DE19956620A1 - Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop - Google Patents

Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop

Info

Publication number
DE19956620A1
DE19956620A1 DE19956620A DE19956620A DE19956620A1 DE 19956620 A1 DE19956620 A1 DE 19956620A1 DE 19956620 A DE19956620 A DE 19956620A DE 19956620 A DE19956620 A DE 19956620A DE 19956620 A1 DE19956620 A1 DE 19956620A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
modulated
laser
detection
fluorescence
phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE19956620A
Other languages
English (en)
Inventor
Volker Gerstner
Ralf Wolleschensky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Priority to DE19956620A priority Critical patent/DE19956620A1/de
Priority to US09/869,317 priority patent/US6741346B1/en
Priority to PCT/EP2000/011626 priority patent/WO2001038856A1/de
Priority to EP00988743A priority patent/EP1149279A1/de
Priority to JP2001540354A priority patent/JP2003515162A/ja
Publication of DE19956620A1 publication Critical patent/DE19956620A1/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Abstract

Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop, wobei die Probe von einer modulierten und/oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird und die Detektion der Fluoreszenz mindestens in zwei unterschiedlichen Phasenlagen des Detektors erfolgt.

Description

Das dargestellte Verfahren betrifft die konfokale und die 2-Photonen Fluoreszenzmikroskopie [Goeppert] [Wilson]. Beide Verfahren werden als bekannt vorausgesetzt.
Sowohl die konfokale Fluoreszenzmikroskopie als auch die 2-Photonen- Mikroskopie werden mit dem unten dargestellten Verfahren dahingehend verändert, daß ein zusätzlicher Kontrastparameter möglich wird: die Fluoreszenz-Lebensdauer.
Zeitaufgelöste Fluoreszenz bzw. die Nutzung der Lebensdauer als Kontrastparameter in der konfokalen/2-Photonen-Mikroskopie kann auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden - durch die Detektion im Zeit-Raum (time- doamin detection) und die Detektion im Frequenz-Raum (frequency-domain detection).
Bei der Time-domain Detektion [Wabnitz] [Gröbler] wird eine fluoreszierende Probe mittels gepulster Lichtquelle zur Fluoreszenz angeregt und die Fluoreszenz- Emission entweder mittels Zeit-korrelierter Einzel-Photonenzählung (Time-Correlated- Singie-Photon Counting, TCSPC) [Müller] [Han] oder Detektion mittels Verstärkungs- Zeitfenster im Detektor (Time-gated detection) [Schbg] [Cubeddu] [Dowling] zeitaufgelöst detektiert.
Bei der Detektion im Frequenzraum wird eine fluoreszierende Probe/Präparat mit einer aktiv modulierten oder auch (z. B. passiv modengekoppelten) gepulsten Lichtquelle angeregt. Da jede beliebige Modulation der Anregung durch eine Fourieranalyse in sinusförmige Komponenten zerfällt, genügt die Betrachtung einer sinusförmigen Anregung. Die Detektion im Frequenz-Raum beruht auf der Verzögerung der Fluoreszenzemission um eine Phase f und einer Änderung der Modulationstiefe M verglichen mit dem Anregungslicht in Abhängigkeit von der Modulationsfrequenz ω (= 2 π fmod) und der Lebensdauer τ.
Das resultierende Fluoreszenz-Signal oszilliert mit der Modulationsfrequenz, ist aber phasenverschoben und demoduliert. Für typische Fluoreszenz-Lebensdauern im Bereich τ = 1 . . . 10 ns sind Modulationsfrequenzen im Bereich fmod = 10 . . . 100 MHz ausreichend.
Da es im allg. nicht sinnvoll ist das Fluoreszenzsignal bei solch hohen Modulationsfrequenzen abzutasten, verwendet man einen Frequenz- Mischungsprozeß zur Erfassung des Signals. Zum Mischen eignet sich z. B. jedes Nachweiselement mit modulierbarer Verstärkung.
Im wesentlichen werden zwei Vorgehensweisen unterschieden - der Homodyne- und der Heterodyne-Nachweis.
Um das Prinzip zu verstehen betrachtet man allg. zwei "Signale" S1, S2 (z. B. S1 modulierte Anregung, S2 modulierte Verstärkung).
S1 = A0 + A1 cos(ωat + α) (3)
S2 = B0 + B1 cos(ωbt + β) (3)
Multiplikation führt zu
S1S2 = A0B0 + A0B1 cos(ωbt + β) + B0A1 cos(ωat + α) + A1B1 {cos((ωa + ωb)t + (α + β)) + cos((ωa - ωb)t + (α - β))} (4)
Homodyne-Nachweis
Ist ωa = ωb (homodyne) wird durch den Mischungsprozess der "Signale" S1 and S2 die 2te Harmonische und eine frequenzunabhängige Komponente erzeugt. Ein Tiefpassfilter führt zur Unterdrückung der Komponenten bei ωa und 2 ωa. Nur der DC-Untergrund und die phasenabhängige DC-Komponente wird detektiert. Das mittels Tiefpass (LP = LowPass) gefilterte Signal lässt sich schreiben als
LP(S1S2) = A0B0 + A1B1 cos(α - β) (5)
Bei der homodyne Detektion wird dieses frequenzunabhängige (DC-)Signal bei mehreren relativen Phasen detektiert. Um die Fluoreszenz Lebensdauer zu messen, sind mindestens 3 verschiedene Phasenstellungen notwendig. Bereits mit zwei relativen Phasenstellungen kann die durch die Fluoreszenz-Lebensdauer induzierte Phasenverschiebung bzw. die Demodulation als Kontrastparameter genutzt werden. [Clegg].
Heterodyne-Nachweis - Kreuzkorrelation
Ist ωb = ωa + Dw (heterodyne), dann wird durch den Mischungsprozess ein hochfrequentes Signal bei der Summenfrequenz und ein Signal bei der Kreuzkorrelationsfrequenz Δω erzeugt. Durch einen Tiefpassfilter werden wieder die Hochfrequenzkomponenten unterdrückt.
LP(S1S2) = A0B0 + A1B1 cos(Δωt + α - β) (6)
Bei dem Heterodyne Nachweis wird die Differenzfrequenz Δω detektiert. Phasenlage und Modulationstiefe des Signals bei der Differenzfrequenz ermöglichen die Bestimmung der Lebensdauer. Typische Kreuzkorrelationsfrequenzen liegen im Bereich von einigen Hz bis zu etwa 100 kHz.
Eine umfassendere Darstellung der Heterodyne-Technik findet man in Veröffentlichungen von E. Gratton et al. [Gratton] [Gratton2].
Sowohl bei der homodyne als auch bei der heterodyne Detektion wird die hochfrequente Änderung gleichsam auf den niederfrequenten Frequenzbereich gespiegelt.
Bei Multiexponentiellem Abklingverhalten der Fluoreszenzemission sind die aus der Modulationstiefe und Phasenverschiebung bestimmten Lebensdauern unterschiedlich. Zur präzisen Messung der Lebensdauer muss deshalb die Anregungsfrequenz variiert werden [Gratton2].
Soll hingegen die Lebensdauer z. B. in einem bildgebenden Verfahren als Kontrastparameter genutzt werden, ist dies im allgemeinen nicht erforderlich. Häufig genügt z. B. die Darstellung der Phasenverschiebung bzw. Demodulation durch die Lebensdauer bzw. die damit berechneten Lebensdauern bei einer festen Modulationsfrequenz.
1.1 Confocal lifetime imaging, homodyne
Der konfokale Aufbau eines LSM wird zur Lebensdauerabbildung dahingehend verändert, daß
  • - die Anregungslichtquelle moduliert wird oder eine Pulslaser eingesetzt wird
  • - die Verstärkung des Detektors (z. B. PMT) moduliert wird
  • - ein elektronischer Phasenschieber eingesetzt wird, der die Einstellung der relativen Phasenlage von Lichtanregung und Detektion erlaubt. Das Schema mit den verwendeten Komponenten ist in Abb. 1 dargestellt.
Realisierung 1
Mittels eines Synthesizers S getrieben durch einen Quarzkristall werden RF- Frequenzen im Bereich 10-100 MHz erzeugt. Der Ausgang des Synthesizers S wird einerseits über eine geschirmte Hochfrequenzleitung (z. B. über ein BNC Kabel) mit einem Phaseshifter/Amplifier PA verbunden. Der Phaseshifter/Amplifier verstärkt einerseits das hochfrequente Eingangssignal des Synthesizers - in der dargestellten Realisierung auf eine Leistung von ca. 1.5 W bei einem Widerstand von 50 W.
Des weiteren kann mit dem PA die Phasenlage des verstärkten RF Signals variiert werden. Über eine Steuerleitung kann die rel. Phase des PA digital eingestellt werden - z. B. durch eine Ansteuerung über eine serielle Schnittstelle eines PC. Das verstärkte RF-Signal wird einem modulierbaren PMT - z. B. dem PMT-Modul (H 6573) der Firma Hamamatsu (Eine detailliertere Darstellung der Funktionsweise ist als "Technical Information" zum H6573 der Fa. Hamamatsu erhältlich.) - zugeführt. Die verstärkte RF-Spannung (etwa 25 Vpp/50 W) wird im PMT zur 2. Dynode geführt und zur Modulation der Verstärkung des PMT benutzt. Zur Erzeugung eines definierten Tiefpaßfilters kann das Ausgangssignal des PMT's mittels handelsüblichem Low-Pass (LP) Filter geglättet werden. Die 3 dB Grenzfrequenz fg des LP Filters ist dabei so zu wählen, daß
1/Pixel-Dwelltime << fg << fLaser
mit fLaser = Laser-Modulationsfrequenz. Das so gefilterte Signal wird der Standard Detektionselektronik des LRM zugeführt. (zum Verständnis: prinzipiell z. B. einem ADC (Analog Digital Converter) der mit den xy-Scannern des LRM synchronisiert wird.)
Ein zweiter identischer Ausgang des Synthesizers S wird mit der Steuerungselektronik des Lichtmodulators M ebenfalls über eine Hochfrequenzleitung verbunden. Als Modulator kann beispielsweise ein akustooptischen Modulator im Laserstrahlengang (oder auch ein elektrooptischer Modulator) verwendet werden. Der Lichtmodulator ist Bestandteil des Lasermoduls des konfokalen LaserRasterMikroskops. Durch einen solchen Aufbau kann die relative Phasenlage von PA und Lichtmodulator M variiert werden. Die Frequenzen für M zur Modulation des Laserlichts und der PMT Verstärkungsspannung sind gleich. Die Phasenlage ist im allg, unterschiedlich. Mindestens die Phase eines RF-Ausgangs ist digital in etwa 1°-Schritten einstellbar. In dem in Abb. 1 dargestellten Fall wird die Phase der PMT Modulationsspannung durch den Phasenschieber in PA variiert.
Beschreibung der Funktionsweise und der damit verbundenen Vorteile der dargestellten Methode
Mitteis des üblichen LSM-Aufbaus wird das Licht der modulierten/gepulsten Laserlichtquelle über die Scanspiegel und der LSM-Scanoptik in die Objektebene fokussiert. Die Fluoreszenz wird wie beim konfokalen Zeiss LSM510 in Reflektionsrichtung über Farbteiler, Fokussierlinse etc. auf das Detektionspinhole fokussiert. Durch rasterförmige Bewegung des Laserfokus über die Objektebene und synchronisierter Detektion im - jetzt modulierten - PMT entsteht ein konfokales Abbild der Objektebene. Durch die Verwendung der homodyne Technik ist das PMT Signal am Ausgang des LP-Filters (Abb. 1) ein DC-Signal, das nur in Abhängigkeit der LaserSpot Position (Pixel) variiert. Durch Wiederholen des Scanvorgangs bei mehreren unterschiedlichen relativen Phasen von Lichtmodulator und Detektormodulation wird die Detektion des Fluoreszenz-Lebensdauerkontrasts bzw. die Messung der Fluoreszenz-Lebensdauer möglich. Der wesentliche Vorteil besteht darin, daß die übliche Datenaufnahmeeinheit des LRM verwendet werden kann. Die Berechnung des Lebensdauerkontrasts geschieht Bildweise.
Bildaufnahme zur Erzeugung des Lebensdauerkontrasts in einer konfokalen mikroskopischen Abbildung bzw. zur Darstellung der konfokalen Lebensdauerverteilung von Farbstoffen.
  • - In einem ersten Schritt wird in der hier dargestellten Realisierung eine erste Phase des PMT-Detektors digital eingestellt. Die Einstellung geschieht wie oben dargestellt mit dem elektronischen Phasenschieber/Amplifier PA und das Resultierende DC-Signal des PMT's (nach üblicher Strom-Spannungswandlung und Analog-Digital-Wandlung) synchron mit dem Scanner mittels üblicher (LSM-)Auswertelektronik registriert und mitteis eines Speichermediums im PC gespeichert.
  • - In mindestens einem zweiten Schritt wird das Vorgehen mit einer zweiten unterschiedlichen relativen Phasenlage wiederholt.
Mittels eines z. B. Computerbildschirms werden wahlweise die mindestens zwei digitalen Bilder ohne weitere Berechnung dargestellt.
Zur Darstellung werden auch die mit den nachfolgenden Algorithmen erzeugten Bilder auf dem Bildschirm dargestellt (Fourierentwicklung)
Die Fourierentwicklung ist gegeben durch
I(ϕ + ϕr) = a0 + a1.sin(ϕ) + b1.cos(ϕ) (7)
Mit der Fluoreszenzintensität eines Pixels I und den entsprechenden Fourierkoeffizienten a0, a1, b1.
Dabei sind a0, a1, b0 die Fourierkoeffizienten (per Pixel), N <= 2 die Anzahl der gespeicherten Phasenbilder (bzw. Pixelintensitäten) I = I(ϕ).
Die Modulationstiefe Mτ und die Phasenverschiebung durch die Lebensdauer ϕτ können durch die Fourierkoeffizienten ausgedrückt werden.
Die Modulationstiefe M wird pixelweise berechnet. M = M(i,j) = Mij. (i,j, Pixelindices). Ebenso die Phasenverschiebung ϕ = ϕ(ij) = ϕij.
Dargestellt wird auf dem Monitor das so pixelweise berechnete Abbild der Modulationstiefe Mij und die Phasenverschiebung ϕij.
Eine weitere Darstellungsart ist die τ - Abbildung, d. h. die durch Auflösung Gleichungen (9) bzw. (10) nach t berechneten Lebensdauern τ(M)i,j bzw. τ(ϕ)i,j. [Cfegg]
M bzw. ϕ werden über Gleichung (9) bzw. (10) und die mit Gleichung (8) bestimmten Fourierkoeffizienten a0, a1, b1 berechnet.
Zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Phase können auch optimierte Algorithmen verwendet werden, die in einer Arbeit von Küchel, Phasenauswertung durch Faltung, 1989 dargestellt sind.
Realisierung 2
Eine weitere Realisierung eines konfokalen Mikroskops mit Lebensdauerkontrast bzw. zur Messung der Lebensdauerverteilung in einem konfokalen Schnittbild kann unter Verwendung von Pulslasern erfolgen. Geeignet sind z. B. Pulslaserdioden oder andere z. B. fs-Lasersysteme (Ti : Saphir-Laser) z. B. mit nachgeschalteter Frequenzkonversionseinheit (z. B. Frequenzverdopplung/Verdreifachung). Bei Verwendung von Pulslasern kann auf die Erzeugung der RF-Treiberfrequenz mittels Synthesizer verzichtet werden. Stattdessen wird z. B. ein elektronisches Diodensignal des Pulslasers zur Verfügung gestellt (z. B. PD-Signal Out des fs/ps NIR-Lasers in Abb. 1 oder ein äquivalenter Aufbau durch Austauch/Erweiterung des VIS-Lasermoduls z. B. mit einem ps-Diodenlaser etc.). Das so erzeugte RF- Signal der (ausreichend schnellen) Photodiode ist a priori synchronisiert mit der Laseranregung. Das RF-Signal kann analog dem RF-Signal eines Synthesizers verwendet werden, d. h. es wird der Phasenschieber/Amplifier PA Einheit am entsprechenden Eingang (über eine RF-Leitung) zur Verfügung gestellt. Das weitere Verfahren ist analog der Realisierung 1. Vorteilhaft ist hier einerseits die Verwendung einer pulsförmigen Lichtquelle und die damit einhergehende Verbesserung des Signal-/Rauschverhältnisses in einem damit erzeugten Lebensdauerkontrasts im Vergleich zur sinusförmigen Modulation der Laseranregung in Realisierung 1 und der Verzicht auf einen Synthesizer zur Erzeugung der RF-Frequenz. Detektiert wird die Fluoreszenz nach einer 1-Photonen Anregung (linerar in der Anregungsintensität).
1.2 2-Photonen Confocal lifetime imaging, homodyne
Gegenstand dieses Kapitels ist die Kombination der 2-Photonen-Mikroskopie mit der Homodyne-Detektion zur Lebensdauerabbildung.
Die Kombination von Zeit-Auflösung und 2-Photonen-Mikroskopie wurde bereits von Gratton mit der sog. Heterodyne-Technik demonstriert [So]. Bei der Heterodyne Technik wird ein fs-Laser zur Fluoreszenz-Anregung in einem 2-Photonen-Mikroskop verwendet und der PMT-Detektor mit einer leicht unterschiedlichen Modulationsfrequenz betrieben. Die typische Wiederholrate von fs-Ti : Saphir-Lasern liegt im Bereich von 80 MHz. In [So] wird zur Verstärkungsmodulation des PMT- Detektors eine Frequenz von 80 MHZ + 25 kHz verwendet. Dadurch entsteht eine Schwebung. Diese Schwebung wird mit einer ADC-Karte digitalisiert und abgetastet. Dadurch ist eine pixelweise Erfassung der Phasenverschiebung von Anregung und Fluoreszenz möglich (Heterodyne-Verfahren).
In dem hier dargestellten Aufbau wird im Unterschied zu [So] nicht pixelweise sondern Bildweise die Phasenverschiebung bestimmt, d. h. Zuerst ein Bild bei einer relativen Phasenverschiebung ϕ1 aufgenommen und gespeichert. In mindestens einem weiteren Schritt wird danach bei einer weiteren unterschiedlichen relativen Phase ϕ2 ein Bild erzeugt. (Homodyne Verfahren).
Das Berechnen der diversen Bilder zur Darstellung des Kontrasts geschieht analog Kapitel 1.1.
Vorgehensweise
Eine gefärbte oder selbst fluoreszierende Probe wird zur Fluoreszenz über eine Zwei-Photonen-Absorption angeregt. Bei dem gepulsten Laser kann es sich z. B. um einen Ti : Saphir laser (auch evtl. frequenzverdoppelt, frequenzverdreifacht Summen oder Diffrerenz frequenzgemischt etc.), eine ps-Laserdiode oder um einen z. B. mittels AOM oder EOM pulsförmig modulierten Laser handeln. Der physikalische Prozess ist in 1.1. eine 1-Photonenanregung in 1.2 eine 2-Photonenanregung (oder allg. Multiphotonenanregung). Zur Anregung der Fluoreszenz in der Realisierung nach Abb. 1 wird ein fs-Ti : Saphirlaser verwendet. Die Wiederholrate des fs- Lasers liegt bei etwa 80 MHz (NLO-LSM, Fluoreszenz-Detektion).
Zur Detektion wird ein modulierbarer PMT-Detektor der Fa. Hamamatsu (H6573) verwendet. Die sinusförmige Modulationsfrequenz wird über eine ECL- Logikschaltung aus einem Photodiodensignal des Lasers (fs-Mira, Fa. Coherent) generiert und mittels eines im Phaseshifters/Amplifiers PA integrierten RF- Verstärkers auf eine mittlere Leistung von 1.5 W @ 50 W verstärkt und steht am Ausgang RF out des PA zur Verfügung. Die Phase des generierten Sinus (und damit des verstärkten Sinus) ist auf etwa 1° einstellbar (analog Kapitel 1.1). Der elektronische Jitter ist < 100 ps (Abb. 1), Phasenschieber/RF Amplifier). Mit dem verstärkten Sinus mit der der Laserwiederholrate entsprechenden Frequenz (frep = fmod) wird die Verstärkung des PMT-Detektors moduliert. Dazu wird die verstärkte RF-Frequenz dem in Abb. 1 als "RF-Modulation In" bezeichneten Eingangs des PMT-Moduls zur Verfügung gestellt. Der Strom am Ausgang des PMT- Detektors wird über einen passiven LP-Filter geglättet oder über eine Integrationsschaltung auf andere Art und Weise integriert. Das resultierende DC- Signal wird wieder der Detektionseinheit eines LRM zur Verfügung gestellt.
Die weitere Datenaufnahme und Auswertung geschieht analog Kapitel 1.1.
Der Unterschied zu 1.1 liegt darin, daß in einem Fall ein 2-Photonen (NLO) LSM mit der Lebensdauerabbildung kombiniert wird - d. h. die Fluoreszenzanregung geschieht mit einem fs- oder ps-Pulslaser. Ein wesentlicher Unterschied besteht also durch die Art der Fluoreszenzanregung (hier 2 oder allg. MehrPhotonen (<2) Anregung.
1.3 Anordnung zur phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektion in einem Laser Scanning Mikroskop
Bei einer 2/multi Photonen Anregung ist der Einsatz von effizienteren Detektionseinrichtungen aufgrund der tiefendiskrimierten Anregung möglich. Diese sind in der Literatur unter dem Sammelbegriff der nicht-descannten Detektion beschrieben.
Dies ist schematisch in Abb. 2 dargestellt, die an der Scanlinse SL und dem Scanner von Abb. 1 ansetzt und einen mikroskopischen Strahlengang darstellt, mit der Probe P, der Objektivlinse OL, dem Strahlteiler ST zur Einkopplung der Beleuchtung/Aus­ kopplung der von der Probe kommenden Strahlung sowie eine erste Tubuslinse TL1.
Über eine zweite Tubuslinse TL2 wird in einem Detektionsstrahlengang DE mit einem weiteren modulierbaren PMT direkt, d. h. nicht über den Scanstrahlengang, detektiert.
Dieser ist mit der Steuereinheit ST in Abb. 1 und über diese mit weiteren Einheiten in Abb. 1 verbunden.
Ein wesentlicher Nachteil dieser Detektionseinrichtungen besteht generell in der höheren Raumlichtempfindlichkeit. Da das Raumlicht im allgemeinen nicht/oder verschieden vom Anregungslicht moduliert ist, ist der Einsatz von phasenempfindlichen Nachweiseinrichtungen zur Unterdrückung des Raumlichtes sinnvoll. Somit entfällt die aufwendige Kapselung der Detektionseinheit. Anordnungen bei 1 und 2/multi Photonen-Anregung wurden bereits oben beschrieben und sind vollständig auf einen phasenempfindlichen Detektor übertragbar. Jedoch besitzt beim phasenempfindlichen Nachweis das Referenzsignal (Anregungslicht) und das Meßsignal (Fluoreszenzsignal) die gleiche Modulation. Für die meist verwendeten TiSa Lasersysteme beträgt diese Modulation 80 Mhz. Somit findet eine homodyne Detektion statt. Zum phasenempfindlichen Nachweis werden beide Signale in einem Multiplikator mit einer festen einstellbaren Phasenbeziehung miteinander multipliziert. In einer vorteilhaften Anordung fungiert als Multiplikator die erste Dynode eines modulierbaren Photomultipliers (H6573). Das Referenzsignal wird von dem oben dargestellten Phasenschieber/ RF Verstärker erzeugt. Die Clock für den Phasenschieber ist das Photodiodensignal des Pulslasers. Zusätzlich kann durch "Beaten" des Laserlichts mit einem optischen Modulator (AOM oder EOM, siehe Abb. 1) die durch den Pulslaser vorgegebene Wiederholfrequenz (Repetitionsrate) auf einen variablen Beat- Frequenzbereich ausgedehnt werden. Die Beat-Frequenz wird durch einem Synthesizer mit einstellbarer Phase, der durch Triggersignale der Anregungslichtquelle gesteuert wird, bereitgestellt (siehe Abb. 1).
Die Phasenbeziehung zwischen Referenz- und Meßsignal wird so eingestellt, daß die Phasenverschiebung null beträgt. Somit findet eine Demodulation der Meßgröße statt. Man erhält somit ein DC bzw. niederfrequent moduliertes Meßsignal. Störgrößen wie Raumlicht sind nach dem Multiplikator jedoch stark moduliert (wie Referenzsignal ca. 80 Mhz). Durch den nachgeschalteten Tiefpaßfilter werden die hochmodulierten Anteile (Störgrößen) herausgefiltert und somit unterdrückt. Bsp. für ein Tiefpaßfilter ist die Nachweiselektronik eines herkömmlichen LSM.
Der Vorteil der beschriebenen Anordnung besteht darin, daß die Elektronik auf der Detektionsseite nur für Niederfrequente Signale ausgelegt werden muß, da die Demodulation bereits im Photomultipier stattfindet.
Literaturverzeichnis
[Wabnitz] H. Wabnitz
Verfahren zur Bestimmung von Calciumionenkonzentration in Zellen Offenlegungsschrift DE 41 04 014, Anmeldetag 9. 02. 91;
[Gröbler] B. Gröbler
Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufs der Fluoreszenzstrahlung Patent DE 36 14 359 C2;
[Müller] R. Müller, M. Sauer, C. Zander
System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung Patent WO 98/09154;
[Han] K.-T. Han, M. Köllner, M. Sauer, S. Seeger, J. Wolfrum, C. Schmitt, A. Schulz
Verfahren zur optischen Sortierung von Kunststoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie Offenlegungsschrift DE 42 31 477 A1, Anmeldetag 19. 09. 92;
[Schbg] H. Schneckenburger, K. König, T. Dienersberger R. Hahn
Time - gated microscopic imaging and spectroscopy in medical diagnosis and photobiology Optoical Engineering 33 (8) 2600 (1994);
[Cubeddu]] R. Cubeddu, G. Canti, A. Pifferi, P. Taroni, G. Valentini
A real time system for fluortescence lifetime imaging SPIE 2976 (1997) 98;
[Dowling] K. Dowling, S. C. W. Hyde, N. P. Barry, J. C. Dainty, P. M. W. French
Two dimensional fluorescence lifetime imaging using a 5 kHz/110 ps gated Image intensifier (WWW);
[Clegg] P:C: Schneider, R. M. Clegg
Rapid acquisition, analysis and display of fluorescence lifetime-resolved images for real time applications Rev. Sci. Instrum. 68 (11) 4107 (1997);
[Gratton] E. Gratton, M. Limkeman
A continuously variable frequency cross-correlation phase föuorometer with picosecond resolution Biophys. J. 44 (1983) 315;
[Gratton2] E. Gratton, D. M. Jameson, R. D. Hall
Multifrequency phase and modulation fluorometry Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 13 (1984) 105;
[So] P. T. C So, T. French, W. M. Yu, K. K. Berland, C. Y. Dong, E. Gratton
Time resolved fluorescence microscopy using two photon excitation Bioimaging 3 (1995) 49;
[Goeppert] M. Göppert-Mayer
Ann. Physik 9, 273 (1931);
[Wilson] T. Wilson
Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy Academic Press, 1984;
[Wabnitz] H. Wabnitz
Verfahren zur Bestimmung von Calciumionenkonzentration in Zellen Offenlegungsschrift DE 41 04 014, Anmeldetag 9. 02. 91;
[Gröbler] B. Gröbler
Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufs der Fluoreszenzstrahlung Patent DE 36 14 359 C2;
[Müller] R. Müller, M. Sauer, C. Zander
System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung Patent WO 98/09154;
[Han] K.-T. Han, M. Köllner, M. Sauer, S. Seeger, J. Wolfrum, C. Schmitt, A. Schulz
Verfahren zur optischen Sortierung von Kunststoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie Offenlegungsschrift DE 42 31 477 A1, Anmeldetag 19. 09. 92;
[Schbg] H. Schneckenburger, K. König, T. Dienersberger R. Hahn
Time-gated microscopic imaging and spectroscopy in medical diagnosis and photobiology Optoical Engineering 33 (8) 2600 (1994);
[Cubeddu]] R. Cubeddu, G. Canti, A. Pifferi, P. Taroni, G. Valentini
A real time system for fluortescence lifetime imaging SPIE 2976 (1997) 98;
[Dowling] K. Dowiing, S. C. W. Hyde, N. P. Barry, J. C. Dainty, P. M. W. French
Two dimensional fluorescence lifetime imaging using a 5 kHz/110 ps gated image intensifier (WWW);
[Clegg] P:C: Schneider, R. M. Clegg
Rapid acquisition, analysis and display of fluorescence lifetime-resolved images for real time applications Rev. Sci. Instrum. 68 (11) 4107 (1997);
[Gratton] E. Gratton, M. Limkeman
R continuously variable frequency cross-correlation phase föuorometer with picosecond resofution Biophys. J. 44 (1983) 315;
[Gratton2] E. Gratton, D. M. Jameson, R. D. Hall
Multifrequency phase and modulation fluorometry Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 13 (1984) 105;
[So] P. T. C So, T. French, W. M. Yu, K. K. Berland, C. Y. Dong, E. Gratton
Time resolved fluorescence microscopy using two photon excitation Bioimaging 3 (1995) 49.

Claims (19)

1. Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop,
wobei die Probe von einer modulierten und/oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird,
und die Detektion der Fluoreszenz mindestens in zwei unterschiedlichen Phasenlagen des Detektors erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei für die Phasenlagen jeweils ein Bild erzeugt wird.
3. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erzeugten Bilder oder aus diesen Bildern berechnete Bilder auf einem Monitor dargestellt werden.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Beleuchtung und Detektion über ein Laser-Scanning-Mikroskop erfolgt.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Detektion mit einem modulierbaren PMT erfolgt.
6. Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop,
wobei die Probe von einer modulierten und/oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird,
wobei ein dem modulierten und/oder gepulsten Laser entsprechendes Referenzsignal und ein einer modulierten Detektion entsprechendes Meßsignal mit einer fest einstellbaren Phasenbeziehung miteinander multipliziert werden und das Ergebnis zur bildlichen Darstellung dient.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Phasenbeziehung so eingestellt, daß die Phasenverschiebung Null beträgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, mit nicht descannter Detektion.
9. Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der obengenannten Ansprüche auf die Multiphotonen Anregung von Fluoreszenzemission, insbesondere Zweiphotonenanregung
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines mittels akustooptischen Modulators (AOM) modulierten cw- Lasers.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines mittels Pockelszeile modulierten cw-Lasers.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers, welcher zusätzlich moduliert wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers, welcher zusätzlich mittels AOM moduliert wird.
14. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers, welcher zusätzlich mittels einer Pockelszelle moduliert wird.
15. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung zur Zeitauflösung von Multiphotonenprozessen wie Second Harmonic Generation an Oberflächen oder Zweiphotonenanregung.
16. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers.
17. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers mit nachfolgender Frequenzkonversion zur 1-Photonen Anregung.
18. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers mit nachfolgender Frequenzkonversion zur 1-Photonen Anregung von Fluoreszenz.
19. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung des phasensensitiven Nachweises zur Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses.
DE19956620A 1999-11-25 1999-11-25 Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop Ceased DE19956620A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19956620A DE19956620A1 (de) 1999-11-25 1999-11-25 Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop
US09/869,317 US6741346B1 (en) 1999-11-25 2000-11-22 Method for detecting fluorescence phenomena in microscope
PCT/EP2000/011626 WO2001038856A1 (de) 1999-11-25 2000-11-22 Verfahren zur erfassung von fluoreszenzerscheinungen in einem mikroskop
EP00988743A EP1149279A1 (de) 1999-11-25 2000-11-22 Verfahren zur erfassung von fluoreszenzerscheinungen in einem mikroskop
JP2001540354A JP2003515162A (ja) 1999-11-25 2000-11-22 顕微鏡内蛍光現象の把握方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19956620A DE19956620A1 (de) 1999-11-25 1999-11-25 Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19956620A1 true DE19956620A1 (de) 2001-05-31

Family

ID=7930229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19956620A Ceased DE19956620A1 (de) 1999-11-25 1999-11-25 Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6741346B1 (de)
EP (1) EP1149279A1 (de)
JP (1) JP2003515162A (de)
DE (1) DE19956620A1 (de)
WO (1) WO2001038856A1 (de)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10222359A1 (de) * 2002-05-21 2003-12-11 Max Planck Gesellschaft Verfahren und Vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht
DE10253108A1 (de) * 2002-11-13 2004-05-27 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop und Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts
DE102006046369A1 (de) * 2006-09-29 2008-04-03 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie
DE102010016395A1 (de) * 2010-04-12 2011-10-13 Becker & Hickl Gmbh Verfahren zur Aufzeichnung von Phosphoreszenz- und Fluoreszenz-Lifetime-Bildern in Laser-Scanning-Systemen
DE102010019095A1 (de) * 2010-04-30 2011-11-03 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzlebensdauermessung
DE102012216164A1 (de) * 2012-09-12 2014-03-13 Forschungsverbund Berlin E.V. Vorrichtung mit einer Anordnung optischer Elemente
DE102010035003B4 (de) * 2010-08-20 2015-08-06 PicoQuant GmbH. Unternehmen für optoelektronische Forschung und Entwicklung Räumlich und zeitlich hochauflösende Mikroskopie
DE102018129833A1 (de) * 2017-12-04 2019-06-06 Leica Microsystems Cms Gmbh Mikroskopsystem, Detektionseinheit für Mikroskopsystem und Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe
DE102004017956B4 (de) 2004-04-14 2022-07-07 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe
DE102022122092A1 (de) 2022-08-31 2024-02-29 Pyroscience Gmbh Referenz-Messung

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041986B2 (en) * 2002-03-14 2006-05-09 University Of Maryland Baltimore County Device for discrimination of fluorescence lifetimes and uses therefor
US7582882B2 (en) * 2003-01-23 2009-09-01 Horiba Jobin Yvon, Inc. Solid state multi frequency fluorometric measurements system and method
US7297962B2 (en) * 2003-01-23 2007-11-20 Horiba Jobin Yvon, Inc. Method for performing spacially coordinated high speed fluorometric measurements
WO2004065997A2 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Jobin Yvon Inc. Microscope for performing multiple frequency fluorometric measurements
US7332700B2 (en) * 2004-04-26 2008-02-19 Bruce Masato Ishimoto Photomultiplier tube with dynode modulation for photon-counting
DE102005022880B4 (de) * 2005-05-18 2010-12-30 Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern
DE102008018475A1 (de) * 2008-04-11 2009-10-15 Carl Zeiss Ag Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung
DE102009029831A1 (de) 2009-06-17 2011-01-13 W.O.M. World Of Medicine Ag Vorrichtung und Verfahren für die Mehr-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie zur Gewinnung von Informationen aus biologischem Gewebe
AU2011217070B2 (en) * 2010-02-19 2014-12-11 Glysure Ltd Intravascular glucose sensor
US8866107B2 (en) 2011-01-19 2014-10-21 Howard Hughes Medical Institute Wavefront compensation for deep tissue optical microscopy
JP6006053B2 (ja) * 2012-09-06 2016-10-12 アストロデザイン株式会社 レーザー走査蛍光顕微鏡装置
CN103257130B (zh) * 2013-05-31 2015-04-01 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 受激辐射损耗显微成像系统
WO2016124197A2 (de) * 2015-02-06 2016-08-11 Unisensor Sensorsysteme Gmbh Verfahren und vorrichtung zur identifizierung von kunststoffen und/oder deren additiven
WO2017222670A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 University Of Virginia Patent Foundation Fiber-optic based material property measurement system and related methods
WO2020106972A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Wide-field nanosecond imaging methods using wide-field optical modulators

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD254998A1 (de) 1985-07-26 1988-03-16 Zeiss Jena Veb Carl Anordnung zur bildlichen darstellung und analyse von fluoreszenzsignalen
US5034613A (en) * 1989-11-14 1991-07-23 Cornell Research Foundation, Inc. Two-photon laser microscopy
GB9000740D0 (en) 1990-01-12 1990-03-14 Univ Salford Measurement of luminescence
DD292084A5 (de) 1990-02-16 1991-07-18 Friedrich-Schiller-Iniversitaet,De Verfahren zur rastermikroskopischen bestimmung von calciumionenkonzentration in zellen
DE69132273D1 (de) * 1990-10-10 2000-08-03 Univ Maryland Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von lebensdauer von fluoreszenz in der durchflusscytometrie
EP0568596A1 (de) * 1991-01-24 1993-11-10 The University Of Maryland Verfahren und gerät zur mehrdimensionalen abbildung mit verwendung der phasenfluoreszenzlebzeit
DE4231477A1 (de) 1992-09-19 1994-03-24 Han Kyung Tae Verfahren zur optischen Sortierung von Kunststoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie
DE19634873A1 (de) 1996-08-29 1998-03-12 Boehringer Mannheim Gmbh System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAWLEY,James B., (Hrsg.: Handbook of Bilogical Confocal Microscopy, Plenum Press, New York, London, 1995 *
WANG,Xue Feng,HERMAN,Brain, (Hrsg.): Fluorescence Imaging Spectroscopy ans Microscopy, John Wiley & Sons, Inc., New York, et.al., 1996 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10222359A1 (de) * 2002-05-21 2003-12-11 Max Planck Gesellschaft Verfahren und Vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht
DE10222359B4 (de) * 2002-05-21 2005-01-05 Max Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht
US7304733B2 (en) 2002-05-21 2007-12-04 Max-Planck-Gesellschaft Method and device for conducting the spectral differentiating, imaging measurement of fluorescent light
DE10253108A1 (de) * 2002-11-13 2004-05-27 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop und Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts
DE10253108B4 (de) * 2002-11-13 2005-11-03 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop und Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts
DE102004017956B4 (de) 2004-04-14 2022-07-07 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe
US8399857B2 (en) 2006-09-29 2013-03-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Luminescence microscopy with enhanced resolution
DE102006046369A1 (de) * 2006-09-29 2008-04-03 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie
DE102010016395A1 (de) * 2010-04-12 2011-10-13 Becker & Hickl Gmbh Verfahren zur Aufzeichnung von Phosphoreszenz- und Fluoreszenz-Lifetime-Bildern in Laser-Scanning-Systemen
DE102010016395B4 (de) * 2010-04-12 2015-08-20 Becker & Hickl Gmbh Verfahren zur Aufzeichnung von Phosphoreszenz- und Fluoreszenz-Lifetime-Bildern in Laser-Scanning-Systemen
DE102010019095A1 (de) * 2010-04-30 2011-11-03 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzlebensdauermessung
US8487275B2 (en) 2010-04-30 2013-07-16 Deutsches Zentrum fur-Luft-und Raumfahrt e.V. Method and a device for measuring fluorescence lifetime
DE102010019095B4 (de) * 2010-04-30 2016-12-08 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzlebensdauermessung
DE102010035003B4 (de) * 2010-08-20 2015-08-06 PicoQuant GmbH. Unternehmen für optoelektronische Forschung und Entwicklung Räumlich und zeitlich hochauflösende Mikroskopie
DE102012216164A1 (de) * 2012-09-12 2014-03-13 Forschungsverbund Berlin E.V. Vorrichtung mit einer Anordnung optischer Elemente
DE102012216164B4 (de) * 2012-09-12 2016-04-28 Forschungsverbund Berlin E.V. Vorrichtung mit einer Anordnung optischer Elemente
DE102018129833A1 (de) * 2017-12-04 2019-06-06 Leica Microsystems Cms Gmbh Mikroskopsystem, Detektionseinheit für Mikroskopsystem und Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe
DE102018129833B4 (de) 2017-12-04 2020-01-02 Leica Microsystems Cms Gmbh Mikroskopsystem, Detektionseinheit für Mikroskopsystem und Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe
DE102022122092A1 (de) 2022-08-31 2024-02-29 Pyroscience Gmbh Referenz-Messung

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003515162A (ja) 2003-04-22
US6741346B1 (en) 2004-05-25
WO2001038856A1 (de) 2001-05-31
EP1149279A1 (de) 2001-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19956620A1 (de) Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop
Gratton et al. Fluorescence lifetime imaging for the two-photon microscope: time-domain and frequency-domain methods
Periasamy et al. Time‐resolved fluorescence lifetime imaging microscopy using a picosecond pulsed tunable dye laser system
EP1898245B1 (de) Anordnung zur Erhöhung der Tiefendiskriminierung optisch abbildender Systeme
DE19829981C2 (de) Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie
DE3614359C2 (de) Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufes der Fluoreszenzstrahlung
Cole et al. Time‐domain whole‐field fluorescence lifetime imaging with optical sectioning
Dong et al. Fluorescence lifetime imaging by asynchronous pump-probe microscopy
DE102006056429B3 (de) Lasermikroskop mit räumlich trennendem Strahlteiler
US9001321B2 (en) Microscope and observation method
EP2483730B1 (de) Verfahren zum erzeugen von bildern mit erweitertem dynamikumfang und optisches gerät zur durchführung eines solchen verfahrens, insbesondere laser-scanning-mikroskop
CN106990089B (zh) 同步降频的相干反斯托克斯拉曼散射成像系统及成像方法
DE102008018475A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung
DE10033180B4 (de) Verfahren zur Detektion von Farbstoffen in der Fluoreszenzmikroskopie
DE10225838A1 (de) Verfahren zur Scanmikroskopie, Scanmikroskop und Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles
US9404867B2 (en) Luminescence microscopy
Eibl et al. Single pulse two photon fluorescence lifetime imaging (SP-FLIM) with MHz pixel rate
CN111971606B (zh) 具有高空间分辨率的时间分辨成像方法
DE112015006288B4 (de) Optische Messvorrichtung und optisches Messverfahren
French et al. Fluorescence lifetime imaging techniques for microscopy
Zhao et al. Parallel excitation-emission multiplexed fluorescence lifetime confocal microscopy for live cell imaging
Chen et al. A practical implementation of multifrequency widefield frequency‐domain fluorescence lifetime imaging microscopy
Schlachter et al. mhFLIM: resolution of heterogeneous fluorescence decays in widefield lifetime microscopy
DE10056384C2 (de) Vorrichtung zur Messung der Lebensdauer eines angeregten Zustandes in einer Probe und Verwendung der Vorrichtung
EP2624743A2 (de) Verwendung einer kombination von auswertungsverfahren in einer vorrichtung zur detektion von tumoren sowie vorrichtung zur detektion von tumoren

Legal Events

Date Code Title Description
OM8 Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law
8110 Request for examination paragraph 44
8131 Rejection