JP2009145550A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、構成をシンプルに抑えながら観察の自由度を高めることのできるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のレーザ走査顕微鏡（１００）は、光源部（１）と、前記光源部（１）からの光を被観察面（１６）へ導き、該被観察面（１６）からの光を検出器へ導く分光手段（９）と、前記分光手段（９）と前記被観察面（１６）との間の光路を、経路の異なる複数の光路（Ｒ１，Ｒ２）の間で切り替える光路切替手段（１０，１３）と、前記複数の光路の各々へ個別に配置される複数の光偏向手段（１１，１２）と、を備え、前記光路切替手段はターレットで構成されていることを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、共焦点レーザ走査顕微鏡、共焦点蛍光レーザ走査顕微鏡などのレーザ走査顕微鏡に関する。

イメージング用の光学系に光刺激用の光学系を組み合わせたレーザ走査顕微鏡が提案されている（特許文献１等を参照）。この顕微鏡によれば、標本の一部へ特定波長の光で刺激を与え、その周辺で生じる変化を観察すること（光刺激観察）が可能である。

複数の走査光学系と１つの検出光学系とを備え、その検出光学系は、複数の走査光学系の１つの走査光学ユニットを介して標本と光学的に結合されている（特許文献２を参照）。従って、第１光ビームによって励起された蛍光試薬から発生した蛍光は、第１光ビームと同じ光路を逆向きに進み、検出光学系へ導かれる。また、第２光ビームによって励起された蛍光試薬から発生した蛍光も、第１光ビームと同じ光路を逆向きに進み、検出光学系へ導かれる。
特開平１０−２０６７４２号公報 特開平２００５−１８９２９０号公報

しかし、特許文献１に記載の顕微鏡では、光刺激用の光学系がイメージング用の光学系と独立しているので、光刺激用の光学系に配置された光源及びガルバノスキャナは、何れも光刺激にしか用いることができない。

例えば、或る標本のイメージング用の波長と光刺激用の波長とが同じであったとしても、イメージング用の光学系と光刺激用の光学系との双方に同じ光源を１台ずつ搭載する必要がある。 また、特許文献２に記載の顕微鏡では、第２光ビームによって励起された蛍光試薬から発生した蛍光は、第２光ビームの走査に用いた第２光学走査ユニット（スキャナ）とは異なる第１走査ユニット（スキャナ）を用いて検出光学系へ導かれるので、両者を同じタイプのものにする必要がある上に、画像を取得するためには、精度良く同期させる必要がある。

そこで本発明は、構成をシンプルに抑えながら観察の自由度を高めることのできるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明のレーザ走査顕微鏡は、光源部と、 前記光源部からの光を被観察面へ導き、該被観察面からの光を検出器へ導く分光手段と、前記分光手段と前記被観察面との間の光路を、経路の異なる複数の光路の間で切り替える光路切替手段と、 前記複数の光路の各々へ個別に配置される複数の光偏向手段と、
を備え、前記光路切替手段はターレットで構成されていることを特徴とする。

本発明によれば、構成をシンプルに抑えながら観察の自由度を高めることのできるレーザ走査顕微鏡が実現する。

［第１実施形態］
以下、第１実施形態を説明する。本実施形態は、蛍光共焦点レーザ走査顕微鏡システムの実施形態である。

先ず、本システムの構成を説明する。

図１は、本システムの構成図である。図１に示すとおり、本システムは、顕微鏡本体１００、コントローラ２０、コンピュータ２１、モニタ２２、入力器２３などを備える。

顕微鏡本体１００には、レーザユニット１、光ファイバ７、コリメートレンズ８、ダイクロイックミラー９、光路切替ユニット１０、制御型ガルバノスキャナ１１、光路切替ユニット１３、共振型ガルバノスキャナ１２、リレーレンズ１４、対物レンズ１５、標本１６、集光レンズ１７、共焦点検出用のピンホール絞り１８、光検出器１９などが配置される。このうち、ダイクロイックミラー９、集光レンズ１７、ピンホール絞り１８、光検出器１９が、検出用光学系１００Ａを構成している。なお、標本１６は、不図示のステージ上に支持された蛍光観察用の標本（蛍光色素が添加された標本）である。

制御型ガルバノスキャナ１１は、直列の関係で配置された主走査用ガルバノミラーと副走査用ガルバノミラーとを備え、共振型ガルバノスキャナ１２は、直列の関係で配置された主走査用共振型ガルバノミラーと、副走査用制御型ガルバノミラーとを備える。このうち、制御型ガルバノスキャナ１１は、スキャン速度が遅いものの、スキャン領域を自由に設定することが可能という利点があるので、レーザ光の照射先を標本１６の観察領域の所望の部分領域に限定するときに有効であり、共振型ガルバノスキャナ１２は、スキャン領域を自由に設定することが困難である反面、スキャン速度が速いという利点があるので、標本１６を高速にレーザスキャンするときに有効である。

レーザユニット１には、複数種類のレーザ光源（ここでは２つのレーザ光源２，３）が搭載されている。レーザ光源２，３の出射光路は、コンバイナミラー４によって共通光路へ統合され、その共通光路には音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）５が挿入されている。このＡＯＴＦ５や個々のレーザ光源２，３を制御することで、レーザユニット１は、使用光源の設定、出射光のオン／オフ、出射光の強度調節などを行う。

レーザユニット１から射出したレーザ光は、ファイバカプラ６を介して光ファイバ７の一端へ入射する。そのレーザ光は、光ファイバ７の内部を伝搬した後、光ファイバ７の他端から射出し、コリメートレンズ８において平行光束化された後、ダイクロイックミラー９へ入射する。そのレーザ光は、ダイクロイックミラー９を通過し、光路切替ユニット１０のダイクロイックミラー１０Ｄへ入射する。

ダイクロイックミラー１０Ｄを透過した波長の短いレーザ光は、第１のフィルタ１０Ｅを透過し、光路Ｒ１を通り、制御型ガルバノスキャナ１１で反射した後、光路切替ユニット１３のダイクロイックミラー１３Ｄへ入射する。このダイクロイックミラー１３Ｄの特性は、ダイクロイックミラー１０Ｄの特性と同じに設定されているので、光路Ｒ１を通ったレーザ光は、ダイクロイックミラー１３Ｄを透過し、リレーレンズ１４及び対物レンズ１５を通り標本１６上にスポットを形成する。そのスポットで生じた蛍光（レーザ光よりも波長が若干長い）は、スポットを形成したレーザ光と同じ光路Ｒ１を逆に辿り、制御型ガルバノスキャナ１１で反射し第１のフィルタ１０Ｅに入射する。第１のフィルタ１０Ｅは波長の短いレーザ光を透過してそれより長い波長を透過しない特性であり、蛍光はここで遮光される。この状態で制御型ガルバノスキャナ１１が駆動されると、スポットが標本１６上を二次元的にスキャンする。

一方、ダイクロイックミラー１０Ｄを反射した比較的波長の長いレーザ光は、光路Ｒ１とは異なる光路Ｒ２を通り、第２のフィルタ１０Ｆを透過し、共振型ガルバノスキャナ１２で反射した後、光路切替ユニット１３のダイクロイックミラー１３Ｄへ入射する。このダイクロイックミラー１３Ｄの特性は、ダイクロイックミラー１０Ｄと同じに設定されているので、光路Ｒ２を通ったレーザ光は、ダイクロイックミラー１３Ｄを反射し、リレーレンズ１４及び対物レンズ１５を通り標本１６上にスポットを形成する。そのスポット部分で生じた蛍光（スポットを形成したレーザ光よりも波長が若干長い）は、スポットを形成したレーザ光と同じ光路Ｒ２を逆に辿り、共振型ガルバノスキャナ１２で反射し、第２のフィルタ１０Ｆを透過し、ダイクロイックミラー１０Ｄを反射し、ダイクロイックミラー９へ向かう。この状態で共振型ガルバノスキャナ１２が駆動されると、スポットが標本１６上を二次元的にスキャンする。

ダイクロイックミラー９へ入射した蛍光はダイクロイックミラー９で反射して検出用光学系１００Ａへ取り込まれる。集光レンズ１７において集光され、ピンホール絞り１８を通過した蛍光は、光検出器１９へ入射して電気信号へ変換される。光路切替ユニット１０は、ダイクロイックミラー１０Ｄと、全反射ミラー１０Ｍと、不図示の中空ブロックとを装着すると共に、光路へ挿入する。

ここで、光路切替ユニット１０，１３の構成について説明する。

図９（ａ）（ｂ）は光路切り替えユニット１０，１３の構成を説明する図である。

光路切替ユニット１０，１３の各々は、ターレットで構成される。ターレット５０、５１は各々、円周方向の９０度ごとに４つの中空ブロック１０Ｒ，１３Ｒが構成され、これらに最大４つの光学素子が配置可能に構成されている。２つの中空ブロック１０Ｒ，１３Ｒにダイクロイックミラー１０Ｄ、１３Ｄ、全反射ミラー１０Ｍ、１３Ｍがそれぞれ配置され、残り２つの中空ブロック１０Ｒ，１３Ｒは空の状態で使用される。ただし、そのうち１つは、ダイクロイックミラー１０Ｄ、１３Ｄと異なる特性のダイクロイックミラーを配置してもよい。

また、ターレット５０、５１には、それぞれ外周部に同じ歯数の歯車５０Ｈ、５１Ｈが形成され、ターレット５０、５１は互いに歯車が噛み合うように、隣接配置されている。また、小歯車５２はその歯車がターレット５０の歯車５０Ｈと噛み合うように隣接配置され、小歯車５２の回転軸は、モータ５３により駆動される。

したがって、モータ５３により駆動された小歯車５２の回転に伴って、ターレット５０、５１が連動して回転（ターレット５０、５１にはそれぞれ不図示の回転軸が設けられており、それらの回転軸は軸受け５４、５５内で回転するとともに保持されている。また、モータ５３、軸受け５４、５５は、台５６上にねじで固定されている。）し、ダイクロイックミラー１０Ｄが光路に配置されると、ダイクロイックミラー１３Ｄが光路に配置される。同様に、全反射ミラー１０Ｍが光路に配置されると、全反射ミラー１３Ｍが光路に配置される。

また、第１のフィルタ１０Ｅ及び第２のフィルタ１０Ｆはターレット５０に連結した保持部材６１、６２に保持され、ダイクロイックミラー１０Ｄの前後にダイクロイックミラー１０Ｄとのなす角が約３３度になるように配置されている。そのため、これらはダイクロイックミラー１０Ｄの切り替えと同時に光路に挿入され、各光路に対して入射角が約１２度に配置される。

なお、第１のフィルタ１０Ｅ及び第２のフィルタ１０Ｆを各光路に対して入射角が０度以外に配置することが好ましい。これらを各光路に対して入射角が０度に配置すると、透過されなかった光が反射して光路を戻り、フレアの原因になるからである。

このような構成にすることにより、１つのモータ５３のみで２つのターレット５０、５１を連動して制御することができ、省スペース化と低コスト化が実現されている。

図１に示すとおり、光路切替ユニット１０，１３による設定素子が、ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの組み合わせにセットされた場合、ダイクロイックミラー９とリレーレンズ１４との間の光路は、波長毎に光路Ｒ１と光路Ｒ２とに分離される。

一方、光路切替ユニット１０，１３による設定素子を、全反射ミラー１０Ｍ，１３Ｍの組み合わせにセットした場合、ダイクロイックミラー９とリレーレンズ１４との間の光路は、波長に依らず光路Ｒ２のみとなる。

また、光路切替ユニット１０，１３による設定素子を、中空ブロック同士の組み合わせにセットした場合、ダイクロイックミラー９とリレーレンズ１４との間の光路は、波長に依らず光路Ｒ１のみとなる。

さらに、光路切替ユニット１０，１３と、顕微鏡本体１００のその他の駆動部（レーザユニット１、制御型ガルバノスキャナ１１、共振型ガルバノスキャナ１２、光検出器１９など）とは、コントローラ２０によって制御される。コントローラ２０は、コンピュータ２１の支配下にあり、ユーザからの指示は、モニタ２２、入力器２３を介してコンピュータ２１へと与えられ、そのコンピュータ２１を介してコントローラ２０へと与えられる。

コントローラ２０は、コンピュータ２１からの指示に従い、顕微鏡本体１００の各駆動部へ必要な指示や駆動信号を与え、それによって顕微鏡本体１００の設定及び駆動を行う。

例えば、コントローラ２０は、光路Ｒ２が有効となるよう顕微鏡本体１００を設定した上で、レーザユニット１と共振型ガルバノスキャナ１２と光検出器１９とを同期駆動しつつ光検出器１９から電気信号を取り込めば、標本１６の観察領域の蛍光画像データを取得すること（イメージング）ができる。この蛍光画像データは、コントローラ２０からコンピュータ２１へと送出され、必要に応じてモニタ２２へ送出されたり、コンピュータ２２にて保存されたりする。

以上、本システムの顕微鏡本体１００は、光路切替ユニット１０，１３の使用により、１対のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１及び共振型ガルバノスキャナ１２）を、ダイクロイックミラー９と標本１６との間の光路に対し並列の関係で配置しているので、１つの光源ユニット１と１つの検出用光学系１００Ａとが、１対のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１及び共振型ガルバノスキャナ１２）に共用されることになる。

したがって、本システムの顕微鏡本体１００は、レーザユニット１と検出用光学系１００Ａとを一台ずつしか搭載していないにも拘わらず、レーザユニット１の投光先を１対のガルバノスキャナの間で選択することや、イメージングに用いられるガルバノスキャナを１対のガルバノスキャナの間で選択することが可能である。

また、光路切替ユニット１０，１３は、光路へ挿入可能な光学素子の１つとしてビームスプリッタ（ここではダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄ）を備えるので、レーザユニットからのレーザ光を１対のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１及び共振型ガルバノスキャナ１２）へ同時に投光することも可能である。

なお、本システムの顕微鏡本体１００では、１対のガルバノスキャナの配置される光路Ｒ１，Ｒ２の分岐箇所を、ダイクロイックミラー９とリレーレンズ１４との間としたが、リレーレンズ４と対物レンズ１５との間や、リレーレンズ４の光路中としてもよい。但し、分岐箇所の一方をリレーレンズ４の光路中とする場合、光路Ｒ１，Ｒ２の各々にリレーレンズの一部を配置する必要があるので、光学素子の点数が若干増える。

また、本システムの顕微鏡本体１００では、光路切替ユニット１０，１３をターレットで構成したが、スライド機構などの他の機構で構成してもよい。

また、本システムの顕微鏡本体１００では、光路切替ユニット１０，１３がモータによって電動化されたが、モータを省略して切り替えを手動にしてもよい。

［第２実施形態］
以下、第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態のシステムを利用して光刺激とイメージングとを同時に行う光刺激観察方法の実施形態である。

ここでは、標本１６に適用された蛍光色素の励起波長を４８８ｎｍとし、標本１６に与えるべき光刺激の波長を４０５ｎｍとする。

この場合、顕微鏡本体１００の各部は、例えば以下のとおりに設定される。
・レーザ光源２：紫外レーザ光源（波長４０５ｎｍ）
・レーザ光源３：アルゴンレーザ光源（波長４８８ｎｍ）
・ダイクロイックミラー９：４８８ｎｍを含む短波長側の光を透過し、かつ４ ８８ｎｍよりも長波長側の光を反射するもの
・ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄ：４０５ｎｍ付近（幅１０ｎｍ程度） の光を透過し、かつ４８８ｎｍを含む長波長側の光を反射するもの
・第１のフィルタ１０Ｅ：４０５ｎｍ付近（幅１０ｎｍ程度）の光を透過し、 これより長波長側の光を透過しないもの
・第２のフィルタ１０Ｆ：４８８ｎｍを含む長波長側の光を透過し、４０ ５ｎｍ付近（幅１０ｎｍ程度）の光を透過しないもの
光刺激観察の手順は、図２に示すとおりである。

（ステップ１）
コントローラ２０は、レーザユニット１の使用光源をレーザ光源３（アルゴンレーザ光源）に設定すると共に、光路切替ユニット１０，１３の設定素子を、図３に示すとおり、ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの組み合わせに設定する。同時に第１のフィルタ１０Ｅと第２のフィルタ１０Ｆも光路Ｒ１，Ｒ２に挿入される。

このとき、レーザユニット１から射出可能なレーザ光は、波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ光のみとなる。このアルゴンレーザ光は、図３に実線で示すとおり、大部分は光路Ｒ２を通り標本１６へ到達可能であり、アルゴンレーザ光のスポットは、共振型ガルバノスキャナ１２により、標本１６の全観察領域（図３下部参照）をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図３に点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。

なお、図３に一点鎖線で示すとおり、ダイクロイックミラー１０Ｄを反射せずに漏れて透過するアルゴンレーザ光は、第１のフィルタ１０Ｅで反射するので、標本１６には到達しない。よって、アルゴンレーザ光が制御型ガルバノスキャナ１１で標本上を不必要にスキャンされることを防ぐことができる。

（ステップ２）
コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、アルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域（図３下部参照）のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ３）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器２３を操作し、所望する部分領域をコンピュータ２１へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ２０へと送出される。

（ステップ４）
コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定すると共に、レーザユニット１の使用光源をレーザ光源２，３の双方（紫外レーザ光源及びアルゴンレーザ光源）に設定する。

このとき、レーザユニット１から射出可能なレーザ光は、波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ光と波長４０５ｎｍの紫外レーザ光との双方となる。

ステップ１と同様に、このうち、アルゴンレーザ光は、図３に実線で示すとおり、大部分は光路Ｒ２を通り標本１６へ到達可能であり、アルゴンレーザ光のスポットは、共振型ガルバノスキャナ１２により、標本１６の全観察領域（図３下部参照）をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図３に点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。

なお、図３に一点鎖線で示すとおり、ダイクロイックミラー１０Ｄを反射せずに漏れて透過するアルゴンレーザ光は、第１のフィルタ１０Ｅで反射するので、標本１６には到達しない。よって、アルゴンレーザ光が制御型ガルバノスキャナ１１で標本上を不必要にスキャンされることを防ぐことができる。

一方、紫外レーザ光は、図４に実線で示すとおり、光路Ｒ１を通り標本１６へ到達可能であり、紫外レーザ光のスポットは、制御型ガルバノスキャナ１１により、標本１６の部分領域（図４下部参照）をスキャンすることが可能である。

なお、図４に一点鎖線で示すとおり、ダイクロイックミラー１０Ｄを透過せずに漏れて反射する紫外レーザ光は、第２のフィルタ１０Ｆで反射するので、標本１６には到達しない。よって、紫外レーザ光が共振型ガルバノスキャナ１２で標本上を不必要にスキャンされることを防ぐことができる。

紫外レーザ光のスポットで生じる蛍光（多少は生じているものと考えられる。）は、図４に点線と二点鎖線で示すとおり、ダイクロイックミラー１３Ｄでその一部分が反射し、残りは透過する。ダイクロイックミラー１３Ｄで反射する蛍光は共振型ガルバノスキャナ１２に入射するため、同じスキャナを通らないのでデスキャンせず、検出用光学系１００Ａのピンホールを通過しない。また、ダイクロイックミラー１３Ｄを透過する蛍光は、制御型ガルバノスキャナ１１をデスキャンして第１のフィルタ１０Ｅで反射するので、検出用光学系１００Ａのピンホールを通過しない。よって、紫外レーザ光のスポットから発生する蛍光がアルゴンレーザ光のスポットから発生する蛍光に混じって光検出器１９で検出されることを防ぐことができる。

（ステップ５）
コントローラ２０は、レーザユニット１、制御型ガルバノスキャナ１１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、紫外レーザ光で標本１６の部分領域（図４下部参照）へ光刺激を与えると共に、アルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域（図３下部参照）のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ６）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激がなされたときの標本１６の様子を観察することができる。コンピュータ２１は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する。（以上、ステップ６）。

上述した各ステップは必要に応じて繰り返しや前段ステップへの戻りが行われる。

以上、本実施形態では、第１実施形態のシステム、特に、光路切替ユニット１０，１３のダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄを有効に利用するので、光刺激とイメージングとを同時に行うことができる。

なお、上述したステップ５では、光刺激（レーザ光源２及び制御型ガルバノスキャナ１１の駆動）とイメージング（レーザ光源３、共振型ガルバノスキャナ１２、光検出器１９の駆動）とを１回ずつしか行わなかったが、これらはその限りではない。例えば、光刺激を連続して繰り返し行ってもよい。そうすれば、より強く刺激することができる。また、イメージングを連続して繰り返し行ってもよい。そうすれば、連続する複数フレーム分の蛍光画像データが得られるので、光刺激直後における標本１６の時間変化を観察することが可能になる。また、光刺激の回数は上述したステップ５とステップ６での光刺激とイメージングおよびモニタ出力をしながらユーザが判断して指定してもよい。

また、上述したステップ１では、光路切替ユニット１０，１３の設定素子をダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの組み合わせとしたが、全反射ミラー１０Ｍ，１３Ｍの組み合わせとしてもよい。但し、その場合、ステップ４において光路切替ユニット１０，１３の設定素子をダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの組み合わせに変更する必要がある。

［第３実施形態］
以下、第３実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態のシステムを利用して光刺激とイメージングとに共通の光源を使用する光刺激観察方法の実施形態である。

ここでは、標本１６に適用された蛍光色素の励起波長を４８８ｎｍとし、標本１６に与えるべき光刺激の波長を４８８ｎｍとする。

この場合、顕微鏡本体１００は、例えば以下のとおりに設定される。
・レーザ光源３：アルゴンレーザ光源（波長４８８ｎｍ）
・ダイクロイックミラー９：４８８ｎｍを含む短波長側の光を透過し、かつ４８８ｎｍよりも長波長側の光を反射するもの
なお、本実施形態では、レーザ光源３，ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄを使用しないので、これらの設定は任意である。したがって、顕微鏡本体１００の設定は、第２実施形態のそれと同じでもよい。

光刺激観察の手順は、図５に示すとおりである。

（ステップ１）
コントローラ２０は、レーザユニット１の使用光源をレーザ光源３（アルゴンレーザ光源）に設定すると共に、光路切替ユニット１０，１３の設定素子を、図６に示すとおり、全反射ミラー１０Ｍ，１３Ｍの組み合わせに設定する。なお、この時点では、レーザユニット１の出射光の強度は、イメージング用の強度（低強度）に設定されているものとする。

このとき、レーザユニット１から射出可能なレーザ光は、低強度のアルゴンレーザ光のみとなる。低強度のアルゴンレーザ光は、図６に実線で示すとおり、光路Ｒ２を通り標本１６へ到達可能であり、そのアルゴンレーザ光のスポットは、共振型ガルバノスキャナ１２により、標本１６の全観察領域（図６下部参照）をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図６に点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。

（ステップ２）
コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域（図６下部参照）のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ３）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器２３を操作し、所望する部分領域をコンピュータ２１へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ２０へ送出される。 （ステップ４）
コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定する。また、コントローラ２０は、レーザユニット１の出射光の強度を、光刺激用の強度（高強度）に変更すると共に、光路切替ユニット１０，１３の設定素子を、図７に示すとおり、中空ブロック１０Ｂ，１３Ｂの組み合わせに変更する。

このとき、レーザユニット１から射出可能なレーザ光は、高強度のアルゴンレーザ光のみとなる。高強度のアルゴンレーザ光は、図７に実線で示すとおり、光路Ｒ１を通り標本１６へ到達可能であり、そのアルゴンレーザ光のスポットは、制御型ガルバノスキャナ１１により、標本１６の部分領域（図７下部参照）をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図７に点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。

（ステップ５）
コントローラ２０は、レーザユニット１及び制御型ガルバノスキャナ１１を駆動して、高強度のアルゴンレーザ光で標本１６の部分領域（図７下部参照）へ光刺激を与える。なお、このときにはイメージングの必要は無く、光検出器１９を駆動する必要は無い。

（ステップ６）
コントローラ２０は、レーザユニット１の出射光の強度を、イメージング用の強度（低強度）に変更すると共に、光路切替ユニット１０，１３の設定素子を、図６に示すとおり、全反射ミラー１０Ｍ，１３Ｍの組み合わせに変更する。

このとき、レーザユニット１から射出可能なレーザ光は、低強度のアルゴンレーザ光のみとなる。低強度のアルゴンレーザ光は、図６に実線で示すとおり、光路Ｒ２を通り標本１６へ到達可能であり、そのアルゴンレーザ光のスポットは、共振型ガルバノスキャナ１２により、標本１６の全観察領域（図６下部参照）をスキャンすることが可能である。そのスポットで生じる蛍光は、図６に点線で示すとおり、ダイクロイックミラー９で反射可能なので、検出用光学系１００Ａの側へと抽出される。

（ステップ７）
コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動して、低強度のアルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域（図６下部参照）のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ８）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激直後の標本１６の様子を観察することができる。コンピュータ２１は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する（以上、ステップ８）。

上述した各ステップは必要に応じて繰り返しや前段ステップへの戻りが行われる。

以上、本実施形態では、第１実施形態のシステム、特に、光路切替ユニット１０，１３の中空ブロック１０Ｂ，１３Ｂ，全反射ミラー１０Ｍ，１３Ｍを有効に利用するので、光刺激とイメージングとに共通の光源を使用することができる。

なお、上述したステップ５では、光刺激を１回しか行わなかったが、連続して繰り返して行ってもよい。そうすれば、より強く刺激することができる。

なお、上述したステップ７では、イメージングを１回しか行わなかったが、連続して繰り返し行ってもよい。そうすれば、連続する複数フレーム分の蛍光画像データが得られるので、光刺激直後における標本１６の時間変化を観察することが可能になる。

［その他］
なお、上述した顕微鏡本体１００では、光源ユニット１に搭載される光源を２種類としたが、３種類以上としてもよい。刺激用レーザ光源３に可視光のレーザ（波長４３０ｎｍなど）を用いてもよい。紫外レーザ光源、アルゴンレーザ光源の他に、２光子刺激に用いられるＩＲレーザ光源（例えば波長７１０ｎｍ）や波長可変のＩＲレーザ光源（例えば波長７６０ｎｍから９６０ｎｍ）などを搭載してもよい。また、複数のＩＲレーザ光源や複数波長を同時出力するＩＲレーザ光源を使用して、２光子で刺激とイメージングを行ってもよい。

また、ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄは、一般に透過帯域よりも反射帯域のほうが、その全帯域において波長特性（反射率）をフラットにしやすい。よって、上述した顕微鏡本体１００のように光刺激用レーザ光（短波長）を透過し、イメージング用レーザ光とそれにより発生する蛍光（長波長）が反射する構成にすることで、イメージング用の波長帯域のダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの特性をフラットにすることが容易となる。

これにより、ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの波長特性を、４８８ｎｍから５６０ｎｍで反射率９５％以上にすることで、アルゴンレーザ光源（波長４８８ｎｍ）で励起する蛍光色素のイメージングを高画質で行うことができる。

より望ましくは、４８８ｎｍから６２０ｎｍで反射率９５％以上にすることで、アルゴンレーザ光源（波長４８８ｎｍ）だけでなく、より波長の長いヘリウムネオンレーザ光源（波長５４３．５ｎｍ）で励起する蛍光色素のイメージングも高画質で行うことができる。

より望ましくは、４８８ｎｍから７５０ｎｍで反射率９５％以上にすることで、さらに波長の長いＬＤ光源（波長６４０ｎｍ）で励起する蛍光色素のイメージングも高画質で行うことができる。
さらに望ましくは、これらの反射波長帯域の９０％以上の領域で反射率９８％以上であれば、波長特性が十分均一であると見なすことができ、ダイクロイックミラー１０Ｄ，１３Ｄの入射角に依存する波長特性（反射率）の変化も小さくな。これにより、標本１６の観察領域の蛍光画像データを、全視野で良好なＳＮ比で取得することができる。

また、ダイクロイックミラー９，１０Ｄ，１３Ｄ，及び第１のフィルタ１０Ｅ，第２のフィルタ１０Ｆの特性は、搭載する光源の組み合わせに応じて設定されることが望ましい。因みに、光源の組み合わせ数が多いときには、様々な特性のダイクロイックミラーと複数種のフィルタを用意し、それらを使い分ければよい。光路切替ユニット１０，１３の各々に複数種のダイクロイックミラーと複数種のフィルタを予め装着してもよい。

また、上述した顕微鏡本体１００では、光路切替ユニット１０，１３に装着される光学素子（設定素子）が、ダイクロイックミラー、全反射ミラー、中空ブロックの３種類であったが、全反射ミラーと中空ブロックとの２種類としてもよい。また、ダイクロイックミラーのみとしてもよい。また、ダイクロイックミラーの代わりに（又はダイクロイックミラーに加えて）、ハーフミラー、マルチバンドダイクロイックミラー（透過波長帯域や反射波長帯域が複数あるダイクロイックミラー）など、他のタイプのビームスプリッタを備えてもよい。マルチバンドダイクロイックミラーやハーフミラーを使用すると、一つのダイクロイックミラーやハーフミラーで複数の組み合わせの光刺激用レーザ光源とイメージング用レーザ光源を使用することができる。

また、光路Ｒ１，Ｒ２の分岐箇所に配置する光学素子がハーフミラーであり、かつ他の光学素子へ切り替える必要の無い場合には、光路切替ユニット１０，１３を使用せずにハーフミラーをそのまま配置してもよい。

また、上述した顕微鏡本体１００には、１対のガルバノスキャナとして互いに異なる種類のガルバノスキャナ（制御型ガルバノスキャナ１１，共振型ガルバノスキャナ１２）が搭載されたが、同じ種類のガルバノスキャナが搭載されてもよい。但し、異なる種類のガルバノスキャナを搭載した方が、使い分けを行う自由が得られるので、より好ましい（また、ガルバノスキャナに限られず、光の向きが変えられる部材、例えば音響光学素子を用いてもよい。）。

また、上述した顕微鏡本体１００では、光路の分離数（切り替え数）とガルバノスキャナの個数とがそれぞれ２であるが、３以上に拡張し、観察の自由度をさらに高めてもよい。

また、上述した顕微鏡本体１００は、蛍光検出の機能と共焦点検出の機能との双方を搭載したレーザ走査顕微鏡であったが、蛍光検出の機能と共焦点検出の機能の一方又は双方を搭載しないレーザ走査顕微鏡にも本発明は適用可能である。

［第４実施形態］
最後に、第４実施形態として、ハーフミラーを使用した光刺激観察方法の１例を簡単に説明する。ここでは、顕微鏡本体１００の設定内容が第３実施形態のそれと同じであるとの前提で説明する。

光刺激観察の手順は、図８に示すとおりである。

（ステップ１）
コントローラ２０は、レーザユニット１の使用光源をレーザ光源３（アルゴンレーザ光源）に設定すると共に、光路切替ユニット１０，１３の設定素子をハーフミラーに設定する。なお、この時点では、レーザユニット１の出射光の強度は、イメージング用の強度（低強度）に設定されているものとする。

また、コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１の少なくとも一方のガルバノミラーを光路から外す。

（ステップ２）
コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域のイメージングを行う。イメージングで取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ３）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器２３を操作し、所望する部分領域をコンピュータ２１へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ２０へ送出される。

（ステップ４）
コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定する。また、コントローラ２０は、レーザユニット１の出射光の強度を、光刺激用の強度（高強度）に変更する。

また、コントローラ２０は、共振型ガルバノスキャナ１２の少なくとも一方のガルバノミラーを光路から外す。

（ステップ５）
コントローラ２０は、レーザユニット１及び制御型ガルバノスキャナ１１を駆動し、高強度のアルゴンレーザ光で標本１６の部分領域へ光刺激を与える。なお、このときには光検出器１９を駆動する必要は無い。

（ステップ６）
コントローラ２０は、レーザユニット１のレーザ光源３（アルゴンレーザ光源）の強度を低強度（イメージング用）に変更する。

また、コントローラ２０は、制御型ガルバノスキャナ１１の少なくとも一方のガルバノミラーを光路から外す。

（ステップ７）
コントローラ２０は、レーザユニット１、共振型ガルバノスキャナ１２、及び光検出器１９を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本１６の全観察領域のイメージングを行う。取得された標本１６の蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出される。

（ステップ８）
コンピュータ２１は、標本１６の蛍光画像データをモニタ２２へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激直後の標本１６の様子を観察することができる。コンピュータ２１は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する（以上、ステップ８）。

上述した各ステップは必要に応じて繰り返しや前段ステップへの戻りが行われる。

なお、上述したステップ５では、光刺激を１回しか行わなかったが、連続して繰り返して行ってもよい。そうすれば、より強く刺激することができる。

なお、上述したステップ７では、イメージングを１回しか行わなかったが、連続して繰り返し行ってもよい。そうすれば、連続する複数フレーム分の蛍光画像データが得られるので、光刺激直後における標本１６の時間変化を観察することが可能になる。

第１実施形態のシステムの構成図である。 第２実施形態の手順を示す図である。 第２実施形態におけるアルゴンレーザ光の光路を説明する概念図である。 第２実施形態における紫外レーザ光の光路を説明する概念図である。 第３実施形態の手順を示す図である。 第３実施形態における低強度のアルゴンレーザ光の光路を説明する概念図である。 第３実施形態における高強度のアルゴンレーザ光の光路を説明する概念図である。 第４実施形態の手順を示す図である。 （ａ）光路切替ユニットの構成を説明する図であり、（ｂ）は（ａ）の矢視Ａを示す光路切替ユニットの構成を説明する図である。

符号の説明

１…レーザユニット，７…光ファイバ，８…コリメートレンズ，９…ダイクロイックミラー，１０，１３…光路切替ユニット，１１…制御型ガルバノスキャナ，５０，５１…ターレット，５２…小歯車，５３…モータ ６１，６２…フィルタ保持部材

Claims (15)

1. 光源部と、
   前記光源部からの光を被観察面へ導き、該被観察面からの光を検出器へ導く分光手段と、
   前記分光手段と前記被観察面との間の光路を、経路の異なる複数の光路の間で切り替える光路切替手段と、
   前記複数の光路の各々へ個別に配置される複数の光偏向手段と、
   を備え、
   前記光路切替手段はターレットで構成されていることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡において、
   前記光路切替手段は、
   前記複数の光路の分岐箇所の各々へ挿脱可能なミラーを含む
   ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
3. 前記光路切替手段は、前記複数の光路の分岐箇所に各々配置され、前記各光路切替手段は同じ歯数の歯車が形成されたターレットからなり、前記歯車が互いに噛み合うように隣接配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ走査顕微鏡。
4. 光源部と、
   前記光源部からの光を被観察面へ導き、該観察面からの光を検出器へ導く分光手段と、
   前記分光手段と前記被観察面との間の光路を、経路の異なる複数の光路に分離する光路設定手段と、
   前記複数の光路の各々へ個別に配置される複数の光偏向手段と
   前記光路設定手段と前記複数の光偏向手段との間にそれぞれ配置するフィルタと
   を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
5. 請求項４に記載のレーザ走査顕微鏡において、
   前記光路設定手段は、
   前記複数の光路の分岐箇所の各々へ配置されたビームスプリッタを含む
   ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
6. 前記ビームスプリッタが複数の透過帯域を有するダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項５記載のレーザ走査顕微鏡。
7. 請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡において、前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅７０ｎｍ以上で反射率９５％以上であることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
8. 請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡において、前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅１３０ｎｍ以上で反射率９５％以上であることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
9. 請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡において、前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅２６０ｎｍ以上で反射率９５％以上であることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
10. 請求項７〜９の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーは、反射波長帯域の９０％以上の領域で反射率９８％以上であることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
11. 前記光路設定手段はターレットで構成されていることを特徴とする請求項４〜１０に記載のレーザ走査顕微鏡。
12. 前記光路設定手段は、前記複数の光路の分岐箇所に各々配置され、前記各光路設定手段は同じ歯数の歯車が形成されたターレットからなり、前記歯車が互いに噛み合うように隣接配置されていることを特徴とする請求項４〜１１に記載のレーザ走査顕微鏡。
13. 前記各フィルタは、前記光路設定手段に設けられた保持部材により保持されていることを特徴とする請求項４〜１２の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡。
14. 請求項１〜請求項１３の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡において、
    前記光源部は、
    波長の異なる複数種類の光源、複数の赤外光光源、又は複数の異なる波長の赤外光を出射する１つの光源を備える
    ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
15. 請求項１〜請求項１４の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡において、
    前記複数の光偏向手段の何れか一つが共振型ガルバノスキャナを含む
    ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

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