することからなり、各点は、連続光源から発射され、偏向され、光ファイバの束の１本の光ファイバ内に注入され、次いで特に光学ヘッドを用いて前記平面内において前記ファイバの出口に集束される、励起信号に対応しており、各点は戻りに蛍光信号を発射し、この蛍光信号は光ファイバによって回収され、次いで検出されかつディジタル化されて画素を形成する。共焦点特性は、検体内に光線を集束するための光学ヘッドを使用すること、および、空間的濾過用の穴として励起信号とこれに応答して発射された蛍光信号とを伝送するためのものと同一の光ファイバを使用することにより得られる。

第１の観点に較べて高解像度で非共焦点性の蛍光画像を形成するためのこの方法の第２の観点によれば、ここではファイバの端部を裸でイメージングすべき検体の表面に直に接触させて配置し、各ファイバは表面から光ファイバのコアの直径に特に依存する最大深度までの間に位置する検体のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成するようになっている。得られる画像は、点から点へと走査される表面下の切断面に由来するものではないので、“共焦点的”ではない。しかしながら、それらは“高度に解像された”画像であると評価することができる。何故ならば、表面の直下に位置するマイクロボリュームを交わる交わる走査することに由来すると共に、励起に用いたのと同じファイバによって各マイクロボリュームから発射された蛍光信号を空間的濾過することに由来するからである。

いづれの場合においても、これら２つの観点については、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で励起信号を偏向させると共に、ファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出する。ファイバ・サンプリング（シャノン基準による）の尊重は各ファイバに良く対応する点から点への画像を得るのを可能にする。これは、平均最小限毎秒画像数（即ち、実際には896×640ピクセルの最大限モードの場合に最小限毎秒１２画像）を尊重しながらすべてのファイバを１本づつサンプリングすることによって情報を失わないことを可能にする。この最小限サンプリングに応じて検出周波数（検出センサーのパスバンド）を選定すれば、可能な最大数の蛍光光子を各ファイバ毎に検出することが可能になる。従って、約30,000の可撓性光ファイバからなるイメージガイドを用いた可能な実施例によれば、検出システム（アバランシュ型フォトダイオード又は同等物）のサンプリング周波数とパスバンドはほぼ１.５MHzに設定され（ファイバ当たり約12ピクセルに対応）、最大限896×640ピクセルのモードで最小限１２画像／秒を得るのを可能にする。実用的には、ビームの偏向は、共鳴式“ライン”ミラーの高速の共鳴周波数と検流式“フレーム”ミラーの遅い共鳴周波数を決定することにより制御される。これは、リアルタイムの画像を得るのに適切な高速でファイバを走査するのを可能にする。

本発明の目的は、蛍光の共焦点イメージング装置によって得た画像を情報において豊富化することにある。本発明の他の目的は、充分に特定された要素（元素、成分。element）の挙動上の進展変化を監視（追跡）することである。

前記目的の少なくとも１つは検体の蛍光の顕微鏡的ファイバ画像を形成する方法によって達成されるもので、この方法においては：
−少なくとも１本の光ファイバを有する１つの光路を介して励起信号を用いて検体（サンプル）を走査すると共に、
−前記検体から来る蛍光信号を検出する（励起信号と蛍光信号はこの同一の光路を通る）。
本発明によれば、：
−前記光路を介して、検体に含まれる少なくとも２つの蛍光体を励起し、
−前記光路を介して、前記少なくとも２つの蛍光体の各々の蛍光信号を検出し、
−前記少なくとも２つの蛍光体に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げる。
励起信号は異なる波長の複数の他の信号から出力することができる。

本発明は、従って、多重マーキングを行うことを可能にするもので、即ち、ヒト又は動物の組織であり得る検体内で少なくとも２つの蛍光体（換言すれば、色素又はマーカー）を検出する。各蛍光体は適当な光ビームによって励起された時に所与の波長の信号を発する。好ましくは、前記少なくとも２つの蛍光体から発射される蛍光信号は、これらの蛍光信号をスペクトル濾過によって分離できるように、互いに充分に離れた波長を有する。しかしながら、前記少なくとも２つの蛍光体から発射された蛍光信号が全部又は一部において重なり合う波長帯域を有する場合には、後述するように、分別は、逐次発射によって、オーバーラップの場合には濾過による精細検出によって、或いは、完全な重なり合いの場合には逐次検出によって行うことができる。

本発明の方法によれば、注入された夫々の蛍光体は特定の要素（元素、成分。element）をマークすることができる。この蛍光体は効果的に投薬することができるか（外来性の蛍光体）、或いは始めから検体内に存在することができる。後者の場合は例えば一若しくは複数の蛍光体を表すあらゆるトランスジーニック動物を含む。得られる画像は、従って、これらの異なる要素（元素）を異なる色で示す。これらの色は任意的であり得るもので、即ち、“偽”の色であるか、或いは蛍光体から発射された蛍光信号の波長に有効に対応する色であり得る。画像を（特にリアルタイムで）可視化すれば、要素（元素）の進展変化を監視することができる。夫々の要素（元素）の反応を可視化するべく例えば刺激を与えることができる。多重マーキングは、マークされた種々の異なる要素（元素）を、異なる色によって、明瞭に区別する画像を得るのを可能にする。最終画像は注入した蛍光体と同じくらい多くの色を有することができる。従って、第１の蛍光体は形態学的又は空間的な役割を有することができ、即ち、例えば細胞構造をマークし、骨格（コンテナー）を示すことができる。第２の蛍光体は、蛋白質やイオンをマークしてそれらの活動を追跡する（従って、コンテンツ・内容物を追跡する）ような、機能的な役割を有することができる。例として、第２蛍光体によってマークされた神経単位内において、第１蛍光体によってマークされたカルシウムの活動を可視化することができる。例えば、本発明に基づいて２つの蛍光体を用いて核と細胞質とをマークすることにより、核−細胞質比（細胞表面に対する核表面）を容易に決定することができる。当業者は各蛍光体は機能的役割、形態学的役割、又は他の役割を有することができることを容易に理解できるであろう。

本発明は多数の用途を有するもので、特に非侵襲性の或いは少ししか侵襲性でない方法を必要とする用途に利用することができる。これらの用途は、例えば、１ｍｍより小さな直径の光学プローブを例えば膀胱内に挿入する場合の尿道内視鏡；小動物の結腸鏡検査；角膜および網膜の可視化；筋肉繊維および神経繊維の可視化；白血球および血流の微小循環；血管構造および腎臓構造；肝細胞隔膜；および例えば生きている小動物の深層脳構造を可視化するためのその場式の神経生物学。

本発明の好ましい実施態様によれば、前記少なくとも２つの蛍光体は同時に励起される。更に、前記少なくとも２つの蛍光体の蛍光信号を同時に検出する時には、従って、リアルタイムで例えば毎秒１２画像を形成することができる。従って、本発明は生体内式かつその場式の画像収集を可能にする。

代替的に、前記少なくとも２つの蛍光体は逐次的に励起することができる。即ち、これらの蛍光体は次々に励起される。２つの蛍光体を注入し、かつ、リアルタイムで毎秒１２画像の画像収集装置を使用する場合には、毎秒６画像のレートで最終画像を得ることができる。

また、前記少なくとも２つの蛍光体の蛍光信号を逐次的に検出することもできる。

理解されるように、従って、好ましい実施態様は、リアルタイムで最終画像を得るべく、同時検出のための同時発射に基づいている。例として、２つの蛍光体を励起するための異なる２つの波長で発光する２つのレーザエミッタを使用することができ、これら２つの蛍光体もやはり異なる２つの波長を発射する。

好ましくは、すべての場合において、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査する。更に、ファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出する。走査はリアルタイム速度にとどまり、検出モード（同時的又は逐次的）に依存するのは最終画像の作成である。

好ましくは、前記最終画像を作り上げるため、先ず検出された蛍光信号と同じくらい多くの一次画像を作り上げ、対応する蛍光体に割り当てられた色に応じて各一次画像を着色し、次いでこれらの一次画像を重ね合わせて最終画像を構成する。この重ね合わせ段階は、また、融合又は50／50透明であることができる。

更に、前記光路を介して検体から来る信号の一部を用いて各画像のスペクトル（波長に応じた強度）を収集することもできる。

変化形によれば、所与の１画像について、前記光路を介して検体から来る信号の一部を用いて興味がある領域のみのスペクトルを更に収集する。所与の領域の経時的な分光分析は最終画像に対する追加的な関連ある情報を提供する。従って、マークされた要素（元素）の進展、並びに、刺激に対するそれらの反応を徹底的に監視（追跡）し決定することができる。

実用的には、スペクトルを形成するにあたり、画像の品質を損なわないようにするため、検体から来る信号の約２０パーセントを採取する。

本発明によれば、第１段階の画像収集を行い、次いで、得られた画像上で前記興味がある領域を画定することにより、前記スペクトルの収集に先立って、前記興味がある領域を定める。

更に、一画像の興味がある領域（複数）のみのスペクトルを収集するため、励起信号が前記興味がある領域を走査する瞬間に対応する所定の瞬間に、検体から来る信号の一部を分光計の方へ指向させる締め切り装置又はスイッチ（一般に英語で“シャッター”と呼ばれている）を使用することができる。制御されたミラーや音響光学式デフレクタのような他の高速スイッチを使用することができる。

また、励起信号を発射するために高周波数でパルスされるレーザを使用することができ、このパルスレーザは前記興味がある領域を走査するためにのみアクティブにされる。

本発明は、また、検体の蛍光の顕微鏡的ファイバ画像を形成する装置を提供するもので、この装置は：
−処理ユニットと、
−少なくとも、検体内で励起信号を走査する手段と、励起信号を検体に向かって搬送すると共に前記検体から来る蛍光信号を回収するための少なくとも１本の光ファイバを有するイメージガイド、とを有する光路、とを備え、励起信号と蛍光信号はこの同一の光路を通る。

本発明によれば、この装置は更に：
−前記光路を介して、検体に含まれる少なくとも２つの蛍光体を励起するための励起手段と、
−前記光路を介して、前記少なくとも２つの蛍光体の各々の蛍光信号を検出するための検出手段と、
−前記少なくとも２つの蛍光体に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げるための、前記処理ユニット内の、処理手段、
とを備えている。

好ましくは、本発明の装置は、文献WO 2004/008952（マウナ ケア テクノロジーズ）に記載されているような装置をベースとして使用する。

励起信号の走査は、検体の表面下の平面内で、表面の平面内で、又は検体の体積内で行うことができる。

励起手段は前記少なくとも２つの蛍光体を同時に励起することの可能なレーザのようなエミッタを有する。実際、２つの蛍光体を一度に励起することの可能な、特に405ｎｍで発光する、レーザ装置が存在する。この場合、受信には、蛍光信号を逐次的に検出する１つのフォトセンサーか、或いは蛍光信号がスペクトル的に解離可能である場合にはこれらの蛍光信号を同時に検出する２つのフォトセンサー（蛍光体と同じくらいの数のフォトセンサー）を配置することができる。

好ましくは、励起手段は、前記少なくとも２つの蛍光体を同時に又は逐次的に励起する少なくとも２つのエミッタ（特に２つのレーザ）を有する。この場合には、夫々のエミッタは好ましくは１つの蛍光体のみを励起することができる。

理想的には、同時に励起しかつ検出すると共にリアルタイム（毎秒１２画像）で画像を作り上げるため、センサーと同じくらいの数のエミッタを配置する。

好ましくは、２つの励起信号エミッタは夫々488ｎｍおよび635ｎｍで発光する２つのレーザであり、検体内の２つの蛍光体は夫々これら２つの波長に反応する。

他の実施態様においては、検出手段はフィルター手段（例えばパスバンド調節可能なフィルター）に接続された特にフォトセンサーのようなレシーバを備え、このフィルター手段は前記少なくとも２つの蛍光体から発射された蛍光信号の各々を逐次的に通過させる。

しかしながら、好ましくは、検出手段は、むしろ、二色フィルターのようなセパレータに接続された少なくとも２つのレシーバを備え、この二色フィルターは波長に応じて各蛍光信号を所与の１つのレシーバに向かって送るようになっている。

多重光路型検出モードにおいては、パスバンド調節可能な複数のフィルター及び／又は調節可能な複数の二色フィルターを使用することができる。同様に、発光においては、複数の波長で同時に発光する唯一のレーザを使用することができる。

好ましくは、走査手段は、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査する。更に、検出手段は、ファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出する。

好ましい実施態様によれば、イメージガイドは数千本の光ファイバからなり、このガイドには前記走査手段が先行すると共に、励起信号を検体内に集束するための光学ヘッドが後従する。

変化形においては、イメージガイドは１本の光ファイバで構成することができ、走査手段はイメージガイドと検体との間に配置された光学ヘッド内に組み込まれている。

他の変化形においては、イメージガイドは数千本の光ファイバで構成することができ、これらの光ファイバの遠位端は裸で検体の表面に直接接触して配置されるようになっている。この場合には、各ファイバは、表面から光ファイバのコアの直径に特に依存する最大深度までの間に位置する検体のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成するようになっている。

この装置は、更に、検体から来る信号の一部を用いてスペクトルを作り上げることの可能な分光計を有することができる。こうして蛍光のファイバ・イメージング装置（特に共焦点式）と分光分析路との接続を行う。この分光計は、励起信号が興味がある領域を走査する瞬間に対応する所定の瞬間に、検体から来る信号の一部を分光計の方へ指向させる締め切り装置又は“シャッター”に接続することができる。或いは、一画像の興味のある一領域のみのスペクトルを収集するため、励起手段は高周波数でパルスされる少なくとも１つのレーザを有することができ、このパルスレーザは前記興味がある領域を走査するときにのみアクティブにされる。留意すべきことに、共焦点式の画像収集装置を使用する場合には、分光器もまた共焦点式である。高解像度、非共焦点式の画像収集装置を使用する場合には、分光器もまた高解像度、非共焦点式である。

本発明によれば、処理ユニットは励起手段とレシーバ手段とを同期させる手段を備えている。

本発明によれば、検出された光束に対して次に行われる画像処理は、検出された限られた光子の光束に基づいて非常に良好な品質の画像を得るべく最適化される。この最適化は次のように行われる。

リアルタイムの画像収集に先立って、次の一連の段階が行われる：
−使用することを意図する選ばれた一群のファイバ（イメージガイド全体か、選ばれたサブアッセンブリ）の各ファイバの場所を検出する段階；この段階は少なくともイメージガイドを交換する度に行うべきである；
−各ファイバへの注入率を較正する段階（即ち、各ファイバに固有の注入率を確定する段階）；
−（検体なしに）バックグラウンド画像を検出する段階。

作動時には、画像処理の最適化は、検出した信号をディジタル化した後に、特に：
−補正された信号を得るべく、ファイバの固有の注入率とバックグラウンド画像の控除とに応じて補正した後に、各ファイバによって回収された（即ち、検体からしか来ない）真の光束を確定すること；
−次いで、この補正された信号に基づいて、特にファイバのモザイクを呈する画像をファイバが目立たない画像に変換することを目的として、画像の再構成を行うこと；
からなる段階を包含する。

本発明によれば、これら２つの最後の段階は好ましくはリアルタイムで行うことができる。信号の補正に関しては、これは、観察された信号の構造に適合した処理および最適化されたアルゴリズムのお陰で、リアルタイムで行うことができる。画像の再構成に関しては、これはリアルタイムで実行可能なピクセル当たり操作数の選択のお陰で行うことができ、画像品質の点で所望の結果を得ることを可能にする。ゴーシアン（Gaussien）ローパスフィルターは処理の複雑さと結果の品質と計算時間との間の良好な妥協を提供する。

本発明の他の利点や特徴は非限定的な実施例の詳細な説明と添付図面から明らかとなろう。

次に、非限定的に、検体内に２つの蛍光体が存在する場合の高精細度の共焦点画像を形成するための本発明の装置を説明する。検体は生物組織又は細胞培養物であり得る。

この装置は、リアルタイムで効果的に画像を形成するように２つの励起路と２つの検出路とを備えている。各光路毎に、光源１、２は所与の１つの蛍光体を励起することの可能な励起波長（例えば、夫々、488ｎｍと635ｎｍ）で発光するレーザである。各光源は１つの蛍光体を励起することができる。イメージガイド６の１本のファイバ内への注入を最適化するため、励起ビームは同じく円形の断面のファイバへ注入できるように円形であると共に、注入率を最適化するため、殆どマルチモードでない光ファイバ内に注入するための可能な最良の波面を呈するべくレーザは好ましくは長手方向モノモードである。レーザの出口で利用可能な出力は少なくとも２０ｍＷである。画像を収集するため、レーザは連続的かつ安定的に発光することができる（ノイズはできるだけ最小であり、＜１％）。例として、量子ウェル型レーザ（VCSEL）、ダイオードによってポンピングされた固体レーザ、ダイオードレーザ、或いは更にアルゴンのようなガスレーザを使用することができる。本発明の場合には、後述するように、各レーザは100MHzを超える周波数でパルスされるモードで使用することができ、これは興味がある領域のみについて分光を行うためである。

光源１、２の出口には励起用レーザビームを成形するための“エキスパンダー”手段３、４が配置されている。これらは、レーザビームの直径を修正することを可能にするレンズからなる、１以外の倍率の無焦点の光学系で構成されている。倍率はビームの直径がファイバへの注入（インジェクション）手段１０に適合するように計算される。

成形された励起用レーザビームは次いで励起波長と蛍光波長とを分離するための手段５、６の方へ向けられる。それは例えば、励起波長に対して98〜99％の透過効率を有すると共に、従って他の波長をほぼ反射する、二色性フィルターである。従って、蛍光信号は、戻りに励起信号と同じ光路を通りながら、検出路１５、１８の方へ送られるであろう。検出路上に配置された拒絶手段１１、１２は夫々の励起波長488ｎｍおよび635ｎｍにおけるノイズ反射の１〜２％を完全に除去する役割を果たし、それらは検出路（例えば、夫々488ｎｍおよび635ｎｍにおける２つの拒絶フィルタ）の方へ通過する。

次に走査手段７は励起ビームを取り上げる。図１に示した選ばれた実施例では、この走査手段は、ビームを水平に偏向し、従って画像のラインを実現するための、４kHzで共鳴するミラーM1と、ビームを垂直に偏向し、従って画像のフレームを形成するための15Hz型（一般には10〜40Hz）の検流式ミラーM2と；統一された倍率の２つの無焦点系（２つのミラーの間に位置するAF1と、ミラーM2の後に位置するAF2）とを備え、これらの無焦点系は２つのミラーM1およびM2の回転面を１本のファイバへの注入面に共役させるために使用される。本発明によれば、走査速度は組織の生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）の観察を可能にするべく決定される。このため、走査は、最も遅いモードに対応する986×640ピクセルの表示モードで少なくとも１２画像／秒がスクリーンに表示されるように、充分速くなければならない。従って、より少ないピクセルを有する表示モードの場合には、毎秒当たりの収集画像数は常に１２画像／秒より大きいであろう。変化形では、走査手段は特に回転ミラー、MEMs型の集積デバイス（XY走査ミラー）、又は音響光学システムを有することができる。

走査手段の出口で偏向された励起ビームは、イメージガイド８のいづれか１本のファイバへ注入されるべく光学手段１０の方へ向けられる。この手段１０はこの実施例では２つの光学アッセンブリE1およびE2で構成されている。第１の光学アッセンブリE1は走査手段７の視野の縁における光学収差を部分的に補正するのを可能にするもので、従って、注入は光学視野の全体（中央においても縁においても）について最適化される。第２の光学アッセンブリE2はいわゆる注入を行うことを目的としている。その焦点距離と開口係数はガイド８の光ファイバへの注入率を最適化するように選ばれる。色消し性の基準を得るのを可能にする実施例によれば、第１のアッセンブリE1は１つの二枚玉レンズからなり、第２のアッセンブリE2は２つの二枚玉レンズからなり、後者の後にはイメージガイドの近くに位置するレンズがある。変化形として、この注入用光学系は、例えば２つの三枚玉レンズのような他の任意のタイプの標準型光学系や、屈折率分布レンズ（回折性光学素子による色収差補正付き）や、或いは顕微鏡の対物レンズ（しかし、より高価）で構成することができる。

イメージガイド８は非常に多数の可撓性光ファイバ（例えば直径２μｍで３.３μｍ離間された30,000本のファイバ）で構成されている。実際には、イメージガイドのファイバの全体を使用するか、或いは、これらのファイバの選ばれたサブアッセンブリ（例えば中央のもの）を使用することができる。

光ファイバを出ると、励起用レーザビームは光学ヘッド９によって検体２６内において検体の表面（光学ヘッド９はこの表面に当接せられるようになっている）から数拾μｍ〜百μｍまでの所与の深さに位置する点に集束される。この深さは例えば４０μｍであり得る。光学ヘッドは従ってイメージガイドを出るビームを検体内に集束させることを可能にするが、検体から戻って来る蛍光光束を回収することをも可能にする。光学ヘッドは２.４の倍率と、検体に対する０.５の開口係数を有する。これら２つのパラメータは、戻り信号が励起信号を発射した光ファイバのみに入り、隣接するファイバには入らないように（および、従って、１本のファイバを用いて共焦点濾過が確保されるように）選ばれる。倍率と開口係数をこのような数値にすれば、軸方向解像度は約１５μｍとなり、横方向解像度は約２μｍとなる。開口係数は、また、回収される光子の数を最適化するように選ばれ、回収される光子の数は可能な限り大きくなければならない。光学ヘッドは、共焦点性に適合した光学的品質と色収差を有する（即ち、光学的収差を最小限にするもの。さもないと、光学的収差は特に視野の深さを悪化させ、その結果、装置の軸方向解像度を悪化させるであろう）従来型の光学系（二枚玉レンズ、三枚玉レンズ、非球面レンズ）及び／又は屈折率分布レンズ（GRIN）で構成することができる。作動時には、光学ヘッドは検体２６に接触して配置される。蛍光の発現は注入した蛍光体によって行われる（システミック蛍光作用）か、遺伝子修正により細胞自身によって作られた蛍光体によって行われる（トランスジーニック蛍光作用）。本発明の場合には、２つの蛍光体が注入され、50〜200ｎｍ（特に100ｎｍ）の幅のスペクトル帯にわたって光子を再発射する。

検出路上では、拒絶フィルター１１、１２を出ると、２つの蛍光信号は、波長の選択により、二色性フィルター１４によって分離される。各蛍光信号は、次いで、夫々手段１７、２０（例えば、検出レンズで構成されている）によって夫々の空間的濾過手段１６、１９の濾過用穴内に集束される。検出レンズの焦点距離は、１本のファイバから来る蛍光信号が濾過用穴のサイズになるか或いはそれより僅かに小さくなるように計算される。この濾過用穴は、入射ビームによって照射されたファイバから来る蛍光光線だけを保存することを可能にする。それは照射されたファイバに隣接するファイバに関連したおそれのある光線を拒絶するのを可能にする。穴のサイズは１本のファイバの画像が完全に内接するように計算される。この実施例では２０μｍである。

使用するフィルターは、蛍光信号同士を分離し得るに充分に選択的で、リアルタイムの画像収集に必要な最大限の光子を捕捉するに充分に幅広の、パスバンドを呈する。

検出手段１５、１８は調べるべき蛍光作用の波長に対して最大の感度を有する。例えばアバランシュ型フォトダイオード（APD）やフォトマルチプリケータを使用することができる。更に、本発明によれば、パスバンドは蛍光信号の積分時間を最適化するように選ばれる。それは１.５MHzであり、これは積分時間が各ピクセル毎に最適化された場合のイメージガイドの最小限サンプリング周波数に対応する。

検出された信号を制御し、分析し、ディジタル処理し、表示するための電子情報処理手段２５（例えば、マイクロコンピュータ）は以下のボードを有する：
−次の機能を有する同期ボード２４：
−走査（即ち、ラインミラー M1とフレームミラーM2の動き）を同期して制御する機能；
−分光計２２から来るデータの分光分析を蛍光画像と同期して制御する機能；
−このように走査されるレーザスポットの位置をあらゆる瞬間において知る機能；および、
−それ自身も制御され得るマイクロコンピュータを介して他のすべてのボードを管理する機能；
−特にインピーダンス適合を行うアナログ回路と、増幅器と、アナログ・ディジタル変換器と、次いで、信号を成形するプログラム可能な論理デバイス（例えば、FPGA回路）とを各検出路毎に有する検出ボード２３。

マイクロコンピュータ２５は、また、可変周波数のデジタルデータの流れを処理してそれをグラフィックボード（図示せず）を用いてスクリーンに表示するためのデジタル・データ収集ボード（図示せず）を有する。

本発明の装置は、特にWO 2004/008952及び／又はWO 2004/010377に記載されているように画像処理を実行するのを可能にする。この画像処理は、各検出路毎に、マーキングされた物質を示す一次画像２７、２８を同時にリアルタイムで得るのを可能にする（図２参照）。画像２７、２８、２９はバイオプシーによって採取された腺質組織に対応する。より詳しくは、この組織は人間の甲状腺に由来する。これらの画像は腺か（crypt）を示す。本発明は、従って、図１の装置を用いて、異なる２つの波長帯内で２つの画像を同時に収集するのを可能にする。

一次画像２７は円形で青色のスポットを発現させる。青色は任意的に選ばれる。これらのスポットは、 To-pro-3と呼ばれる、635ｎｍのレーザビームによって励起することの可能な、一次蛍光体から発射された蛍光信号に対応する。それはDNAの割り込み体である。この蛍光体は核の中のDNAの存在により細胞の核を識別するのを可能にする。

一次画像２８は非常に特殊な空間領域を画定する任意の赤色の構造を発現させる。これらの領域は、DiAと呼ばれる、488ｎｍのレーザビームによって励起することの可能な、第２蛍光体から発射された蛍光信号に対応する。この蛍光体は細胞の細胞膜内に含まれる脂質（脂肪酸）と非常に強い親和力を有する。従って、画像上で見える領域は画像の視野の中で見える膜に対応する。本発明によれば、次に２つの一次画像を重ね合わせて最終画像２９を形成し、図２上に、青色の元素（要素）と赤色の元素（要素）とを一度に現われさせる。これは赤色の隔膜の中に青色の核をより良く画定するのを可能にする。

同様に、図３において、画像３３、３４、３５は子宮頸部に由来するマルピギー小体組織を示す。画像３３では、青色に着色された視認可能なスポットは、細胞核のDNAに対応する。使用したマーカーは405ｎｍで励起されるPOPO-1である。図３４では、赤色に着色された“ハニカム”構造は核隔膜および細胞膜に対応する。使用したマーカーは488ｎｍで励起されるDiAである。画像３５では、２つの画像３３と３４とが重なって見える。細胞膜の中の核が明瞭に区別される。

好ましくは、蛍光画像の収集路は分光路に連結されている。図１の分光計２２は画像の全部又は一部の分光分析を行うのを可能にする。

蛍光信号の時間的・スペクトル的な追跡（監視）は、生物組織の機能的生化学的活動に関する非常に重要な情報を与えることができる。即ち、蛍光画像を形成するために用いる蛍光体は、それらの近接環境に対して非常に敏感である（特に、直近の環境変化に特殊な反応をするか、或いは充分に特定された分子的種に対して特殊な相互作用をする、“インテリジェント”な蛍光体を選択することができる）。それらの蛍光のレベル（強度）およびそれらの蛍光の形態（スペクトル）は、周囲の環境内で起こる変化に応じて変動する。従って、蛍光の強度とスペクトルの経時的な研究は生物学的環境の動力学に関する情報を提供する。この場合、医薬の作用の追跡や、新陳代謝活動の追跡や、或いは更に外的ストレス（pH、温度、酵素活動等の変化）の作用の追跡は、蛍光の分光的時間的分析のお陰で記録することができる。

このような連結の利点は特に蛍光のより精細な分析にある。以下のような複数の分析ケースを想定することができる：
−１画像の蛍光の時間的かつスペクトル的な追跡：このケースでは、分光分析はすべての画像に適用される。それは全体の中における観察された領域のかなり大雑把な最初の分析である；
−１画像のうち興味がある１領域の蛍光の時間的かつスペクトル的な追跡：このケースは、遥かにより興味深いことに、画像の特定の１領域の分析を提示する。従って、いわゆる“興味がある”領域を決定し、次いでこれらの領域の分光分析をするため、蛍光の共焦点画像の予備的な分析をする必要がある。従って、画像による分析と分光分析とを同期させる必要がある；そして、
−１画像の自動蛍光の時間的かつスペクトル的な追跡：この最後のケースは、組織の自動蛍光の分析である。この特殊なケースでは、青色ではレーザを用いる。更に、外来性の蛍光体によって誘引された蛍光は、自動蛍光（これはかなり微弱なものである）の検出を阻害してはならない。自動蛍光は、生きている組織内に存在するフラヴィン、NADH、ポルフィリン、等のような当然に蛍光性の化合物に由来する光束に対応する。

特に第２のケースでは、画像を分析し（収集、処理、興味がある領域の特定）、分光路を興味がある領域の通過に同期させ、最後に、対応するスペクトルを分析する必要がある。この第２のケースにおける連結の実施は２つの変化形に応じて考えられる：即ち、パルスレーザを用いるモードと高速スイッチングを用いるモードである。

図１は、検体を励起して、１画像全体の（又は、興味がある一若しくは複数の領域の）画像とスペクトルを得るために、パルスレーザを使用するケースを示す。パルスレーザを使用することは、高速スイッチングモードにおいて見られるような分光路上への構成要素の追加によって生じる追加的な損失を回避することを可能にする。分離用ガラス１３は拒絶フィルター１１、１２から来る光束の２０％を採取する。採取された光束は次いで分光器２２にそれを供給する光ファイバ２１内に導入される。

このケースでは、従って、興味がある領域だけにレーザを照射し、これらの領域に関連するスペクトルを検出すれば足りる。これは組織の照明に対する簡単な同期であり、演算処理によって簡単に実行することができる。この解決方法は実施するのが最も簡単である。

高速スイッチングモードは、分光器の入口に配置された非常に高速の濾過装置を使用することを推奨する（図４参照）。この場合には、レーザ走査の位置が興味がある領域への通過に非常に短時間対応するときに、分光器に向かって蛍光光束を通過させることができる。理想的には、この装置は各ファイバへ１μｓの時間で切り替えなければならない（１ラインのファイバを１μｓ／ファイバの速度で走査する）。実際には、例えば１つの核（組織のところで５μｍ）の光束を積分し、これは最大限数μｓの積分時間に対応する。図４から分かるように、この分光路の構成要素は以下の通りである：

−画像を形成するために必要な光束を過剰に減少させないため、イメージング路に対する８０％の透過係数と分光路に対する２０％の反射係数を有する分離用ガラス（ビーム・スプリッター）１３；
−走査される各ファイバへ、又は予め定められた興味がある一若しくは複数の領域へ、充分に高速で切り替える装置３１。これは機械式、音響光学式（３１）、ミラー、等々であり得る；
−ビームを光ファイバ内に集束させるための焦点100ｍｍの無色の二枚玉レンズ３０。
−所望の解像度に応じてコア直径が50又は100μｍで、開口係数が０.２２の光ファイバ２１；および、
−以下の特性の分光器２２：第１に、波長範囲200〜1100ｎｍで、感度86フォトン／ショット（2.9×10^−１７Ｗ／ショット）で、信号対ノイズ比が250：１の、例えばリニア型（2048ピクセル）又はマトリックス型ＣＣＤからなる検出器。第２に、600ライン／ｍｍで、効率が30％より大きく、解像度が0.3ｎｍ〜10.0ｎｍで、最後にスリット幅200μｍの、回折格子。

複数の高速スイッチング装置が考えられる：
１）機械的“シャッター”：ここでは、興味がある領域を走査する時にビームを通過させるべく、動力駆動の並進ステージによって運動せられるプレートである。並進ステージは１マイクロメートルの数十分の一の解像度を有しなければならず、ステッピングモータか直流モータによって駆動され、数ミリメートルの走程を有しなければならない。その応答速度は興味がある領域のサイズに依存し、好ましくは非常に大きい。

２）ミラー：他のスイッチング装置は、走査が興味がある領域の外にある時に、“興味がある領域の外”の信号を拒絶するべくビームを偏向させることからなる。このため、分離用ガラスの後に配置され、最小限数ミリラジアンの角度についてマイクロセカンドのオーダーの応答時間を有し、強度の反射率を有する、ミラーを使用する。従って、分光路は最早透過では作用せず、反射で作用する。

３）図４に示した音響光学デフレクタ。この構成に必要な構成要素は：２ｍｍの開口を有するデフレクタ３１内に入るようにビームのサイズを減少させるべく２つの無色の二枚玉レンズで構成された倍率１／３の無焦点系３０。このデフレクタは（可能ならば各ファイバへスイッチングするために）マイクロセカンドより短い応答時間で400〜800ｎｍのスペクトル範囲にわたり作動する。透過損失が余り大きくならないようにするため、かつ、偏向角が数ミリラジアンにならないようにするため、偏向効率は90％であり、静的損失は最小化される（＜10％）。最後に、偏向効率は90％であるので（順位０の方向には常に10％の光束がある）、集束用光学系３２を偏向方向（順位１）に配置する。

構成の全ての場合（“シャッター”方法又はパルスレーザ方法）において、経時的な蛍光ピークの減少、又は、時間と空間における２つの蛍光ピークの比の変化進展を追跡することの可能なコンピュータ・プラグイン（自動）を想定することができる。これらはユーザの必要に応じて作られる技術的モジュールである。
興味がある領域の選択はユーザによって行われるか、自動的に行われる。

勿論、本発明は前記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を加えることができる。遠位端を裸で直接に検体の表面に接触させるようになった数千本の光ファイバからなるガイドを用いて、非共焦点式の高解像度の画像を形成することを想定することができる。この場合には、特に文献WO 2004/008952の教示を本発明に基づいて修正して使用することができる。

図１は本発明の収集装置の模式図である。 図２は所与の１つの蛍光体によって着色された要素（元素）を夫々示す２つの一次画像から本発明に基づいて最終画像を作り上げるところを示す模式図である。 図３は所与の１つの蛍光体によって着色された要素（元素）を夫々示す他の２つの一次画像から本発明に基づいて他の最終画像を作り上げるところを示す模式図である。 図４は音響−光学スイッチの模式図である。

Claims (27)

1. 検体の蛍光の顕微鏡的ファイバ画像を形成する方法であって：
   −少なくとも１本の光ファイバを有する１つの光路を介して励起信号を用いて検体を走査し、
   −前記検体から来る蛍光信号を検出することからなり（励起信号と蛍光信号はこの同一の光路を通る）；
   この方法の特徴は：
   −前記光路を介して、検体に含まれる少なくとも２つの蛍光体を励起し、
   −前記光路を介して、前記少なくとも２つの蛍光体の各々の蛍光信号を検出し、
   −前記少なくとも２つの蛍光体に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げることからなる方法。
2. 前記少なくとも２つの蛍光体を同時に励起することを特徴とする請求項１に基づく方法。
3. 前記少なくとも２つの蛍光体を逐次的に励起することを特徴とする請求項１に基づく方法。
4. 前記少なくとも２つの蛍光体の蛍光信号を同時に検出することを特徴とする請求項２に基づく方法。
5. 前記少なくとも２つの蛍光体の蛍光信号を逐次的に検出することを特徴とする請求項１から３のいづれかに基づく方法。
6. リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査すること、および、ファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
7. 前記最終画像を作り上げるため、先ず検出された蛍光信号と同じくらい多くの一次画像を作り上げ、対応する蛍光体に割り当てられた色に応じて各一次画像を着色し、次いで最終画像を構成するべく前記一次画像を重ね合わせることを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
8. 前記光路を介して検体から来る信号の一部を用いて各画像のスペクトルを更に収集することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
9. 所与の１画像について、前記光路を介して検体から来る信号の一部を用いて興味がある領域のスペクトルを更に収集することを特徴とする請求項１から７のいづれかに基づく方法。
10. 請求項９に基づく方法であって、請求項１から７のいづれかに従い第１段階の画像収集を行い、次いで、得られた画像上で前記興味がある領域を画定することにより、前記スペクトルの収集に先立って、前記興味がある領域を定めることを特徴とする方法。
11. 一画像の興味のある複数領域のみについてスペクトルを収集するため、励起信号が前記興味がある領域を走査する瞬間に対応する所定の瞬間に、検体から来る信号の一部を分光計の方へ指向させるシャッターを使用することを特徴とする請求項９又は１０に基づく方法。
12. 一画像の興味のある一領域のみのスペクトルを収集するため、励起信号を発射するために高周波数でパルスされる少なくとも１つのレーザを使用し、このパルスレーザは前記興味がある領域を走査するためにのみアクティブにされることを特徴とする請求項９から１１のいづれかに基づく方法。
13. 検体（26）の蛍光の顕微鏡的ファイバ画像を形成する装置であって、この装置は：
    −処理ユニット（23、24、25）と、
    −少なくとも、検体内で励起信号を走査する手段（7）と、励起信号を検体に向かって搬送すると共に前記検体から来る蛍光信号を回収するための少なくとも１本の光ファイバを有するイメージガイド（8）、とを有する光路（7、8）、
    とを備え、励起信号と蛍光信号はこの同一の光路を通り、
    特徴は、この装置は更に：
    −前記光路を介して、検体に含まれる少なくとも２つの蛍光体を励起するための励起手段（1、2）と、
    −前記光路を介して、前記少なくとも２つの蛍光体の各々の蛍光信号を検出するための検出手段（15、18）と、
    −前記少なくとも２つの蛍光体に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げるための、前記処理ユニット内の、処理手段（25）、
    とを備えていることからなる装置。
14. 前記励起手段は前記少なくとも２つの蛍光体を同時に励起することの可能なエミッタを有することを特徴とする請求項１３に基づく装置。
15. 前記励起手段は少なくとも２つのエミッタを有し、夫々のエミッタは前記少なくとも２つの蛍光体の１つを励起することを特徴とする請求項１３に基づく装置。
16. 前記少なくとも２つの蛍光体から発射される蛍光信号は、これらの蛍光信号が濾過によって分離されるように互いに充分に離れた波長を有することを特徴とする請求項１５に基づく装置。
17. ２つの励起信号エミッタは夫々488ｎｍおよび635ｎｍで発光する２つのレーザであり、検体内の２つの蛍光体は夫々これら２つの波長に反応することを特徴とする請求項１５又は１６に基づく装置。
18. 前記検出手段は、前記少なくとも２つの蛍光体から発射された蛍光信号の各々を逐次的に通過させるパスバンド調節可能なフィルターのような調節可能な濾過手段に接続されたレシーバを備えていることを特徴とする請求項１３から１７のいづれかに基づく装置。
19. 前記検出手段はセパレータ（14）に接続された少なくとも２つのレシーバを備え、このセパレータは波長に応じて各蛍光信号を所与の１つのレシーバに向かって送るようになっていることを特徴とする請求項１３から１７のいづれかに基づく装置。
20. 前記走査手段はリアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査し、前記検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することを特徴とする請求項１３から１９のいづれかに基づく装置。
21. 前記イメージガイドは数千本の光ファイバからなり、このガイドには前記走査手段が先行すると共に励起信号を検体内に集束するための光学ヘッドが後従することを特徴とする請求項１３から２０のいづれかに基づく装置。
22. 前記イメージガイドは１本の光ファイバからなり、前記走査手段はイメージガイドと検体との間に配置された光学ヘッド内に組み込まれていることを特徴とする請求項１３から２０のいづれかに基づく装置。
23. 前記イメージガイドは数千本の光ファイバからなり、これらの光ファイバの遠位端は裸で検体の表面に直接接触して配置されるようになっていることを特徴とする請求項１３から２０のいづれかに基づく装置。
24. 検体から来る信号の一部に基づいてスペクトルを作り上げることの可能な分光計を更に備えていることを特徴とする請求項１３から２３のいづれかに基づく装置。
25. 前記分光計は、興味がある一領域を励起信号が走査する瞬間に対応する所定の瞬間に検体から来る信号の一部を分光計の方へ指向させるシャッターに接続されていることを特徴とする請求項２４に基づく装置。
26. 一画像の興味のある一領域のみのスペクトルを収集するため、前記励起手段は高周波数でパルスされる少なくとも１つのレーザを備え、このパルスレーザは前記興味がある領域を走査するときにのみアクティブにされることを特徴とする請求項２４に基づく装置。
27. 前記処理ユニットは励起手段とレシーバ手段とを同期させる手段を備えていることを特徴とする請求項１３から２６のいづれかに基づく装置。

Images