JP2018185457A - 共焦点顕微鏡、及び撮像方法 - Google Patents

Abstract

【課題】共焦点画像を効率よく取得することができる共焦点顕微鏡、及び観察方法を提供する。【解決手段】本発明の一態様にかかる共焦点顕微鏡１００は、ＲＧＢの波長帯を含む照明光を発生する光源１１と、光源１１からの照明光Ｌ１を第１の方向に沿ったライン状にして、試料に導く照明光学系１０であって、前記ライン状の照明光を走査するガルバノミラー２３を有する照明光学系１０と、ライン状の照明光Ｌ１によって照明された試料からの検出光Ｌ２を導く検出光学系３０であって、検出光Ｌ２をＹ方向に波長分散させる分光プリズム３１を有する検出光学系３０と、波長分散された検出光Ｌ２を検出する検出器４０であって、ＲＧＢのカラーフィルタを有する第１〜第３の画素列４１〜４３を有する検出器４０と、を備えたものである。【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡、及び共焦点画像の撮像方法に関する。

特許文献１にはマルチカラー共焦点（コンフォーカル）顕微鏡が開示されている。特許文献１の共焦点顕微鏡は、ピンホールと、ホログラムカラーフィルタと、検出器とを備えている。ホログラムカラーフィルタは、ピンホールを通って入射した光を分光し、集光している。そして、検出器は、ホログラムカラーフィルタが集光した光を波長毎に検出している。さらに、ホログラムカラーフィルタの代わりに集光用レンズと回折格子、ダイクロイックミラーを用いることが記載されている。

また、特許文献２には、２つの光源と２つの検出器を用いた多色走査型顕微鏡が開示されている。第１の光源からの第１の波長の励起ビームと、第２の光源からの第２の波長の励起ビームは、カラースプリッタによって、異なる角度で結合される。そして、第１の励起ビームと第２の励起ビームとは、標本の異なる位置に入射する。さらに、走査型顕微鏡が共焦点顕微鏡であると記載されている。

特開２００２−２３６２５７号公報 特開２０１７−５０２３４４号公報

このような共焦点顕微鏡において、２色以上の多色画像を取得するためには、照明光を走査する必要がある。しかしながら、ピンホールを用いているため、試料の一点しか照明することができない。よって、試料の２次元画像を取得するためには、２次元走査が必要となってしまう。また、特許文献２では、異なる角度で伝播するため、光学系の調整が複雑になってしまう。

本発明は、このような事情を背景としてなされたものであり、多色の共焦点画像を効率よく取得することができる共焦点顕微鏡、及び撮像方法を提供するものである。

本実施形態の一態様にかかる共焦点顕微鏡は、第１の波長帯と、前記第１の波長帯と異なる第２の波長帯とを含む照明光を発生する光源と、前記光源からの照明光を第１の方向に沿ったライン状にして、試料に導く照明光学系であって、試料上における前記ライン状の照明光を走査するスキャナを有する照明光学系と、前記ライン状の照明光によって照明された前記試料からの検出光を導く検出光学系であって、前記検出光を前記第１の方向と異なる第２の方向に波長分散させる波長分散素子を有する検出光学系と、前記第１の方向に沿って配列された複数の画素を含むラインセンサを用いて、前記波長分散素子によって波長分散された検出光を検出する光検出器であって、前記第１の波長帯の光を透過する第１のカラーフィルタを有する第１のラインセンサと、前記第２の波長帯の光を透過する第２のカラーフィルタを有する第２のラインセンサと、を有する検出器と、を備えたものである。多色の共焦点画像を効率よく取得することができる。

上記の共焦点顕微鏡において、前記第１の波長帯と前記第２の波長帯との間の波長帯を遮光する波長フィルタが光路中に設けられていてもよい。

上記の共焦点顕微鏡において、前記照明光が、前記第１及び第２の波長帯と異なる第３の波長帯を含み、前記検出器が第３の波長帯の光を透過する第３のカラーフィルタを有する第３のラインセンサを有していてもよい。

上記の共焦点顕微鏡において、前記波長分散素子が分光プリズムであり、前記分光プリズムが、光軸と垂直な方向でかつ、前記第２の方向と垂直な方向な回転軸周りに回転可能に設けられていてもよい。

上記の共焦点顕微鏡において、前記分光プリズムが、光軸に沿った方向に移動可能に設けられていてもよい。

本実施の形態にかかる共焦点画像の撮像方法は、第１の波長帯と、前記第１の波長帯と異なる第２の波長帯とを含む照明光を発生するステップと、第１の方向に沿ったライン状の前記照明光の光路中に配置されたスキャナを用いて、試料上における前記ライン状の照明光を走査するステップと、前記ライン状の照明光によって照明された前記試料からの検出光の光路中に配置された波長分散素子を用いて、前記検出光を前記第１の方向と異なる第２の方向に波長分散させるステップと、前記第１の方向に沿って配列された複数の画素を含むラインセンサを用いて、前記波長分散素子によって波長分散された検出光を検出する、前記第１の波長帯の光を透過する第１のカラーフィルタを有する第１のラインセンサと、前記第２の波長帯の光を透過する第２のカラーフィルタを有する第２のラインセンサとを有する検出器を用いて、波長分散された検出光を検出するステップと、を備えたものである。これにより、多色の共焦点画像を効率よく取得することができる。

上記の撮像方法において、前記照明光又は前記検出光の光路中に設けられた波長フィルタによって、前記第１の波長帯と前記第２の波長帯との間の波長帯を遮光してもよい。

上記の撮像方法において、前記照明光が、前記第１及び第２の波長帯と異なる第３の波長帯を含み、前記検出器が第３の波長帯の光を透過する第３のカラーフィルタを有する第３のラインセンサを有していてもよい。

上記の撮像方法において、前記波長分散素子が分光プリズムであり、前記分光プリズムが、光軸と垂直な方向でかつ、前記第２の方向と垂直な方向な回転軸周りに回転することで、第２の方向において、前記検出器に対する検出光の入射位置を調整するようにしてもよい。

上記の撮像方法において、前記分光プリズムが、光軸に沿った方向に移動することで、前記検出器に対する第１の波長帯の検出光と第２の波長帯の検出光の入射位置間隔を調整するようにしてもよい。

本発明によれば、多色の共焦点画像を効率よく取得することができる共焦点顕微鏡、及び撮像方法を提供することができる。

本実施の形態１にかかる共焦点顕微鏡の構成を示す図である。 検出器の画素配列を模式的に示す図である。 分光プリズムによって分散された検出光を示す図である。 各画素列に入射する検出光を説明するための図である。 各画素列に入射する検出光を説明するための図である。 本実施の形態２にかかる共焦点顕微鏡の構成を示す図である。 カラーフィルタの透過率スペクトルを示すグラフである。 各画素列に入射する検出光を説明するための図である。 各画素列に入射する検出光を説明するための図である。 波長分散された検出光の光路を説明するための図である。 分光プリズムの材料毎の屈折値とアッベ数を示す表である。 検出光の入射位置間の距離を示す表である。

実施の形態１．
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。まず、図１を用いて本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００の全体構成を説明する。共焦点顕微鏡１００はライン状の照明光を用いたラインコンフォーカル（スリットコンフォーカル）光学系を有している。共焦点顕微鏡１００は、多色の共焦点画像を取得することができる。なお、以下の説明では、光軸方向をＺ方向とし、光軸と直交する平面をＸＹ平面としている。なお、ＸＹ平面内において、Ｘ方向とＹ方向とは、互いに直交する方向である。

共焦点顕微鏡１００は、光源１１と、照明光学系１０と、検出光学系３０、検出器４０と、ステージ５１とを備えている。ステージ５１には、試料５０が載置されている。照明光学系１０は、光源１１からの照明光を試料５０まで導く。検出光学系３０は、試料５０からの検出光を検出器４０まで導く。

まず、照明光学系１０について説明する。照明光学系１０は、バンドルファイバ１２、レンズ１５、スリット１６、偏光ビームスプリッタ（以下、ＰＢＳ）２１、レンズ２２、ガルバノミラー２３、レンズ２４、レンズ２５、１／４波長板２６、及び対物レンズ２７を備えている。

光源１１は、試料５０を照明するための照明光を発生する。ここで、光源１１は、キセノンランプなどのランプ光源を用いることが好ましい。あるいは、光源１１は、輝線が離間したスペクトル分布を持つ水銀ランプなどであってもよい。また、光源１１は、多色光源であり、白色光源であることが好ましい。フルカラーでの観察を行うため、光源１１は、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、及び青色（Ｂ）の波長帯の光を含む照明光を発生する。また、光源１１は、後述するカラーフィルタの透過波長帯域に輝線を有するランプ光源でもよい。もちろん、異なる波長を発生する単色光源を複数組み合わせることで、光源１１を構成しても良い。

光源１１は、バンドルファイバ１２に連結されている。よって、光源１１で発生した照明光は各光ファイバ内を伝搬する。バンドルファイバ１２の出射端１２ａにおいて、照明光が所定のスポット形状となるように複数の光ファイバが束ねられている。例えば、バンドルファイバ１２から出射した照明光Ｌ１は、直径６ｍｍの円形のスポットを形成する。

バンドルファイバ１２を出射した照明光Ｌ１は、レンズ１５で集光される。レンズ１５は例えば、焦点距離ｆ＝５０ｍｍのレンズである。レンズ１５の集光位置には、スリット１６が配置されている。スリット１６は、Ｘ方向を長手方向（紙面に垂直方向）とする開口部を有している。照明光Ｌ１がスリット１６を通過することで、照明光Ｌ１がライン状の照明光に変換される。なお、照明光Ｌ１をライン状に変換する手段としては、スリット１６に限らず、シリンドリカルレンズを用いることも可能である。さらには、シリンドリカルレンズとスリット１６を組み合わせることで、ライン状の照明光Ｌ１を生成しても良い。バンドルファイバ１２の出射端１２ａをライン状にして、ライン状の照明光Ｌ１を形成してもよい。

スリット１６を通過した照明光Ｌ１は、広がりながら伝搬して、ＰＢＳ２１に入射する。ＰＢＳ２１は照明光Ｌ１を試料５０の方向に反射する。なお、ＰＢＳ２１は，偏光状態に応じて、光を反射、又は透過する。よって、ＰＢＳ２１で反射した照明光Ｌ１は、所定の方向の直線偏光となっている。

ＰＢＳ２１で反射した照明光Ｌ１は、レンズ２２に入射する。レンズ２２は、照明光Ｌ１を屈折して、平行光束とする。レンズ２２からの照明光Ｌ１は、ガルバノミラー２３に入射する。ガルバノミラー２３は照明光Ｌ１を走査するスキャナである。ここでは、試料５０上において、Ｘ方向に沿ったライン状の照明光Ｌ１がＹ方向に走査されるように、照明光Ｌ１を走査する。これにより、試料５０の２次元領域の共焦点画像を取得することができる。もちろん、ＭＥＭＳ（micro electro mechanical system）ミラーやポリゴンミラー等の他のスキャナを用いてもよい。また、ガルバノミラー２３は、対物レンズ２７の瞳と共役な位置に配置されている。

ガルバノミラー２３で反射した照明光Ｌ１は、レンズ２４、レンズ２５を介して、１／４波長板２６に入射する。なお、レンズ２４は、例えば、焦点距離ｆ＝５０であり、レンズ２５は、焦点距離ｆ＝１００ｍｍのレンズである。

レンズ２５からの照明光Ｌ１は、１／４波長板２６を透過して、対物レンズ２７に入射する。対物レンズ２７は、照明光Ｌ１を屈折して，試料５０上に集光する。上記のように、照明光Ｌ１がスリット１６を通過しているため、試料５０のライン状の領域が照明されている。さらに、Ｘ方向に沿ったライン状の照明光Ｌ１が、ガルバノミラー２３によってＹ方向に走査されている。試料５０を照明した照明光Ｌ１は試料５０に応じて反射する。試料５０で反射した照明光Ｌ１は、検出光Ｌ２となる。

このように、照明光学系１０は、光源１１からの照明光を、第１の方向に沿ったライン状にして、試料５０に導いている。さらに、照明光学系１０は、試料５０におけるライン状の照明光Ｌ１を走査するスキャナとして、ガルバノミラー２３を有している。Ｘ方向に沿ったライン状の照明光Ｌ１の光路中に配置されたガルバノミラー２３を用いて、試料５０上におけるライン状の照明光Ｌ１を走査する。よって、試料５０の２次元領域を撮像することができる。

また、試料５０は、ステージ５１上に保持されている。ステージ５１は、ＸＹＺステージなどの３次元駆動ステージである。よって、ステージ５１はＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向に試料５０を移動させることができる。ステージ５１がＸＹ方向に駆動することで、試料５０の任意の位置を観察することができる。また、ステージ５１をＺ方向に駆動することで、試料５０の任意の高さの共焦点画像を取得することができる。

次に、試料５０からの検出光Ｌ２を検出器４０に導くための検出光学系３０について説明する。検出器４０は、対物レンズ２７、１／４波長板２６、レンズ２５、レンズ２４、ガルバノミラー２３、レンズ２２、ＰＢＳ２１、及び分光プリズム３１を備えている。

試料５０からの検出光Ｌ２は、照明光Ｌ１の光路を反対方向に伝搬する。具体的には、試料５０で反射した検出光Ｌ２は、対物レンズ２７で屈折されて、１／４波長板２６に入射する。よって、ＰＢＳ２１で反射した光が２回、１／４波長板２６を通過する。これにより、１／４波長板２６に入射する前の照明光Ｌ１と、１／４波長板２６を通過した後の検出光Ｌ２とは、偏光方向が直交する直線偏光となっている。

そして、１／４波長板２６を透過した検出光Ｌ２は、レンズ２５、及びレンズ２４を介して、ガルバノミラー２３に入射する。ガルバノミラー２３は、検出光Ｌ２をデスキャンする。そして、ガルバノミラー２３で反射した検出光Ｌ２は、レンズ２２を介して、ＰＢＳ２１に入射する。レンズ２２は、試料５０の像を検出器４０に結像する結像レンズである。

上記のように、ＰＢＳ２１で反射した照明光Ｌ１の偏光方向と、ＰＢＳ２１に入射する検出光Ｌ２の偏光方向は直交している。よって、検出光Ｌ２は、ＰＢＳ２１を透過する。これにより、照明光Ｌ１の光路と、検出光Ｌ２の光路が分岐される。もちろん、ＰＢＳ２１の代わりにハーフミラーなどを用いて、光路を分岐してもよい。

ＰＢＳ２１を透過した検出光Ｌ２は、分光プリズム３１に入射する。分光プリズム３１は、波長に応じて光を分散させる波長分散素子である。よって、分光プリズム３１を通過した検出光Ｌ２は、Ｙ方向に分散している。分光プリズム３１で分散された検出光４１は、検出器４０に入射する。

検出器４０は、複数の画素を備えたＣＣＤ（Charged Coupled Device)センサやＣＭＯＳ(Complementary Metal Oxide Semiconductor)センサ等である。ここでは、検出器４０は、３ラインセンサとなっている。検出器４０の画素には、Ｒ、Ｇ、Ｂのカラーフィルタ４４が形成されている。Ｒのカラーフィルタ４４は、Ｒの光を透過して、Ｇ、及びＢの光を遮光する。Ｇのカラーフィルタ４４は、Ｇの光を透過して、Ｒ、及びＢの光を遮光する。Ｂのカラーフィルタ４４は、Ｂの光を透過して、Ｒ、及びＧの光を遮光する。検出器４０の各画素は、カラーフィルタ４４を通過した検出光Ｌ２を検出する。

検出器４０は、検出光Ｌ２の検出光量に応じた検出信号を処理装置５３に出力する。処理装置５３は、例えば、パーソナルコンピュータなどで有り、コンピュータプログラムに従って動作するプロセッサやメモリなどを有している。メモリは、画素毎の検出信号を記憶する。さらに、処理装置５３は、ステージ５１の駆動位置、及びガルバノミラー２３の走査位置を制御している。処理装置５３は、検出信号と、試料５０上の位置を対応付けて記憶する。そして、処理装置５３は、画素毎の検出信号を合成することで、共焦点画像を生成する。

検出光学系３０は、ライン状の照明光Ｌ１によって照明された試料５０からの検出光を導いている。検出光学系３０は、検出光Ｌ２をＹ方向に波長分散させる分光プリズム３１を有している。ライン状の照明光Ｌ１によって照明された試料５０からの検出光Ｌ２の光路中に配置された分光プリズム３１を用いて、検出光Ｌ２をＹ方向に波長分散させている。

スリット１６は対物レンズ２７の焦点位置と共役な位置に配置されている。よって、スリット１６の像が試料５０に投影される。試料５０と検出器４０は対物レンズ２７の焦点位置と共役な位置に配置されている。すなわち、対物レンズ２７の焦点以外からの光は、検出器４０の画素の外側に入射する。よって、処理装置５３は、共焦点画像を形成することができる。

ここで、検出器４０の画素配列について、図２を用いて説明する。図２は、検出器４０の受光面における画素配置を模式的に示すＸＹ平面図である。検出器４０は、第１の画素列４１と、第２の画素列４２と、第３の画素列４３と、を備えている。例えば、検出器４０は、３つの画素列４１〜４３を備えた３ラインＣＣＤである。

第１の画素列４１は、複数の画素４８ＲがＸ方向に並んで配置された第１のラインセンサを構成する。複数の画素４８Ｒは、Ｒのカラーフィルタを備えている。よって、第１の画素列４１の各画素４８Ｒは、赤色の検出光Ｌ２を検出する。

第２の画素列４２は、複数の画素４８ＧがＸ方向に並んで配置された第２のラインセンサを構成する。複数の画素４８Ｇは、Ｇのカラーフィルタを備えている。よって、第２の画素列４２の各画素４８Ｇは、緑色の検出光Ｌ２を検出する。第２の画素列４２は第１の画素列４１から間隔を隔てて配置されている。

第３の画素列４３は、複数の画素４８ＢがＸ方向に並んで配置された第３のラインセンサを構成する。複数の画素４８Ｇは、Ｂのカラーフィルタを備えている。よって、第３の画素列４３の各画素４８Ｂは、青色の検出光Ｌ２を検出する。第３の画素列４３は第２の画素列４２から間隔を隔てて配置されている。

また、画素の配列方向であるＸ方向が照明光のライン方向に対応している。よって、ライン状の照明領域からの検出光Ｌ２を各画素列４１〜４３が検出する。なお、ＣＣＤの電荷転送方向はＸ方向となっている。そして、検出器４０は、３つのラインセンサ（ラインＣＣＤ）が１パッケージ内に配置されている。そして、３つのラインセンサの画素列４１〜４３がＹ方向に離間して配置されている。検出器４０はラインセンサが３つ並んだデバイスであるため、それぞれのラインセンサの信号の読み出し方向がＸ方向となっている。

このように、第１の画素列４１、第２の画素列４２、及び第３の画素列４３は、それぞれ異なる色のカラーフィルタを有している。したがって、第１の画素列４１、第２の画素列４２、及び第３の画素列４３で検出される検出光Ｌ２は、異なる波長帯となっている。

第１の画素列４１と第２の画素列４２と第３の画素列４３の画素数は、同じとなっている。第１の画素列４１は例えば、１０２４個の画素４８Ｒを有している。同様に、第２の画素列４２、第３の画素列４３は、それぞれ、１０２４個の画素４８Ｒを有している。この場合、検出器４０は、３×１０２４個の画素４８を有している。もちろん、１列の画素数は１０２４に限られるものではない。

以下、Ｒの検出光Ｌ２を検出する第１の画素列４１をＲの画素列４１、Ｇの検出光Ｌ２を検出する第２の画素列４２をＧの画素列４２、Ｂの検出光Ｌ２を検出する第３の画素列４３をＢの画素列４３と称する。Ｒの画素列４１は、Ｇの画素列４２の＋Ｙ側に配置されている。Ｙ方向において、Ｇの画素列４２は、Ｒの画素列４２とＢの画素列４３との間に配置されている。Ｂの画素列４３は、Ｂの画素列の−Ｙ側に配置されている。３つの画素列４１〜４３は、互いに間隔を隔てて配置されている。

ここで、Ｙ方向における画素サイズは、８μｍとなっている。画素列４１〜４３のそれぞれは、Ｙ方向における幅が８μｍの帯状（ライン状の）領域となる。各画素列が存在する領域が光を検出する検出領域となる。１つの画素列に対応する検出領域の幅は、８μｍとなっている。さらに、Ｒの画素列４１、Ｇの画素列４２、及びＢの画素列４３の３つの画素列が３０μｍピッチで配置されている。画素列４１〜画素列４３は平行、かつ等間隔に離れて配置されている。

従って、Ｒの画素列４１とＧの画素列４２との間には、非検出領域４５が配置されている。また、Ｇの画素列４２とＢの画素列４３との間には、非検出領域４６が配置されている。非検出領域４５、４６では、検出光Ｌ２を検出しない。すなわち、非検出領域４５、４６は光に対する感度がなく、検出領域となる画素列４１〜４３のみに入射した検出光Ｌ２に応じて検出信号が生成される。非検出領域４５、４６はそれぞれ、Ｙ方向における幅が約２２μｍの帯状の領域である。よって、Ｙ方向において、画素列の幅、すなわち、検出領域の幅は、非検出領域４５、４６の幅よりも狭くなっている。

次に、検出器４０に入射する検出光Ｌ２について説明する。図３は、分光プリズム３１で分散されて、検出器４０で検出される検出光Ｌ２の光路を示す図である。なお、図３では、赤色の検出光Ｌ２を検出光Ｌ２Ｒとし、緑色の検出光Ｌ２を検出光Ｌ２Ｇとし、青色の検出光Ｌ２を検出光Ｌ２Ｂとして示している。

レンズ２２で集光された検出光Ｌ２は、分光プリズム３１を透過して、検出器４０に入射する。レンズ２２は、検出光Ｌ２を検出器４０の受光面に集光している。また、分光プリズム３１は、波長に応じて、検出光Ｌ２をＹ方向に分散させる。すなわち、分光プリズム３１は、ＲＧＢの光に対して異なる屈折率を有している。従って、分光プリズム３１を透過した検出光Ｌ２は、波長に応じた角度で伝搬している。

したがって、検出光Ｌ２Ｒと、検出光Ｌ２Ｇと、検出光Ｌ２Ｂとが、検出器４０の受光面において、異なる位置に入射する。検出光Ｌ２Ｒは、検出光Ｌ２Ｇと検出光Ｌ２Ｂよりも＋Ｙ側に入射する。検出光Ｌ２Ｂは、検出光Ｌ２Ｇよりも−Ｙ側に入射する。さらに、レンズ２２は、検出光Ｌ２ＲをＲの画素列４１に集光している。同様に、レンズ２２は検出光Ｌ２ＧをＧの画素列４２に集光し、検出光Ｌ２ＢをＢの画素列４３に集光している。

ここで、図４、及び図５を用いて、画素列４１〜４３で検出される検出光について説明する。図４、及び図５は検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの空間分布と、画素列４１〜４３の配置を模式的に示す図である。図４は、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面と一致している場合を示している。図５は、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面からずれている場合を示している。また、図４、図５において、左側には画素列４１〜４３の配置を示すＹＸ平面図が示され、右側には、Ｙ方向における検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの強度分布が示されている。

図４のように、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面に一致している場合、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂは急峻なピークを形成している。そして、検出光Ｌ２Ｒのピーク位置は、Ｒの画素列４１の中心位置に一致している。同様に、検出光Ｌ２Ｇのピーク位置は、Ｇの画素列４２の中心位置に一致して、検出光Ｌ２Ｂのピーク位置は、Ｂの画素列４３の位置に一致している。３つの画素列４１〜４３は、分散方向（Ｙ方向）に互いに離間して配置されている。

図４の場合、検出光Ｌ２Ｒのほとんどは、Ｇの画素列４２、及びＢの画素列４３に入射せずに、Ｒの画素列４１で検出される。同様に、検出光Ｌ２Ｇのほとんどは、Ｒの画素列４１、及びＢの画素列４３に入射せずに、Ｇの画素列４２で検出される。検出光Ｌ２Ｂのほとんどは、Ｒの画素列４１、及びＧの画素列４２に入射せずに、Ｂの画素列４３で検出される。

図５のように、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面からずれている場合、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂはブロードなピークを形成している。検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂのピーク位置は、それぞれ、Ｒの画素列４１、Ｇの画素列４２、Ｂの画素列４３の位置に一致している。

図５の場合、検出光Ｌ２Ｒの強度分布がブロードになっているため、検出光Ｌ２Ｒの一部がＧの画素列４２に入射してしまう。しかしながら、Ｇの画素列４２にはＧのカラーフィルタが設けられている。よって、Ｇの画素列４２は、カラーフィルタによって、検出光Ｌ２Ｒが遮光されるため、検出光Ｌ２Ｇのみを検出する。

同様に、検出光Ｌ２Ｇの一部は、Ｒの画素列４１、及びＢの画素列４３に入射する。しかしながら、カラーフィルタによって、Ｒの画素列４１は、検出光Ｌ２Ｒのみを検出し、Ｂの画素列４３は、検出光Ｌ２Ｇのみを検出する。

このように、分散方向において、３つの画素列４１〜４３が離間して配置されており、かつ、３つの画素列４１〜４３には、異なる色のカラーフィルタが設けられている。これにより、焦点位置がずれた場合であっても、各画素列４１〜４３が、対応する色と異なる色の検出光を検出するのを防ぐことができる。よって、共焦点画像における混色を防ぐことができ、適切なカラー画像を形成することができる。特に、３次元画像を取得するために、試料５０の高さを変えると、試料５０の表面から焦点位置がずれる。あるいは、試料５０の表面に凹凸が形成されている場合、ライン状の照明光Ｌ１において、一部の焦点位置が試料５０の表面からずれる。このような場合でも、それぞれの位置及び高さで適切な共焦点画像を取得することができる。

また、１ラインの照明光Ｌ１で試料５０を照明しているため、マルチライン照明のように他の照明ラインからのゴーストが生じるのを防ぐことができる。また、ＲＧＢそれぞれの光を３板式のＣＣＤラインセンサで検出する場合、２つのダイクロイックミラーで検出光を分岐するため、それぞれの光学系で調整が必要となる。これに対して、本実施形態では、１つの検出器でＲＧＢの検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂを別々に検出することができる。よって、光学系を容易に調整することができる。これにより、効率よく共焦点画像を取得することができる。

さらに、図３に示すように分光プリズム３１の角度や位置を調整することで、検出器４０に対する検出光Ｌ２の入射位置を調整することができる。例えば、矢印Ａの方向に分光プリズム３１を回転させることで、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの入射位置をＹ方向に調整することができる。このようにすることで、分光プリズム３１をビームポジショナとして機能させることができる。光学系の調整を簡素化することができ、効率よく共焦点画像を取得することができる。この場合の分光プリズム３１の回転軸は、光軸方向に垂直な方向であり、かつ、分散方向（Ｙ方向）と垂直な方向である。分光プリズム３１の回転軸は、Ｘ方向と平行になる。

さらに、分光プリズム３１を光軸の方向（図３中の矢印Ｂ）に移動させることで、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの入射位置の間隔を調整することができる。これにより、検出される波長帯の間隔を調整することができる。例えば、検出器４０に分光プリズム３１を近づけていくと、検出器４０の受光面における分散量が小さくなる。よって、３つの画素列４１〜４３検出される検出光の波長の違いをより小さくすることができる。

なお、上記の説明では、ＲＧＢの３色を用いてフルカラーの共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡１００について説明したが、共焦点顕微鏡１００は、少なくとも２色の光で共焦点画像を取得するものでもよい。すなわち、光源１１は、少なくとも２色を発生させる光源であればよい。第１の波長帯と、第１の波長帯と異なる第２の波長帯とを含む照明光を発生するものであればよい。この場合は、検出器４０は、第１及び第２の画素列を有する２ラインセンサであればよい。そして、第１の画素列に第１の波長帯の光を透過する第１のカラーフィルタが設けられており、第２の画素列には、第２の波長帯を透過する第２のカラーフィルタが設けられている。

さらには、ＲＧＢ以外の波長帯による共焦点画像を取得するようにしてもよい。この場合、検出したい波長の光を透過するカラーフィルタを各画素列に設ければよい。さらに、同時に検出する検出光は、３色に限られるものでなく、４色以上であってもよい。例えば、４色の検出光を同時に検出する場合、４つの画素列を有する４ラインセンサを用いて、それぞれの画素列でカラーフィルタの透過波長を変えればよい。すなわち、本実施の形態にかかる共焦点顕微鏡によれば、２色以上の多色の共焦点画像を撮像することができる。

実施の形態２．
実施の形態２にかかる共焦点顕微鏡２００について、図６を用いて説明する。図６は、共焦点顕微鏡２００の全体構成を示す図である。図６では、図１の共焦点顕微鏡１００に対して、波長フィルタ１３、１４が追加されている。なお、波長フィルタ１３、１４以外の共焦点顕微鏡２００の構成については、実施の形態１の共焦点顕微鏡１００と同様であるため、適宜説明を省略する。

図６に示すように、バンドルファイバ１２とレンズ１５との間に、波長フィルタ１３、１４が追加されている。したがって、バンドルファイバ１２から出射した照明光Ｌ１が波長フィルタ１３、１４を通過して、レンズ１５に入射する。波長フィルタ１３、１４は、所定の波長帯の光を遮光するバンドカットフィルタ（バンドストップフィルタ）である。具体的には、波長フィルタ１３は、赤色と緑色の間の中間波長帯の光（例えば、黄色の光）を遮光する。波長フィルタ１４は、青色と緑色の間の中間波長帯の光（例えば、青緑の光）を遮光する。

なお、波長フィルタ１３、１４を設ける位置については、特に限定されるものではない。波長フィルタ１３、及び波長フィルタ１４は、照明光学系１０の光路中、又は検出光学系３０の光路中に配置されていればよい。例えば、光源１１の内部に波長フィルタ１３、１４が配置されていてもよい。波長フィルタ１３、及び波長フィルタ１４は、照明光Ｌ１又は検出光Ｌ２の所定の波長帯を遮光すればよい。さらに、波長フィルタ１３と波長フィルタ１４とは、離れた位置に配置されていてもよい。また、図６では２枚の波長フィルタ１３、１４が示されている例が示されているが、波長フィルタ１３の数は１枚でもよく、あるいは３枚以上でよい。

ここで、光源１１がランプ光源などの白色光源であるとする。この場合、照明光Ｌ１には、ＲＧＢの中間色が含まれている。具体的には、照明光Ｌ１には、ＲとＧの間の波長帯の光（以下、Ｙ（黄色）の光とする）と、ＧとＢの間の波長帯の光（以下、ＧＢ（青緑）に光とする）が含まれている。よって、試料５０で反射した検出光Ｌ２にもＹの光とＧＢの光とが含まれている。

ここで、検出器４０の画素の前面に設けられたカラーフィルタの特性について、図７を用いて説明する。図７は、ＲＧＢのカラーフィルタ４４のスペクトル特性の一例を示す図である。図７の横軸は波長、縦軸は透過率を示している。Ｒのカラーフィルタは、波長約５８０ｎｍで約５０％の透過率を有している。したがって、Ｙの光が画素４８Ｒに入射すると、画素４８ＲがＹの光のほぼ半分を検出する。同様に、画素４８ＧがＹの光、及びＧＢの光を検出し、画素４８ＢがＧＢの光を検出する。このように、カラーフィルタは、ＲＧＢの中間色の光を透過してしまう。

図８、図９を用いて、画素列４１〜４３で検出される検出光について説明する。図８、及び図９は検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｙ，Ｌ２Ｇ、Ｌ２ＧＢ、Ｌ２Ｂの空間分布と、画素列４１〜４３の配置を模式的に示す図である。図８は、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面と一致している場合を示している。図９は、レンズ２２の焦点位置が検出器４０の受光面からずれている場合を示している。また、図８、図９において、左側には画素列の配置を示すＸＹ平面図が示され、右側には、Ｙ方向における検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｙ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２ＧＢ、Ｌ２Ｂの強度分布が示されている。検出光Ｌ２Ｙは黄色の検出光Ｌ２であり、検出光Ｌ２ＧＢは、青緑色の検出光Ｌ２である。

図８に示すように、合焦位置にある場合は、図４と同様に、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｙ，Ｌ２Ｇ、Ｌ２ＧＢ、Ｌ２Ｂの強度分布は急峻なピークを形成している。図９に示すように、合焦位置にない場合は、図５と同様に、検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｙ，Ｌ２Ｇ、Ｌ２ＧＢ、Ｌ２Ｂの強度分布はブロードなピークを形成している。

また、合焦位置にある場合でも、検出光Ｌ２Ｙは、Ｒの画素列４１、Ｇの画素列４２に入射する。検出光Ｌ２ＧＢは、Ｇの画素列４２と、Ｂの画素列４３に入射する。さらに、ＲＧＢのカラーフィルタでは、検出光Ｌ２Ｙ、Ｌ２ＧＢを完全には遮光できないため、Ｒの画素列４１は、検出光Ｌ２Ｙを検出する．同様に、Ｇの画素列４２は、検出光Ｌ２Ｙ、Ｌ２ＧＢを検出し、Ｂの画素列４３は、検出光Ｌ２ＧＢを検出する。

このような混色が発生すると、カラー共焦点画像を適切に取得できなくなってしまうおそれがある。例えば、焦点位置のずれにより、検出光量が変化してしまう。そこで、本実施の形態では、照明光Ｌ１、及び検出光Ｌ２の光路中に波長フィルタ１３、１４を配置している。波長フィルタ１３はＹの照明光Ｌ１を遮光し、波長フィルタ１４は、ＧＢの照明光Ｌ１を遮光する。また、波長フィルタ１３、１４は、ＲＧＢの照明光Ｌ１を透過する。すなわち、波長フィルタ１３、１４は、ＲＧＢの中間色のみを遮光する。

このように波長フィルタ１３、１４を設けることで、検出器４０における混色を防ぐことができる。すなわち、カラーフィルタの遮光特性が急峻に変化しない場合でも、適切なカラー共焦点画像を取得することができる。ＲＧＢの中間色による混色が発生することを防ぐことができる。スペクトル特性における透過波長とカット波長とのエッジが急峻になっている特殊なカラーフィルタを用いることなく、一般的なカラーフィルタを用いるｋとができる。よって、検出器４０の部品コストを低減することができる。

もちろん、検出器の画素に、中間色を遮光できる狭帯域のカラーフィルタを設けることで、波長フィルタ１３、１４を不要とすることができる。あるいは、照明光Ｌ１が中間色を含まないスペクトルを有していてもよい。

（設計例）
以下、分光プリズム３１と検出器４０の設計例について説明する。図１０は、分光プリズム３１で波長分散された検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの光路を模式的に示す図である。なお、設計例においては、検出光Ｌ２Ｒの波長を６３０ｎｍ、検出光Ｌ２Ｇの波長を５４０ｎｍ、検出光Ｌ２Ｂの波長を４６０ｎｍとしている。また、分光プリズム３１と検出器４０との間の距離を１００ｍｍとしている。

図１１は、分光プリズム３１の屈折率とアッベ数を示す表である。ここでは、分光プリズム３１の材料として、ＢＫ７、石英、ＳＦ１５、ＳＫ２が挙げられている。そして、図１１には、６３０ｎｍ（Ｒ）、５４０ｎｍ（Ｇ）、４６０ｎｍ（Ｂ）での屈折率がそれぞれ示されている。

図１２は、検出器４０の受光面における検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂの集光位置間の距離を示す表である。図１２では、検出光Ｌ２Ｒと検出光Ｌ２Ｇとの集光位置間の距離を赤−緑とし、検出光Ｌ２Ｂと検出光Ｌ２Ｇとの集光位置間の距離を青−緑としている。さらに、分光プリズム３１の材料と、分光プリズム３１のプリズム頂角αを変えた、計算を行った計算結果が示されている。なお、ここでは、分光プリズム３１の１点から検出光Ｌ２Ｒ、Ｌ２Ｇ、Ｌ２Ｂが出射すると仮定している。図２のように、画素列が３０μｍピッチであるとすると、プリズム頂角αは２〜３°程度でよい。

ここで、検出器４０と分光プリズム３１との距離が１００ｍｍ画素列のピッチが３０μｍであるとする。

分光プリズム３１における屈折率特性によって、青−緑間の距離は、赤−緑間の距離よりも大きくなっている。したがって、Ｙ方向における第１の画素列４１と第２の画素列４２との間の間隔を、第２の画素列４２と第３の画素列４３との間の間隔よりも狭くすることが好ましい。還元すると、Ｙ方向における第１の画素列４１と第２の画素列４２との間の間隔と、第２の画素列４２と第３の画素列４３との間の間隔とを同じ場合、検出する波長帯の間隔が異なる。

ここで、検出器４０と分光プリズム３１との距離が１００ｍｍとし、画素列のピッチが３０μｍで、分光プリズム３１の材料がＢＫ７であるとする。Ｒの中心波長が７１０ｎｍ、Ｇの中心波長が５４０ｎｍ、Ｂの中心波長が４５０ｎｍの場合、分光プリズム３１の頂角αは２．７３°となる。

図３で示したように、分光プリズム３１を移動又は回転させると、画素列４１〜４３で検出される検出光の波長を調整することができる。しかしながら、画素列４１〜４３の間隔は固定されているため、画素列４１〜４３で検出される検出光の波長を独立に調整することは困難である。このため、中間色を含む照明光Ｌ１を発生する白色光源を光源１１として用いて、中間色を波長フィルタ１３、波長フィルタ１４で遮光することが好ましい。このようにすることで、光学系の調整をより容易に行うことができる。

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明はその目的と利点を損なうことのない適宜の変形を含み、更に、上記の実施形態よる限定は受けない。

１０ 検出光学系
１１ 光源
１２ バンドルファイバ
１３ 波長フィルタ
１４ 波長フィルタ
１５ レンズ
１６ スリット
２１ ＰＢＳ
２２ レンズ
２３ ガルバノミラー
２４ レンズ
２５ レンズ
２６ １／４波長板
２７ 対物レンズ
３０ 検出光学系
３１ 分光プリズム
４０ 検出器
４１ 画素列
４２ 画素列
４３ 画素列
４４ カラーフィルタ
４８ 画素
５０ 試料
５１ ステージ
１００ 共焦点顕微鏡

Claims (10)

1. 第１の波長帯と、前記第１の波長帯と異なる第２の波長帯とを含む照明光を発生する光源と、
   前記光源からの照明光を第１の方向に沿ったライン状にして、試料に導く照明光学系であって、試料上における前記ライン状の照明光を走査するスキャナを有する照明光学系と、
   前記ライン状の照明光によって照明された前記試料からの検出光を導く検出光学系であって、前記検出光を前記第１の方向と異なる第２の方向に波長分散させる波長分散素子を有する検出光学系と、
   前記第１の方向に沿って配列された複数の画素を含むラインセンサを用いて、前記波長分散素子によって波長分散された検出光を検出する光検出器であって、前記第１の波長帯の光を透過する第１のカラーフィルタを有する第１のラインセンサと、前記第２の波長帯の光を透過する第２のカラーフィルタを有する第２のラインセンサと、を備えた検出器と、
   共焦点顕微鏡。
2. 前記第１の波長帯と前記第２の波長帯との間の波長帯を遮光する波長フィルタが光路中に設けられている請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記照明光が、前記第１及び第２の波長帯と異なる第３の波長帯を含み、
   前記検出器が第３の波長帯の光を透過する第３のカラーフィルタを有する第３のラインセンサを有している請求項１、又は２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記波長分散素子が分光プリズムであり、
   前記分光プリズムが、光軸と垂直な方向でかつ、前記第２の方向と垂直な方向な回転軸周りに回転可能に設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記分光プリズムが、光軸に沿った方向に移動可能に設けられている請求項４に記載の共焦点顕微鏡。
6. 第１の波長帯と、前記第１の波長帯と異なる第２の波長帯とを含む照明光を発生するステップと、
   第１の方向に沿ったライン状の前記照明光の光路中に配置されたスキャナを用いて、試料上における前記ライン状の照明光を走査するステップと、
   前記ライン状の照明光によって照明された前記試料からの検出光の光路中に配置された波長分散素子を用いて、前記検出光を前記第１の方向と異なる第２の方向に波長分散させるステップと、
   前記第１の方向に沿って配列された複数の画素を含むラインセンサを用いて、前記波長分散素子によって波長分散された検出光を検出するステップであって、前記第１の波長帯の光を透過する第１のカラーフィルタを有する第１のラインセンサと、前記第２の波長帯の光を透過する第２のカラーフィルタを有する第２のラインセンサとを有する検出器を用いて、波長分散された検出光を検出するステップと、を備えた共焦点画像の撮像方法。
7. 前記照明光又は前記検出光の光路中に設けられた波長フィルタによって、前記第１の波長帯と前記第２の波長帯との間の波長帯を遮光する請求項６に記載の撮像方法。
8. 前記照明光が、前記第１及び第２の波長帯と異なる第３の波長帯を含み、
   前記検出器が第３の波長帯の光を透過する第３のカラーフィルタを有する第３のラインセンサを有している請求項６、又は７に記載の撮像方法。
9. 前記波長分散素子が分光プリズムであり、
   前記分光プリズムが、光軸と垂直な方向でかつ、前記第２の方向と垂直な方向な回転軸周りに回転することで、第２の方向において、前記検出器に対する検出光の入射位置を調整する請求項６〜８のいずれか１項に記載の撮像方法。
10. 前記分光プリズムが、光軸に沿った方向に移動することで、前記検出器に対する第１の波長帯の検出光と第２の波長帯の検出光の入射位置間隔を調整する請求項９に記載の撮像方法。

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