CN113295662A - 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统 - Google Patents

一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统 Download PDF

Info

Publication number
CN113295662A
CN113295662A CN202110563055.3A CN202110563055A CN113295662A CN 113295662 A CN113295662 A CN 113295662A CN 202110563055 A CN202110563055 A CN 202110563055A CN 113295662 A CN113295662 A CN 113295662A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescence
ternary
signals
ternary correlation
correlation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110563055.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113295662B (zh
Inventor
董朝青
任吉存
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202110563055.3A priority Critical patent/CN113295662B/zh
Publication of CN113295662A publication Critical patent/CN113295662A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113295662B publication Critical patent/CN113295662B/zh
Priority to US17/744,909 priority patent/US11530988B1/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号根据荧光波长分成多路信号，通过单光子探测器探测，将信号传输至信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线，本系统实现了荧光三元相关光谱通过对检测微区内三种发射出不同波长的荧光分子荧光波动信号进行实时记录和三元相关函数分析获得荧光三元相关光谱曲线，解析曲线的振幅与三种荧光分子复合物浓度的关系，实现三种不同分子间共同结合作用的分析，将拓展荧光相关光谱在活细胞内原位分析研究。

Description

一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统
技术领域
本发明涉及一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，属于光谱分析领域。
背景技术
显微成像和光谱分析技术由于具有的非侵入性、高检测灵敏度等优势成为目前生命科学研究中重要的研究工具，如光活化定位显微镜技术、随机光学重构显微镜技术等。细胞内不同生物分子间通过不断的两两相互作用和三元相互作用等，进行电子转移、信号传导、功能调控等，实现细胞的生理功能。细胞内异常的分子间相互作用的发生，如多蛋白的聚集作用是很多疾病发生的基础，如克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，并可能导致癌症。目前发展的很多技术，包括酵母双杂交法、亲和纯化-质谱分析法、免疫共沉淀法、蛋白质微阵列、超速离心分析法、表面等离子体共振分析和量热法等可以实现对分子间相互作用的离线分析。但这些方法无法实现对活细胞内分子间作用进行原位分析。
荧光相关光谱是一类具有超高灵敏度的单分子光学检测方法，是目前进行活细胞原位分析的重要工具，包括荧光自相关光谱(FACS)和荧光互相关光谱(FCCS)等。荧光自相关光谱系统通过对检测微区(<1fL)内的荧光分子由于布朗运动或者化学反应造成的荧光信号的涨落进行记录，然后对荧光涨落信号进行自相关函数(Autocorrelation function，ACF)分析，得到荧光分子的荧光自相关光谱曲线，获取其浓度、扩散系数、化学反应速率常数、结合和解离常数等信息。由于FACS作为一种单分子光学分析技术，具有非侵入性、灵敏度高、空间分辨率高等特点，因此被广泛应用于在活细胞内进行测定。
荧光自相关光谱通过测定荧光分子或者荧光分子标记的生物分子的扩散系数的变化分析荧光分子或者荧光分子标记生物分子与其它分子间发生的结合作用。由于分子的扩散速率一般与分子的质量的立方根成反比，因此扩散系数的显著变化必须要求荧光分子与其它分子结合后存在质量的非常显著差异。同时，由于细胞内复杂的不均匀性、高拥挤性等特点，严重限制了荧光自相关光谱在活细胞内分子间相互作用的研究。
与荧光自相关光谱系统不同，荧光互相关光谱系统一般采用两束同轴的激光束作为激发源，采用分光光路构建了两个针对不同波长的荧光信号的检测通道。通过对从两个通道的荧光波动信号进行互相关函数(Cross-correlation function，CCF)分析，获得荧光互相关光谱曲线。荧光互相关光谱常用于运动中的两种不同的荧光分子间的相互作用分析。当两种标记不同荧光发射波长的基团的分子由于布朗运动并发生结合作用时，那么两个通道荧光信号的涨落呈现出同步性，在荧光互相关光谱分析中可获得荧光互相关光谱曲线。发生相互作用的分子比例越高，荧光互相关光谱的振幅G(0)值越大。
对比于荧光自相关光谱，荧光互相关光谱对相互结合的两分子间分子量差异没有要求，因此显著增加了对分子间相互作用分析的适用性，因此它已成为活细胞内研究分子间相互作用的重要工具之一。然而，在复杂的生命体系如细胞中很多生物功能的表达需要三种及三种以上生物分子间发生共同结合作用。荧光互相关光谱虽然可以实现分子间两两相互作用研究，但无法实现三种生物分子间共同结合作用的研究。
发明内容
本发明的研究目的是提供一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，该系统可实现三种不同荧光团标记的分子间结合作用的实时原位分析，突破传统的荧光相关光谱无法用于三种分子间结合作用实时解析的限制。
本发明提供的荧光三元相关光谱系统中，激发光源同轴发射的激光束经准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头、筒镜后进入物镜，用于照明样品。照明样品激发产生的荧光信号经同一物镜收集，穿过同一筒镜、扫描镜头、扫描振镜和二色镜后，经聚焦透镜聚焦，并由三组二色镜将荧光信号根据荧光波长分成四路信号，分别经聚光透镜汇聚后进入多模光纤传导至单光子探测器，进行信号探测。信号传输至与四个单光子探测器相连的信号采集卡，实时采集四路信号数据，并进行任意三路信号间的三元相关光谱实时运算。
所述荧光三元相关光谱系统的激发光源分别由四个激光器、至少三个二色镜和至多一根单模光纤组成，激光器输出的四条激光束被调至从同一根单模光纤输出。所述荧光三元相关光谱系统中单模光纤输出激光束进入物镜激发样品之前，经过准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头和筒镜实现光学整形。
所述荧光三元相关光谱系统中，在多个二色镜之间设置聚光透镜，以调整荧光信号的聚焦和荧光检测光路的对准。
所述荧光三元相关光谱系统中，在聚光透镜汇聚荧光信号进入光纤头前，聚光透镜和四个单光子探测器之间设置有至少三个二色镜，使样品的荧光信号按照光谱波长分成四个检测光路。
所述荧光三元相关光谱系统中，每条检测光路的荧光信号被聚光透镜汇聚到一个光纤头，再经多模光纤传输到单光子探测器，以实现共焦检测。
所述荧光三元相关光谱系统中，每个光纤头架在一个机械三维光学调整架上，用以实现单光子探测器对荧光信号的高效收集。
所述荧光三元相关光谱系统中，通过信号采集和运算卡实时运算出三元相关光谱曲线。
本发明提供的荧光三元相关光谱系统具有以下有益效果：
1、实现了不同激光束经同一单模光纤传导和物镜聚焦形成的光斑重合，提高了三元相关光谱的振幅；
2、实现了不同激光束经同一单模光纤传导和物镜聚焦形成的检测体积同时都小于1毫微微升(fL)；
3、实现了对三路荧光波动信号的三元相关函数的在线实时运算；
4、实现了对具有四种不同荧光发射光谱的粒子的荧光相关光谱分析，增加了可分析的荧光分子种类数目；
5.本系统实现了荧光三元相关光谱通过对检测微区(<1fL)内三种发射出不同波长的荧光分子荧光波动信号进行实时记录和三元相关函数分析(Triple-correlationfunction，TCF)，获得荧光三元相关光谱曲线，解析曲线的振幅与三种荧光分子复合物浓度的关系，从而实现三种不同分子间共同结合作用的分析，荧光三元相关光谱将拓展荧光相关光谱在活细胞内原位分析研究。
附图说明
图1为本发明提供的荧光三元相关光谱系统的结构示意图；
图中各标记如下：第一固体激光器1、第二固体激光器2、第三固体激光器3、第四固体激光器4、第一二色镜501、第二二色镜502、第三二色镜503、单模光纤6、准直扩束镜7、第四二色镜8、扫描振镜9、扫描镜头10、筒镜11、第一反射镜1201、第二反射镜1202、第三反射镜1203、第四反射镜1204、第五反射镜1205、第六反射镜1206、物镜13、样品14、第一聚光透镜15、第五二色镜16、第六二色镜17、第七二色镜18、第一带通滤光片19、第二聚光透镜20、第一光纤头21、第一多模光纤22、第一单光子探测器23、第二带通滤光片24、第三聚光透镜25、第二光纤头26、第二多模光纤27、第二单光子探测器28、第三带通滤光片29、第四聚光透镜30、第三光纤头31、第三多模光纤32、第三单光子探测器33、第四带通滤光片34、第五聚光透镜35、第四光纤头36、第四多模光纤37、第四单光子探测器38、信号采集卡39、计算机40。
图2为不同浓度的四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统测得的荧光三元相关光谱曲线。
图3为将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以405nm激光线激发，在检测通道1测得的荧光自相关曲线。
图4为将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm激光线激发，在检测通道2测得的荧光自相关曲线。
图5为将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以568nm激光线激发，在检测通道3测得的荧光自相关曲线。
图6为将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以640nm激光线激发，在检测通道4测得的荧光自相关曲线。
图7为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道2测得的荧光自相关曲线。
图8为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道3测得的荧光自相关曲线。
图9为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道4测得的荧光自相关曲线。
图10为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道2和3间测得的荧光互相关曲线。
图11为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道2和4间测得的荧光互相关曲线。
图12为四色荧光微球溶液(来自Life Technologies公司的TetraSpeckmicrosphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm、561nm和640nm激光线同时激发，在检测通道3和4间测得的荧光互相关曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
本发明提供的荧光三元相关光谱系统，第一固体激光器1、第二固体激光器2、第三固体激光器3、第四固体激光器4(来自德国Coherent公司的Sapphire系列或OBIS系列)输出的激光波长分别为640nm，561nm，488nm和405nm，分别经第一反射镜1201、第一二色镜501、第二二色镜502、第三二色镜503(分别为来自Thorlab公司的DMLP567，DMLP490和DMLP425)输送到准直耦合器(来自Thorlab公司的PAF2A-A10A)耦合后进入单模光纤6(来自Thorlab公司的P3-405B)输出，输出的激光束经准直扩束镜7(来自Thorlab公司的F810APC-543)后，经第二反射镜1202和第四二色镜8(来自Chroma公司的ZT405/488/561/640rpcv2)反射，依次经过扫描振镜9(来自Thorlab公司的GVS012)、扫描透镜10(来自Thorlab公司的LSM03-VIS)、筒镜11、第三反射镜1203、第四反射镜1204反射后汇聚到物镜13(装配有奥林帕斯公司的放大倍数60倍和数值孔径为1.2的复消差水镜)的后孔上；经过物镜汇聚的激光照射到待测样品14中；激发产生的荧光信号又经同一显微镜物镜13汇聚后经过第四反射镜1204、第三反射镜1203、筒镜11、扫描透镜10、扫描振镜9后穿过第四二色镜8；滤除激发光后荧光信号经第五反射镜1205、第一聚焦透镜15、第五二色镜16(来自Chroma公司的T550lpxr)、第六二色镜17(来自Chroma公司的T495lpxr)、第七二色镜18(来自Chroma公司的T685lpxr)分成四路检测通道(Channel 1-4)：第1路检测通道(Channel 1)经第一带通滤光片19(来自Chroma公司的ET450/50m)滤波后由第二聚光透镜20收集后穿过第一光纤头21进入第一多模光纤22导入第一单光子探测器23(来自Excelitas公司的SPCM-AQRH系列)；第二路(Channel 2)经第二带通滤光片24(来自Chroma公司的ET520/40m)滤波后由第三聚光镜25收集后穿过第二光纤头26进入第二多模光纤27导入第二单光子探测器28；第三路(Channel3)经第三带通滤光片29(来自Chroma公司的ET625/30m)滤波后由第四聚光透镜30收集后穿过第三光纤头31进入第三多模光纤32导入第三单光子探测器33；第四路(Channel 4)经第四带通滤光片34(来自Chroma公司的ET720/60m)滤波后由第五聚光透镜35收集后穿过第四光纤头36进入第四多模光纤37导入第四单光子探测器38；四个单光子探测器输出的电信号输入至信号采集卡39和运算卡，并连接计算机40，信号采集和运算卡实时采集四路荧光强度波动信号(I1(t)，I2(t)，I3(t)和I4(t))，并对第2，3，4路荧光强度波动信号(I2(t)，I3(t)和I4(t))使用下面三元相关函数(公式1)进行实时运算，获得三元相关光谱曲线，
Figure BDA0003078735840000061
公式1
对获得的三元相关光谱曲线可采用以下理论模型通过例如Origin软件(OriginLab公司)或者Matlab软件(The Mathwork公司)等采用非线性最小二乘Levenberg-Marquardt算法进行拟合，获得G(0,0)和τD等参数，
Figure BDA0003078735840000062
公式2
其中τ1和τ2为第3和4检测通道与第2检测通道相关时的延迟时间；τD为三种分子复合物的平均扩散时间。ω为激光聚焦重叠区的横向半径。N为在三束激光束形成的聚焦重叠区内存在的三种分子复合物的平均数目。三元相关光谱曲线的振幅G(0,0)值与形成的分子复合物数目N值成反比例关系，其值越小，N值越大，反映形成的分子复合物数目越多，说明三种分子间的结合作用力越强。
应用实施例1
以下提供的由本发明的荧光三元相关光谱系统可对具有三种不同荧光发射光谱的粒子的荧光三元相关光谱分析。图2A-2E显示将四色荧光微球(例如来自LifeTechnologies公司的TetraSpeck microsphere，尺寸100nm)溶解在水中作为样品，浓度分别为A-1.0×10-10mol/LB-5.00×10-11mol/L,C-3.33×10-11mol/L,D-2.50×10-11mol/L,E-1.25×10-11mol/L，采用488nm，561nm和640nm激光同时激发，对第2，3，4路检测通道进行荧光三元相关光谱实验，实时测得的荧光三元相关光谱曲线，其中488nm，561nm和640nm激光功率约为5微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒，从图可以看出测得的荧光三元相关光谱符合荧光三元相关光谱模型的形状，其振幅G(0,0)值随浓度减小而增大，与荧光三元相关光谱理论模型相符。图2F为测得的振幅G(0,0)值与粒子的浓度的线性关系曲线，其相关系数(R2)大于0.99。这些数据说明这些图正是四色荧光微球的荧光三元相关光谱。
应用实施例2
本发明提供的荧光三元相关光谱系统，也可进行荧光自相关光谱分析，图3显示将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和Alexa Fluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统采用405nm激光线激发测得的荧光自相关曲线。在该实施例中激光激发功率为35微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒。用FCS自由扩散模型进行拟合，测得扩散时间为105微秒，测得横向1/e2半径为343nm，纵向1/e2半径为1.252um，检测体积为0.820毫微微升(fL)。
图4显示将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统采用488nm激光线激发测得的荧光自相关曲线。在该实施例中激光激发功率为35微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒。用FCS自由扩散模型进行拟合，测得扩散时间为48.4微秒，测得横向1/e2半径为233nm，纵向1/e2半径为1.040um，检测体积为0.313毫微微升(fL)。
图5显示将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统采用561nm激光线激发测得的荧光自相关曲线。在该实施例中激光激发功率为35微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒。用FCS自由扩散模型进行拟合，测得扩散时间为66.8微秒，测得横向1/e2半径为274nm，纵向1/e2半径为1.479um，检测体积为0.616毫微微升(fL)。
图6显示将Alexa Fluor 405、Rhodamine green、Alexa Fluor 568和AlexaFluor647四种具有不同荧光发射波长的染料共同溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统采用640nm激光线激发测得的荧光自相关曲线。在该实施例中激光激发功率为35微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒。用FCS自由扩散模型进行拟合，测得扩散时间为90.2微秒，测得横向1/e2半径为318nm，纵向1/e2半径为1.542um，检测体积为0.867毫微微升(fL)。采用这四种具有不同荧光发射波长的荧光染料作为探针均测得了它们的荧光自相关光谱曲线，这说明该荧光三元相关光谱系统中四束激光束经同一单模光纤传导和物镜聚焦实现了它们的同轴激发和焦斑重合；测得的检测体积均小于1毫微微升(fL)，实现了荧光相关光谱单分子检测要求。同时也说明了荧光三元相关光谱系统可以实现四种不同组分的同时检测。
应用实施例3
本发明提供的荧光三元相关光谱系统，也可进行荧光互相关光谱分析。将四色荧光微球(例如来自Life Technologies公司的TetraSpeck microsphere，尺寸100nm)溶解在水中，采用荧光三元相关光谱系统，以488nm，561nm和640nm激光同时激发，进行荧光自相关光谱和荧光互相关光谱测试实验。488nm,561nm和640nm激光功率分别为5微瓦，单光子计数器的采样时间为30秒。图7-9为在检测通道2，3，4测得得荧光自相关光谱曲线，图10为检测通道2和3间测得的荧光互相关光谱曲线，图11为检测通道2和4间测得的荧光互相关光谱曲线，图12为检测通道3和4间测得的荧光互相关光谱曲线。

Claims (10)

1.一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，其特征在于：所述荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源同轴发射的激光束照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号由多组二色镜根据荧光波长分成多路信号，分别传导至对应的单光子探测器进行信号探测，信号传输至与对应单光子探测器相连的信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述激发光源包括多个激光器，激光器经二色镜或反射镜处理后通过准直耦合器从同一根单模光纤输出。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：激发光源发射的激光束依次经过准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头和筒镜调节后进入物镜激发样品。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：激发产生的荧光信号经物镜汇聚后，经过反射镜、筒镜、扫描镜头、扫描振镜后，经过滤除激发光的二色镜后再分成多路信号；
根据权利要求4所述的系统，其特征在于：滤除激发光的二色镜和根据荧光波长分成多路信号的二色镜之间设有一聚光透镜。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：样品的荧光信号由至少三个二色镜按照光谱波长分成至少四个检测光路。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：检测光路的荧光信号均由对应的聚光透镜汇聚到对应的光纤头，再由对应的多模光纤传输到对应的单光子探测器。
7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：信号采集卡和运算卡与单光子探测器相连接，实时进行三元相关函数运算和实时获得其中三路荧光信号的三元相关光谱曲线。
8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：信号采集卡和运算卡与扫描振镜相连接。
9.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述激发光源至少包括三个输出波长分别为488nm、561nm和640nm激光束的激光器。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：所述三个激光束产生的荧光强度波动信号(I2(t)，I3(t)和I4(t))使用下面三元相关函数进行实时运算，获得三元相关光谱曲线，
Figure FDA0003078735830000021
对获得的三元相关光谱曲线采用以下模型获得G(0，0)和τD参数，
Figure FDA0003078735830000022
其中，τ1和τ2为561nm和640nm检测通道与488nm检测通道相关时的延迟时间；τD为三种分子复合物的平均扩散时间，ω为激光聚焦重叠区的横向半径，N为在三束激光束形成的聚焦重叠区内存在的三种分子复合物的平均数目，三元相关光谱曲线的振幅G(0，0)值与形成的分子复合物数目N值成反比例关系，其值越小，N值越大，反映形成的分子复合物数目越多，说明三种分子间的结合作用力越强。
CN202110563055.3A 2021-05-21 2021-05-21 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统 Active CN113295662B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110563055.3A CN113295662B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统
US17/744,909 US11530988B1 (en) 2021-05-21 2022-05-16 Fluorescence triple-correlation spectroscopy system for analyzing interaction between three kinds of molecules

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110563055.3A CN113295662B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113295662A true CN113295662A (zh) 2021-08-24
CN113295662B CN113295662B (zh) 2022-04-12

Family

ID=77324019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110563055.3A Active CN113295662B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11530988B1 (zh)
CN (1) CN113295662B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005283264A (ja) * 2004-03-29 2005-10-13 Olympus Corp 蛍光分光分析装置
CN101019018A (zh) * 2004-09-06 2007-08-15 浜松光子学株式会社 荧光显微镜及荧光相关光谱分析装置
CN101718696A (zh) * 2009-12-10 2010-06-02 上海交通大学 激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪
CN101900605A (zh) * 2009-05-26 2010-12-01 奥林巴斯株式会社 荧光相关光谱设备和方法
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
CN110998295A (zh) * 2017-08-09 2020-04-10 国立研究开发法人科学技术振兴机构 测量装置及照射装置

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004013620A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Sensor Technologies Llc Fluorescence correlation spectroscopy instrument
US7839500B2 (en) * 2005-05-30 2010-11-23 Jerker Widengren Apparatus, method and computer program for spectroscopic measurements and analysis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005283264A (ja) * 2004-03-29 2005-10-13 Olympus Corp 蛍光分光分析装置
CN101019018A (zh) * 2004-09-06 2007-08-15 浜松光子学株式会社 荧光显微镜及荧光相关光谱分析装置
CN101900605A (zh) * 2009-05-26 2010-12-01 奥林巴斯株式会社 荧光相关光谱设备和方法
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
CN101718696A (zh) * 2009-12-10 2010-06-02 上海交通大学 激光荧光扫描成像-荧光相关光谱单分子探测仪
CN110998295A (zh) * 2017-08-09 2020-04-10 国立研究开发法人科学技术振兴机构 测量装置及照射装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAN W KRIEGER等: "Imaging fluorescence (cross-) correlation spectroscopy in live cells and organisms", 《NATURE PROTOCOL》 *
SHENGRONG YU等: "In Situ Study of Interactions between Endogenous c-myc mRNA with CRDBP in a Single Living Cell by Combining Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy with Molecular Beacons", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
TOBIAS KOHL等: "Determining Protease Activity In Vivo by Fluorescence Cross-Correlation Analysis", 《BIOPHYSICAL JOURNAL》 *
董辰博等: "激光共聚焦扫描成像-荧光相关光谱系统的研究及其应用", 《分析科学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220381690A1 (en) 2022-12-01
US11530988B1 (en) 2022-12-20
CN113295662B (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103743718B (zh) 共聚焦显微拉曼和激光诱导击穿光谱联用激光光谱分析仪
US7196339B2 (en) Light-receiving unit and measuring apparatus including the same
CN203606288U (zh) 共聚焦显微拉曼和激光诱导击穿光谱联用激光光谱分析仪
CN107192702B (zh) 分光瞳激光共焦cars显微光谱测试方法及装置
Weisshart et al. The LSM 510 META-ConfoCor 2 system: an integrated imaging and spectroscopic platform for single-molecule detection
CN104330398A (zh) 一种多模式非线性光学显微成像方法及装置
JP2005534944A (ja) 螢光相関分光器
CN104359892A (zh) 一种不同模态分子振动光谱检测与成像装置及方法
CN108267445A (zh) 三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法
CN112414992A (zh) 拉曼光谱激发增强模块
US8964183B2 (en) Systems and methods for screening of biological samples
CN115656130A (zh) 一种荧光发射比率三维超分辨成像方法
CN111380848A (zh) 一种高光谱活体荧光分子成像系统及方法
EP1411345B1 (en) Multi-parameter fluorimetric analysis in a parallel multi-focal arrangement
CN117705773A (zh) 模块化多模态显微光学分析系统
CN111678898B (zh) 基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成像方法
CN212514263U (zh) 高光谱成像显微镜
CN113295662B (zh) 一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统
CN116840131A (zh) 组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测装置及方法
US20230221178A1 (en) Apparatus and a method for fluorescence imaging
JP2004191251A (ja) 蛍光分光分析装置
Bulseco et al. Fluorescence correlation spectroscopy: molecular complexing in solution and in living cells
US20210239590A1 (en) Apparatus and Method for Cyclic Flow Cytometry Using Particularized Cell Identification
US20120228518A1 (en) Fluorescence correlation spectroscopy system for analyzing particles in a medium
CN212159566U (zh) 一种高光谱活体荧光分子成像系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant