JP2005515493A - 画像発生用の顕微鏡使用画像化装置および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料の光学的に区分化された画像を発生させる方法および顕微鏡
使用画像装置を提供するものである。前記方法は、変調する空間的周期的な照
明パターンで試料を照明するステップと、結合する画像面に前記試料を画像化
するステップと、各信号が各位置での入射光強度に対応し、照明パターンの変
調により引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像面上のそれぞれの位
置で複数の信号を収集するステップと、各々の前記信号の振動性構成要素の特
性を測定するステップとを備えることより、測定された特性が、その相対的な
位置に一体化された場合に、前記試料の光学的に区分化された画像を発生させ
ることを特徴とする。

Description

本発明は、画像を発生させるための顕微鏡使用画像化装置および方法に関し、より詳しくは、光学的に区分化された画像を発生させる装置および方法に関する。

従来の広視野の顕微鏡では、合成した画像は試料対象面の画像をぼかせる試料対象面の上方および下方で焦点がずれた試料構造からの寄与を含むので、三次元試料の適切な二次元の光学的に区分化された画像を得ることは可能でない。従来の広視野の顕微鏡では、これらの焦点がずれた細部を除去できない。

この問題を打開するために共焦点顕微鏡が開発されている。この共焦点顕微鏡は、光学的に試料対象面に結合する平面に位置する点光源を用いる。この配列では焦点がずれた光を除去することは可能であるが、点ごとに光学的に区分化された画像を作り上げるには照明ビームを横に走査しなければならない。このことは、特に試料の三次元画像を形成するように、連続する焦点位置で得られる光学的に区分化された画像を「積層する」ことを望むならば、収集時間が長くなる。そのような装置の光効率も低い傾向となる。

走査を避け、収集時間を減らすために、数多くのやり方が提案されている。
そのひとつに、ピンホールがいくつかの共焦点容積の平行な観察を可能とする、多孔回転円盤により置き換えられるニプコウ（Nipkow）円盤の使用が含まれる。
それでさえも、照明光使用量全体のたった約二パーセントしか画像化に用いられない。

この問題を打開する試みにおいて、Verveer等（Verveer P.J., Gemkow M.J.およびJovin M., J. Microscopy, Vol. 189 (3), (1998), 192-198）は、前記ニプコウ円盤をプログラム化可能なピンホール配列として供するデジタルマイクロミラー装置に置き換える提案を行った。このようにして得られた画像は、共焦点画像と従来の画像を重ね合わせたものからなっている。純粋な共焦点の寄与は、従来の画像を引き去ることにより回復することが可能であるが、ノイズが代償として増加する。

ＷＯ ９８/４５７４５では、対象物が周期的なパターンにより照明され、少なくとも三つの試料画像が前記パターンの異なる空間的な位相で記録される代わりのやり方を開示している。前記三つの画像は、周期的なパターンおよび焦点ずれの寄与を取り除く画像処理により結合され、これにより光学的に区分化された画像を生成する。しかしながら、このやり方はリアルタイムな画像化を実施するには便利ではない。

本発明の目的は、従来の共焦点技術のように実質的に焦点内の細部のみを含むが、より好ましい光使用量と収集時間を有する光学的に区分化された試料画像を発生させる方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、リアルタイムな画像化を容易にする光学的に区分化された試料画像を発生させる方法を提供することである。

第一の態様において、本発明は試料の光学的に区分化された画像を発生させる方法を提供するものであって、この方法は前記試料を変調する空間的に周期的な照明パターンで照明するステップと、前記試料を結合する画像面上に画像化するステップと、各信号（代表的には電気信号）が各位置での入射光強度に対応し、照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像面上のそれぞれの位置で複数の信号を収集するステップと、各々の前記信号の振動性構成要素の特性（代表的には振幅）を測定するステップとを備えることにより、測定された特性が、その相対的な位置に一体化された場合に、
前記試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする。

このように本発明は、試料からの光の一時的な変化の解析が焦点ずれの寄与の除去を可能にするとの理解に基づいている。そのような解析は自動化された処理に従い、その処理はリアルタイム画像化への門戸を開く。これは、一時的な変化よりむしろ離散した画像が解析されるＷＯ９８/４５７４５のやり方と対照的である。

好ましくは、前記方法は収集と測定のステップの間に、さらに振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号を透過するステップを備える。
代表的には、各画像画素の値（例えば、明度値または色値）はそれぞれの振動性構成要素の測定された特性と画像面上のそれぞれの位置に対応する各画素の位置により判定され、光学的に区分化された画像は画素化される。

前記方法は、試料の一連の光学的に区分化された画像を生成するように、異なる焦点位置に対して繰り返してよい。それから、これらの画像を前記試料の三次元画像を形成するように結合することが可能である。
好ましくは、空間的に周期的な照明パターンがそれぞれの試料位置で所定の変調周波数を生成するように変調されることにより、画素面上の対応する位置で収集した信号の振動性構成要素は実質的に同じ周波数を有する。「変調周波数」は、試料のある位置が明から暗へ、そして再び明へと完全な一照明サイクル行うのに要する往復時間を意味するものとする。

好ましい実施形態において、照明パターンは一次元の周期性を有している。例えば、前記パターンが縞パターン、例えば、平行な直線状縞または同心円状縞を備えてもよい。そのようなパターンはよく定義された空間的な周期性を有し、例えば、干渉分光法または照明マスクにより生成することが可能である。実質的に全ての画像化した試料位置が実質的に等しい変調周波数および時間積分した照明強度を受けることを保証するような方法で、前記パターンの要素を移動または移すことにより、これらのパターンもまた変調することが可能である。

例えば、平行な直線状縞パターンは、縞の横方向に試料を横切って縞を移すことにより移動可能である。その際、変調周波数は縞ひとつ分だけ縞を移すのに要する時間の逆数である。同心円状縞パターンは、縞をその共通の中心から離れて膨張させるか、中心方向に縮ませることにより移動可能である。つまり、変調周波数はひとつの縞が隣接する縞の大きさに成長（または縮小）するのに要する時間の逆数である。

好ましくは、前記照明パターンは少なくとも１００ヘルツ（より好ましくは１キロヘルツ、１０キロヘルツまたは１００キロヘルツ）の変調周波数を生成するように変調される。
代表的には、画像面での入射光は反射光または透過光を含み、かつ/または前記照明パターンに応じて試料（蛍光灯等）により発せられた光を含む。

本発明のさらなる態様は、光学的に区分化された画像を発生させる画像データを処理する方法を提供するものであって、前記方法は、試料を変調する空間的に周期的な照明パターンで照明するステップと、結合する画像面上の前記試料を画像化するステップと、各信号が各位置での入射光強度に対応し、照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像上のそれぞれの位置で複数の信号を収集するステップとを実行することにより、前に収集した複数の信号を含むデータを受信する手順と、各々の前記信号の振動性構成要素の特性（代表的には振幅）を測定する手順とを含むことにより、測定された特性が、相対的な位置に一体化された場合に、試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする。

このように、本発明のこの態様は、前の態様の照明、画像化および収集ステップを実行することにより、前に収集した画像データの処理に関係する。前の態様の随意および好ましい特徴はこの態様にも適用される。
例えば、前記方法は受信と測定のステップの間にさらに振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号を透過するステップを備える。

本発明のさらなる態様は、顕微鏡使用画像装置を提供するものであって、前記装置は変調する空間的に周期的な照明パターンで試料を照明する照明手段と、結合する画像面上で前記試料を画像化する画像化手段と、各信号が各位置での入射光強度に対応し、変調する照明パターンにより引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像上のそれぞれの位置で複数の信号を収集する収集手段と、各々の前記信号の振動性構成要素の特性（代表的には振幅）を測定する処理手段とを備えることにより、測定された特性が、相対的な位置に一体化する場合に、前記試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする。

好ましくは、前記処理手段は振動性構成要素の特性を測定するに前に、振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号をも透過する。

ひとつの実施形態においては、照明手段はふたつの重なり合う干渉性光のビームにより発生させることが可能なような、空間的に周期的な干渉照明パターンを発生させる手段を備える。干渉性光のビームはレーザにより生成してもよい。

代わりに、前記照明手段はパターン化した格子、すなわち、照明パターンに対応した格子パターンにより試料を照明する光源を備えてもよい。そのような光源は干渉性でなくてもよい。さらに、そのような光源は白色光で試料を照明してもよい。

収集手段は、複数の画像面位置でそれぞれ光強度を検出する光検出器の配列を備えてもよい。代表的には、そのような検出器は併行で作動する。好適な一次元ならびに二次元の信号検出器配列は、ＥＰ−Ａ １０６５８０９に記載されている。一次元配列を使用すると、二次元の光学的に区分化された画像を発生させるには、一次元配列を画像面に渡って走査する必要がある。しかしながら、好ましくは、二次元配列は実質的に全体の画像面に渡って光強度が同時に検出されるように使用される。このことは画像収集時間を低減する。

二次元配列の検出器では、各検出器は画素化した光学的に区分化された画像のひとつの画素に対応した信号を収集することが可能である。一次元配列の検出器では、各検出器は画素化した光学的に区分化された画像の一列の画素に対応した信号を収集することが可能である。

好ましくは、前記処理手段は、収集した信号の振動性構成要素をそれぞれ測定（かつ随意には透過）する複数の信号処理装置を備えている。
代表的には、前記処理装置は画像発生時間を低減するために併行で作動する。

より好ましくは、信号検出器の配列に関して、例えば、各信号発生器はＥＰ−Ａ−１０６５８０９に記載されたような専用の信号検出器を有する。このように、信号収集、つまり、透過およびそれに続く測定は、完全自動化が可能である。

代表的には、照明手段は所定の照明変調周波数（例えば、少なくとも１００ヘルツ、１キロヘルツまたは１０キロヘルツ）を生成するように、照明パターンを変調する。
好ましくは、前記処理手段は信号から効果的に振動性構成要素を隔離するために、実質的に同じ周波数で収集した信号を透過するようになっている。

本発明のさらなる態様は、従来の顕微鏡を前の態様の顕微鏡使用画像装置に転用する転用道具一式を提供するものであり、前記転用道具一式は、変調する空間的に周期的な照明パターンで試料を照明する照明手段と、各信号が各位置での入射光強度に対応し、かつ照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、顕微鏡が試料を画像化する、結合する画像面上のそれぞれの位置で複数の信号を収集する収集手段と、各々の前記信号の振動性構成要素の特性(代表的には振幅)を測定する処理手段とを備えることにより、測定された特性が、相対位置に一体化される場合に、試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする。

好ましくは、前記処理手段は振動性構成要素の特性を測定する前に、振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号を透過する。
前記転用道具一式は、前の態様の顕微鏡使用画像化装置の好ましいまたは随意の特徴 に対応した、他の好ましいまたは随意の特徴を有してもよい。

本発明の特定の実施形態について、以下に添付図面を参照して記述する。
直線状で平行な縞を含む空間的に周期的な照明パターンは、例えば、ふたつの互いに干渉性ビーム間の干渉により形成してもよい。前記干渉縞は、光軸に基本的に平行に延びる均一な照明強度の平面により形成される。このように、光軸（焦点面等）に垂直な面上において、干渉縞は波シフトベクトル

合成試料照明強度Ｉ_exは以下で表される。

上述の理論モデルは、往復ｋ空間の関係で画像化を記述するという公知の取り組み方に基づいている。簡単のため干渉性照明の例を用いてきた。しかしながら、非干渉性照明は、代わりに直接的はやり方で取り上げることが可能である。例えば、直線状平行縞は適当なマスクを照明し、かつ試料と同じ焦点面上に前記マスクを画像化することにより形成してもよい。

前記理論モデルと矛盾することなく、本発明により達成した光区分化効果についても、簡単な質的モデルにより現実のｘ−ｙ−ｚ空間において記述することが可能である。ここで光軸はｘ−ｙ−ｚ空間のｚ軸に相当する。事実上、移動する周期的な照明パターンは、あるｘ−ｙ面に渡って延びる光学的に区分化された容積内の画像化された試料において、単に「可視」（強いコントラストを有するという意味において）である。前記パターンの可視性は、他のｘ−ｙ面において、光軸に沿って光学的に区分化された容積のどちらか側に鋭く減少する。すなわち、光学的に区分化された容積から離れると、前記パターンは不鮮明になり、そして結局上記の直流構成要素に寄与する非周期的背景照明を形成する。

このように、焦点がずれるとは干渉縞のコントラストおよび動きが緩くなることを意味する。従って、光学的に区分化された容積内の試料のそれらの部分だけが、振動性構成要素を有する光信号となるような方法で、照明光を（例えば、反射、透過または蛍光により）修正する。この振動性構成要素は光学的に区分化された画像を構築するのに用いることが可能な交流信号として測定可能である。

このように、光区分化は結合する画像面上の光検出器の配列を位置付け、各検出器で収集した信号を直流および交流構成要素に分割することにより達成可能である。直流構成要素は、時間不変の従来の顕微鏡画像に相当し、無視することが可能である。それ対して、交流信号は実質的に焦点内の空間周波数構成要素だけを搬送し、光学的に区分化された画像を発生させるために使用可能である。

好適な検出器配列は、ＥＰ−Ａ−１−１０６５８０９に記載された振幅復調検出器配列（ＡＤＤＡ）である。ＡＤＤＡは、光検出器および対応する集積回路信号処理装置の二次元配列としてシリコンチップ上に形成される。各対の信号・処理装置は最終の光学的に区分化された画像のひとつの画素に相当し、それにより事実上完全な画像を瞬時に収集することが達成可能となる。

ＡＤＤＡを使用する利点は、全ての信号処理関数がシリコンチップ上で集積回路により実行可能なことである。ＡＤＤＡは変動を助長する感度が低い。
図２は、ＡＤＤＡの各対の検出器・処理装置により実行される信号収集および処理ステップを模式的に示す。光検出器１は光を捕らえ、相当する電気信号を発生する。増幅器２はローパスフィルター３および電流源４と共に、電気信号の直流構成要素の除去および交流構成要素の増幅となるフィードバックループを提供する。交流構成要素は整流器５で整流され、最終段のローパスフィルター６はさらに交流構成要素を透過し、かつ平滑化する。

対の検出器・処理装置のアナログ出力は、それゆえ事実上交流構成要素の振幅の測定であり、そして他の対の出力と結合して光学的に区分化された画像とするためにアナログ/デジタル変換機へ送られることが可能となる。前記画像を、例えばビデオモニター（例えば画素明度レベルに変換される交流構成要素測定付）上に表示してもよいし、あるいはコンピュータで読み出し可能な記憶装置に格納してもよい（ハードディスクやＲＡＭやＣＤ等）。

図３は代表的な検出器・処理装置対の周波数応答を示す。この応答は直流信号抑制、および約２００キロヘルツに最大周波数応答を有する交流信号通過帯域を提供する。そのような対から形成されるＡＤＤＡ配列との最適互換性のため、照明パターンを照明変調周波数が２００キロヘルツとなるように変調すべきである。
そのような周波数応答の利点は、従来の顕微鏡画像に対してもまた抑制されることである。

図４は、本発明の第一の実施形態による顕微鏡使用画像化装置を示す。光はレーザのような干渉性光源１１により生成され、そして随意の減衰器１２により随意に減衰される。この光はビーム分離器１３およびミラーまたはプリズム１４でふたつの平行ビームに分割される。次に、位相または周波数シフト素子１５と１６が、それぞれ前記ビームに作動する。ふたつのシフトしたビームは試料１９でミラー１７と１８により再結合され、均一な照明変調周波数を試料１９上の各点に提供する、連続的に移動する周期的な照明パターンを形成する。

試料１９からの光は、レンズ２０と２１（このレンズは、例えば、透過または反射構成で配置した従来の広視野の顕微鏡観察レンズを含む顕微鏡の光路の一部であってもよい）を介して二次元ＡＤＤＡ配列２２上に画像化され。前記ＡＤＤＡ配列の各対の検出器・処理装置は照明変調周波数に調整した最大周波数応答を有する。

図５は本発明の第２の実施形態による顕微鏡使用画像処理装置を示す。本実施形態では、光は随意の減衰器３２により随意に減衰される前に、非干渉性光源により生成される。周期的な照明パターンは、ハウジング３５に備えられ、かつ対象物に結合した中間の画像位置に位置したマスク３６により発生させられる。前記パターンは、従来の顕微鏡観察光学素子４１である対物レンズ４０を経由して試料３９上に画像化される。前記マスクは、試料に相対的な照明パターンの画像を移すために、ピエゾ素子（図示しない）により横に動かされる。そして前記観察光学部品は、結合する画像面に位置する二次元のＡＤＤＡ配列４２で散乱または発せられる光から試料の画像を形成する。

本発明においては、より好ましい光使用量と収集時間を有し、かつリアルタイムな画像化を容易にする光学的に区分化された試料画像を発生させる方法および装置が提供され、実用上の効果が極めて大きい。

光学伝達関数ＯＴＦの絶対値を焦点面への正規化した距離および正規化した空間周波数の関数として示す図である。 検出器・処理装置対である振幅復調検出配列（ＡＤＤＡ）により実行される信号検出ステップおよび処理ステップを模式的に示すフローチャートである。 代表的な検出器・処理装置対の周波数応答を示す図である。 本発明の第一の実施形態による顕微鏡使用画像化装置を示す図である。 本発明の第二の実施形態による顕微鏡使用画像化装置を示す図である。

Claims (20)

1. 試料の光学的に区分化された画像を発生させる方法であって、
   変調する空間的に周期的な照明パターンで試料を照明するステップと、
   結合する画像面に前記試料を画像化するステップと、
   各信号が各位置での入射光強度に対応し、照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像面上のそれぞれの位置で複数の前記信号を収集するステップと、
   各々の前記信号の振動性構成要素の特性を測定するステップとを備えることにより、測定された特性が、その相対的な位置に一体化された場合に、前記試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする画像を発生させる方法。
2. 請求項１において、測定された前記特性が前記振動性構成要素の振幅であることを特徴とする画像を発生させる方法。
3. 請求項１または２において、収集ステップと測定ステップの間に前記振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号を透過するステップをさらに備えることを特徴とする画像を発生させる方法。
4. 請求項１乃至３のいずれかにおいて、前記照明パターンは縞パターンであることを特徴とする画像を発生させる方法。
5. 請求項４において、前記縞パターンは干渉パターンであることを特徴とする画像を発生させる方法。
6. 請求項１乃至５のいずれかににおいて、前記照明パターンを試料対象面に相対的に移動させることにより前記照明パターンを変調することを特徴とする画像を発生させる方法。
7. 請求項１乃至６のいずれかにおいて、前記照明パターンを少なくとも１００ヘルツの照明変調周波数を生成するように変調することを特徴とする画像を発生させる方法。
8. 請求項１乃至７のいずれかにおいて、画像面での入射光は反射光または透過光を含むことを特徴とする画像を発生させる方法。
9. 請求項１乃至８のいずれかにおいて、前記画像面での前記入射光は、前記照明パターンに応じて試料により発せられた光を含むことを特徴とする画像を発生させる方法。
10. 光学的に区分化された画像発生させる画像データを処理する方法であって、
    試料を変調する空間的に周期的な照明パターンで照明するステップと、結合する画像面上の前記試料を画像化するステップと、各信号が各位置での入射光強度に対応し、前記照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像上のそれぞれの位置で複数の前記信号を収集するステップとを実行することにより、前に収集される複数の前記信号を含むデータを受信する手順と、
    各々の前記信号の振動性構成要素の特性を測定する手順とを含むことにより、測定された前記特性が、相対的な位置に一体化された場合に、試料の光学的に区分化された画像発生させることを特徴とする画像データを処理する方法。
11. 顕微鏡使用画像化装置であって、
    前記装置は変調する空間的に周期的な照明パターンで試料を照明する照明手段と、
    結合する画像面上で前記試料を画像化する画像化手段と、
    各信号が各位置での入射光強度に対応し、変調する照明パターンにより引き起こされる振動性構成要素を有し、前記画像上のそれぞれの位置で複数の前記信号を収集する収集手段と、
    各々の前記信号の振動性構成要素の特性を測定する処理手段とを備えることにより、測定された前記特性が、相対的な位置に一体化する場合に、前記試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする画像化装置。
12. 請求項１１において、前記処理手段は前記振動性構成要素の特性を測定する前に、前記振動性構成要素を隔離するために、各収集した信号をも透過することを特徴とする画像化装置。
13. 請求項１２において、前記照明手段は所定の変調周波数を生成するように前記照明パターンを変調し、前記処理手段は実質的に同じ周波数で収集した信号を透過するようになっていることを特徴とする画像化装置。
14. 請求項１１乃至１３のいずれかにおいて、前記照明手段は空間的に周期的な干渉照明パターンを発生させる手段を備えることを特徴とする画像化装置。
15. 請求項１１乃至１４のいずれかにおいて、前記収集手段は複数の画像面位置で光強度をそれぞれ検出する光検出器の配列を備えることを特徴とする画像化装置。
16. 請求項１５において、光検出器の前記配列は二次元配列であることを特徴とする画像化装置。
17. 請求項１１乃至１６のいずれかにおいて、前記処理手段は収集した光信号の前記振動性構成要素の特性をそれぞれ測定する複数の信号処理装置を備えることを特徴とする画像化装置。
18. 請求項１３乃至１７のいずれかにおいて、前記照明手段は変調周波数が少なくとも１００ヘルツであるように、前記照明パターン照明を変調することを特徴とする画像化装置。
19. 従来の顕微鏡を請求項１３乃至１８のいずれかに記載の顕微鏡使用画像化装置に転用する転用道具一式であって、
    変調する空間的に周期的な照明パターンで試料を照明する照明手段と、
    各信号が各位置での入射光強度に対応し、かつ照明パターンの変調により引き起こされる振動性構成要素を有し、顕微鏡が試料を画像化する、結合する画像面上のそれぞれの位置で複数の信号を収集する収集手段と、
    各々の前記信号の振動性構成要素の特性を測定する処理手段とを備えることにより、測定された特性が、相対位置に一体化される場合に、試料の光学的に区分化された画像を発生させることを特徴とする転用道具一式。
20. 顕微鏡使用画像化装置であって、添付図面を参照して記載または示された画像化装置。

Images