DE10225838A1

DE10225838A1 - Verfahren zur Scanmikroskopie, Scanmikroskop und Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles

Info

Publication number: DE10225838A1
Application number: DE10225838A
Authority: DE
Inventors: Rafael Storz; Volker Seyfried
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2022-06-12
Also published as: US7133130B2; US20030226977A1; DE10225838B4

Abstract

Ein Verfahren zur Scanmikroskopie, das durch den Schritt des Erzeugens eines Beleuchtungslichtstrahles, der zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet, wobei zumindest das erste Licht eine Codierung aufweist, des Beleuchtens einer Probe mit dem Beleuchtungslichtstrahl und des Decodierens des von der Probe ausgehenden Detektionslichts gekennzeichnet ist, ist offenbart. Außerdem offenbart die Erfindung ein Scanmikroskop und eine Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Scanmikroskopie.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop mit zumindest einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahles, der auf eine Probe richtbar ist und zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles, welche sich auch außerhalb der bzw. unabhängig von der Scanmikroskopie einsetzen lässt.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y- Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.

Bei vielen Anwendungen werden Proben mit mehreren Markern, beispielsweise mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen präpariert. Diese Farbstoffe können sequentiell, beispielsweise mit Beleuchtungslichtstrahlen, die unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen, angeregt werden. Auch eine simultane Anregung mit einem Beleuchtungslichtstrahl, der Licht mehrerer Anregungswellenlängen beinhaltet, ist üblich. Aus der Europäischen Patentanmeldung EP 0 495 930: "Konfokales Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz" ist beispielsweise ein Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. Derzeit sind in der Praxis solche Laser meist als Mischgaslaser, insbesondere als ArKr-Laser, ausgebildet.

Bei der Analyse der aufgenommenen Bilddaten ist es wichtig zuordnen zu können, welche Detektionssignale auf welchen Marker bzw. Fluoreszenzfarbstoff zurück zu führen sind. Dies funktioniert besonders zuverlässig und reproduzierbar, wenn jeder Fluoreszenzfarbstoff ein für sich spezifisches Emissionsspektrum besitzt, das mit keinem der anderen Emissionsspektren überlappt. In diesem Fall lassen sich die einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig anregen, und das nach den einzelnen Fluoreszenzfarbstoffen spektral aufgespaltene detektierte Licht spiegelt die Verteilung der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe wider. Zur Detektion wird hierbei oft ein Multibanddetektor verwendet, wie er beispielsweise aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 199 02 625 A1 bekannt ist.

Überlappen allerdings die Emissionsspektren der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe, dann lassen sich die Verteilungen der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe optisch nicht mehr sauber voneinander trennen, wenngleich man durch mathematische Verfahren anhand der aufgenommenen Daten eine Trennung der Farbstoffe bis zu einem gewissen Grad erreichen kann.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Scanmikroskopie vorzuschlagen, das zuverlässig und effizient eine Zuordnung von gemessenen Detektionssignalen zu verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe insbesondere auch dann ermöglicht, wenn die Emissionsspektren der Fluoreszenzfarbstoffe überlappen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, dass durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

- Erzeugen eines Beleuchtungslichtstrahles, der zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet, wobei zumindest das erste Licht eine Codierung aufweist,
- Beleuchten einer Probe mit dem Beleuchtungslichtstrahl,
- Decodieren von des der Probe ausgehenden Detektionslichts.

Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, mit dem zuverlässig und effizient eine Zuordnung von gemessenen Detektionssignalen zu verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe insbesondere auch dann möglich ist, wenn die Emissionsspektren der Fluoreszenzfarbstoffe überlappen.

Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Codiervorrichtung zum Codieren von zumindest dem ersten Licht und eine Decodiervorrichtung zum Decodieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichts vorgesehen ist.

Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles, der zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet, anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zum Codieren mit einem akustooptischen Bauteil gelöst.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass auf einfache und effiziente Weise bei mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen eingefärbten Proben die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe in den aufgenommenen Bildern voneinander unterschieden werden können.

Durch eine geeignete Codierung sowie die zugehörige spätere Decodierung der gleichzeitig eingestrahlten Anregungslichtquellen wird ein weiteres Unterscheidungsmerkmal der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe, nämlich die Tatsache, dass sich in der Regel auch die Anregungsspektren der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe voneinander unterscheiden, ausgenutzt. Besonders einfach gestaltet sich das Verfahren - wobei es nicht auf diesen Spezialfall eingeschränkt ist, wenn das erste und das zweite Licht, die unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen, jeweils auch nur einen einzelnen der in der Probe befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe anregen. Dann bedeutet die Zuordnung von detektiertem Fluoreszenzlicht zu einer bestimmten Anregungswellenlänge auch automatisch die Zuordnung zu einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff, so dass die Verteilung der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe direkt bestimmt werden kann. Hierzu müssen allerdings die einzelnen Anteile des detektierten Fluoreszenzlichts jeweils den zugehörigen Anregungswellenlängen zugeordnet werden können.

Damit dies möglich ist, muss die Information darüber, welcher Licht-Anteil des Beleuchtungslichtstrahles das Fluoreszenzlicht erzeugt hat, im Detektionslicht codiert vorhanden sein.

In einer speziellen Ausführung beinhaltet die Probe einen ersten Fluoreszenzfarbstoff, der mit dem ersten Licht anregbar ist und einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff, der mit dem zweiten Licht anregbar ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in einer bevorzugten Ausgestaltung die weiteren Schritte des Ermittelns eines ersten Anteils des Detektionslichtes, der von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff ausgeht und des Ermittelns zumindest eines zweiten Anteils des Detektionslichtes, der von dem zweiten Fluoreszenzfarbstoff ausgeht.

Die Codierung des Beleuchtungslichtstrahles kann auf unterschiedliche Arten erfolgen und ist somit an die individuellen Anforderungen der zu untersuchenden Probe und der durchzuführenden Experimente anpassbar.

In einer bevorzugten Variante umfasst die Codierung eine zeitliche Codierung der Pulsfolgezeit eines zumindest bezüglich des ersten Lichtes gepulsten Beleuchtungslichtstrahles.

Zur zeitlichen Codierung umfasst die Lichtquelle, die den Beleuchtungslichtstrahl erzeugt, vorzugsweise mehrere Pulslaser, die in fortwährender Repetition aufeinanderfolgend zu unterschiedlichen Zeiten nacheinander Lichtpulse emittieren, die unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen. Die zeitliche Codierung erfolgt beispielsweise indem man verschiedene Pulslaser, Laserdioden oder LEDs zeitverzögert synchronisiert triggert. Es ist auch möglich (z. B. mit Hilfe von optisch parametrischen Oszillatoren oder Verstärkern; OPOs bzw. OPAs oder durch auf mehreren Wellenlängen gleichzeitig laufenden Lasern) verschiedene Anregungswellenlängen gleichzeitig gepulst zu erzeugen und dann beispielsweise durch unterschiedliche Laufwege eine Zeitverzögerung zu erzeugen, so dass die Codierung eine Festlegung einer zeitlichen Reihenfolge der Pulse des ersten und des zweiten Lichtes beinhaltet. Das Licht mit den codierten Licht-Anteilen (erstes Licht, zweites Licht, . . .) verschiedener Anregungswellenlängen wird vereinigt und im Scanmikroskop, bzw. konfokalen Scanmikroskop, zur Probenanregung eingesetzt.

In einer anderen Variante beinhaltet die Codierung eine Amplitudencodierung, deren zeitlicher Verlauf bei der Decodierung wiedererkennbar ist.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsvariante beinhaltet die Codierung eine Frequenzcodierung. Eine Frequenzcodierung ist auf verschiedene Weisen realisierbar.

Zur Frequenzcodierung können die unterschiedenen Anteile des Beleuchtungslichtstrahles unterschiedlicher Anregungswellenlängen mit einer jeweils unterschiedlichen Frequenz moduliert werden. Dies kann dadurch erfolgen, dass die einzelnen Licht-Anteile einzeln moduliert werden (z. B. durch akustooptische, elektrooptische, mechanische Modulatoren, etc.) und ihr Licht anschließend vereinigt wird. In einer anderen bevorzugten Ausführung wird das bereits vereinigte Licht der unterschiedlichen Anregungswellenlängen wellenlängenabhängig frequenzmoduliert. Das folglich ebenfalls frequenzmodulierte Fluoreszenzlicht kann durch eine Decodierung mittels üblicher Demodulatoren (z. B. aus der Radiotechnik, Lockin-Verstärkern oder digital nach A/D-Wandlung) in die zu den einzelnen Frequenzen d. h. Anregungswellenlängen gehörenden Anteile zerlegt werden.

Eine besonders vorteilhafte Vorrichtung zur Codierung und Modulation nutzt aus, dass bei der Beugung von Licht an laufenden Wellen ein Impulsübertrag an die Lichtwelle stattfindet und sich die Frequenz des gebeugten Lichts durch die Beugung ändert. Eine solche Beugung an laufenden Wellen findet, wie bereits erwähnt, in akustooptischen Bauteilen statt.

In einer bevorzugen Ausgestaltung beinhaltet die Codiervorrichtung zur Frequenzcodierung ein akustooptisches Bauteil oder einen elektrooptischen Modulator. Das akustooptische Bauteil ist vorzugsweise als akustooptischer Filter (AOTF) ausgestaltet. Akustooptische Filter sind weithin bekannt. Nur beispielsweise ist hier die Deutsche Offenlegungsschrift DE 197 13 254 zu nennen. In akustooptischen Modulatoren (AOTF; acoustooptic tunable filter) wird mit Hilfe eines Schallerzeugers, beispielsweise einem Piezoelement, das von einer elektromagnetischen Steuerfrequenz angesteuert wird, eine akustische Welle erzeugt, die den AOTF durchläuft und an dem eine Lichtwelle beugbar ist. Akustooptische Filter sind idealer Weise derart aufgebaut, dass nur der Anteil der zur Steuerfrequenz korrespondierenden Wellenlänge von dem übrigen einfallenden Licht durch Beugung getrennt wird.

Von einem AOTF wird nur Licht bestimmter Wellenlängen gebeugt, wobei sich die Wellenlänge des gebeugten Lichts durch die Frequenz der in den akustooptischen Kristall eingestrahlten akustische Welle festlegen lässt und die Effizienz der Beugung durch die Amplitude der eingestrahlten akustischen Welle bestimmt ist. Mit Hilfe eines AOTFs lassen sich nicht nur bestimmte Wellenlängen ablenken, es ändert sich außerdem die Wellenlänge des abgelenkten Lichts in einer typischen Größenordnung von ca. 10 MHz-100 MHz, wobei die Wellenlängenänderung von der Frequenz der in den AOTF eingespeisten akustischen Welle abhängt, welche wiederum von der abgelenkten Wellenlänge abhängt. Das heißt, für jede Wellenlänge ist die Wellenlängenänderung eine andere.

In einer bevorzugen Ausgestaltung des Scanmikroskops bzw. der Vorrichtung zur Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles ist ein Strahlteiler vorgesehen, der den Beleuchtungslichtstrahl in einen ersten und einen zweiten Teilstrahl aufspaltet, und ein Strahlvereiniger, der den ersten und den zweiten Teilstrahl zumindest teilweise vereinigt, vorgesehen, wobei das akustooptische Bauteil auf den ersten Teilstrahl wirkt. In einer Variante kann ein weiteres akustooptisches Bauteil vorgesehen sein, das auf den zweiten Teilstrahl wirkt. Die akustooptischen Bauteile sind vorzugsweise als AOTFs ausgestaltet, so dass der Beleuchtungslichtstrahl theoretisch beliebig viele Licht-Anteile unterschiedlicher Wellenlänge enthalten kann, ohne dass es auf Grund unterschiedlicher Ablenkwinkel zu Problemen bei der Wiedervereinigung durch den Strahlvereiniger kommt. Die miteinander vereinten Strahlen einer Wellenlänge schweben nun miteinander, so dass man für Licht jeder Anregungswellenlänge eine sinusförmige Modulation erhält, deren Modulationsfrequenz der zugehörigen Frequenz der in den akustooptischen Kristall eingestrahlten akustische Welle entspricht. Die Intensitätsmodulation ist folglich für alle Licht-Anteile unterschiedlicher Anregungswellenlängen unterschiedlich. In einer bevorzugen Ausgestaltung kann das akustooptische Bauteil zusätzlich auch als Strahlteiler wirken.

Das in der Probe entstehende Detektionslicht, das in der Regel Fluoreszenzlicht ist, wird vorzugsweise mit den in der Scanmikroskopie üblichen Detektoren (z. B. Photomultiplier) detektiert und in elektrische Detektionssignale, deren Amplitude proportional zur Detektionslichtleistung sind, übersetzt. Das Detektionslicht bzw. die Detektionssignale werden bei der zeitlichen Codierung decodiert, indem die zeitliche Information, wann die einzelnen Anregungswellenlängen bei der Probe eingetroffen sind, ausgenutzt wird. Hierzu ist es sinnvoll, dass die Codiereinheit der Decodiereinheit ein Synchronisationssignal (z. B. die Trigger, die die einzelnen Anregungslaser starten) übermittelt. Die zeitliche Decodierung kann darin bestehen, dass das Detektionssignal entweder in einer Demultiplexer-Einheit auf verschiedene Kanäle verteilt wird, oder dadurch, dass für jede Wellenlänge ein gegateter Integrierer (z. B. gegateter Ladungsverstärker, Boxcar-Averager etc.) eine analoge oder digitale Integration des Signals innerhalb der zur entsprechenden Anregungswellenlänge gehörenden Zeitintervalle vornimmt. Es ist sinnvoll, den zeitlichen Abstand der Laserpulse der einzelnen Wellenlängen größer als die Emissionsdauer der Fluoreszenzfarbstoffe (in der Regel ca. 10 ns) zu wählen, damit die Decodierung optimal funktioniert.

In einer anderen bevorzugen Ausgestaltung erfolgt das Decodieren digital, beispielsweise in einem Computer. Die Decodiervorrichtung beinhaltet dazu einen Analog-Digital-Wandler, der eine Analog-Digital-Wandlung der Detektionssignale vornimmt.

Das Decodieren beinhaltet vorzugsweise das Anfitten einer vorgebbaren Funktion, was insbesondere bei der Frequenzcodierung von Vorteil ist. Dies kann sowohl digital, als auch - besonders effizient und schnell - analog erfolgen.

In einer anderen Ausführungsvariante umfasst das Decodieren eine Fouriertransformation.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung ist die Decodiervorrichtung mit der Codiervorrichtung synchronisiert.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop. Besonders interessant ist die Codierung vor allem auch dann, wenn das Fluoreszenzlicht in der konfokalen Mikroskopie mit Hilfe eines Matrixdetektors (CCD o. ä.) detektiert wird (z. B. Nipkow-Disk-Systeme, oder herkömmliche Mikroskop-Systeme, bei denen die Konfokalität durch Dekonvolution erreicht wird), da hier eine spektrale Trennung der Emission der unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe in der Regel nicht oder nur schwierig möglich ist.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 Ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zeitlichen Codierung,
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Frequenzcodierung,
Fig. 4 eine Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles,
Fig. 5 bis Fig. 9 weitere Vorrichtungen zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles.
Fig. 1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop, das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Der von einer Lichtquelle 1, die einen ersten Laser 3, der Anregungslicht einer ersten Wellenlänge emittiert, einen zweiten Laser 5, der Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge emittiert, und einen dritten Laser 7, der Anregungslicht einer dritten Wellenlänge emittiert, beinhaltet, kommende Beleuchtungslichtstrahl 9 wird mit einer Codiervorrichtung 11 codiert und mit Hilfe der Optik 13 auf die Beleuchtungslochblende 15 fokussiert. Die Vereinigung der einzelnen von den Lasern emittierten Lichtstrahlen erfolgt in der Lichtquelle 1 mit dichroitischen Strahlvereinigern. Nach Passieren der Beleuchtungslochblende 15 wird der Beleuchtungslichtstrahl 9 von einen Strahlteiler 17 über die Mikroskopoptik 19 auf die Probe 21 fokussiert. Der besseren Übersichtlichkeit halber sind weitere übliche Elemente zur Strahlführung und Strahlformung, wie beispielsweise die Scanvorrichtung, die Scanoptik oder die Tubusoptik, nicht gezeigt. Diese sind dem Fachmann jedoch bekannt. Die Probe 21 ist mit drei Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Der Beleuchtungslichtstrahl 9 wird bei nicht transparenten Proben 21 über die Probenoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 21 (Präparaten) oder transparenten Proben kann der Beleuchtungslichtstrahl 9 auch durch die Probe 21 geführt werden. Der von der Probe 21 ausgehende Detektionslichtstrahl 23 gelangt durch die Mikroskopoptik 19 hindurch zum Strahlteiler 17, passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 25 auf einen Detektor 27, der als Photomultiplier ausgebildet ist und der elektrische Detektionssignale erzeugt, deren Amplitude zur Leistung des Detektionslichtes proportional ist. Die Detektionssignale werden an eine Decodiervorrichtung 29 übergeben, die mit der Codiervorrichtung 11 über die Leitung 35 synchronisiert ist. Synchronisierung bedeutet in diesem Fall, dass an die Decodiervorrichtung 29 Informationen bezüglich der von der Codiervorrichtung verursachten Codierung übergeben werden. Es ist jedoch auch denkbar, dass der Informationsfluss auch in umgekehrter Richtung erfolgt. In der Decodiervorrichtung wird eine Zuordnung getroffen, welche Detektionssignale von welchem Licht-Anteil des Beleuchtungslichtstrahles 9 verursacht wurde. Diese Informationen werden an einen PC 31 übergeben und auf einem Monitor 33 dem Benutzer grafisch aufbereitet angezeigt.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer zeitlichen Codierung, die eine Festlegung einer zeitlichen Reihenfolge der Pulse eines ersten, eines zweiten und eines dritten Lichts eines Beleuchtungslichtstrahles beinhaltet, wobei das erste Licht eine Wellenlänge λ₁, das zweite Licht eine Wellenlänge λ₂ und das dritte Licht eine Wellenlänge λ₃ aufweist. Dargestellt ist die Lichtleistung P in Abhängigkeit von der Zeit t. Alle drei Wellenlängen können mit verschiedenen Lichtleistungen beaufschlagt sein.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer Frequenzcodierung. Hierzu werden die Anteile eines Beleuchtungslichtstrahles unterschiedlicher Anregungswellenlängen mit einer jeweils unterschiedlichen Frequenz moduliert.
Fig. 4 zeigt eine Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles. In dieser Variante wird der Beleuchtungslichtstrahl 9, der alle zu modulierenden Wellenlängen beinhaltet, mit einem Strahlteiler 37 in einen ersten Teilstrahl 39 und einen zweiten Teilstrahl 41 aufgespalten. Der erste Teilstrahl 39 wird durch einen AOTF 43 geführt, wobei dieser so beschaltet wird, dass alle relevanten Wellenlängen gebeugt werden. Bei der Beugung an den laufenden akustischen Wellen des AOTF 43 findet ein Impulsübertrag an die Lichtwelle statt, wodurch sich die Wellenlänge des gebeugten Lichts durch die Beugung ändert. Der erste Teilstrahl 39 und der zweite Teilstrahl 41 werden zu einem Strahlvereiniger 45 geführt, der den ersten und den zweiten Teilstrahl in zwei Ausgangsstrahlen 49, 51 vereinigt. Vor der Wiedervereinigung durchläuft der erste Teilstrahl 39 eine Polarisationsdrehereinheit 47, die als λ/2-Platte ausgeführt ist, um die Polarisation zurückzudrehen, da er hier eingesetzte AOTF die Polarisation dreht. Die miteinander vereinten Licht-Anteile, die ursprünglich dieselbe Wellenlänge aufwiesen, schweben nach der Vereinigung miteinander, so dass man für jeden Anteil des Beleuchtungslichtes einer Anregungswellenlänge eine sinusförmige Intensitätsmodulation erhält. Die Modulationsfrequenz jeder Wellenlänge entspricht der zugehörigen akustischen Ablenkungsfrequenz und unterscheidet sich dadurch von Wellenlänge zu Wellenlänge.
Fig. 5 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles. Diese arbeitet dem Prinzip nach wie die in Fig. 4 gezeigte Vorrichtung. Nachdem die Polarisation des ersten Ausgangsstrahls 49 mit einer weiteren Polarisationsdrehereinheit 53 um 90° gedreht wurde, werden die beiden Ausgangsstrahlen 49, 51 mit einem Polarisationsstrahlvereiniger 55 wieder miteinander vereint, so dass letztendlich kein Licht verschenkt wird. Der resultierende Laserstrahl 57 ist in jeder der beiden Polarisationsrichtungen (um 90° in der Phase versetzt) moduliert, so dass die Gesamtlichtleistung zeitlich konstant ist. Generell lassen sich so bei polarisationserhaltenden Prozessen (wie bei der SHG- Zweiphotonenmikroskopie) beide Signalanteile nutzen, indem bei der Signaldetektion beide Polarisationen des Detektionslichts getrennt nachgewiesen und decodiert werden.
Fig. 6 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles. Bei dieser Vorrichtung befindet sich ein weiterer AOTF 59 im Strahlengang des zweiten Teilstrahls 41, wobei dieser die Wellenlänge des zweiten Teilstrahls 41 erhöht, während der AOTF 43 die Wellenlänge des ersten Teilstrahls 39 - in demselben Maße - verringert. Die akustischen Wellen laufen gegensinnig durch den AOTF 43 und den weiteren AOTF 59. Die Modulations-Frequenz der Ausgangsstrahlen 49, 51 entspricht folglich dem Doppelten der Frequenz der akustischen Wellen.
Fig. 7 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles, die im Wesentlichen der Vorrichtung, die in Fig. 6 illustriert ist, entspricht. Allerdings sind der AOTF 43 und der weitere AOTF 59 mit unterschiedlichen HF-Frequenzen angesteuert. Die Modulations- Frequenz der Ausgangsstrahlen 49, 51 entspricht der Summe bzw. Differenz der Frequenzen der akustischen Wellen.
Fig. 8 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles, bei der die Vereinigung des ersten und zweiten Teilstrahles 39, 41 mit einem Polarisationsstrahlvereiniger 55 erfolgt und ein nachfolgender Polarisator 61, der unter 45 Grad angeordnet ist, eine Trennung in den ersten Ausgangsstrahl 49 und den zweiten Ausgangsstrahl 51 bewirkt und dabei Licht der unterschiedlichen Polarisationsrichtungen mischt.
Fig. 9 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Modulierung und/oder Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles. Diese arbeitet dem Prinzip nach wie die in Fig. 4 gezeigte Vorrichtung, wobei der Beleuchtungslichtstrahl 9 mit einer unter 45 Grad zur Aufspaltungsebene auf einen Polarisationsstrahlteiler 63 trifft, der in den ersten und den zweiten Teilsstrahl 39, 41 aufspaltet.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Bezugszeichenliste 1 Lichtquelle
3 erster Laser
5 zweiter Laser
7 dritter Laser
9 Beleuchtungslichtstrahl
11 Codiervorrichtung
13 Optik
15 Beleuchtungslochblende
17 Strahlteiler
19 Mikroskopoptik
21 Probe
23 Detektionslichtstrahl
25 Detektionsblende
27 Detektor
29 Decodiervorrichtung
31 PC
33 Monitor
35 Leitung
37 Strahlteiler
39 erster Teilstrahl
41 zweiter Teilstrahl
43 AOTF
45 Strahlvereiniger
47 Polarisationsdrehereinheit
49 erster Ausgangsstrahl
51 zweiter Ausgangsstrahl
53 Polarisationsdrehereinheit
55 Polarisationsstrahlvereiniger
57 Laserstrahl
59 weiterer AOTF
61 Polarisator
63 Polarisationsstrahlteiler

Claims

1. Verfahren zur Scanmikroskopie gekennzeichnet durch folgende Schritte:

- Erzeugen eines Beleuchtungslichtstrahles, der zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet, wobei zumindest das erste Licht eine Codierung aufweist,

- Beleuchten einer Probe mit dem Beleuchtungslichtstrahl,

- Decodieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichts.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe einen ersten Fluoreszenzfarbstoff beinhaltet, der mit dem ersten Licht anregbar ist und dass die Probe einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff beinhaltet, der mit dem zweiten Licht anregbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2 gekennzeichnet durch die weiteren Schritte:

- Ermitteln eines ersten Anteils des Detektionslichtes, der von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff ausgeht und

- Ermitteln zumindest eines zweiten Anteils des Detektionslichtes, der von dem zweiten Fluoreszenzfarbstoff ausgeht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Codierung eine zeitliche Codierung der Pulsfolgezeit eines zumindest bezüglich des ersten Lichtes gepulsten Beleuchtungslichtstrahles umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest das erste und das zweite Licht gepulst sind und dass die Codierung eine Festlegung einer zeitlichen Reihenfolge der Pulse des ersten und des zweiten Lichtes beinhaltet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Codierung eine Amplitudencodierung beinhaltet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Codierung eine Frequenzcodierung beinhaltet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Decodieren digital erfolgt und eine Analog-Digital- Wandlung umfasst.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Decodieren das Anfitten einer vorgebbaren Funktion beinhaltet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Decodieren eine Fouriertransformation umfasst.

11. Scanmikroskop mit zumindest einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahles, der auf eine Probe richtbar ist und zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht einer zweiten Wellenlänge beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Codiervorrichtung zum Codieren von zumindest dem ersten Licht und eine Decodiervorrichtung zum Decodieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichts vorgesehen ist.

12. Scanmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle einen Pulslaser umfasst.

13. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Codiervorrichtung eine zeitliche Codierung der Pulsfolgezeit eines zumindest bezüglich des ersten Lichtes gepulsten Beleuchtungslichtstrahles vornimmt.

14. Scanmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Codiervorrichtung eine Amplitudencodierung vornimmt.

15. Scanmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest das erste und das zweite Licht gepulst sind, und dass mit der Codiervorrichtung eine zeitliche Reihenfolge der Pulse des ersten und des zweiten Lichtes festlegbar ist.

16. Scanmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Codiervorrichtung eine Frequenzcodierung vornimmt.

17. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Codiervorrichtung ein akustooptisches Bauteil beinhaltet.

18. Scanmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil ein akustooptischer Filter (AOTF) ist.

19. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Codiervorrichtung einen elektrooptischen Modulator (EOM) beinhaltet.

20. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Decodiervorrichtung einen Analog-Digital-Wander beinhaltet.

21. Scanmikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Decodiervorrichtung eine Recheneinheit zum Anfitten einer vorgebbaren Funktion beinhaltet.

22. Scanmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Decodiervorrichtung eine Recheneinheit zum Ausführen einer Fouriertransformation umfasst.

23. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Decodiervorrichtung mit der Codiervorrichtung synchronisiert ist.

24. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop ist.

25. Vorrichtung zum Modulieren eines Lichtstrahles, der zumindest erstes Licht einer ersten Wellenlänge und zweites Licht beinhaltet, mit einem akustooptischen Bauteil oder mit einem elektrooptischen Bauteil.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil ein akustooptischer Filter (AOTF) ist.

27. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil die Wellenlänge zumindest eines Teils des Beleuchtungslichtstrahles durch Beugung an einer akustischen Welle verändert.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein Strahlteiler, der den Beleuchtungslichtstrahl in einen ersten und einen zweiten Teilstrahl aufspaltet, und ein Strahlvereiniger, der den ersten und den zweiten Teilstrahl zumindest teilweise vereinigt vorgesehen ist, wobei das akustooptische bzw. elektrooptische Bauteil zumindest auf den ersten Teilstrahl wirkt.

29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, das auf den zweiten Teilstrahl wirkt.

30. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil als Strahlteiler wirkt.

31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in ein Scanmikroskop einsetzbar ist.

32. Verwendung eines akustooptischen Bauteils zur Codierung eines Beleuchtungslichtstrahles.