JP2005283264A - 蛍光分光分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 蛍光色素の蛍光スペクトルの間に重なりがあっても、クロストークによる測定誤差の影響を除去することのできる蛍光分光分析装置を提供する。
【解決手段】 異なる波長帯域の複数の励起光を同一の試料部位（７）に照射する励起光学手段（１〜７）と、それぞれの励起光により試料から発するそれぞれの蛍光を繰り返し検出手段に導く光学手段（８〜１４）と、該検出手段（１５、１６）からのそれぞれの蛍光に対応した出力信号同士の比較に基づいて解析する演算手段（２３）とを備えた蛍光分光分析装置であって、上記励起光学手段は少なくとも１つの励起光の強度を断続的に変化させる励起光変化手段（２０）を有する蛍光分光分析装置である。
【選択図】 図１

Description

本発明は生物試料内の蛍光分子の揺らぎを解析することにより、蛍光分子の状態を解析する蛍光分光分析法に係り、異なる蛍光分子間の相互作用を解析する蛍光分光分析装置に関する。

蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自已相関関数を求め、分子毎の拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば、非特許文献１に詳述されている。ここでは、蛍光強度をＩ(t)とすると、自已相関関数ｃ（τ）は、式（１）で表される。

図５は、このような蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）に用いられる測定光学系を示す図である。

試料を励起するための励起光源１０１にはレーザが用いられる。励起光源１０１から発せられたレーザ光はダイクロイックミラー１０２で反射した後、対物レンズ１０３に入射する。対物レンズ１０３の焦点位置には蛍光色素で標識された試料１０４が置かれている。対物レンズ１０３の焦点部分に集光されたレーザ光は試料中の蛍光色素を励起して蛍光を誘起する。

試料１０４の蛍光色素から発した蛍光は、対物レンズ１０３を介してダイクロイックミラー１０２に達する。このダイクロイックミラー１０２は、励起光を反射して蛍光を透過する光学特性を有している。これにより試料１０４からの蛍光はダイクロイックミラー１０２を通過し、集光レンズ１０５によって集光される。

この集光レンズ１０５の焦点位置にはピンホール１０６が配置され、このピンホール１０６が対物レンズ１０３の焦点位置以外からの蛍光を遮断することにより高い空間分解能が得られる。ピンホール１０６を通過した蛍光のうち所望の波長帯域の蛍光がバリアフィルタ１０８を通過して光検出器１０９に入射する。そして、光検出器１０９によって蛍光強度の揺らぎが計測される。

また、このような蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）を拡張した解析法として、蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）が考えられている。この蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法である。蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、２色の蛍光色素で標識した分子間の相互作用の解析等に用いられ、例えば、非特許文献２、非特許文献３に詳述されている。

ここで、２つの蛍光色素をそれぞれＡ、Ｂとし、それぞれの蛍光強度をI_A(t) 及びI_B(t)とすると、相互相関関数ｇ（τ）は、式（２）で表される。

更に、二つの蛍光分子からの蛍光揺らぎの一致度をハイスループットで検出する、共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）も提案されている（例えば、非特許文献４参照）。この手法では、一致度を示すＫ値は式（３）で表わされる。

これら、蛍光分光分析法（ＦＣＳ／ＦＣＣＳ／ＣＦＣＡ法）は測定が非侵襲でリアルタイムに行える利点が注目され、近年では溶液系のみならず細胞など幅広い生体試料に用いられるようになってきている。

ところで、蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は拡散時間の変化によって相互作用の有無を検出するため、タンパク質の相互作用のように拡散時間の変化の少ない反応には適していない。一方、蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）や共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）はこの制限がないため、タンパク質の相互作用解析への応用が特に期待されている分析手法である。

図６は、蛍光相互相関分光分析（ＦＣＣＳ法）や共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）の測定に用いられる光学系を示す図である。図６と同様の光学系は、例えば非特許文献２、３、４に記載されている。この測定光学系では、励起光源として２つのレーザ光源が用いられる。例えば励起光源１２１に青色のレーザ（波長＝４８８ｎｍ）、励起光源１２２に緑色のレーザ（波長＝５４３ｎｍ）が用いられる。

励起光源１２１、励起光源１２２からのレーザ光はダイクロイックミラー１２４で１本の光束に混合され、ダイクロイックミラー１２５で反射した後、対物レンズ１２６に入射する。対物レンズ１２６の焦点位置には、青色の励起光で励起される蛍光色素Ａ、及び緑色の励起光で励起される蛍光色素Ｂでそれぞれ標識された、２種類の分子が含まれる試料１２７が置かれている。

試料１２７の２つの蛍光色素から発した蛍光は、対物レンズ１２６を介してダイクロイックミラー１２５に達する。このダイクロイックミラー１２５は、それぞれの励起光を反射して、それぞれの蛍光を透過する光学特性を有している。これにより試料１２７からの蛍光はダイクロイックミラー１２５を通過し、集光レンズ１２８によって集光され、ピンホール１２９により高い空間分解能を与えられる。

この後、蛍光はダイクロイックミラー１３１により、蛍光色素Ａから出た蛍光と蛍光色素Ｂから出た蛍光とに分離される。そして、それぞれバリアフィルタ１３３（例えば、透過帯域４９５〜５３５ｎｍ）、バリアフィルタ１３４（例えば、透過帯域５７０〜６１０ｎｍ）で所望の波長帯域の蛍光のみが通過して、それぞれ光検出器１３５、光検出器１３６に入射する。そして、光検出器１３５、１３６により蛍光強度の揺らぎが計測される。
「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素, 1999, vo1.44NO9 1431-1438 Dua1-Co1or F1uorescence Cross-Corre1ation Spectroscopy for Mu1ticomponent Diffusiona1 Ana1ysis in So1ution, Petra. Schwi11e et a1, Biophysica1 Journa1 1997,72,1878-1886 A dynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence auto- and cross-correlation spectroscopy, Petra. Schwi11e et al, Methods 29 (2003) 74-85 Confocal fluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1375-1378, 1999

図６に示すように、蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）では、一般にそれぞれの２色の蛍光に対応して独立した検出器１３５、１３６を用いている。即ち、検出器１３５は蛍光色素Ａからだけの蛍光を、検出器１３６は蛍光色素Ｂからだけの蛍光を検出する。しかし、実際は両方の検出器間である程度のクロストークが発生している。このクロストークの主原因は蛍光色素間の発光スペクトルの重なりによるものである。

図７は、青色レーザで励起される蛍光色素ＡＬＥＸＡ４８８と緑色レーザで励起される蛍光色素ＴＡＭＲＡの蛍光スペクトルを示す図である。ＡＬＥＸＡ４８８の蛍光スペクトルの長波長側の裾野が、ＴＡＭＲＡの蛍光波長と重なっており、分光でＴＡＭＲＡの蛍光のみ抽出することが不可能なことが分る。

例えば、ＡＬＥＸＡ４８８とＴＡＭＲＡを図６の測定系で測定した場合、検出器１３６の出力は色素ＴＡＭＲＡの蛍光揺らぎを計測しているが、その内１０％程度はＡＬＥＸＡ４８８の蛍光揺らぎを計測していることになる。この結果、仮にＡＬＥＸＡ４８８で標識した分子と、ＴＡＭＲＡで標識した分子間で一切の相互作用がないとしても、約１０％が相互作用しているように誤分析されてしまう。

このように使用する２色の蛍光色素の蛍光スペクトル間に重なりがある場合、相互相関関数の測定にクロストークによる大きな誤差が生じてしまう。このクロストークによる誤差を避けるために、２色の蛍光の波長を極力離し、その影響を軽減することも行われる。非特許文献３で紹介されている光学系の例では、この波長の組合せとして、４８８ｎｍと６３３ｎｍの励起光が使用されている。しかし、波長の離れた蛍光色素を用いようとすると蛍光色素の選択の幅が著しく制限されてしまう。

本発明は係る事情に鑑みてなされたものであって、蛍光色素の蛍光スペクトルの間に重なりがあっても、クロストークによる測定誤差の影響を除去することのできる蛍光分光分析装置を提供することを目的とする。

本発明に係る請求項１に記載の蛍光分光分析装置は、異なる波長帯域の複数の励起光を同一の試料部位に照射する励起光学手段と、それぞれの励起光により試料から発するそれぞれの蛍光を繰り返し検出手段に導く光学手段と、該検出手段からのそれぞれの蛍光に対応した出力信号同士の比較に基づいて解析する演算手段とを備えた蛍光分光分析装置であって、上記励起光学手段は少なくとも１つの励起光の強度を断続的に変化させる励起光変化手段を有する。

また本発明に係る請求項２に記載の蛍光分光分析装置は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、上記励起光変化手段の励起光の強度を断続的に変化させる操作信号に同期して、上記検出手段からの出力信号を上記演算手段に断続的に出力する信号選別手段を更に有する。

また本発明に係る請求項３に記載の蛍光分光分析装置は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、上記演算手段は、上記励起光変化手段の励起光の強度を断続的に変化させる操作信号に同期して、上記検出手段からの出力信号を選別して解析する。

また本発明に係る請求項４に記載の蛍光分光分析装置は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、上記励起光変化手段は、上記励起光の強度を矩形状に変化させる。

また本発明に係る請求項５に記載の蛍光分光分析装置は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、上記励起光変化手段は、励起光の強度を２０ナノ秒以上、１００ミリ秒以下の周期で断続的に変化させる。

また本発明に係る請求項６に記載の蛍光分光分析装置は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、上記解析は、相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析である。

本発明によれば、蛍光スペクトルに重なりがある蛍光色素を用いても、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確に測定することのできる蛍光分光分析装置を提供することが可能となる。

［第１の実施の形態］
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図である。

励起光源１は青色のレーザ光源で、切り換え信号源より与えられる信号により高速でレーザ光のＯＮ、ＯＦＦを繰返して断続的なレーザ光を出力する。励起光源２は緑のレーザ光源で励起光源１がＯＮの時はＯＦＦ、励起光源１がＯＦＦの時はＯＮの動作を繰り返して断続的なレーザ光を出力する。この繰り返し動作は高速で行われ、例えば１マイクロ秒の周期で繰返す。

励起光源１、励起光源２から出た断続的なレーザ光は、ダイクロイックミラー４で１本の光束に混合され、ダイクロイックミラー５で反射した後、対物レンズ６に入射する。対物レンズ６の焦点位置には、青色の励起光で励起される蛍光色素Ａ、及び緑色の励起光で励起される蛍光色素Ｂでそれぞれ標識された、２種類の分子が含まれる試料７が置かれている。

蛍光色素Ａは励起光源１からの励起光で励起され蛍光を発する。一方、蛍光色素Ｂは励起光源２からの励起光で励起され蛍光を発する。励起光源１と励起光源２は交互にＯＮ／ＯＦＦを繰返しているので、蛍光色素Ａは励起光源１がＯＮの時のみ蛍光を発する。一方、蛍光色素Ｂは励起光源２がＯＮの時のみ蛍光を発する。励起光がＯＦＦになってからも、蛍光寿命の範囲で蛍光が持続するが、蛍光相関分光分析に用いられる蛍光の蛍光寿命は通常数ナノ秒であるので、励起光の切り換え周期が長い場合はクロストークの影響は実用上無視することができる。

試料の２つの蛍光色素Ａ、Ｂから発したそれぞれの蛍光は、再び対物レンズ６を介してダイクロイックミラー５に達する。このダイクロイックミラー５は、それぞれの励起光を反射してそれぞれの蛍光を透過する光学特性を有している。これにより試料７からの蛍光はダイクロイックミラー５を通過し、集光レンズ８、ピンホール９を経たのち、ダイクロイックミラー１１で、蛍光色素Ａから出た蛍光と蛍光色素Ｂから出た蛍光とに分離される。そして、所望の波長帯域を持つ蛍光がバリアフィルタ１３、バリアフィルタ１４を通過して、検出器１５、検出器１６がそれぞれの蛍光を検出する。

ここで、蛍光色素Ａの蛍光スペクトルの裾野の一部が蛍光色素Ｂの蛍光スペクトルに重なっている場合には、検出器１６には、蛍光色素Ｂから出た蛍光に加え、蛍光色素Ａから出た蛍光の一部がクロストーク成分として加わって出力される。

検出器１５からの信号は信号選別器２１に入り、励起光源１のレーザがＯＮの期間の信号のみが通過する。同様に、検出器１６からの信号は信号選別器２２に入り、励起光源２のレーザがＯＮの期間の信号のみが通過する。

蛍光色素Ａは、励起光源１がＯＮの期間に蛍光を発しているため、検出器１６で検出されるクロストーク成分としての蛍光は信号選別器２を通過することはできない。また逆に、蛍光色素Ｂは、励起光源２がＯＮの期間に蛍光を発しているため、検出器１５で検出されるクロストーク成分としての蛍光は信号選別器１を通過することはできない。

信号選別器２１、２２でそれぞれの蛍光色素Ａ、Ｂから発した蛍光のみの信号に選別された後、これらの信号は相関演算器２３に入力され、相互相関演算が行われる。相関演算器２３に入力する信号には、蛍光クロストーク成分が含まれていないため、クロストークによる誤差のない正確な演算結果が得られる。

なお、相互相関演算において、信号選別器２１、２２から出力される断続信号を用いて相互相関演算を行っても良く、信号選別器２１、２２から出力される断続信号を滑らかな連続信号に補間し、その補間された信号を用いて相互相関演算を行っても良い。また、相互相関演算は、相関演算器２３のみで行っても良く、相関演算器２３と処理装置２４とが協働して実施しても良い。

第１の実施の形態の蛍光分光分析装置によれば、クロストークによる誤差のない正確な演算結果が得られる。従って、蛍光色素の選択の幅に制限を受けることがなくなり、最適な測定環境を構築することができる。

［第２の実施の形態］
図２は、本発明の第２の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図である。第２の実施の形態では、図１に示す信号選別器２１、２２を用いず相関演算器２３がこれらの処理を併せて実施する点が、第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一機能を有する部位には同一符号を付して、その詳細の説明を省略する。

次に第２の実施の形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。

第１の実施の形態と同様に、青色の励起光源１及び緑色の励起光源２は高速で交互にＯＮ／ＯＦＦ繰返す。励起光は第１の実施の形態と同様な経路を通過して対物レンズ６に入射し、青色の励起光で励起される蛍光色素Ａ、及び緑色の励起光で励起される蛍光色素Ｂでそれぞれ標識された、２種類の分子が含まれる試料７を照射する。

試料７の２つの蛍光色素からそれぞれ発した蛍光は、第１の実施の形態と同様な経路を通過し、検出器１５、検出器１６でそれぞれ検出され、その検出信号は相関演算器２３に入力される。相関演算器２３には光源切り換え信号源２０より、励起光源１、２のＯＮ／ＯＦＦに同期した信号が入力されている。相関演算器２３に入力する検出器１６からの蛍光信号には、蛍光色素Ａからのクロストーク成分が含まれているが、励起光源２がＯＮの時の信号のみを選別するため、選別された信号にはクロストーク成分は含まれていない。また、相関演算器２３に入力する検出器１５からの蛍光信号には、蛍光色素Ｂからのクロストーク成分が含まれているが、励起光源１がＯＮの時の信号のみを選別するため、選別された信号にはクロストーク成分は含まれていない。そして、これらの信号に基づいて相関演算を行うことにより、クロストークによる誤差を除去することができる。

第２の実施の形態に係る蛍光分光分析装置によれば、第１の実施の形態の効果に加え、信号選別器を設ける必要がないため装置構成を簡素化することができ、装置コストを低減することができる。

［第３の実施の形態］
図３は、本発明の第３の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図である。第３の実施の形態では、図１に示す励起光源２が、常時ＯＮ状態にあり連続的にレーザ光を発振している点が第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一機能を有する部位には同一符号を付して、その詳細の説明を省略する。

次に第３の実施の形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。

第１の実施の形態と同様に、青色の励起光源１は、切り換え信号源２０より与えられる信号により高速でレーザ光のＯＮ、ＯＦＦを繰返す。一方、緑色の励起光源２は常時ＯＮで恒に緑の励起光を発振し続けている。励起光は第１の実施の形態と同様な経路を通過して対物レンズ６に入射し、青色の励起光で励起される蛍光色素Ａ、及び緑色の励起光で励起される蛍光色素Ｂでそれぞれ標識された２種類の分子が含まれる試料７を照射する。励起光源２は恒にＯＮのため、蛍光色素Ｂは恒に蛍光を発し続けている。一方、蛍光色素Ａは励起光源１がＯＮの時のみ蛍光を発している。

試料の２つの蛍光色素からそれぞれ発した蛍光は、第１の実施の形態と同様な経路を通過し、検出器１５と検出器１６それぞれ検出される。

蛍光色素Ａの蛍光スペクトルの裾野の一部が蛍光色素Ｂの蛍光スペクトルに重なっているため、検出器１６からの出力信号には、蛍光色素Ｂから出た蛍光に加え、蛍光色素Ａから出た蛍光の一部がクロストーク成分として加わっている。

検出器１５からの信号は信号選別器２１に入り、励起光源１のレーザがＯＮの期間の信号のみ通過する。ここで励起光源２は連続発光のため、このタイミングでは蛍光色素Ｂからの蛍光も発している。しかし、バリアフィルタ１の波長帯域を適切に選ぶと（例えば４９５ｎｍ〜５３５ｎｍ）、蛍光色素Ｂの蛍光は殆どバリアフィルタ１３で除去され、検出器１５からの信号は蛍光色素Ａからの蛍光のみとなる。

一方、検出器１６からの信号は信号選別器２２に入り、励起光源１のレーザがＯＦＦの期間、即ち蛍光色素Ｂからの蛍光のみの信号を通過する。このように、信号選別器２１、２２でそれぞれの蛍光色素Ａ、Ｂから発した蛍光の信号が選別された後、信号は相関演算器２３に入力され、相互相関演算が行われる。相関演算器２３に入力する信号は、クロストーク成分が取除かれているので、相関演算器２３より出力される演算結果はクロストーク誤差のない正確な結果である。

第３の実施の形態に係る蛍光分光分析装置によれば、第１の実施の形態の効果に加え、一方のレーザ光のＯＮ、ＯＦＦを切り換える必要がないため装置構成を簡素化することができ、装置を安価に製造することができる。

なお上述の実施の形態では、片方の励起光源がＯＦＦになった直後に、もう一方の励起光源をＯＮとするような切り換え動作を示したが、切り換え時に遅れ時間を設けてもよい。蛍光相関分光分析に用いられる蛍光色素は、一般に蛍光寿命が数ナノ秒のものが用いられる。このため励起光を遮断しても蛍光寿命の数倍の範囲までは蛍光が残る可能性がある。従って、蛍光の混入を防ぐため、切り換え時に約５ナノ秒以上の遅れ時間を設けることにより、本発明の効果をより一層高めることができる。この場合の切り換えのタイミングを図４に示す。

また、上述の実施の形態では切り換え速度を１マイクロ秒としたがこれに限定されず、切り換え速度は広範囲に選ぶことができる。切り換え時間の最小値は、蛍光寿命で規定される。切り換え時の遅れ時間を５ナノ秒とし、５ナノ秒の測定時間を確保すると、最小周期は２０ナノ秒以上必要となる。

切り換え速度の上限は測定対象物のブラウン運動の速さで規定される。高ＮＡの共焦点光学系を用いた場合、低分子の蛍光分子のブラウン運動の速さ、即ち拡散時間は５０マイクロ秒前後である。一方、分子量の多いタンパク質等巨大分子に蛍光分子を標識した場合、拡散時間は数百ミリ秒に至る場合もある。切り換え時間は測定対象の分子の拡散時間に比べ十分に小さい事が必要であり、上述の拡散時間を考慮すると切り換え時間が１００ミリ秒を越えると有意なデータを得ることが事実上困難となる。

以上の各実施の形態では相互相関分光分析について説明したが、本発明は２色の異なった励起光を用いる同様の測定系を備えた共焦点コインシデンス分析においても、全く同様に適応可能である。即ち、図１〜図３の「相関演算器」をコインシデンス解析のための演算器に置換えればよい。従って、相互相関分光分析と共焦点蛍光コインシデンス分析は、収集された光検出器からのデータについての処理方法が異なるだけであり、装置の構成は共通にすることができる。

また以上の各実施の形態は、低分子の色素の例について記したが、本発明は低分子蛍光色素に留まらず、より高分子の蛍光色素、例えば、蛍光タンパク質のような高分子蛍光色素に対しても適用することができる。

なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。

本発明の第１の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図。 本発明の第３の実施の形態に係る蛍光分光分析装置の構成を示す図。 切り換えのタイミングを示す図。 蛍光相関分光分析法に用いられる測定光学系を示す図。 蛍光相互相関分光分析や共焦点蛍光コインシデンス分析の測定に用いられる光学系を示す図。 青色レーザで励起される蛍光色素と緑色レーザで励起される蛍光色素の蛍光スペクトルを示す図。

符号の説明

１…励起光源、２…励起光源、３…ミラー、４…ダイクロイックミラー、５…ダイクロイックミラー、７…試料、９…ピンホール、１１…ダイクロイックミラー、１２…ミラー、１３…バリアフィルタ、１４…バリアフィルタ、１５…検出器、１６…検出器、２０…切り換え信号源、２１…信号選別器、２２…信号選別器、２３…相関演算器、２４…処理装置。

Claims (6)

1. 異なる波長帯域の複数の励起光を同一の試料部位に照射する励起光学手段と、
   それぞれの励起光により試料から発するそれぞれの蛍光を繰り返し検出手段に導く光学手段と、
   該検出手段からのそれぞれの蛍光に対応した出力信号同士の比較に基づいて解析する演算手段とを備えた蛍光分光分析装置であって、
   上記励起光学手段は少なくとも１つの励起光の強度を断続的に変化させる励起光変化手段を有することを特徴とする蛍光分光分析装置。
2. 上記励起光変化手段の励起光の強度を断続的に変化させる操作信号に同期して、上記検出手段からの出力信号を上記演算手段に断続的に出力する信号選別手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
3. 上記演算手段は、上記励起光変化手段の励起光の強度を断続的に変化させる操作信号に同期して、上記検出手段からの出力信号を選別して解析することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
4. 上記励起光変化手段は、上記励起光の強度を矩形状に変化させることを特徴とする請求項１乃至３のうちいずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
5. 上記励起光変化手段は、励起光の強度を２０ナノ秒以上、１００ミリ秒以下の周期で断続的に変化させることを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
6. 上記解析は、相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析であることを特徴とする請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。

Images