JP4924146B2 - 共焦点顕微鏡システム - Google Patents

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Description

本発明は、回転式のピンホールアレイディスクを用いた共焦点顕微鏡システムに関するものであり、共焦点画像とともに透過光画像および蛍光画像を観察することのできる共焦点顕微鏡システムに関するものである。
従来より、ピンホールアレイディスク(ニポウディスク)型共焦点スキャナを用いた共焦点顕微鏡は良く知られている。
図7は、このような従来の共焦点顕微鏡システムの一例を示す構成図である。図7においては、共焦点スキャナユニット1が倒立顕微鏡2のポート部3に取りけられている。ポート部3の内部にはチューブレンズ3aが設けられている。
顕微鏡2には、透過光画像観察用の観察光を出射する観察光源4、蛍光画像観察用の励起光を出射する励起光源5、コンデンサレンズ6、対物レンズ7、撮像カメラ8、観察鏡筒9、観察試料10を載せた試料台11が取り付けられている。
ミラー部12は全反射ミラーとスルー状態とを選択可能に構成されている。また、ミラー部13は、励起光は透過させるとともに観察試料10からの蛍光を反射するようなダイクロイックミラーと、全反射ミラーとを選択可能に構成されている。ミラーの選択は直線移動機構上にダイクロイックミラーと、全反射ミラーとを同一の角度で配置してスライドさせることによって行う。ミラー部14は全反射ミラーとハーフミラーとスルー状態とを選択可能に構成されている。その他ミラー15、ミラー16、ミラー17は全反射ミラーである。
また、共焦点スキャナユニット1には、光ファイバ18を介してレーザ光(励起光)を出射するレーザ光源19と、共焦点画像を撮像する撮像カメラ20が取り付けられている。共焦点スキャナユニット1の内部にはマイクロレンズアレイディスク21とピンホールアレイディスク22が設けられており、これらは軸受け部23で連結されており、モータ24によって同時に回転するように構成されている。
マイクロレンズアレイディスク21とピンホールアレイディスク22の中間には、レーザ光源19からのレーザ光(励起光)は透過し、観察試料10からの蛍光は反射するようなダイクロイックミラー25が配置されており、さらに全反射ミラー26、27、28が図のように配置されている。
また、光ファイバー18の先端から出射される光を平行光に変換するコリメートレンズ29と、観察画像を撮像カメラ20に結像させる一組のリレーレンズ30、31がそれぞれ図のように配置されている。
観察光源4からの光はミラー16およびコンデンサレンズ6を介して観察試料10を照明し、観察試料10からの透過光は、スルー状態のミラー部12を透過し、全反射ミラーが選択されたミラー部13によって反射される。
反射された透過光を肉眼で観察する場合には、ミラー部14で全反射ミラーを選択することによって、透過光が観察鏡筒9に導かれ、観察鏡筒9内の図示しない接眼レンズによって肉眼での観察が可能となる。
また、透過光を撮像カメラ8で撮影する場合には、ミラー部14をスルー状態にすることによって、透過光画像が撮像カメラ8の結像レンズに結像される。
さらに、ミラー部14をハーフミラーにすることによって、目視観察と撮像カメラ8での観察を同時に行うことができる。
蛍光観察時には、ミラー部13はダイクロイックミラーを選択し、さらにミラー部12はスルー状態にする。このため、励起光源5からの励起光はミラー17で反射され、ミラー部13のダイクロイックミラーおよびミラー部12を透過して、対物レンズ7を介して観察試料10に照射される。
観察試料10から発せられた蛍光は同じ光路を戻るが、ミラー部13のダイクロイックミラーにより反射される。したがって、この蛍光画像は図示しないバリアフィルタなどを通った後に、前記と同様の方法により観察鏡筒9や撮像カメラ8に導かれ、肉眼観察や撮影が行われる。
また、共焦点画像を得る際には、顕微鏡2の観察光源4、励起光源5を消して、ミラー部12を全反射ミラー状態にする。レーザ光源19からのレーザ光はコリメートレンズ29によって平行光にされた後に、ミラー28、27で反射されてマイクロレンズアレイディスク21へと向けられる。
ここで、レーザ光はマイクロレンズアレイディスク21の個々のマイクロレンズによって複数のビームスポットに集光される。この光はダイクロイックミラー25を透過して、ピンホールアレイディスク22上の対応する個々のピンホールに集光される。ピンホールを通過した光は、ポート部3内のチューブレンズ3aによって平行光とされ、ミラー12で反射されて対物レンズ7を介して観察試料10に照射される。
観察試料10からの蛍光は同じ光路を戻り、再び個々のピンホールを通過した後に、ダイクロイックミラー25で反射され、ミラー26、リレーレンズ30、31を介して撮像カメラ20の撮像素子上に結像する。
ここで、前記マイクロレンズアレイディスク21とピンホールアレイディスク22が高速回転することによって、前記観察試料10上の個々のビームスポットが観察試料上の焦点面を走査し、これに伴って、観察試料の焦点面からの蛍光も撮像素子上を走査する。また、焦点面以外の光は同様の光路を通ることができず、ほとんどピンホールを通過できない。これによって焦点面からの蛍光画像(共焦点画像)が撮像カメラ20で撮像される。
また、共焦点画像と蛍光画像とを共通の観察部により観察するものとして、次のような特許文献がある。
実用新案登録第2570631号公報
しかしながら、図7のような構成の共焦点顕微鏡システムでは、透過画像や蛍光画像のような通常の顕微鏡画像と共焦点画像とをカメラにより撮影するためには、撮像カメラが2台必要になるか、それぞれの観察時に付け替えることが必要になる。このため、高価な高感度カメラを2台搭載すると、システムが高価になるという問題がある。また、カメラ1台を付け替えて使用すると、交換が煩わしく実用的では無いという問題がある。また、通常の顕微鏡画像を、共焦点スキャナユニットを透過させて撮像カメラで撮影すると、光はピンホールアレイディスクの開口率分しか透過せず、2桁程度暗い画像となってしまう。
また、上記の特許文献1に記載された装置は、透過光画像を観察するものではないとともに、蛍光画像を観察するための励起光は共焦点スキャナを介して観察試料に照射されており、蛍光画像は半共焦点の画像となってしまう。
本発明は上記のような従来装置の欠点をなくし、共焦点画像とともに透過光画像および蛍光画像を観察することのできる共焦点顕微鏡システムを簡単な構成より実現することを目的としたものである。
本発明の共焦点システムは、請求項1においては、観察試料から得られる透過光画像と蛍光画像と共焦点画像とを観察する共焦点顕微鏡システムにおいて、
少なくともマイクロレンズアレイディスクとピンホールアレイディスクとを有し、複数のビームスポットにより前記観察試料面を走査するとともに、観察画像を撮影するカメラを接続する接続鏡筒を有する共焦点スキャナユニットと、
前記観察試料を保持し、この観察試料に透過光画像観察用の観察光および蛍光観察用の励起光を照射するとともに、観察試料から得られる観察光を前記共焦点スキャナユニットなどに出力するポート部を有する顕微鏡と、
前記顕微鏡のポート部と前記共焦点スキャナユニットとの間に選択的に挿入され、前記観察試料からの観察光を分岐して、前記共焦点スキャナユニットにおける接続鏡筒に導く迂回光路ユニットとを具備し
前記迂回光路ユニットは、
前記顕微鏡のポート部と前記共焦点スキャナユニットとの間に挿入する分岐手段をハーフミラーまたはダイクロイックミラーにより構成するとともに、その光路中に前記観察試料に蛍光退色観察用のレーザ光を照射するレーザ光重畳手段が設けられていることを特徴とする。
請求項2においては、請求項1の共焦点顕微鏡システムにおいて、前記レーザ光重畳手段にレーザ光を導入するレーザ光導入ユニットは、前記観察試料上でこのレーザ光を走査させる操作手段を有することを特徴とする。
請求項3においては、請求項1または2に記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、前記顕微鏡は、透過光画像観察用の観察光を出射する観察光源と、蛍光観察用の励起光を出射する励起光源とを有し、前記共焦点スキャナユニットは、共焦点画像観察用のレーザ光源を有することを特徴とする。
請求項4においては、請求項1乃至3のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、前記共焦点スキャナユニットの接続鏡筒には、前記観察画像を撮影するカメラを接続したことを特徴とする前記共焦点スキャナユニットの接続鏡筒には、前記観察画像を撮影するカメラを接続したことを特徴とする
前記共焦点スキャナユニットの接続鏡筒には、前記観察画像を撮影するカメラを接続したことを特徴とする。
本発明の共焦点顕微鏡システムによれば、共通の観察鏡筒により、共焦点画像とともに透過光画像および蛍光画像を観察することができる。言い換えれば、観察試料から得られる透過光画像と蛍光画像と共焦点画像とを1台の撮像カメラにより、容易に撮影することができる。また、顕微鏡のポート部とカメラとを同軸上に配置することができるので、光軸のずれに対して強いシステムとすることができる。さらに、顕微鏡のポート部とカメラとを同軸上に配置することにより、反射するミラー枚数が共焦点画像、顕微鏡画像ともに偶数枚となるため、鏡像にならない利点がある。
以下、図面を用いて、本発明の共焦点顕微鏡システムの一実施形態について説明する。
図1は、本発明の共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。図において、前記図7と同様のものは同一符号を付して示す。また、図2、図3は共焦点スキャナユニットにおける励起光光路の配置状態を示す概略説明図(平面側および背面側)である。
図1〜図3において、共焦点スキャナユニット33は迂回光路ユニット34を介して顕微鏡2のポート部3に取りけられている。ポート部3の内部にはチューブレンズ3aが設けられている。前記顕微鏡2には観察光源4、励起光源5、コンデンサレンズ6、対物レンズ7、観察鏡筒9、観察試料10を載せた試料台11が取り付けられている。本実施例では撮像カメラ8は用いない。
ミラー部12は全反射ミラーとスルー状態とを選択可能に構成されている。また、ミラー部13は、励起光は透過させるとともに観察試料10からの蛍光を反射するようなダイクロイックミラーと、全反射ミラーとを選択可能に構成されている。ミラー部14は全反射ミラーとハーフミラーとスルー状態とを選択可能に構成されている。その他ミラー15、ミラー16、ミラー17は全反射ミラーである。
共焦点スキャナユニット33のファイバコネクタ37には、レーザ光(励起光)を出射するレーザ光源35が光ファイバ36を介して接続されている。ファイバコネクタ37の前方には、ガウシアンビームを均一にする均一化光学系38が配置されている。
さらに、共焦点スキャナユニット33には、励起光の導入光学系部39が設けられており、ミラー40、励起光フィルタ41、コリメートレンズ42、ミラー43が図2、図3のように配置されている。これらの導入光学系39は図1中に示す共焦点スキャナユニット33の背面側に位置している。
共焦点スキャナユニット33には、導入光学系部39からの光をマイクロレンズアレイディスク45方向に反射するミラー44が設けられている。また、マイクロレンズアレイディスク45とピンホールアレイディスク46とは対向するように、軸受け48で支持されており、さらにモータ47で回転可能に構成されている。
また、マイクロレンズアレイディスク45とピンホールアレイディスク46の間にはダイクロイックミラー55が設けられている。さらに、観察画像を導くために、ミラー56、58とリレーレンズ57が設けられている。
迂回光路ユニット34には、手動もしくは電動で切り替えられる分岐手段49が設けられており、スルー状態と図示のような反射状態が選択可能に構成されている。分岐手段49はリニアガイド等の直線移動機構上に設置され、光路挿入時の反射角度の再現性が得られるようになっている。さらに、迂回光路ユニット34には、リレーレンズ50、52、54と反射ミラー51、53が設けられている。
また、共焦点スキャナユニット33側には、手動もしくは電動で切り替えられる光切り替え部59が設けられており、図のように光路を切り替え可能になっている。光を切り替えた場合を実線と破線で示す。さらに共焦点スキャナユニット33には接続鏡筒60を介して観察カメラ61が接続されている。また、接続鏡筒60にはバリアフィルタ62とリレーレンズ63が設けられている。
次に、本構成で共焦点画像を取得する場合を説明する。
レーザ光源35からの光は、光ファイバ36を介してファイバコネクタ37から照射される。このレーザ光は、光ファイバ36の先端から光ファイバ36の開口数で広がる概ねガウシアンビームとなる。このレーザ光は均一化光学系38を通ることによって、概ねフラットな強度分布を持つように変換される。
さらにこの光は、導入光学系部39に導かれ、ミラー40で反射し、励起光フィルタ41で不要な波長成分を取り除き、コリメートレンズ42で平行光に変換され、ミラー43で反射する。この光は共焦点スキャナユニット33のミラー44で反射されて、マイクロレンズアレイディスク45に導入される。
マイクロレンズアレイディスク45のマイクロレンズを通過した光は、ダイクロイックミラー55を透過し、対応するピンホールディスクアレイ46のピンホールを通るように集光される。
この部分の作用を図4で模式的に示す。図4ではミラー類は省略しており、レンズもまとめて表示している。また、共焦点画像取得時には、分岐手段49はスルー状態が選択されており、ピンホールを出た光は分岐手段49を透過して、ポート3内部のチューブレンズ3aによって平行光とされ、全反射状態が選択されたミラー12で反射されて、対物レンズ7によってそれぞれ観察試料10に集光される。
観察試料10からの蛍光は同じ光路を戻り、再び個々のピンホールを通過した後に、この蛍光を反射するダイクロイックミラー55で反射され、ミラー56、58によって反射される。また、共焦点画像取得時には光切り替え部59は図の破線で示す状態が選択され、蛍光はバリアフィルタ62で必要な蛍光成分のみがフィルタされて、観察カメラ61へ導かれる。また、ここで一組のリレーレンズ57,63によってこれらの蛍光は観察カメラ61の撮像素子に結像される。
また、ここで前記のマイクロレンズアレイディスク45とピンホールアレイディスク46が図4に示すように高速回転することによって、前記観察試料10の焦点面上の個々の焦点が試料上を走査し、これに伴って、試料の焦点面からの蛍光も撮像素子上を走査する。また、焦点面以外の光は同様の光路を通ることができず、ほとんどピンホールを通過できない。これによって焦点面からの蛍光画像(共焦点画像)が撮像カメラ61で撮像される。
次に、透過光画像を取得する場合を説明する。
観察光源4からの光はミラー16によって反射された後に、コンデンサレンズ6によって観察試料10を照明し、観察試料10からの透過光は、全反射ミラーが選択されたミラー部12で反射されて、ポート部3へ向かう。ポート部3のチューブレンズを通過した後に、全反射状態が選択された分岐手段49によって迂回光路ユニット34を通るように分岐される。
また、この場合光切り替え部59では実線で示すミラーの状態が選択されるため、分岐手段49で分岐された光は、ミラー51、ミラー53、光切り替え部59で反射して、撮像カメラ61へ導かれる。透過光画像を取得する際にはバリアフィルタ62は取り除かれる。また、レンズ3aによる像は、二組のリレーレンズ50,52と54,63によって、観察カメラ61の撮像素子に結像される。ここで一組のリレーレンズ50、52は、迂回光路ユニット34を通過することによって、伸びた光路分を補正するように構成されている。
また、蛍光画像取得時には、ミラー部12、13はダイクロイックミラーを選択する。この場合、励起光源5からの光はミラー17で反射され、ミラー部12、13のダイクロイックミラーを透過して、対物レンズ7によって観察試料10を照明する。観察試料10から発せられた蛍光は同じ光路を戻るが、ミラー部12のダイクロイックミラーで反射することによって、ポート部3へ向かう。ポート部3のチューブレンズを通過した後に、全反射状態が選択された分岐手段49によって、迂回光路ユニット34を通るように分岐される。
この場合、光切り替え部59では実線で示すミラーの状態が選択されるため、分岐手段49で分岐された光は、ミラー51、ミラー53、光切り替え部59で反射して、撮像カメラ61へ導かれる。蛍光画像を取得する際には、取得したい蛍光のみを透過するバリアフィルタ62が挿入される。また、レンズ3aによる像は、二組のリレーレンズ50,52と54,63によって、観察カメラ61の撮像素子に結像される。ここで一組のリレーレンズ50、52は、迂回光路ユニット34を通過することによって、伸びた光路分を補正するように構成されている。
なお、撮影した共焦点画像と、蛍光画像および透過光画像とでは、後者の方がリレーレンズを一組多く用いているために、画像が共焦点画像に対して180度回転した画像となっている。これを補正するために、光路の途中にダハプリズムやシュミットプリズムなどを挿入しても良い。また、撮影された画像を電子的に回転させ、回転画像を作成しても良い。
図5は、本発明の共焦点顕微鏡システムの他の実施例を示す構成図である。図において、前記図1と同様のものは、同一符号を付して示す。図に示す例は、図1の迂回光路ユニット34の途中に、着脱自在なレーザ光導入ユニット64およびレーザ光重畳手段71を取り付けたものである。レーザ光導入ユニット64には、光ファイバ66を介してレーザ光源65の光が導かれる。また、レーザ光導入ユニット64には、コリメートレンズ67、光を走査するためのガルバノミラー68,69、Fθレンズ70が設けられている。また、迂回光路ユニット34には挿入自在なレーザ光重畳手段(ミラー)71が設けられている。レーザ光重畳手段71はリニアガイド等の直線移動機構上に設置され、光路挿入時の反射角度の再現性が得られるようになっている。また、本実施例の分岐手段49には、ハーフミラーまたはダイクロイックミラーが装着されている。
このように構成した共焦点顕微鏡システムでは、前記した方法で共焦点画像を観察しながら、レーザ光導入ユニット64よりレーザ光を導入する。レーザ光源65のレーザ光は光ファイバ66を介して、レーザ光導入ユニット64に導かれる。このレーザ光はコリメートレンズで平行光に変えられ、二つのガルバノミラー68、69で自在に走査され、Fθレンズ70によってリレーレンズの52の結像位置に結像する。
この光はリレーレンズ52、50でとミラー51と分岐手段49のハーフミラーまたはダイクロイックミラーで、顕微鏡のポート3に導入される。Fθレンズの結像した光はリレーレンズ52、50でチューブレンズ3aの結像位置にリレーされて、平行光に変えられる。この光は、共焦点画像のレーザ光と同様の光路を通り、対物レンズ7によって観察試料10に焦点を結ぶ。
ここで、二つのガルバノミラー68、69で観察試料10の所望の位置に光を照射することによって、観察試料10に蛍光退色を起こさせて(フォトブリーチング)、共焦点画像によって、この退色した蛍光の回復を観察することができる(FRAP法)。
顕微鏡のポート一つでフォトブリーチングと共焦点観察を行うことができ、簡便である。
また、前記図1の使用方法以外に、迂回光路ユニットの光路が有効活用できる。
図6は、本発明の共焦点顕微鏡システムの他の実施例を示す構成図である。図において、前記図1と同様のものは、同一符号を付して示す。図に示す例は、前記図1の迂回光路ユニット34を取り外した際に、迂回光路ユニット34からの光を共焦点スキャナユニット33に戻すポート口72に、第2の撮像カメラ74を取り付けた例である。
ポート口72には、着脱自在な接続鏡筒73を介して第2の撮像カメラ74が設けられている。また、接続鏡筒73にはバリアフィルタ75と結像レンズ76が設けられている。また、光切り替え部59では破線で示す部分に、ダイクロイックミラーが取り付けられている。さらに、ポート3には迂回光路ユニット34の代わりに、スペーサ77が取り付けられている。
図6に示す例では、撮像カメラ61により、図1で示した共焦点画像取得の方法で画像が撮影される。さらに、観察試料10からの光の別の波長の蛍光を観察する際には、取得する蛍光波長を透過する性質の光切り替え部59のダイクロイックミラーで、この蛍光は第2の撮像カメラ74に向けられる。
この蛍光は、バリアフィルタ75で必要な蛍光のみをフィルタされた後に、結像レンズ76によって、第2の撮像カメラ74内部の結像素子に結像される。また、このとき撮影される第2の撮像カメラ74の画像は、第1の撮像カメラ61の鏡像となる。従って、第2の撮像カメラ74の前に、像回転プリズム(ドーブプリズム、台形プリズム)を挿入しても良い。また、第2の撮像カメラ74からの画像信号を電子的に反転させても良い。また、第2の撮像カメラ74の代わりに接眼アイピースを設けても良い。
第2の撮像カメラと、迂回光路の光軸を共通化したので、構成が簡便である。また、二つのカメラの画像が反転画像では無いので重ね合わせができる。また、2つの波長の蛍光画像を撮影する場合に、バリアフィルタ62を切り替えると波長ごとの同時性が失われるが、本方式では2台のカメラで同時に取り込むので、タイムラグの問題は生じない。
以上説明したように、本発明の共焦点顕微鏡システムによれば、顕微鏡と共焦点スキャナユニットとの間に分岐手段を設け、観察試料から得られる観察光を共焦点スキャナユニットの前で選択的にバイパスさせ、観察鏡筒(撮像カメラ)に入射させるようにしているので、共通の観察鏡筒(撮像カメラ)により、共焦点画像とともに透過光画像および蛍光画像を観察することができる。
また、顕微鏡のポート部とカメラとを同軸上に配置することにより、反射するミラー枚数が共焦点画像、顕微鏡画像ともに偶数枚となるため、鏡像にならない利点がある。
なお、上記の説明においては、ミラーや分岐手段を切り替える手段として、複数のミラー等を一列に並べ、リニアガイド等の直線移動機構によりスライドさせる場合を例示したが、これらの切り替え手段はこのような構成に限られるものではない。
本発明の共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。 図1の共焦点顕微鏡システムにおける励起光光路の平面側概略説明図である。 図1の共焦点顕微鏡システムにおける励起光光路の背面側概略説明図である。 図1の共焦点顕微鏡システムにおける共焦点スキャナユニットの動作を模式的に示す説明図である。 本発明の共焦点顕微鏡システムの他の実施例を示す構成図である。 本発明の共焦点顕微鏡システムの他の実施例を示す構成図である。 従来の共焦点顕微鏡システムの一例を示す構成図である。
符号の説明
1、33 共焦点スキャナユニット
2 顕微鏡
3 ポート部
4 観察光源
5 励起光源
7 対物レンズ
8、20、61、74 撮像カメラ
9、60、73 観察鏡筒
10 観察試料
21、45 マイクロレンズアレイディスク
22、46 ピンホールアレイディスク
25、55 ダイクロイックミラー
34 迂回光路ユニット
49 分岐手段
59 光切り替え部
64 レーザ光導入ユニット
71 レーザ光重畳手段
77 スペーサ

Claims (4)

  1. 観察試料から得られる透過光画像と蛍光画像と共焦点画像とを観察する共焦点顕微鏡システムにおいて、
    少なくともマイクロレンズアレイディスクとピンホールアレイディスクとを有し、複数のビームスポットにより前記観察試料面を走査するとともに、観察画像を撮影するカメラを接続する接続鏡筒を有する共焦点スキャナユニットと、
    前記観察試料を保持し、この観察試料に透過光画像観察用の観察光および蛍光観察用の励起光を照射するとともに、観察試料から得られる観察光を前記共焦点スキャナユニットなどに出力するポート部を有する顕微鏡と、
    前記顕微鏡のポート部と前記共焦点スキャナユニットとの間に選択的に挿入され、前記観察試料からの観察光を分岐して、前記共焦点スキャナユニットにおける接続鏡筒に導く迂回光路ユニットとを具備し
    前記迂回光路ユニットは、
    前記顕微鏡のポート部と前記共焦点スキャナユニットとの間に挿入する分岐手段をハーフミラーまたはダイクロイックミラーにより構成するとともに、その光路中に前記観察試料に蛍光退色観察用のレーザ光を照射するレーザ光重畳手段が設けられていることを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
  2. 前記レーザ光重畳手段にレーザ光を導入するレーザ光導入ユニットは、前記観察試料上でこのレーザ光を走査させる操作手段を有することを特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡システム。
  3. 前記顕微鏡は、透過光画像観察用の観察光を出射する観察光源と、蛍光観察用の励起光を出射する励起光源とを有し、前記共焦点スキャナユニットは、共焦点画像観察用のレーザ光源を有することを特徴とする請求項1または2に記載の共焦点顕微鏡システム。
  4. 前記共焦点スキャナユニットの接続鏡筒には、前記観察画像を撮影するカメラを接続したことを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
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