CN113711014A - 使用结构化照明显微镜增强样品成像 - Google Patents

使用结构化照明显微镜增强样品成像 Download PDF

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Abstract

公开了将结构化照明显微镜(SIM)应用于如共焦激光扫描显微镜或样品扫描显微镜等扫描显微镜以提高空间分辨率的方法和设备。本公开的具体方面涉及发现以下能力的重要进展：(i)增加对样品的光通量，从而增加信噪比和/或减少曝光时间，以及(ii)减少待处理的原始图像的数量，从而减少图像采集时间。这两种效果都显著提高了整体性能，从而使扫描显微镜的用户受益。

Description

使用结构化照明显微镜增强样品成像
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月2日提交的美国专利申请序列号62/827,921的优先权，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及使用扫描显微镜(例如，共焦激光扫描或样品扫描显微镜)和用于提高分辨率的结构照明对样品进行成像。
背景技术
传统的光学显微镜具有受衍射限制的空间分辨率。当显微镜物镜的背面孔径完全充满准直光时，焦点或样品平面中的图像为艾里斑，根据下式其半径为rairy(以纳米nm为单位)：
Figure BDA0003292887960000011
其中λ(以nm为单位)为照射波长，NA(无量纲)为显微镜物镜的数值孔径，并提供其分辨能力的量度。与该数量相关的是显微镜的分辨率，其通常被定义为两个物体之间的最小距离，这使得它们能够单独成像，而不是单个物体。如果通过在样品上扫描艾里斑光束对样品进行成像，则所得图像的分辨率由下式给出：
Figure BDA0003292887960000012
其中在这种情况下r是分辨率(以nm为单位)，λ和NA如以上定义，n是环境介质的折射率，并且θ是可以进入或离开透镜的最大光锥的半角。从该等式可以明显看出，通过减小照明光的波长或增大物镜的数值孔径，可以提高空间分辨率(即，可以减小“r”的值)。然而，这仅适用于线性偏振光束填充显微镜物镜的整个背面孔径的情况。通过仅填充某些设计部件，可以生成和扫描样品表面的干涉图案，而不是艾里斑。重要的是，干涉图案的条纹间隔相对小于艾里斑的直径。此类设计的照明图案及其产生的检测和重建算法在本领域中被称为“结构化照明”，该技术可以将显微镜分辨率提高多达两倍。
结构化照明显微镜(SIM)系统可在多种荧光显微镜上商用。然而，这些SIM系统使用“宽场”照明，这是指在进入物镜之前通过聚焦透镜发送准直光源来照明大的样品区域。荧光成像的正常目的不是收集整个光谱，而是简单地过滤所关注波长的发射光，然后将其引导到照相机中。尽管宽场显微镜适用于各种荧光成像应用，但也存在共焦显微镜更胜一筹的情况。共焦显微镜利用针孔来拒绝失焦的光，从而极大地改善通过厚样品的成像。由于共焦图像是逐像素构建的，而不是在大面积上(如在宽场成像中)构建的，共焦显微镜非常适用于光谱成像，因为发射光或散射光可以发送到针孔下游的光谱仪中。共焦显微镜的具体用途包括通过厚的非均匀样品进行荧光切片，以及高光谱成像，如在成像拉曼显微镜的情况下。
因为共焦显微镜不能像在宽场显微镜的情况下那样一次照射整个样品，所以现有的SIM系统及其重建算法不能与共焦显微镜直接“嵌入式”兼容。然而，在Gao等人中描述了SIM在共焦激光扫描显微镜(CLSM)的特定应用(《光学快报(Optics Letters)》(2016)第41卷第6期：1193－96)。根据该出版物，使用由通过显微镜物镜的两个“圆形瞳孔”光的集中生成的条纹图案逐点扫描样品多次。更具体地，这些条纹图案的特征在于它们的方向指数m，其指的是连接瞳孔的线的角度，以及两个瞳孔中的一个相对于另一个的相移n。使用4个不同的角度和4个不同的相对相位需要收集16个原始图像以重建增强图像。现有技术将受益于SIM在扫描显微镜(如CLSM)中的应用的改进，特别是在性能效率方面的改进。
发明内容
本发明的各方面与方法和设备相关联，借此将结构化照明显微镜(SIM)应用于扫描显微镜，如共焦激光扫描显微镜或共焦样品扫描显微镜，以提高空间分辨率。具体方面涉及发现以下能力的重要进展：(i)增加对样品的光通量，从而增加信噪比和/或减少曝光时间，以及(ii)减少待处理的原始图像的数量，从而减少图像采集时间。这两种效应都显著提高了整体性能，从而使扫描显微镜的用户受益。
根据用于对样品成像的具体方法，其中将SIM应用于共焦显微镜，在样品区域上扫描干涉条纹或聚焦条纹图案，或者更具体地，在样品的离散点上，如在该区域上以规则间隔生成干涉条纹或聚焦条纹图案。通过将激光束以给定角度和两束之间的相位差发送到显微镜物镜的两侧来生成聚焦条纹图案。例如，可以使用空间光调制器来改变角度和相位，空间光调制器例如是可以逐像素地调制光束的波前的已知可编程装置。用于相位调制的常见类型是硅上液晶空间光调制器(LCOS-SLM)，其以类似于LCD显示器的方式操作，即液晶在所施加的电场下改变其折射率，从而在光与晶体相互作用时导致相位延迟。空间光调制器可以利用计算机作为辅助显示器，使得颜色图案被转换成相位描记。例如，在8位颜色图案的情况下，128和256可以分别表示π和2π的相位延迟。如果光仅射向显微镜物镜背面孔径的边缘，则两个光束将在样品上相长地和相消地相互干涉，从而产生周期约为上述艾里斑直径一半的正弦图案。与传统的共焦显微镜相比，这为使用SIM获得图像的额外分辨率奠定了基础。
然而，从单个给定角度和相位获得的原始图像不足以重建完全分辨的图像。相反，为了建立图像，生成光束的激光器扫过样品并通过共焦针孔成像多次，例如以一系列或预定组的离散角度和相位中的每一个。即，对应于显微镜物镜的背面(后)孔径上的照明区域的两个光束的照明图案以这些角度和相位投射。在给定的角度，如0弧度，可以收集两个或更多个相位图像，例如使用空间光调制器来延迟光束中的一个相对于另一个的相位。相移为0的一个图像和具有相同角度但相对于彼此具有如π/2、π、3π/2弧度的非零相移的其它图像以及对应于角度和相位的其它组合的其它聚焦条纹图案的图像可用于逐像素合成(重建)所关注的特定样品区域的整个扫描共焦图像。以这种方式，在如共焦显微镜的扫描显微镜中，SIM的使用可以有利地将空间分辨率提高(减小上述等式中的“r”的值)大于约1.5的因子，如从约1.8到约2.0的因子。
本发明的具体方面涉及通过使用两个光束的照明图案来发现允许在整个系统中显著提高光通量的参数，使得显微镜物镜的对应照明区域为非圆形。在圆形区域的情况下，具有圆形轮廓的两个光束在样品上沿着两个圆的位移轴生成正弦图案，该位移轴是指通过两个圆的中心的线。在样品上生成最佳正弦曲线的关键因素是两个圆沿着其轴位移的长度或距离。重要的是，圆上方或下方的光的存在(或不存在)不会影响在样品上生成的正弦曲线的质量，但仍保持位移距离。因此，可以在圆圈外部的区域进一步照射背面孔径，而不是仅仅用两个圆圈照射，以在不牺牲图像质量的情况下增加引入的光量。
例如，“照明增强区域”可以由狭缝形照明区域形成，其中最大狭缝宽度与表示狭缝内的最大内切圆的圆形“瞳孔”的直径相同。通过显微镜物镜引入的附加光也会在选定的角度和相位干涉形成正弦聚焦条纹图案。在具体实施例中，狭缝形式的照明区域或对应于显微镜物镜的后圆形孔径的大得多的圆的圆形段提供最大内切圆之外(外部)的照明增强区域，其用于增加光通量，这可有利地增加信噪比和/或减少曝光时间。这对于共焦显微镜或其它扫描显微镜的整体性能非常重要，因为传统上光通量非常有限，因为激光生成的大部分光没有直接射入物镜。有利地，容易实现对使用一个或多个(并且优选地两个)非圆形照明区域的改变。与使用由照明区域内的最大内切圆表示的参考或基线圆形区域相比，光通量的相应显著(例如，四倍)增加允许以相等的信噪比但具有较低照相机曝光时间进行图像收集。结果，整体图像采集时间缩短，为扫描显微镜领域的用户提供了多种益处。根据其它实施例，非圆形照明区域可以被构造成提供与参考或基线圆形区域相同的总照明，但是与这些参考或基线圆形区域相比具有更小的最大内切圆。这允许沿着位移轴增加区域的间隔，从而具有提高图像质量的效果。
其它方面涉及以下发现：在将SIM应用于共焦激光扫描显微镜或样品扫描显微镜中，不存在需要以每角度三个相位收集图像的数学限制，且实际上，不超过两个相位的照明就足够了，如1D和2D物理光学传播模拟所示。这样做的直接影响是要采集的原始图像总数减少，这意味着整个图像采集时间也同样减少。例如，与使用每角度四个相位(例如，总共收集16个图像，具有四个单独的角度)或甚至每角度仅三个相位(例如，总共收集9个图像，具有三个单独的角度)的技术相比，图像采集时间可以分别减少约50％或约33％。此类采集时间的改进是显着的，不仅因为时间对用户来说很宝贵，而且还因为图像采集时间的减少降低了系统对热漂移或振动的敏感性，而热漂移或振动反过来又会导致图像出现明显的像差。从而提高了图像质量。采集较少的原始图像还降低了对其管理、跟踪和存储的软件开销要求。因此，与使用已知方法和设备相比，可以以显著降低的成本实现SIM在提高空间分辨率方面的益处，例如通过使用高数值孔径(NA)物镜提高1.8倍或更多。
这些和其它实施例涉及利用SIM来提高图像分辨率的方法和设备，例如在执行超光谱成像，如在成像拉曼光谱术中，或者在其它基于标记的成像，如在荧光显微术中，从以下详细描述中将变得显而易见。
附图说明
图1A和1B是输入光束轮廓，或显微镜物镜背面孔径的照明区域，其形式为圆形(图1A)和狭缝，或具有较大直径的圆形段(图1B)。
图1C绘示了具有不同角度的旋转轴的如图1B所示的输入光束轮廓。
图2是利用SIM(共焦SIM)以改进分辨率进行样品成像的共焦扫描显微镜的示意图。
图3绘示了共焦SIM的模拟点扩展函数，其中532nm波长的照明通过100x、0.7NA物镜，通过75mm焦距透镜聚焦到25μm针孔中。六个模拟图像基于使用光束的三个不同角度(0、π/3、2π/3)，并且对于每个角度，两个光束的照明图案相对于彼此偏移0和π的相位。
图4绘示了使用传统CLSM的模拟样品图像，以及相同的模拟图像，但是利用共焦SIM来提高分辨率。通过使用如图3所示的六种角度和相位组合重建超分辨图像获得对在整个样品上扫过的照明图案的改进。
附图应被理解为表示本发明的实施例和/或所涉及的原理，其中在附图中使用相同的附图标记来表示相同或相似的元件。如具有本公开知识的本领域技术人员将清楚的，使用SIM的其它方法和设备将具有部分地根据特定成像应用确定的相关联的步骤和组件。
具体实施方式
本发明的代表性实施例涉及通过用多个聚焦条纹图案(或干涉条纹)照射样品的多个点，例如照射所关注的区域，对样品进行成像的方法，这些条纹图案是由光束围绕旋转轴以各种角度照射并以各种相位相对于彼此相移而生成。因此，这些多个聚焦条纹图案可以被指定为“第一聚焦条纹图案”、“第二聚焦条纹图案”、“第三聚焦条纹图案”等，其中术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于指示这些聚焦条纹图案与干涉生成它们的光束的特征，即它们各自的特征旋转轴角度和相移(例如，对应于“第一旋转轴”、“第二旋转轴”、“第三旋转轴”等的角度，或“第一相位”、“第二相位”、“第三相位”等的偏移)相关联。这些术语并不意味着被解释为生成聚焦条纹图案的特定顺序。这些术语也不应被解释为必须要求不同的角度和/或相位值。实际上，根据优选实施例，用于在多个点处照射给定样品的一些聚焦条纹图案由具有与用于生成其它聚焦条纹图案的光束相同的旋转轴角(具有与该旋转轴基本重合的旋转轴)的光束生成，但是其它聚焦条纹图案由偏移了不同相位的光束生成。如本文更详细地描述的，该旋转轴角度是指显微镜的背面孔径上的分离的照明区域的取向，这些照明区域由这些光束照射。同样地，一些聚焦条纹图案可以由偏移了与用于生成其它聚焦条纹图案的光束相同相位的光束生成，但是其它聚焦条纹图案由具有不同旋转轴角度的光束生成。因此，对于用于照射样品的任何两个聚焦条纹图案，它们可以仅在其特征旋转轴角度、特征相移或特征旋转轴角度和相移方面不同。
术语“光”和“光束”，特别是在通过显微镜物镜发射并由显微镜物镜聚焦并在物镜的后孔径上提供照明区域的光的情况下，是指任何波长的电磁辐射，但优选地具有波长λ，其范围从电磁光谱的紫外(UV)部分到电磁光谱的中红外部分，例如在约200nm至约11μm的范围内。通常，将使用具有例如约380nm至约750nm的波长的可见光。除非另有说明，所有角度以弧度表示，其中2π弧度＝360°。
本文描述的方法利用结构化照明显微镜(SIM)，例如在共焦SIM的情况下，当具体应用于共焦激光扫描显微镜(CLSM)时。根据此类方法，所关注的样品的多个点不是如在常规共焦显微镜的情况中那样由占据显微镜物镜的整个背面孔径的激光束照射，而是由通过显微镜物镜发射并由显微镜物镜聚焦的两个或更多个，但优选地仅两个光束(例如，准直激光束)的干涉生成的正弦聚焦条纹图案照射。具体地，这些光束仅填充物镜背面孔径的一部分，如设计的照明区域。光束由显微镜物镜聚焦并发射到样品上的这些区域可以例如位于背面孔径直径的相对端。给定的聚焦条纹图案可以在样品区域上扫描或扫过，并用于获得照明数据，例如以对应于给定样品频率的离散样品间隔，如每微米几个样品。照明数据可以是例如从单元件检测器获得的强度值或从光谱仪获得的光谱。
例如，图1A和1B提供了相应的输入光束轮廓10、20的两个图示，其中光束的对应的、相应的照明区域12、22投射到显微镜物镜的背面孔径14上。左图将这些光束示为白色区域(在图1A的情况下为圆形，在图1B的情况下为狭缝)，其照射背面孔径，否则背面孔径是完全黑暗的。右图去除了这些深色背景，以显示更多细节。在图1A和1B的实施例中，如上所述，光束从显微镜的背面孔径14的直径的相对端发射，该直径与位移轴16重合，光束沿着位移轴间隔或分离。因此，光束仅照射“照明区域”，这些区域的总和小于孔径面积。通常，通过将这些照明区域12、22配置成使得它们安置在后孔径14的边缘附近，或者与这些边缘的至少一部分一致，以获得最大可能的分隔距离，可以提高图像质量。具体地，由提供这些照明区域12、22的光束的干涉而在样品上生成的正弦曲线的质量是它们之间的距离的函数，距离越大，质量越高。
在图1A的实施例中，这些照明区域12呈圆形或瞳孔的形式并且沿着位移轴16间隔开，位移轴也包括背面孔径14的中心18。图1B描绘了不同的输入光束轮廓20，其中分离的照明区域22为非圆形(与图1A中所示的不同)。这些区域包括最大内切圆25，即对应于可以内切在这些相应照明区域22内的最大圆，并且在所示实施例中，在面积上等同于图1A的整个圆形照明区域12。因此，最大内切圆25可以具有沿着位移轴线16与背面孔径14的中心18共线的相应中心27。在不具有此类共线中心的最大内切圆的情况下，术语“最大内切圆”在其应用于相应照明区域的范围内，在一些实施例中可以但不一定是指具有此类共线中心(即，与背面孔径14的中心18共线)的最大内切圆。
如从图1B所示的非圆形照明区域22中明显看出，这些照明区域还包括照明增强区域29，其指的是最大内切圆25之外的任何照明区域，这些区域沿着位移轴线16的方向，即在图1B所示的水平方向上不比最大内切圆25的任何部分更近。满足这些要求的此类照明增强区域29中的光有利地用于增加光通量而不牺牲图像质量(分辨率)。相反，在圆形段形或狭缝形照明区域22的两个弦23之间的光在增加光通量的同时仍将通过在传统共焦显微镜的方向上移动经设计的照明图案来降低分辨率，在传统共焦显微镜中，整个背面孔径被照射。鉴于该描述，可以理解，为圆形段的照明区域22(即，由圆的边缘和弦限定的区域)为最大内切圆25的任何给定直径提供最大照明增强区域，该直径反过来又限定给定的位移距离并因此限定给定的分辨率程度。根据图1B的优选实施例，狭缝或圆形段形状的照明区域22的弦23是平行的，由位移距离d隔开，以这种方式，位移距离d以上述方式影响光通量和分辨率。同样在该优选实施例中，狭缝形照明区域22与显微镜物镜的圆形背面孔径14的相对侧部分或弧21一致，使得这些区域限定圆形段，该圆形段包括(i)与圆形背面孔径14的弧或这些相对侧部分21基本一致的弧21，以及(ii)弦23，其也限定圆形背面孔径14的弦。此外，在该实施例中可以看出，最大内切圆25的直径28对应于其最宽点处的狭缝宽度，在这种情况下，最宽点处的狭缝宽度沿着位移轴线16。
通常，使用提供照明增强区域的任何非圆形照明区域可以改善将SIM应用于共焦显微镜所涉及的权衡。这就是(i)增加位移距离，提高生成的条纹图案的精细度，从而提高生成图像的分辨率，以(ii)减少光通量，降低信噪比和/或增加曝光时间为代价的权衡。即，照明增强区域有利地补偿(ii)而不影响(i)，或者替代地允许(i)的改进而不影响(ii)。有利地，照明增强区域可在整个照明区域中占相当大的比例，并且由此将来自最大内切圆的光通量的基线量增加例如至少约1.5(例如，从约1.5至约6.0)或至少约2.0(例如，从约2.0至约5.0)倍，此倍数表示总照明区域与最大内切圆的面积之比。例如，在狭缝形照明区域的情况下，该比率随着最大内切圆的直径(在这种情况下为穿过位移轴的狭缝宽度)与背面孔径的直径的比率减小而增大，即，随着狭缝相对于背面孔径变小。例如，狭缝宽度为背面孔径宽度的3/8、1/4或1/8的狭缝形照明区域提供来自分别代表整个照明区域的59％、68％或78％的照明增强区域的光，使得相对于基线量的增加因子分别为2.4、3.1或4.5。在此类圆形段或狭缝形照明区域的特定情况下，狭缝宽度与背面孔径直径的比率通常为约0.02至约0.4，通常为约0.05至约0.3，并且经常为约0.1至约0.25。
从本公开可以理解，许多可能的非圆形照明区域可以有利地允许从本文所述的照明增强区域的光通量。例如，可以使用透镜形状(足球横截面)、多边形或圆形多边形。在一些情况下，如在透镜形照明区域的情况下，其最大内切圆之外的所有照明区域都可以满足上述“照明增强区域”的特性。在其它情况下，非圆形照明区域的形状可以在其最大的内切圆之外提供照明区域，这将不符合上述定义的“照明增强区域”的特征。无论具体形状如何，优选地(i)最大内切圆之外的照明区域的至少约85％、至少约95％或全部为“照明增强区域”，(ii)照明增强区域占整个照明区域的至少约50％(例如，约50％至约95％)、至少约75％(例如，约50％至约90％)，或至少约80％(例如，约80％至约90％)，(iii)最大内切圆具有与位移轴基本重合的中心，因此基本上与背面孔径的中心共线，和/或(iv)整个照明区域占背面孔径面积的小于约25％(例如，约1％至约25％)或小于约15％(例如，约2％至约15％)。
如图1B所示，图1C同样绘示了沿着与显微镜物镜的背面孔径14的直径重合的位移轴16隔开的狭缝形照明区域22。图1C中进一步绘示了垂直于位移轴16的旋转轴32。根据该实施例，旋转轴32在分离的照明区域22之间延伸并且不相交，并且与对称轴重合，照明区域22关于该对称轴是彼此的镜像。如图所示，旋转轴32的代表性角度为0(0°)、π/3(60°)和2π/3(120°)，并且以这些不同角度发射的干涉光束产生不同的聚焦条纹图案，即从不同方向生成。通过扫描或扫过具有聚焦条纹图案的样品表面，其中旋转轴的特征角度不同，这允许沿着不同方向增强图像分辨率。因此，如图1C所示，在旋转轴为0、π/3和2π/3的不同角度下，可以实现整个空间的图像分辨率增强。因此，在一些实施例中，可以用多个聚焦条纹图案来扫描或扫过样品，由此用具有不同的第一旋转轴、第二旋转轴和第三旋转轴(例如，0、π/3和2π/3)的聚焦条纹图案对样品的点进行第一次、第二次和第三次照明。然而，对于其中不需要沿着给定方向的分辨率增强的成像应用，可以认为用具有两个不同旋转轴或甚至仅一个旋转轴的聚焦条纹图案的样品照明是足够的。尽管在图1C中，垂直方向具体地对应于旋转轴32的角度为0，但是可以理解，这是任意方向，并且主要考虑在于使用不同聚焦条纹图案的组合来增强沿着所需方向或不同方向的组合的图像分辨率的能力，对于不同聚焦条纹图案，其中分离的照明区域具有不同的旋转轴。
图2绘示了共焦扫描显微镜(例如，共焦激光扫描显微镜)200及其利用结构照明显微镜(SIM)以改进的分辨率进行样品成像的操作。激光器201通过保偏光纤203和光纤准直器205提供水平偏振和准直光束207，例如光束直径从约2mm至约20mm，如从约5mm至约15mm。该光束被引导到空间光调制器(SLM)209，其可以是根据固定空间(例如，像素)图案调制光的电可编程装置。具体地，每个像素的地址的编程信息改变其光学特性，从而提供对输入或读出光的适当调制。在这种情况下，SLM 209用于修改该光的相位，特别是通过显示导致衍射的相位光栅211。组合的SLM 209和相位光栅211根据上述所需的照明区域和旋转轴方向在调制的光束213'、213″离开SLM后，通过附加设备投射光图案并投射到显微镜物镜223的背面孔径14上。此类附加设备可以包括(i)光束压缩器215，例如可变光束压缩器，其被配置用于将光束间隔减小到背面孔径14的直径内；(ii)用于区分激发波长和发射波长的边缘滤镜217，(iii)具有用于操纵和移动光束的检流计的激光扫描模块219，以及(iii)具有适当反射/透射特性的分色镜221。物镜223可以使用折射率为1的空气作为环境介质。否则，物镜223可以用具有较高折射率(例如，从约1.2至约1.6)的介质操作，如在油浸式物镜的情况下的油，从而增加显微镜的分辨能力。
SLM 209可以显示对应于图1B所示的非圆形照明区域22的2-D图案(图像)。在一些实施例中，模糊可用于减少在所显示图案(例如，圆形段图案的边缘)的边缘处发生的衍射或“软化”这些边缘。例如，可以通过执行具有一定标准偏差的高斯核的图像的卷积来实现模糊，其中较大的标准偏差在方向上导致所得图像的较大模糊。可以通过应用称为高斯模糊滤镜208的软件算法来实现在其显示在SLM 209或其它相位调制装置上之前的图像模糊。SLM 209例如可以是仅相位SLM或以其它方式组合的振幅相位SLM，具有调制振幅的附加能力。仅相位SLM显示导致发射光衍射的相位光栅。然而，通过选择显示和不显示相位光栅图案的位置，可以实现振幅调制。例如，如果需要生成狭缝形图案，则SLM可以被配置成以该形状显示光栅图案，而在其它地方不显示光栅。在这种情况下，从光栅衍射的光将具有狭缝形状的振幅分布，而第0级衍射光束将具有狭缝的负像。由于SLM还能够调制光栅图案顶部的相位，因此可以将相位延迟(例如，π的相位延迟)添加到两个狭缝中的一个。
具体地，SLM 209可用于(例如，编程)调制投射到物镜223上并通过物镜223发射的一个光束213'相对于另一个光束213″的相移。调制光束213'、213″即用于提供照明区域，如图1A至1C所示的那些照明区域22。如关于这些附图所描述的，并且进一步参考图2，光束213'、213″被物镜223聚焦并且干涉样品225以生成具有不同旋转轴角度和/或光束之间的相移的聚焦条纹图案，如上所述。每个聚焦条纹图案用于扫描样品225的多个点并收集对应原始图像的照明数据。这可以例如使用检测器250来检测聚焦透镜229和共焦针孔231下游的发射光。检测器250可以是提供强度值的单元件检测器，使得可以以2-D阵列的形式收集图像数据。否则，检测器250可以是多元件检测器，如提供光谱数据的光谱仪，使得可以以3-D数据立方体的形式收集图像数据，其中第三维是光谱维度。图像重建算法在每种情况下都是相同的，尽管在光谱数据的情况下通常需要更长的时间。对于拉曼光谱成像，检测器250可以是商业上可获得的光谱仪，如DXR2光谱仪。共焦显微镜200可以作为激光扫描装置操作，根据该激光扫描装置，样品保持在固定位置，并且通过在样品上扫描用于该图像的聚焦条纹图案，逐像素地建立给定图像，或者获得其相关联的照明数据。替代地，共焦显微镜200可以作为样品扫描装置来操作以获得该像素信息，根据该像素信息，激光器保持在固定位置并且移动样品，例如使用电动载物台227(例如，XYZ电动载物台)在二维或可能三维中移动。处理器260(例如，在个人计算机PC内)可以用于协调高斯模糊滤镜208、SLM 209、激光扫描模块219、电动载物台227和/或检测器250的操作，并与之可操作地链接(例如，以电或无线方式)，并且可以包含用于收集和处理照明数据以及用于执行图像重建算法的指令程序。
通过使用具有光束的不同旋转轴角度和/或两个光束之间的不同相移的不同聚焦条纹图案，可以获得多个“原始”图像的照明数据，其中每个原始图像对应于用于在多个点处照射(扫描或扫过)样品的每个聚焦条纹图案。与使用传统共焦显微镜获得的图像相比，该原始图像数据又可用于重建具有更高分辨率的超分辨率合成图像。因此，用于对样品进行成像的代表性方法可以包含用第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案照射样品的多个点，如照射在样品的关注区域上，其中这些聚焦条纹图案中的每一个通过光束(例如，来自准直激光源)的干涉在多个点中的每一个点处生成。这些光束可以通过显微镜物镜发射，例如在其背面或后孔径的直径的相对端。光束照射小于整个孔径，以提供“结构化照明”。对于第一聚焦条纹图案，光束被引导到显微镜物镜的分离的照明区域，该区域可被视为用于生成该图案的“第一分离的照明区域”。第一分离的照明区域可以具有如上所述的旋转轴，其可被视为“第一旋转轴”，并且光束可以在相位上相对于彼此相移“第一相位”。如上所述，对应的修饰语“第二”、“第三”、“第四”、“第五”和“第六”可以作为一种方便的方式指代相应的“第二”、“第三”、“第四”、“第五”和“第六”聚焦条纹图案的分离的照明区域、旋转轴和相位，而这些修饰语不需要用于样品成像的任何特定顺序，并且这些修饰语也不需要不同的分离的照明区域、旋转轴和相位。旋转轴角度和相移的可能值包括0。这些较高序数的修饰语中的任何一个也不一定需要所有较低序数的修饰语。因此，例如，样品可以用本文描述的“第一”、“第二”、“第五”和“第六”聚焦条纹图案成像，而不必用本文描述的“第三”和“第四”聚焦条纹图案成像。
除了用第一聚焦条纹图案照射样品的多个点之外，代表性方法还包含用至少一个不同的聚焦条纹图案照射这些点，其中光束(以及因此投射到分离的照明区域处的背面孔径上的光)相对于第一相位相对于彼此相移不同的相位。对于相对于第一聚焦条纹图案具有不同相移的该至少一个不同的聚焦条纹图案，旋转轴角度可以与第一聚焦条纹图案的旋转轴角度相同或不同。即，对于该至少一个不同的聚焦条纹图案，或者(i)使用显微镜物镜的相同的分离照明区域，其具有不相对于第一旋转轴成角度(即，基本上重合)的相同的旋转轴，或者(ii)使用显微镜物镜的不同的分离照明区域，其具有相对于第一旋转轴成角度的另一旋转轴，从而导致光束在样品上聚焦的方向不同。根据特定实施例(属于上述情况(i))，至少一个不同的聚焦条纹图案可以是相对于第一聚焦条纹图案具有不同相移的第二聚焦条纹图案。根据其它特定实施例，至少一个不同的聚焦条纹图案可以是两个或更多个，如两个、三个、四个或五个不同的聚焦条纹图案。因此，使用总共至少两个不同的聚焦条纹图案(第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案)，如总共三个、四个、五个或六个不同的聚焦条纹图案对样品进行照射，这些聚焦条纹图案的特征旋转轴角度(对于给定聚焦条纹图案，分离照明区域的旋转轴的角度)或其特征相移(对于给定的聚焦条纹图案，投射到分离照明区域上的光束偏移的相位)不同，或者两者都不同。
执行多次的该照明(扫描或扫过)允许采集或获得多个原始图像中的每一个的对应照明数据，多个原始图像中的每一个对应于多个聚焦条纹图案中的每一个，即第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案。如上所述，照明数据可以例如从单元件检测器(用于收集2-D阵列形式的数据)或光谱仪(用于收集3-D数据立方体形式的数据)获得。不管具体的检测器如何，然后可以根据以下图像重构算法从多个原始图像中的每一个的照明数据重建超分辨合成图像：
Figure BDA0003292887960000111
其中Isyn是合成图像，nimages是原始图像的数量，对应于所使用的聚焦条纹图案的数量。对于这些聚焦条纹图案中的每一个，即第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案，i是对应于其特征旋转轴角度的指数，且j是对应于其特征相移的指数。上述等式中的指数i、j可以具有各自的X和Y唯一数字(例如，旋转轴角度指数i可以具有3个数字：1、2和3；并且相移指数j可以具有2个数字：1和2)，对应于旋转轴角度和相移的各自X和Y唯一值。例如，可以利用具有X个唯一旋转轴角度和Y个唯一相移的一组X·Y聚焦条纹图案，如在具有3个唯一旋转角度和2个唯一相移的6个聚焦条纹图案的情况下。项
Figure BDA0003292887960000112
是多个原始图像中的每一个的照明数据，具有对应的旋转轴角度和相移指数i、j。A是表示聚焦条纹图案的对比度的因子，其可以是在样品上生成的干涉图案的正弦波的振幅，并且phase是相移的值(以弧度为单位)。
鉴于由余弦(相位)因子加权的上述和中的第二项，某些相移，特别是该因子的值相对较低的那些相移，对合成图像Isyn的贡献相对较小。即，在一些实施例中，由对应于具有特征相移的聚焦条纹图案的附加照明数据导致的合成图像的分辨率的边际改善使得余弦(相位)相对较低，并不能证明与收集该照明数据相关联的附加采集和处理时间是合理的。在某些实施例中，聚焦条纹图案中没有一个具有特征相移，或者以其它方式对于第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案中的任何一个，分离的照明区域没有偏移相位，其余弦为0。例如，此类实施例排除了在生成具有π/2或3π/2的特征相移的Isyn时使用聚焦条纹图案。在某些更具体的实施例中，可以排除使用更广泛的聚焦条纹图案的可能性。例如，根据此类实施例，聚焦条纹图案中没有一个具有特征相移，或者以其它方式对于第一聚焦条纹图案和至少一个不同的聚焦条纹图案中的任何一个，分离的照明区域没有偏移相位，其具有绝对值小于0.5的余弦。此类实施例排除了在生成Isyn时使用聚焦条纹图案，其具有例如在π/3至2π/3或5π/3至5π/3的范围内的特征相移。
如上所述，除了具有相同旋转轴角度但不同相移的第二(或第三或第四)聚焦条纹图案之外，用具有特征旋转轴角度和相移的第一聚焦条纹图案照射样品可足以提供沿着该旋转轴角度方向的图像分辨率增强。因此，在具体实施例中，至少一个不同的聚焦条纹图案可以是第二聚焦条纹图案，对于该第二聚焦条纹图案，光束偏移不同于第一相位的第二相位，但是对于该第二聚焦条纹图案，第二分离的照明区域与第一聚焦条纹图案的那些照明区域相同，使得这些分离的照明区域具有不相对于第一旋转轴成角度(与其基本上重合)的第二旋转轴。在优选实施例中，第二相位与第一相位相差π，如在第一相移(或生成第一聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为零(0)并且第二相移(或生成第二聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为圆周率(π)的情况下。
同样，如果需要沿着另一方向增强图像分辨率，则可以使用第三聚焦条纹图案和第四聚焦条纹图案，其具有另一特征旋转轴角度但具有不同的特征相移。根据代表性的成像方法，至少一个不同的聚焦条纹图案因此可以包括不仅使用第二聚焦条纹图案，而且使用第三聚焦条纹图案和/或第四聚焦条纹图案，并且优选地使用第三聚焦条纹图案和第四聚焦条纹图案两者。对于第三聚焦条纹图案，光束可以偏移基本上与第一相位相同的第三相位，但是第三分离的照明区域可以具有相对于第一旋转轴和第二旋转轴两者成角度的第三旋转轴。对于第四聚焦条纹图案，光束可以偏移基本上与第二相位相同的第四相位，但是第四分离的照明区域可以具有不相对于第三旋转轴成角度(与其基本上重合)的第四旋转轴。在优选实施例中，第四相位与第三相位相差π，如在第三相移(或生成第三聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为零(0)并且第四相移(或生成第四聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为圆周率(π)的情况下。在其它优选实施例中，第三旋转轴，或第三旋转轴和第四旋转轴两者，相对于第一旋转轴，或以其它方式相对于第一旋转轴和第二旋转轴两者成约π/6至约π/2，如约π/4至约π/2的角度。例如，第一旋转轴和/或第二旋转轴可以具有零(0)的参考旋转轴角度，并且第三旋转轴和/或第四旋转轴可以相对于第一旋转轴和/或第二旋转轴成π/3的角度。
如果需要沿着另一方向增强图像分辨率，则可以使用第五聚焦条纹图案和第六聚焦条纹图案，其具有另一特征旋转轴角但具有不同的特征相移。根据代表性的成像方法，至少一个不同的聚焦条纹图案因此可以不仅包括第二聚焦条纹图案、第三聚焦条纹图案和第四聚焦条纹图案，而且包括第五聚焦条纹图案和/或第六聚焦条纹图案，并且优选地包括第五聚焦条纹图案和第六聚焦条纹图案。对于第五聚焦条纹图案，光束可以偏移基本上与第一相位和第三相位相同的第五相位，但是第五分离的照明区域可以具有相对于所有第一旋转轴、第二旋转轴、第三旋转轴和第四旋转轴成角度的第五旋转轴。对于第六聚焦条纹图案，光束可以偏移基本上与第二相位和第四相位相同的第六相位，但是第六分离的照明区域可以具有不相对于第五旋转轴成角度(与其基本上重合)的第六旋转轴。在优选实施例中，第六相位与第五相位相差π，如在第五相移(或生成第五聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为零(0)并且第六相移(或生成第六聚焦条纹图案的光束相对于彼此偏移的相位)为圆周率(π)的情况下。在其它优选实施例中，第五旋转轴或第五旋转轴和第六旋转轴两者相对于第一旋转轴或以其它方式相对于第一旋转轴和第二旋转轴两者成约π/2至约5π/6，如约π/2至约3π/4的角度。例如，第一旋转轴和/或第二旋转轴可以具有零(0)的参考旋转轴角度，并且第五旋转轴和/或第六旋转轴可以相对于第一旋转轴和/或第二旋转轴成2π/3的角度。
因此，本文描述的代表性样品成像方法包含获得多个原始图像中的每一个的照明数据，其中每个原始图像对应于一组聚焦条纹图案中的给定聚焦条纹图案。每个聚焦条纹图案由通过显微镜物镜发射的一对光束的干涉生成，以照射样品的多个点，例如通过围绕固定样品扫描图案以执行激光扫描显微术，或者以其它方式通过围绕固定图案移动样品以执行样品扫描显微术。该组聚焦条纹图案可以包含X·Y个成员，所述成员为(i)光束的旋转轴定向的X个唯一角度和(ii)光束偏移的Y个唯一相位的组合或限定这两者的矩阵。有利地，如本文所述，通过明智地选择相移的对应Y个唯一值，通过限制或消除传统方法中提供很少或不提供额外益处的照明数据的收集，以减少的时间和数据处理实现增强的图像分辨率。例如，如果相移指数1和2的值的余弦是显著的(例如，在相移指数1具有0的值并且相移指数2具有π的值的情况下)，则可能需要选择与π的相移指数1和2的值的差对应的相位差，但是如果这些值的余弦较不显著(例如，在相移指数1具有π/2的值并且相移指数2具有3π/2的值的情况下)，则不需要。因此，可以理解，在某些情况下，仅仅选择相移指数的差值而不选择更多的值可能是不够的。然而，通过适当地选择指数值，可以根据本文描述的方法对样品进行成像，其中相移的唯一值不超过两个，和/或总共不超过六个，或甚至不超过四个聚焦条纹图案。
在代表性实施例中，例如，可以用如下面表1中关于其旋转轴角度指数i和相移指数j表征的聚焦条纹图案1至6中的两个、四个或六个对样品进行成像。
表1
聚焦条纹图案 旋转轴角度指数i 相移指数j
1 1 1
2 1 2
3 2 1
4 2 2
5 3 1
6 3 2
例如，可以用仅聚焦条纹图案1至2，仅聚焦条纹图案1至4或仅聚焦条纹图案1至6对样品进行成像。旋转轴角度指数i的值可以是例如0、π/3和2π/3，且相移指数j的值可以是例如0和π。在这种情况下，对于表1中的各个旋转轴指数i和相移指数j，上述特定的聚焦条纹图案1至6可以更具体地通过旋转轴角度和相移的值来表征，这些值提供在下面的表2中。
表2
聚焦条纹图案 旋转轴角度值 相移值
1 0 0
2 0 π
3 π/3 0
4 π/3 π
5 2π/3 0
6 2π/3 π
本发明的进一步实施例涉及用于根据本文描述的成像方法中的任一种执行拉曼光谱或荧光显微术的设备。此类设备可以包括如可编程空间光调制器(SLM)的组件，用于调制投射到显微镜物镜的背面孔径上的光束的相位，如本文所述，并且干涉以在样品上生成聚焦条纹图案。优选地，SLM显示相位光栅，该相位光栅使光束穿过显微镜物镜的分离照明区域，这些分离区域为非圆形。该设备，或者更具体地，在该设备中使用的处理器的软件可以进一步执行高斯模糊(根据被称为高斯模糊滤镜的软件算法)，用于减少或消除沿着这些非圆形的分离的照明区域的边缘的衍射。
总体上，本发明的各方面涉及在样品成像应用中的优点，这些优点通过将激光束引导到显微镜的背面孔径的分离照明区域中获得，这些区域在一些实施例中是非圆形的(例如，狭缝或圆形段的形状)。与使用圆形照明区域相比，对于通过背面孔径的给定位移(距离)，两个非圆形照明区域可以增加光通量。例如，沿着如图1A和1B所示的水平位移轴16，两个圆之间的距离(图1A)与两个非圆形狭缝之间的距离(图1B)相同。然而，在两个非圆形狭缝(在该特定实施例中为圆形段)的情况下，基本上更多的光沿着垂直方向进入显微镜物镜。例如，可以实现该目标的背面孔径的光强度增加至少四倍。替代地，与使用圆形照明区域相比，对于给定的光通量，两个非圆形照明区域可以增加位移，从而提供由干涉产生的高质量(更精细的)正弦曲线。通过明智地选择用于样品扫描的聚焦条纹图案轮廓，其它方面与由照明数据收集和处理的效率产生的优点相关联。本领域技术人员利用从本公开获得的知识将认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所公开的成像方法和设备进行各种改变以实现这些和其它优点。因此，应当理解，本文描述的特征易于被改变或替换。本文所图示的和描述的具体实施例仅仅是为了说明性目的，并且不是对所附权利要求中阐述的本发明的限制。
以下实例作为本发明的代表而提出。这些实例不应被解释为限制本发明的范围，因为鉴于本公开和所附权利要求，这些和其它等效实施例将是显而易见的。
实例1
模拟研究
具有“地面实况图像”的真实样品的成像根据本文描述的改进成像方法使用共焦SIM进行模拟，并与传统的CLSM进行比较。使用可作为“PROPER”在线获得的光传播库获得模拟结果。这套程序用于使用傅立叶变换算法(菲涅耳(Fresnel)，角谱法)来模拟光通过光学系统的传播，已经被彻底验证为物理光学传播工具，并被天文学家普遍用于对望远镜的性能建模。该库用于模拟，特别是模拟532nm激光通过100x、0.7NA物镜，通过75mm焦距透镜聚焦到25μm的共焦针孔的共焦和共焦SIM点扩展函数。图3绘示了对于光束的三个不同角度(0、π/3、2π/3)，以及对于每个角度，光束相对于彼此偏移0和π的相位，该共焦SIM实例的模拟点扩展函数。然后，通过取点扩展函数与地面实况图像的卷积，使用这些图案模拟所收集的结果图像。在角度为0、相移为π的原始共焦SIM图像的情况下，该图像本身没有什么用处。只有当收集所有角度和相位的原始图像数据并将其用于根据本文描述的图像重建算法重建超分辨图像时，相对于传统CLSM的改进才是明显的。
图4绘示了使用传统CLSM的模拟样品图像的集合，以及相同的模拟图像，但是利用共焦SIM来提高分辨率。通过使用如图3所示的六种角度和相位组合重建超分辨图像实现了对在整个样品上扫过的照明图案的改进。图像重建算法如上所述。因此，模拟工作证明了在模拟显微镜分辨率标准上使用上述改进的共焦SIM图像的成功模拟。在其它研究中，在1D和2D模拟中都证明了在给定的旋转轴角度下仅需要2个不同的照明相移。
实例2
实验演示
根据图2所示的配置，构建了一个用于执行共焦SIM的原型显微镜。分色镜提供了使用显微镜照相机观察样品上的激光光斑的能力。该照相机用于从SLM获取由SIM图案生成的光斑图像，以证明生成了与实例1中描述的物理光学传播模拟研究中相同的聚焦条纹图案。这基于与模拟结果的并排比较，考虑到在该实验演示中获得的图像周围的圆形边界，以帮助指示与共焦针孔的近似对齐。在模拟研究中，模拟的SIM激光图案已经考虑了共焦掩模的应用，这也是这些图案的外部形状为圆形的原因，如图3所示。
使用PelcotecTMCDMS(Ted Pella公司的临界尺寸放大标准)，在行扫描以及全2D图像中成功地演示了共焦SIM的超级分辨率。CDMS样品具有500nm间隔的线，这是共焦成像系统无法分辨的。相反，当使用共焦SIM成像时，可以解析图像。此外，当使用100x、0.9NA的物镜在532nm激发下成像时，根据背景技术中给出的等式计算出的共焦分辨率将为296nm。这可以使用碳纳米管样品通过实验证实，并且通过实现279nm的共焦(非SIM)分辨率在共焦系统上得到证实。通过相同的系统，使用相同的激发波长、物镜和碳纳米管样品，当使用组合的共焦SIM成像时，实现了186nm的改进分辨率。

Claims (22)

1.一种对样品进行成像的方法，所述方法包含：
用通过显微镜物镜发射的光束的干涉在所述样品的多个点中的每一个点处生成的第一聚焦条纹图案照射所述多个点；
其中对于所述第一聚焦条纹图案，所述显微镜物镜的第一分离的照明区域具有第一旋转轴，并且所述光束相对于彼此相移第一相位；
所述方法进一步包含用至少一个不同的聚焦条纹图案照射所述多个点，其中所述光束相对于彼此相移不同于所述第一相位的相位，并且其中(i)所述显微镜物镜的相同的分离照明区域具有不相对于所述第一旋转轴成角度的相同旋转轴，或者(ii)所述显微镜物镜的不同的分离照明区域具有相对于所述第一旋转轴成角度的另一旋转轴，
其中所述分离的照明区域中的一个或两个是非圆形的。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从单元件检测器或光谱仪获得对应于所述第一聚焦条纹图案和所述至少一个不同的聚焦条纹图案中的每一个的多个原始图像中的每一个的照明数据。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含根据下式从所述多个原始图像中的每一个的所述照明数据重建超分辨合成图像：
Figure FDA0003292887950000011
其中Isyn是所述合成图像并且nimages是所述多个原始图像中的每一个的数量，并且
其中对于所述第一聚焦条纹图案和所述至少一个不同的聚焦条纹图案中的每一个：
i是对应于旋转轴角度的指数；
j是对应于所述光束相对于彼此的相移的指数；
Figure FDA0003292887950000012
是所述多个原始图像中的每一个的所述照明数据，具有对应于所述旋转轴角度的指数i和对应于所述相移的指数j；
A是表示所述聚焦条纹图案的对比度的因子，
phase是所述相移。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离的照明区域包括最大内切圆，其中心与所述显微镜物镜的后孔径的中心基本共线。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离的照明区域各自进一步包括在所述最大内切圆外部的照明增强区域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述照明增强区域占所述分离的照明区域的至少约50％。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述照明区域的形状为与所述显微镜物镜的后圆形孔径的相对侧部分一致的狭缝。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中对于所述至少一个不同的聚焦条纹图案，使用可编程空间光调制器对所述光束进行相位调制。
9.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述第一聚焦条纹图案和所述至少一个不同的聚焦条纹图案中的任何一个，所述分离的照明区域没有偏移相位，所述相位余弦为0。
10.根据权利要求9所述的方法，其中对于所述第一聚焦条纹图案和所述至少一个不同的聚焦条纹图案中的任何一个，所述分离的照明区域没有偏移相位，所述相位具有绝对值小于0.5的余弦。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个不同的聚焦条纹图案是第二聚焦条纹图案，对于所述第二聚焦条纹图案，所述光束偏移不同于所述第一相位的第二相位，并且所述相同的分离照明区域是具有第二旋转轴的第二分离的照明区域，所述第二旋转轴不相对于所述第一旋转轴成角度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一个不同的聚焦条纹图案进一步包括：
第三聚焦条纹图案，对于所述第三聚焦条纹图案，所述光束偏移基本上与所述第一相位相同的第三相位，并且对于所述第三聚焦条纹图案，第三分离的照明区域具有相对于所述第一旋转轴和所述第二旋转轴成角度的第三旋转轴。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个不同的聚焦条纹图案进一步包括：
第四聚焦条纹图案，对于所述第四聚焦条纹图案，所述光束偏移基本上与所述第二相位相同的第四相位，并且对于所述第四聚焦条纹图案，第四分离的照明区域具有不相对于所述第三旋转轴成角度的第四旋转轴。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二相位与所述第一相位相差π。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一相位为0并且所述第二相位为π。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一个不同的聚焦条纹图案进一步包括：
第五聚焦条纹图案，对于所述第五聚焦条纹图案，所述光束偏移基本上与所述第一相位和所述第三相位相同的第五相位，并且对于所述第五聚焦条纹图案，第五分离的照明区域具有相对于所述第一旋转轴、所述第二旋转轴、所述第三旋转轴和所述第四旋转轴成角度的第五旋转轴；以及
第六聚焦条纹图案，对于所述第六聚焦条纹图案，所述光束偏移基本上与所述第二相位和所述第四相位相同的第六相位，并且对于所述第六聚焦条纹图案，第六分离的照明区域具有不相对于所述第五旋转轴成角度的第六旋转轴。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一相位、所述第三相位和所述第五相位为0，并且其中所述第二相位、所述第四相位和所述第六相位为π。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第三旋转轴相对于所述第一旋转轴成约π/6至约π/2的角度，并且其中所述第五旋转轴相对于所述第一旋转轴成约π/2至约5π/6的角度。
19.一种对样品进行成像的方法，所述方法包含：
获得多个原始图像中的每一个的照明数据，每个原始图像对应于一组聚焦条纹图案中的给定聚焦条纹图案，每个聚焦条纹图案由通过显微镜物镜发射的一对光束的干涉生成，以照射所述样品的多个点，
其中所述一组聚焦条纹图案包含X·Y个成员，所述成员为(i)所述光束偏移的X个相位和(ii)所述光束的旋转轴定向的Y个角度的组合，其中所述组包括不超过两个不同的X值。
20.一种用于执行拉曼光谱术或荧光显微术的设备，所述设备包含可编程空间光调制器(SLM)，所述可编程空间光调制器用于调制所述光束的相位并且被配置用于执行根据权利要求1所述的方法。
21.根据权利要求20所述的设备，其中所述SLM显示相位光栅，所述相位光栅使所述光束穿过显微镜物镜的非圆形的分离照明区域。
22.根据权利要求21所述的设备，其被配置用于执行高斯模糊以平滑所述非圆形的分离照明区域。
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