JP2005195485A - 共焦点顕微分光装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 良好な分光検出を行なうことができる小型で安価な共焦点顕微分光装置を提供する。
【解決手段】 ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄより５ｎｍステップで波長の異なる単色のレーザ光を順に発生し、これらを励起光として蛍光標本Ｓに照射させて、それぞれの蛍光を共焦点検出部１３で検出する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡などに用いられる共焦点顕微分光装置に関するものである。

レーザ光源からのレーザ光を走査して試料に照射し、試料から発せられる蛍光や反射光などの光を検出するものとしてレーザ走査型顕微鏡が知られている。

また、レーザ走査型顕微鏡のうち、レーザ走査型共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ）については、最近の蛍光試薬の発展にともない高機能化が進んできている。例えば、標本からの蛍光を検出する方法として、これまでのフィルタを用いて所望する波長域の蛍光を検出する方法に加え、標本からの蛍光を回折格子などを用いて蛍光スペクトルに分光し、この蛍光スペクトルを複数の検出チャンネルを有する検出器により検出する方法が実用化されている。このように蛍光分光検出方法によれば、蛍光試薬ごとの固有の蛍光スペクトルを、詳細に分析・定量化できるようになる。

特許文献１は、このような蛍光分光検出方法を開示したもので、レーザ光源からののレーザ光によって標本の染色に用いられる蛍光試薬を励起し、この励起された蛍光試薬が発する蛍光を回折格子を用いて蛍光スペクトルに分光し、この蛍光スペクトルを複数の検出チャンネルを有するマルチチャンネル検出器により波長ごとのスペクトル強度を検出するようにしている。この場合、レーザ光源には、波長の異なる単色性の高いレーザ光を発生する複数のレーザ光源が用いられ、これらレーザ光源を蛍光試薬の励起波長に対応させて使用するようにしている。
米国特許２００２／００２０８１９号明細書

ところが、特許文献１に開示される方法は、単色性の高いレーザ光により蛍光試薬より発する蛍光を回折格子で蛍光スペクトルに分光し、マルチチャンネル検出器により波長ごとのスペクトル強度を検出するようにしているため、これら分光検出のために回折格子やマルチチャンネル検出器などの特別な構成が必要になる。また、蛍光試薬が発する蛍光の強度が十分であれば、問題ないが、仮に、蛍光が微弱なものだと、回折格子で分光される蛍光スペクトルが、さらに微弱なものになってしまい、マルチチャンネル検出器上で光量不足となり、検出不能に陥るおそれがあった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、良好な分光検出を行なうことができる小型で安価な共焦点顕微分光装置を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、半導体プロセスにより同一チップ上に形成された波長がわずかに異なる２つ以上の半導体光源を有し所定の波長領域をカバーする励起光源と、前記半導体光源のオンオフを制御する半導体光源制御手段と、前記励起光源からの光を標本上で走査する走査手段と前記標本から発せられる光を検出する共焦点検出手段を有する顕微鏡本体とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記励起光源は、前記半導体光源を同一チップ上にアレイ状に配置し、前記半導体光源から発せられる光を結合するカプラとともに同一基板上に配置されユニット化されたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記励起光源は、２つ以上設けられ、２以上の波長領域をカバーすることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記励起光源がカバーする前記波長領域が、５０ｎｍ以下であることを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項４記載の発明において、前記２つ以上の半導体光源が持つ波長差が前記５０ｎｍ以下の波長領域の範囲において１ｎｍ以上であることを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記半導体光源は、半導体プロセスによって製作された半導体レーザもしくは発光ダイオードであることを特徴としている。

請求項７記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記励起光源からの光を前記顕微鏡本体に伝送する光ファイバを有し、該光ファイバがシングルモードファイバであることを特徴としている。

請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明において、前記光ファイバは、偏光面保存型のファイバであることを特徴としている。

本発明によれば、波長のわずかに異なる複数の半導体光源より単色の光を順に発生し、これらを励起光として走査手段により標本に照射し、標本より発せられる、それぞれの蛍光を共焦点検出手段により検出することで、励起波長に応じた励起波長分解能で分光検出を行なうことができるので、明るく、ＳＮのよい蛍光を取得でき、精度の高い良好な分光検出を実現できる。

また、本発明によれば、複数の半導体光源は、半導体プロセスによって同一のチップ上に形成され、一体化構成となっているので、安定な動作と性能を持たせることができる。また、これら半導体光源を一体構成とすることで取り扱いが簡単となり、価格的にも安価にできる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかるレーザ走査型共焦点顕微鏡に適用される共焦点顕微分光装置の概略構成を示している。

図１において、１は光源手段としてのレーザ光源部で、このレーザ光源部１には、励起光源２が設けられている。この励起光源２は、半導体光源として波長がわずかに異なるレーザ光を発生するＬＤ（レーザダイオード）光源２ａ、２ｂ、２ｃを有している。これらＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄは、それぞれＬＤの組成成分の配分を微小に異ならすことで、例えば５ｎｍステップで波長の異なる単色のレーザ光（４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍ）を発するもので、半導体プロセスによって同一のチップ２ｅ上にアレイ状に形成されている。

これらＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄのレーザ出射光路上には、カプラ３が配置されている。このカプラ３は、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄより発せられるレーザ光を結合して一つのビームとして出力するようになっている。

この場合、励起光源２とカプラ３は、同じ基板４上に配置され、レーザ光源部１としてユニット化されている。

ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄには、それぞれ半導体光源制御手段としてのＬＤ駆動部５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄが接続されている。ＬＤ駆動部５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄは、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを各別にオンオフ制御するためのものである。これらＬＤ駆動部５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄには、制御部６が接続されている。制御部６は、ＬＤ駆動部５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄに対し、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを独立して、また、同期してオンオフ制御させるように指示するようになっている。

カプラ３から発せられる光の光路には、光ファイバ７の光入射端７ａが配置されている。この光ファイバ７は、カプラ３からの光を伝送するためのもので、ここでは、偏光面保存型のシングルモードファイバが用いられている。なお、光ファイバ７は、後述する顕微鏡本体８の光学系に合わせて、マルチモードファイバなどの異なるファイバを用いてもかまわない。

光ファイバ７の光出射端７ｂには、レーザ走査型共焦点顕微鏡を構成する顕微鏡本体８が接続されている。この顕微鏡本体８は、光ファイバ７の光出射端７ｂから発せられた光の光路にダイクロイックミラー９が配置されている。このダイクロイックミラー９は、後述する蛍光標本Ｓを励起するに必要な帯域の波長光を反射し、蛍光標本Ｓから発せられる蛍光を透過させるような特性を有している。

ダイクロイックミラー９の反射光路には、走査手段としてのレーザ走査光学系１０が配置されている。レーザ走査光学系１０は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー（不図示）を有し、これらのミラーによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

レーザ走査光学系１０で２次元走査されたレーザ光の光路上には、対物レンズ１１が配置されている。対物レンズ１１は、ステージ１２上方に、蛍光試薬により染色された蛍光標本Ｓに近接して配置されており、不図示のレボルバーの操作によって選択的に光路上に位置されるようになっている。

これにより、レーザ走査光学系１０で２次元走査されたレーザ光は、対物レンズ１１を介して蛍光標本Ｓの焦点位置に結像され、蛍光標本Ｓから発生された蛍光は、レーザ光と逆の光路をたどって対物レンズ１１、レーザ走査光学系１０を介してダイクロイックミラー９まで戻るようになっている。

一方、ダイクロイックミラー９を透過した蛍光の光路には、共焦点検出手段としての共焦点検出部１３が配置されている。共焦点検出部１３は、バリアフィルタ１４、共焦点レンズ１５、共焦点ピンホール１６、光検出器１７を有している。バリアフィルタ１４は、励起光をカットして検出したい蛍光成分のみ抽出するものである。共焦点ピンホール１６は、対物レンズ１１の焦点と光学的に共役な位置に配置され、蛍光標本Ｓからの蛍光のうち合焦の成分を通過し、非合焦の成分を遮断して高い空間分解能を与えるためのものである。光検出器１７は、共焦点ピンホール１６を透過した、焦点のあっている蛍光の成分を受光し、光電変換により電気信号に変換するもので、例えばフォトマルチプライアが用いられている。

次に、このような第１の実施の形態の作用を説明する。

図２は、蛍光標本Ｓの染色に用いられる蛍光試薬の分光特性を示すもので、励起プロファイル１８と蛍光プロファイル１９から構成されている。また、レーザ光源部１に用いられるＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄは、それぞれ発生するレーザ光の波長領域（４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍ）が、図２に示す励起プロファイル１８の領域をカバーしているものとする。

この状態で、制御部６によりＬＤ駆動部５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄに指示を出して、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを順にオンオフしていく。

まず、ＬＤ光源２ａをオンすると、ＬＤ光源２ａからの波長領域４３０ｎｍのレーザ光は、カプラ３から光ファイバ７を介してダイクロイックミラー９に入射し、ダイクロイックミラー９で反射してレーザ走査光学系１０に入射する。レーザ走査光学系１０で２次元走査されたレーザ光は、対物レンズ１１を介して蛍光標本Ｓの焦点位置に励起光として結像される。蛍光標本Ｓは、入射したレーザ光により蛍光プロファイル１９（図２参照）の領域の蛍光を発生する。この蛍光は、対物レンズ１１、レーザ走査光学系１０を介してダイクロイックミラー９まで戻り、蛍光である長い波長が透過し、共焦点検出部１３のバリアフィルタ１４、共焦点レンズ１５を介して共焦点ピンホール１６に収束される。

共焦点ピンホール１６は、対物レンズ１１の焦点と光学的に共役である。これにより、蛍光標本Ｓからの蛍光のうち合焦の成分のみが共焦点ピンホール１６を通過し、光検出器１７で受光され、光電変換されて電気信号として出力される。

以下、続けて順にオンオフされるＬＤ光源２ｂ、２ｃ、２ｄからのレーザ光についても同様で、それぞれの波長領域４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍのレーザ光により励起された蛍光プロファイル１９（図２参照）の領域の蛍光は、共焦点ピンホール１６を通過して光検出器１７で受光され、光電変換されて電気信号として出力される。

このようにして、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄより５ｎｍステップで波長の異なる単色のレーザ光を順に発生し、これらを励起光として蛍光標本Ｓに照射させて、それぞれの蛍光を共焦点検出部１３で検出するようにすると、５ｎｍの励起波長分解能で分光検出を行なうことができる。つまり、蛍光標本Ｓに用いられる蛍光試薬は、励起プロファイル１８の領域の励起光により蛍光プロファイル１９の領域の蛍光を発生するので、励起プロファイル１８の領域をカバーする波長領域４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍのレーザ光を励起光として順に切り換えて与えることで、蛍光プロファイル１９の領域の蛍光から、従来の蛍光標本が発する蛍光を蛍光スペクトルに分光して検出するのと等価の蛍光分光の結果が得られることになる。

これにより、従来の分光検出のための回折格子やマルチチャンネル検出器などの特別な構成を用いる必要がなく、レーザ走査型共焦点顕微鏡に用いられる共焦点検出部１３をそのまま使用することができる。また、蛍光試薬が発する蛍光の強度が微弱な場合であっても、従来のように蛍光をスペクトルに分光して検出するのでなく、共焦点検出部１３では、蛍光スペクトルに対して最適化されたフィルタ１４を用いて検出することができるため、明るく、ＳＮのよい蛍光を取得でき、精度の高い良好な分光検出を行なうことができる。

また、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを順次オンオフすることによって、励起光の波長を可変するようにしているが、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ自身、高速なオンオフ制御が可能なので、励起波長分解能の高い分光検出を行なうことができる。

さらに、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄは、半導体プロセスによって同一のチップ２ｅ上にアレイ状に形成され、一体化構成になっているので、安定な動作と性能を持たせることができる。また、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを一体構成とすることで取り扱いが簡単となり、光ファイバ７などとの接続も容易にでき、さらに価格的にも安価にできる。

さらに、光ファイバ７としてシングルモードファイバを用いたので、理想的な点光源として顕微鏡本体８、つまりレーザ走査型共焦点顕微鏡上で扱うことができ、市販されているシステムとハードウェア上での互換性を持たせることもできる。また、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄは偏光特性をもつため、光ファイバ７が偏光面保存型のものであれば更によく、このような光ファイバ７を用いてＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄの偏光方向と一致させることによって、より高効率なカップリングを行なうことができる。

なお、上述した実施の形態では、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄによる励起光源のカバーする波長領域は５ｎｍステップで２０ｎｍの例を述べたが、５０ｎｍ以下とするのがよい。これには、ＬＤの一つの組成成分の配分を換えることによって、５０ｎｍ以下の範囲で発振波長にバリエーションを持たせることができる。５０ｎｍ以下とすると、励起光源自体が大型化せず、異なる波長領域をもつ別な励起光源との組合せも容易にできる。また、大きく離れた波長領域をカバーしたい場合は、５０ｎｍ以下の波長領域のものを複数用意することで対応することができる。

また、上述した実施の形態では、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄの波長差を５ｎｍとしているが、５０ｎｍ以下の波長領域の範囲で１ｍ以上に設定することができる。このようにすると、高精度な波長スイッチングができる励起光源を実現でき、逆に、大きな波長差を持たせれば、大きなステップでスイッチング可能な励起光源も実現できるなど、目的に合わせて幅広いバリエーションを持たせることができる。

さらに、ＬＤ光源２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄは、半導体プロセスによって製作された半導体レーザとしたが、発光ダイオード（ＬＥＤ）によっても実現できる。ＬＥＤを用いれば、さらに安価な構成が可能となる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図３は、本発明の第２の実施の形態にかかるレーザ走査型共焦点顕微鏡に適用される共焦点顕微分光装置の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、レーザ光源部２１は、異なる波長領域をカバーする複数（図示例では２個）の励起光源２２，２３を有している。これら励起光源２２、２３は、第１の実施の形態で述べたと同様、波長の異なるレーザ光を発生する複数のＬＤ光源（不図示）を有している。これらＬＤ光源２２，２３についても、半導体プロセスによって同一のチップ上にアレイ状に形成され、それぞれＬＤの組成を微小に異ならすことで、波長の異なる単色のレーザ光を発生するようになっている。ここでは、励起光源２２は、５ｎｍステップで４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍの波長の異なるレーザ光を発生し、励起光源２３は、５ｎｍステップで４６０ｎｍ、４６５ｎｍ、４７０ｎｍ、４７５ｎｍの波長の異なるレーザ光を発生するようになっている。

また、これら励起光源２２、２３には、第１の実施の形態で述べたと同様、それぞれのＬＤ光源より発せられるレーザ光を結合して一つのビームとして出力するためのカプラ、各ＬＤ光源を各別にオンオフ制御するためのＬＤ駆動部、これらＬＤ駆動部に対し、ＬＤ光源を独立して、また、同期してオンオフ制御させるように指示する制御部が設けられている。

励起光源２２、２３からのレーザ光の光路には、レーザ光合成部２４が配置されている。このレーザ光合成部２４は、励起光源２２、２３からのレーザ光を合成するためのもので、励起光源２３からのレーザ光を反射するミラー２４ａ、このミラー２４ａで反射されるレーザ光を反射し、励起光源２２からのレーザ光を透過するダイクロイックミラー２４ｂから構成されている。

レーザ光合成部２４には、光ファイバ７を介して顕微鏡本体８が接続されている。これら光ファイバ７と顕微鏡本体８については、第１の実施の形態で述べたと同様である。なお、顕微鏡本体８は、励起光源２２、２３に対応して異なる蛍光試薬の蛍光を検出するため２個の共焦点検出部１３、１３１が設けられている。ここでの共焦点検出部１３１は、共焦点検出部１３と同様な構成をしたもので、共焦点検出部１３と同一部分には、符号先頭に添え字１を付している。

次に、このような第１の実施の形態の作用を説明する。

図４は、蛍光標本Ｓを２つの蛍光試薬で染色した場合、それぞれの蛍光試薬の分光特性を示すもので、一方の蛍光試薬は、励起プロファイル２５と蛍光プロファイル２６から構成され、他の蛍光試薬は、励起プロファイル２７と蛍光プロファイル２８から構成されている。また、レーザ光源部２１に用いられる一方の励起光源２２は、発生するレーザ光の波長領域（４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍ）が、図４に示す励起プロファイル２５の領域をカバーしているものとし、他方の励起光源２３は、発生するレーザ光の波長領域（４６０ｎｍ、４６５ｎｍ、４７０ｎｍ、４７５ｎｍ）が、図４に示す励起プロファイル２７の領域をカバーしているものとする。

この状態で、これら励起光源２２，２３のそれぞれのＬＤ光源を順にオンオフすると、ＬＤ光源からのレーザ光による励起により、２つの蛍光試薬より蛍光プロファイル２６、２８（図４参照）の領域の蛍光を発生する。これら蛍光は、それぞれ波長ごとに共焦点検出部１３、１３１で検出される。

従って、このように蛍光標本Ｓを２つの蛍光試薬で染色したような場合も、励起光源２２より５ｎｍステップで４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍの波長の異なるレーザ光と、励起光源２３より５ｎｍステップで４６０ｎｍ、４６５ｎｍ、４７０ｎｍ、４７５ｎｍの波長の異なるレーザ光を順次発生させることによって、２つの励起光波長領域をカバーした２色同時の多波長切り換え可能な励起光照明を実現でき、５ｎｍの励起波長分解能で分光検出を行なうことができる。

また、この場合も、上述した第１の実施の形態と同様に、より明るく、ＳＮのよい蛍光を取得でき、精度の高い分光検出を行なうことができるなどの効果を得ることができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられる蛍光試薬の分光特性を示す図。 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。 第２の実施の形態に用いられる蛍光試薬の分光特性を示す図。

符号の説明

Ｓ…蛍光標本、１…レーザ光源部、２…励起光源
２ａ〜２ｄ…ＬＤ光源、２ｅ…チップ、３…カプラ
４…基板、５ａ〜５ｄ…ＬＤ駆動部
６…制御部、７…光ファイバ、７ａ…光入射端、７ｂ…光出射端
８…顕微鏡本体、９…ダイクロイックミラー
１０…レーザ走査光学系、１１…対物レンズ
１２…ステージ、１３、１３１…共焦点検出部
１４…バリアフィルタ、１５…共焦点レンズ
１６…共焦点ピンホール、１７…光検出器
１８…励起プロファイル、１９…蛍光プロファイル
２１…レーザ光源部、２２．２３…励起光源
２４…レーザ光合成部、２４ａ…ミラー
２４ｂ…ダイクロイックミラー、２５…励起プロファイル
２６…蛍光プロファイル、２７…励起プロファイル
２８…蛍光プロファイル

Claims (8)

1. 半導体プロセスにより同一チップ上に形成された波長がわずかに異なる２つ以上の半導体光源を有し所定の波長領域をカバーする励起光源と、
   前記半導体光源のオンオフを制御する半導体光源制御手段と、
   前記励起光源からの光を標本上で走査する走査手段と前記標本から発せられる光を検出する共焦点検出手段を有する顕微鏡本体と
   を具備したことを特徴とする共焦点顕微分光装置。
2. 前記励起光源は、前記半導体光源を同一チップ上にアレイ状に配置し、前記半導体光源から発せられる光を結合するカプラとともに同一基板上に配置されることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
3. 前記励起光源は、２つ以上設けられ、２以上の波長領域をカバーすることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
4. 前記励起光源がカバーする前記波長領域が、５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
5. 前記２つ以上の半導体光源が持つ波長差が前記５０ｎｍ以下の波長領域の範囲において１ｎｍ以上であることを特徴とする請求項４記載の共焦点顕微分光装置。
6. 前記半導体光源は、半導体プロセスによって製作された半導体レーザもしくは発光ダイオードであることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
7. 前記励起光源からの光を前記顕微鏡本体に伝送する光ファイバを有し、該光ファイバがシングルモードファイバであることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
8. 前記光ファイバは、偏光面保存型のファイバであることを特徴とした請求項７記載の共焦点顕微分光装置。

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