JP2014212876A - 腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 腫瘍領域を高精度に判別可能とする腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法を提供する。【解決手段】 励起光を出力する光源１と、被検部Ｐの広領域を構成する各微小領域に対して光源１からの励起光を照射する照射用光学系２Ａと、照射用光学系２Ａから照射される励起光に応答して微小領域から発せられる蛍光を受光する受光用光学系２Ｂと、受光用光学系２Ｂから出射される微小領域からの蛍光を検知する光検知部３と、光検知部３により検知された微小領域の蛍光の強度に基づいて、広領域の蛍光強度分布を生成する蛍光強度分布生成部４とを備える。【選択図】 図１

Description

本発明は、光線力学診断法（Photo Dynamic Diagnosis：ＰＤＤ）に用いて好適な腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法に関する。

悪性腫瘍の外科的治療において、腫瘍組織と正常組織の境界を特定することは、正常組織への影響を最小限に抑えつつ腫瘍を摘出する上で非常に重要である。その中でも悪性脳腫瘍に対する治療手術では、脳の機能を温存しつつより多くの腫瘍を摘出することが患者の予後に大きく影響を与えることが知られている。特に神経膠芽腫（glioblastoma：ＧＢＭ）の５年生存率は７％前後と極めて予後不良とされているが、摘出率の増加に伴い、有意に生存率が高くなることが報告されている。安全により多くの腫瘍を摘出するためには、術中に腫瘍組織と正常脳組織の識別を行うことが非常に重要である。しかし、ＧＢＭに代表される悪性脳腫瘍は正常脳組織の中に浸潤しながら成長するため、腫瘍境界を肉眼で識別することは困難である。

一方、従来から、ＰＤＤについての研究が種々なされている。ＰＤＤは、生体に薬剤を投与して腫瘍を蛍光マーカーでマークし、蛍光マーカーの励起波長領域にある励起光を照射し、蛍光を発する部位を腫瘍と診断する技術である。例えば、腫瘍親和性を有し、光により励起されたときに蛍光を発する光感受性物質を予め生体の腫瘍に吸収させておき、励起光に応答して発せられる蛍光により腫瘍領域を診断する方法がある。

また、近年では、腫瘍組織の同定を目的として、５−ＡＬＡ（5-Amino Levulinic acid）を用いたＰＤＤが注目されている。この方法は、経口投与された５−ＡＬＡが体内に取り込まれた後の代謝の過程で、次の特徴を持つＰｐＩＸ（Protoporphyrin-IX）に変化することを利用したものである。
（１）腫瘍細胞に集中的に蓄積する。
（２）波長４１０ｎｍをピークとする青色光で励起され、波長６３５ｎｍをピークとする赤色蛍光を発する。

これらにより、患者に５−ＡＬＡを投与し、術中に患部に青色光を照射することで赤色発光部を腫瘍として識別することができる。ＰｐＩＸが腫瘍に蓄積されるメカニズムは腫瘍細胞の膜トランスポーターや腫瘍細胞内フェロキラターゼ活性の関与が指摘されているものの未だ詳細には解明されていないが、腫瘍に特異的に蛍光が見られることは多くの臨床研究によって示されている。一方で悪性腫瘍が蛍光陰性を示す例も報告されており、蛍光が見られない場合の判断は難しいのが現状である。

このＰＤＤにおいては、腫瘍から発せられる蛍光を画像撮像装置により撮像し、蛍光画像を用いて腫瘍領域と正常領域を診断可能とする装置が提案されている。この装置は、多くの場合、生体内部に挿入される内視鏡や手術用顕微鏡等に組み込まれて構成される。

下記特許文献１には、被検体に腫瘍検出剤を投与した後に、腫瘍に蓄積されたＰｐＩＸを励起させる励起光を照射し、励起された蛍光を分光検出することにより、正常領域と腫瘍領域とを自動判別する技術が開示されている。

特開２０１０−２４００７８

しかし、従来の内視鏡や手術用顕微鏡等は倍率が低く、発光領域の境界が明確ではないため、腫瘍領域を特定することが困難であった。特に、悪性脳腫瘍の浸潤領域については、正常組織との境界が明確ではないため、腫瘍領域の特定に困難を極めていた。境界の特定は、摘出手術において、どこまでを摘出するかを決定する重要なファクターである。腫瘍を取りきれない場合は再発率が高くなり、逆に正常組織まで摘出すると神経学的障害をきたす危険があるため、腫瘍の同定技術の高精度化が強く望まれている。

本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、腫瘍領域を高精度に判別可能とする腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法を提供することを目的とする。

本願発明者は、腫瘍、特に、悪性脳腫瘍の判別手法について鋭意研究を行った結果、励起光に反応して発せられる蛍光を微小領域の単位で捉え、その微小領域の単位で被検部を走査することで、複数の微小領域の蛍光強度を取得し、その蛍光強度を走査に同期させて配列することで広領域の蛍光強度分布を生成することにより、高精度の蛍光強度分布が得られるという技術思想に至り、本発明を完成させるに至った。

すなわち、上述した目的を達成する本発明にかかる腫瘍領域判別装置は、励起光に応答して被検部から発せられる蛍光の強度に基づいて腫瘍領域を判別する腫瘍領域判別法に用いられる腫瘍領域判別装置であり、励起光を出力する光源と、前記被検部の広領域を構成する各微小領域に対して前記光源からの励起光を照射する照射用光学系と、前記照射用光学系から照射される励起光に応答して前記微小領域から発せられる蛍光を受光する受光用光学系と、前記受光用光学系から出射される前記微小領域からの蛍光を検知する光検知部と、前記光検知部により検知された微小領域の蛍光の強度に基づいて、前記広領域の蛍光強度分布を生成する蛍光強度分布生成部とを備えることを特徴とする。

また、上述した目的を達成する本発明にかかる腫瘍領域判別方法は、励起光に応答して被検部から発せられる蛍光の強度に基づいて腫瘍領域を判別する腫瘍領域判別方法であり、光源から励起光を出力する工程と、前記被検部の広領域を構成する各微小領域に対して前記光源からの励起光を照射用光学系を介して照射する工程と、前記照射用光学系から照射される励起光に応答して前記微小領域から発せられる蛍光を受光用光学系により受光する工程と、前記受光用光学系から出射される前記微小領域からの蛍光を光検知部により検知する工程と、コンピュータが、前記光検知部により検知された微小領域の蛍光の強度に基づいて、前記広領域の蛍光強度分布を生成する工程とを備えることを特徴とする。

このような本発明にかかる腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法は、微小領域の蛍光強度に基づいて広領域の蛍光強度分布を生成することから、高精度の蛍光強度分布を得ることができる。

本発明においては、微小領域の蛍光強度に基づいて広領域の蛍光強度分布を生成することから、高精度の蛍光強度分布を得ることができ、腫瘍領域の判別がミクロなレベルで可能となる。これにより、腫瘍領域を高精度に識別することが可能となる。腫瘍の摘出手術に際しては、正常組織を温存しつつ、より多くの腫瘍を摘出することが可能となり、再発率や生存率に多大な効果を発揮する。とくに、悪性脳腫瘍の浸潤領域については、正常組織との境界の特定が困難であったが、微小領域の蛍光強度が反映された蛍光強度分布により、高精度且つ客観的な境界特定が可能となる。

本発明の実施の形態として示す腫瘍領域判別装置の構成の概略を説明する概略説明図である。 上記実施の形態の腫瘍領域判別装置により生成される広領域の蛍光強度分布の一例を説明する説明図である 本発明の実施の形態として示す腫瘍領域判別方法をフローチャートで説明する説明図である。 赤色部の広領域画像、非赤色部の広領域画像、中間部の広領域画像、ダーク画像について、各蛍光強度に対応するピクセル数の分布をグラフ化した図である。 赤色部の広領域画像、非赤色部の広領域画像、中間部の広領域画像、ダーク画像について、蛍光強度の平均値をグラフ化した図である。 赤色部、中間部、非赤色部、組織の無いダーク領域を含む部位について生成した広領域の蛍光強度分布（撮像画像）を示す図である。 赤色部、中間部、非赤色部、組織の無いダーク領域を含む部位について生成した広領域の蛍光強度分布（蛍光強度を複数段階で表示したマップ）を示す図である。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。

本実施の形態は、励起光に応答して発せられる蛍光の強度に基づいて腫瘍領域を判別する腫瘍領域判別法に用いられる腫瘍領域判別装置であり、被検部をミクロなレベルで診断可能とするものである。本実施の形態では、５−ＡＬＡを用いたＰＤＤに用いて好適な腫瘍領域判別装置を例に説明する。境界の特定が困難な浸潤領域についても、正常組織との境界を高精度且つ客観的に特定可能となることから、特に脳腫瘍の判別に用いることにより、多大な効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態として示す腫瘍領域判別装置１０の概略説明図である。すなわち、腫瘍領域判別装置１０は、励起光を出力する光源１と、被検部Ｐの広領域を構成する各微小領域に対して光源１からの励起光を収束させて照射する照射用光学系２Ａと、照射用光学系２Ａにより照射される励起光に応答して微小領域から発せられる蛍光を受光する受光用光学系２Ｂと、受光用光学系２Ｂから出射される微小領域からの蛍光を検知する光検知部３と、光検知部３により検知した複数の微小領域の蛍光の強度に基づいて、広領域における蛍光強度分布を生成する蛍光強度分布生成部４と、蛍光強度分布生成部４により生成された蛍光強度分布を表示する表示部５とを備える。

なお、これら各部のうち、少なくとも、照射用光学系２Ａと受光用光学系２Ｂは、共焦点光学系、例えば共焦点レーザ走査型顕微鏡（Confocal laser scanning microscopy）２を用いて実現可能である。また、少なくとも、蛍光強度分布生成部５は、例えば、信号処理を行うコンピュータにおけるＣＰＵ（Central Processing Unit）やメモリ等のハードウェアを用いて実行可能なＤＬＬ（Dynamic Link Library）等のプログラムとして実装したり、コンピュータに装着可能な拡張ボードに搭載されたＤＳＰ（Digital Processing Unit）やＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）等の専用プロセッサを用いて実装したりすることができる。また、表示部６は、手術用顕微鏡や内視鏡の画像表示部や液晶表示ディスプレイ等として実現可能である。以下、各部について詳細に説明する。

光源１は、被検部Ｐに励起光を照射可能なものであれば、どのようなものでも良く、本実施の形態においては、励起光として青色レーザ光を照射可能なレーザユニットである。レーザ光の波長は可変であり、適宜調整されて使用される。

照射用光学系２Ａと受光用光学系２Ｂは、共焦点レーザ走査型顕微鏡２により実現されている。共焦点レーザ走査型顕微鏡２は、共焦点スキャナユニット２１と対物レンズ２２を備える。共焦点スキャナユニット２１は、マイクロレンズアレイディスク２１ａとピンホールアレイディスク２１ｂとビームスプリッタ２１ｃとフィルタ２１ｄとを備える。

マイクロレンズアレイディスク２１ａは複数のマイクロレンズが配列するディスクであり、光源１から受光した励起光を、複数のマイクロレンズを介して空間的に分岐させ、複数の光束（以下、励起光束と言う。）とするとともに、各励起光束を収光させる機能を備える。

ピンホールアレイディスク２１ｂは、マイクロレンズアレイディスク２１ａの複数のマイクロレンズと対応する複数のピンホールが配列したディスクであり、マイクロレンズアレイディスク２１ａに対向配置される。このピンホールアレイディスク２１ｂは、マイクロレンズアレイディスク２１ａから出射される複数の励起光束のみを、各ピンホールを介して通過させ、又、対物レンズ２２から出射される複数の蛍光の光束（以下、蛍光束という。）のみを、各ピンホールを介して通過させる機能を備える。

ビームスプリッタ２１ｃは、マイクロレンズアレイディスク２１ａとピンホールアレイディスク２１ｂとの間に配置される。このビームスプリッタ２１ｃは、マイクロレンズアレイディスク２１ａから入射した複数の励起光束を透過させ、対物レンズ２２から入射した蛍光のうち所定範囲の波長の蛍光を反射して光検知部３に誘導する機能を備える。本実施の形態では、分光特性を持つ平板ミラーからなるダイクロイックミラーを用いている。

対物レンズ２２は、共焦点スキャナユニット２１から入射した励起光束の各々を空間的に分岐したままの状態を維持しつつ集光して被検部Ｐに照射し、又、被検部Ｐから発せられて入射した複数の蛍光束をピンホールアレイディスク２１ｂの各ピンホールに誘導する機能を備える。

フィルタ２１ｄは、所定範囲の波長のみを通過させるバンドパスフィルタであり、ビームスプリッタ２１ｃから入射する蛍光束について、励起光により励起された蛍光のみを通過させる機能を備える。本実施の形態では、赤色蛍光のみが通過することとなる。

すなわち、照射用光学系２Ａは、マイクロレンズアレイディスク２１ａ、ピンホールアレイディスク２１ｂ、対物レンズ２２により実現されており、受光用光学系２Ｂは、対物レンズ２２、ピンホールアレイディスク２１ｂ、ビームスプリッタ２１ｃ、フィルタ２１ｄにより実現されている。

なお、励起光が十分に明るい場合は、マイクロレンズアレイディスク２１ａは省略されても良い。また、ビームスプリッタ２１ｃは、ダイクロイックミラーに限られず、分離することのできる任意の手段を用いることができる。

光検知部３は、ＣＣＤカメラ等により実現可能であり、共焦点レーザ走査型顕微鏡２から入射した複数の蛍光束を検知する光検出素子を備える。複数の蛍光束は、光検出素子に入射して結像される。光検知部３の光検出素子は、光電子倍増管などのポイントセンサであり、受光した光強度を電気信号に変換し、蛍光強度分布生成部４に送出する。

すなわち、マイクロアレイディスク２１ａのマイクロレンズと、ピンホールアレイディスク２１ｂのピンホールと、被検部Ｐの被観察面における焦点と、光検知部３の受光面の焦点とが互に光学的に共役関係となるように各要素が配置されている。これにより、光源１からの励起光は、複数の励起光束として被検部Ｐの微小領域に焦点を結び、その微小領域から発せられる複数の蛍光束は光検知部３の受光面に焦点を結ぶこととなる。励起光の照射はサーボ機構により自動制御されており、これにより光検知部３では微小領域の全体の画像が得られる。

ここで、共焦点レーザ走査型顕微鏡２と被検部Ｐは、相対的に移動可能となっている。相対移動は、共焦点レーザ走査型顕微鏡２又は被検部ＰをＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に移動させる駆動装置で実現可能である。これにより、励起光束の個々の焦点が被検部Ｐの被観察面を走査し、これに伴って、被検部Ｐから発せられる蛍光束の個々の焦点が光検知部３の光検出素子上を走査することとなる。Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸における座標値は、駆動装置から蛍光強度分布生成部４に送出され、被観察面における焦点位置の特定に利用される。なお、本実施の形態では、共焦点レーザ走査型顕微鏡２を三次元方向に駆動する駆動装置６を備え、座標値が蛍光強度分布生成部４に送出される。また、三次元方向の移動距離、移動方向及び移動速度は、内蔵されるマイクロコンピュータ若しくは別体のパーソナルコンピュータ等により自動制御可能となっている。また、光検知部３は、共焦点レーザ走査型顕微鏡２の移動に連動して移動する構成となっており、本実施の形態では光検知部３と共焦点レーザ走査型顕微鏡２とが連結部７により物理的に連結固定されている。

蛍光強度分布生成部４は、既存の画像取得用ソフトウェアや数値解析用ソフトウェアや表計算用ソフトウェアや画像処理ソフトウェア、又はそれらと同等の機能を有するハードウェアにより実現することができる。

蛍光強度分布は、撮影画像であるか、又は、蛍光強度をレベル分けして示すマップとして生成される。いずれにするかは、必要に応じて操作者等により適宜選択可能となっている。撮影画像が選択された場合、蛍光強度分布生成部４は、光検知部３から受信した各微小領域の蛍光強度を示す電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタルデータにする。そして、駆動装置６から受信した座標値を利用し、蛍光強度を示すデジタルデータを走査に同期して２次元に配置する。これにより、広領域の撮影画像が生成される。図２は、腫瘍領域判別装置１０により生成される広領域の蛍光強度分布Ｒ（撮影画像）の一例を説明する説明図である。本実施の形態では、走査するごとに静止画像を撮影することで連続的に複数の微小領域の蛍光強度画像ｒを取得し、その蛍光強度画像ｒを配列して広領域の蛍光強度画像Ｒを合成している。

蛍光強度分布としてマップが選択された場合、蛍光強度分布生成部４は、上記撮影画像が選択された場合と同様に広領域の蛍光強度画像Ｒを生成し、その後に、その広領域の蛍光強度画像を画像処理ソフトウェア等により解析処理し、蛍光強度が複数段階にレベル分けされたマップを生成する。レベルは、予め記憶領域に記憶されていても良いし、任意に設定可能としても良い。また、所定の蛍光強度の値を閾値として、閾値以上の蛍光強度の領域を腫瘍領域とし、その他の領域を正常領域として示すマップとしても良い。

表示部５は、蛍光強度分布を表示する機能を備えるものである。腫瘍領域判別装置１０が、摘出手術において患者の腫瘍を特定するために使用される場合は、手術用顕微鏡若しくは内視鏡と併用することが好ましい。すなわち、表示部５として手術用顕微鏡若しくは内視鏡の画像表示部を利用し、生成された蛍光強度分布を手術用顕微鏡若しくは内視鏡の画像表示部に出力する。このとき、手術用顕微鏡若しくは内視鏡により得られる画像に、蛍光強度分布を重畳させ、いずれの画像も認識可能となるように蛍光強度分布を半透明化する等して表示することが好ましい。

以下、腫瘍領域判別装置１０を用いた腫瘍領域判別方法について説明する。図３は、腫瘍領域判別方法を説明するフローチャートである。（ステップＳ１）被検部Ｐを所定位置に配置し、光源１から励起光を出力する。

（ステップＳ２）光源１からの励起光を照射用光学系２Ａを介して被検部Ｐの微小領域に照射する。励起光は、マイクロレンズアレイディスク２１ａにより複数の励起光束に分岐・収光され、ビームスプリッタ２１ｃを透過して、ピンホールアレイディスク２１ｂのピンホールを通過する。ピンホールを通過した複数の励起光束は、対物レンズ２２に入射し、被検部Ｐの被観察面に焦点を結ぶ。ピンホールと被検部Ｐの焦点とは共役関係にあり、微小領域に複数の励起光束が照射されることとなる。微小領域からは、各励起光束に応答して蛍光が発せられる。

（ステップＳ３）微小領域から発せられた蛍光は受光用光学系２Ｂにより受光する。蛍光は複数の蛍光束として対物レンズ２２に入射し、ピンホールアレイディスク２１ｂの各ピンホールに誘導される。複数のピンホールから出射した各蛍光束は、ビームスプリッタ２１ｃにより必要な蛍光（本実施の形態では赤色蛍光）のみが反射され、フィルタ２１ｄにより所定範囲の波長の蛍光のみがフィルタリングされて、光検知部３に誘導される。なお、共焦点レーザ走査型顕微鏡２は、サーボ制御により複数の蛍光束の焦点が微小領域内を走査するように制御し、微小領域全体の蛍光画像を合成して光検知部３に出力する。

（ステップＳ４）光検知部３は、受光用光学系２Ｂから出射される蛍光の強度を検知し、電気信号に変換して蛍光強度分布生成部４に送出する。

このとき、駆動装置６により共焦点レーザ走査型顕微鏡２と被検部Ｐとを三次元方向に相対移動させる。また、共焦点レーザ走査型顕微鏡２に連動して光検知部３も移動する。これにより、励起光束の個々の焦点が被検部Ｐの被観察面を走査し、これに伴って、被検部Ｐから発せられる複数の蛍光束が光検知部３の光検出素子上を走査することとなる。

（ステップＳ５）蛍光強度分布生成部４は、各微小領域の蛍光強度示す電気信号を受信すると、それをデジタルデータに変換し、共焦点レーザ走査型顕微鏡２と被検部Ｐの相対移動による走査に同期して２次元に配置する。これにより、微小領域の蛍光強度に基づく、広領域における蛍光強度分布が生成される。

ここで、蛍光強度分布として撮像画像が選択された場合は、蛍光強度分布生成部４は、各微小領域の蛍光画像を撮影し、それを合成することで広領域の撮影画像を生成する。また、蛍光強度分布として蛍光強度が複数段階にレベル分けされたマップが選択された場合は、広領域の撮影画像を生成した後に、数値解析用ソフトウェアや画像解析ソフトウェア等を使用して蛍光強度を複数段階にレベル分けしたマップを生成する。

（ステップＳ６）生成した蛍光強度分布を表示部５に出力する。表示部５が手術用顕微鏡や内視鏡の画像表示部である場合は、手術用顕微鏡や内視鏡の画像に重畳して蛍光強度分布が表示される。

生成された蛍光強度分布は、微小領域から発せられる蛍光の光強度に基づいて生成されているため、腫瘍領域の判別がミクロなレベルで可能となる。特に、手術用顕微鏡や内視鏡と接続し、腫瘍の摘出手術において使用することにより、正常組織を温存しつつ、より多くの腫瘍を摘出することが可能となり、多大な効果を発揮する。

以下、このような腫瘍領域判別装置を発明するに至った本願発明者による実験内容及びその実験結果を示しながら、腫瘍領域判別装置の詳細及びその有効性について説明する。

本願発明者は、５−ＡＬＡ蛍光ガイド下手術を施行した１０例の膠芽腫において、手術顕微鏡下で強い赤色発光を確認し腫瘍組織であると判断した部分（以下、赤色部と言う。）、発光は確認できず周囲の正常脳に近い組織であると判断した部分（以下、非赤色部と言う。）、及び、その中間の組織であると判断した部分（以下、中間部と言う。）を取り分けた。それから、速やかにスライス幅５μｍの凍結薄切標本を作製した。作製した各標本をスライドガラスに載せて観察用試料を作製した。なお、同部位の組織所見は連続凍結切片のＨ＆Ｅ染色で確認された。

（装置の構成）
以下に本実験に使用した腫瘍領域判別装置の具体的な構成を説明する。照射用光学系２Ａ及び受光用光学系２Ｂには、顕微鏡本体（商品名：ＯＬＹＭＰＵＳ／ＢＸ６０Ｆ）に共焦点スキャナユニットと対物レンズを備える共焦点光学系、具体的には共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いた。光源は、青色固体レーザユニット（商品名：昭和オプトロニクス／Ｄ４０５Ｃ―５０、光出力５０ｍＷ）を使用した。なお、共焦点レーザ走査型顕微鏡の共焦点スキャナユニット（商品名：横河電機／ＣＳＵ２２Ｚ）は、ニボウディスクを用いた多焦点式のものであり、対物レンズ（商品名：ＯＬＹＭＰＵＳ／ＵＰＬＳＡＰＯ４０Ｘ２、ｘ４０、ＰｌａｎＡｐｏ、ＮＡ０．９５）は４０倍のものを用いた。ダイクロイックミラーは波長５８０ｎｍ以上の光を反射するものを用い、波長６１０から６８０nmの光のみを通過させるバンドパスフィルタを用いることで赤色蛍光のみを通過させた。光検知部にはＣＣＤカメラ（商品名：ＡＮＤＯＲ／ＬｕｃａＳ６５８Ｍ）を使用した。

腫瘍領域判別装置は、本実験に適する構成とするため、スライドガラスを載置する載置台を三次元方向に駆動する駆動装置により走査可能とした。

パーソナルコンピュータに画像取得用のソフトウェア（商品名：ANDOR/IQおよび商品名：Solis）、数値計算用のソフトウェア（商品名：MATLAB）及び表計算用のソフトウェア（商品名：Excel）等をインストールし、画像取得用ソフトウェアによりＣＣＤカメラの観察画像を取得し、取得した観察画像を上記各計算用ソフトウェアで解析処理した。

（実験１）
作製した各観察用試料を駆動ステージに配置して、蛍光観察を行った。波長４０５ｎｍのレーザ光を励起光として共焦点レーザ走査型顕微鏡内に照射し、組織から発する波長６１０から６８０ｎｍの赤色蛍光のみを観察した。観察は、対物レンズとＣＣＤカメラの光検出素子の解像度との組み合わせにおいて、横１６４μｍ×縦１２４μｍの視野で行った。

各観察用試料について、三次元方向に試料を走査しながら１０行２０列の２００枚の観察画像（微小領域の画像）を取得し、観察画像を合成して約横３．２ｍｍ×縦１．２ｍｍの広領域画像を生成した。広領域画像では、ＣＣＤカメラが捉えた光に応じたグレイカラーが表示されており、光が強いほど白色で、弱いほど黒色で表される。

各観察画像が１ピクセル毎に持つ蛍光強度の数値を元に、赤色部の広領域画像、非赤色部の広領域画像、中間部の広領域画像、ダーク画像について、各蛍光強度に対応するピクセル数の分布を求めた。なお、ダーク画像は、レーザの照射を止めて、試料を置かず何も観察していない状態で撮影した画像であり、一定のオフセット値にノイズ成分が加わったものである。その結果を示すグラフを図４に示す。縦軸はピクセル数、横軸は蛍光強度を示す。また、ａは赤色部の広領域画像のデータ、bは非赤色部の広領域画像のデータ、cは中間部の広領域画像のデータ、dはダーク画像のデータを示す。赤色部ａは分布にばらつきはあるが、非赤色部ｂよりも蛍光強度が大きい分布傾向を示している。非赤色部ｂは、ダーク画像ｄよりも蛍光強度が大きい分布傾向を示している。中間部dは赤色部ａと非赤色部ｂとの間にピークが位置している。すなわち、各部は蛍光強度ごとのピクセル数の分布に有意な差が見られることがわかる。

つぎに、赤色部の広領域画像、非赤色部の広領域画像、中間部の広領域画像、ダーク画像について、蛍光強度の平均値を求めた。その結果を示すグラフを図５に示す。縦軸は蛍光強度の平均値である。ダーク画像、非赤色部、中間部、赤色部の順に、蛍光強度の平均値が大きくなっており、有意な差が見られることがわかった。

また、広領域画像を構成する２００枚の観察画像の取得にかかる時間を測定した。その結果、約９０秒であった。また、平均蛍光強度を求める画像解析に要する時間は約８分であった。これは、術中の使用においても問題のない時間であり、臨床上の有用性も高いことがわかった。なお、この時間は駆動ステージの駆動スピードが律速となっている。

（実験２）
赤色部、中間部、非赤色部、組織の無いダーク領域を含む部位の観察試料を作製し、蛍光強度分布を生成した。観察試料の作製、及び、広領域画像の取得については、上記と同様である。図６は、蛍光強度分布として生成した撮影画像の一例を示す図である。図６中の太線で囲んだ領域rは、微小領域から得られた撮影画像である。なお、太線は説明の便宜のため記載しただけであり、実際には存在しない。本実験では、微小領域rの撮影画像を１０行２０列で配列することで広領域の撮影画像を生成している。これにより、高精度の撮影画像が得られることがわかる。

また、広領域画像から蛍光強度を複数段階で表示したマップを生成した。図７は、そのマップを示す図である。マップは、蛍光強度５００〜６００Ａ．Ｕ．までを１０Ａ．Ｕ．単位で区分し、広領域画像の蛍光強度を各区分で表示した。なお、マップは、ピクセル毎に各区分で表示しても良いが、本実験においては、赤色部の広領域画像、非赤色部の広領域画像、中間部の広領域画像、ダーク画像の各画像の蛍光強度の平均値をマップの各格子点の値とし、マップにおける最低点から最高点までを複数の区分に分けて、同一区分の領域に色をつけて、等高領域マップとして示している。これにより、各領域が異なる色で表示されることとなり、蛍光強度の分布が視覚的に把握しやすくなる。とくに、腫瘍の摘出手術において、摘出する領域と温存する領域の境界の特定を高精度且つ客観的に行えることとなる。

実験１での結果に基づき判断すると、蛍光強度５００−５１０の範囲は組織の無いダーク領域であり、蛍光強度５１０−５２０の範囲は正常組織であり、蛍光強度５２０−６００の範囲は腫瘍組織若しくは浸潤領域であると判断できる。したがって、腫瘍の摘出に際しては、マップに示される蛍光強度５２０−６００の領域を摘出することで、正常組織を温存しつつ、腫瘍を確実に摘出することが可能となることがわかる。

すなわち、本発明の腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法によれば、蛍光強度の定量化により腫瘍領域及び浸潤領域を高精度に診断することが可能となる。蛍光強度分布として上記マップを用いることにより、境界の特定も容易となる。とくに、浸潤領域と正常組織との境界の特定が高精度且つ客観的に行えることから、悪性グリオーマにおける術中浸潤領域診断に極めて有用であるといえる。

なお、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではない。

例えば、上述した実施の形態では、照射用光学系と受光用光学系として、両方の機能を果たす共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いたが、各々独立した光学系を用いても良い。また、共焦点レーザ走査型顕微鏡に限定されるものではなく、微小領域から発せられる蛍光の強度が得られる光学系であれば、どのようなものでも良い。

また、光検知部３は、共焦点レーザ走査型顕微鏡２からの蛍光束を検知できるものであれば良く、ＣＣＤカメラに限定されるものではない。また、光検知部３と共焦点レーザ走査型顕微鏡２の連動も上記構成に限定されるものではない。例えば、光検知部３を共焦点レーザ走査型顕微鏡２に内蔵して一体的に構成しても良いし、共焦点レーザ走査型顕微鏡２と別体として構成し、駆動装置６と接続して制御することで、共焦点レーザ走査型顕微鏡２の移動に連動させても良い。

また、蛍光強度分布は、上述した撮影画像やマップに限られるものではなく、例えば、蛍光強度を色分けしてピクセル毎に二次元空間にプロットしたり、所定の蛍光強度を閾値として、閾値以上の領域を腫瘍として表示したりしても良い。この場合、閾値は予めコンピュータの記憶領域に記憶されていても良いし、所望の閾値を自由に設定可能としても良い。

また、走査用の駆動装置としては、判別対象がプレパラート上の試料である場合、試料を二次元方向に移動させる機構としても良い。また、この場合は、表示部をパーソナルコンピュータに接続される液晶表示パネル等にすることが好ましい。

また、本発明の腫瘍領域判別装置及び腫瘍領域判別方法は、５−ＡＬＡを用いたＰＤＤだけでなく、その他のＰＤＤにも適用可能である。また、脳腫瘍以外の腫瘍の判別にも適用可能である。

このように、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更が可能であることはいうまでもない。

１ 光源
２ 共焦点レーザ走査型顕微鏡
２Ａ 照射用光学系
２Ｂ 受光用光学系
２１ 共焦点スキャナユニット
２１ａ マイクロレンズアレイディスク
２１ｂ ピンホールアレイディスク
２１ｃ ビームスプリッタ
２１ｄ フィルタ
２２ 対物レンズ
３ 光検知部
４ 蛍光強度分布生成部
５ 表示部
６ 駆動装置
７ 連結部

Claims (5)

1. 励起光に応答して被検部から発せられる蛍光の強度に基づいて腫瘍領域を判別する腫瘍領域判別法に用いられる腫瘍領域判別装置であり、
   励起光を出力する光源と、
   前記被検部の広領域を構成する各微小領域に対して前記光源からの励起光を照射する照射用光学系と、
   前記照射用光学系から照射される励起光に応答して前記微小領域から発せられる蛍光を受光する受光用光学系と、
   前記受光用光学系から出射される前記微小領域からの蛍光を検知する光検知部と、
   前記光検知部により検知された微小領域の蛍光の強度に基づいて、前記広領域の蛍光強度分布を生成する蛍光強度分布生成部とを備えることを特徴とする腫瘍領域判別装置。
2. 前記蛍光強度分布生成部は、前記蛍光強度分布として、前記広領域を構成する各微小領域の蛍光強度を撮影した撮影画像を取得し、当該各微小領域の撮影画像を合成して前記広領域の蛍光強度画像を生成することを特徴とする請求項１記載の腫瘍領域判別装置。
3. 前記蛍光強度分布生成部は、前記蛍光強度分布として、前記広領域について蛍光強度を複数段階にレベル分けして示したマップを生成することを特徴とする請求項１記載の腫瘍領域判別装置。
4. 前記照射用光学系及び前記受光用光学系は、共焦点光学系であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の腫瘍領域判別装置。
5. 励起光に応答して被検部から発せられる蛍光の強度に基づいて腫瘍領域を判別する腫瘍領域判別方法であり、
   光源から励起光を出力する工程と、
   前記被検部の広領域を構成する各微小領域に対して前記光源からの励起光を照射用光学系を介して照射する工程と、
   前記照射用光学系から照射される励起光に応答して前記微小領域から発せられる蛍光を受光用光学系により受光する工程と、
   前記受光用光学系から出射される前記微小領域からの蛍光を光検知部により検知する工程と、
   コンピュータが、前記光検知部により検知された微小領域の蛍光の強度に基づいて、前記広領域の蛍光強度分布を生成する工程とを備えることを特徴とする腫瘍領域判別方法。