JP5825476B2

JP5825476B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5825476B2
Application number: JP2011178343A
Authority: JP
Inventors: 山宮　広之; 広之山宮
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2031-08-17
Also published as: JP2013041142A

Description

本発明は、試料に照明光を照射して、試料の画像を観察する顕微鏡装置に関するものである。

顕微鏡装置は、試料に照明光を照射して、その画像を観察するために用いられる。顕微鏡装置としては、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡等がある。観察対象が生物試料の場合、一般に明視野顕微鏡や位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡は、観察対象である試料に光を透過させて観察を行う。明視野顕微鏡は、光の吸収の分布を観察するが、一般に細胞等の試料は光の吸収の程度が小さくコントラストの低い細胞の細胞情報が観察される。位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡は、屈折率の分布を画像化するもので、細胞等の屈折率差を用いて比較的コントラスト良く細胞形状が観察できる。

蛍光顕微鏡は、蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対して照明光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う。この種の顕微鏡は、主に細胞の機能情報を観察するために用いられる。蛍光顕微鏡は、落射蛍光を行うことにより観察を行う。特に、蛍光顕微鏡としては、深さ方向に高い分解能を有する共焦点顕微鏡が多用されている。

試料に光を透過させて観察を行う顕微鏡として、共焦点型レーザ走査透過顕微鏡が特許文献１に開示されている。この文献の顕微鏡は、無限遠補正対物レンズとコーナキューブリフレクタとを設けることで、試料にレーザ光を２回透過させている。これにより、コントラストを強調した画像を得るようにしている。

特開平６−１８７８５号公報

特許文献１の顕微鏡のように、試料にレーザ光を２回透過させることで、試料の光の吸収の２倍にすることにより、光の吸収によるコントラストを強調することができる。ただし、試料が細胞のような場合、一般に細胞は光の吸収する量が極めて小さいいために、単にレーザ光を試料に２回透過させたとしても、十分なコントラストを得ることができない。

また、特許文献１の顕微鏡は、試料に光を透過させる明視野顕微鏡であり、光の吸収の分布を観察することはできるが、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡のように屈折率の分布を観察することができない。また特許文献１の顕微鏡は、蛍光顕微鏡のように試料の機能情報を観察することもできない。同一の観察対象である試料について、細胞の形状と機能情報との両者を観察したい場合に、特許文献１の顕微鏡では細胞の光の吸収に基づいたコントラストの低い形状のみが観察可能になる。

そこで、本発明は、細胞の屈折率分布に基づいた高いコントラストの画像を得ることを目的とし、また蛍光画像と微分干渉画像とを１つの顕微鏡装置で得ることを目的とする。

以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料に照射する照明光を発振する光源と、前記照明光を偏光方向の異なる２つの偏光に分離する偏光分離素子と、前記２つの偏光を前記試料の離間した２点に集光する第１対物レンズと、前記試料を透過した前記２つの偏光を平行光に変換する第２対物レンズと、この第２対物レンズを通過した前記２つの偏光を再帰反射させる再帰反射光学系と、前記偏光分離素子に入射する前記照明光を直線偏光に変換し、前記再帰反射光学系で再帰反射して前記試料を透過した２つの偏光が干渉する偏光子と、前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路から挿抜可能に移動する移動機構と、第１のモードが設定されたときには前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路に挿入し、第２のモードが設定されたときには前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路から退避するように前記移動機構を制御する制御部と、を備え、前記移動機構は、前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路と直交する方向に移動させ、前記第１のモードおよび前記第２のモードのいずれが設定されていても、前記光源および前記第１対物レンズは同一の位置にあり、前記第２のモードが設定されているときに、前記第１対物レンズにより前記試料に前記照明光の焦点を結ぶことを特徴とする。

この顕微鏡装置によれば、偏光分離素子により分離された２つの偏光を再帰反射光学系で再帰反射させている。これにより、試料の異なる２点を２つの偏光が２回透過することになる。このため、２つの偏光の位相差が２倍になり、高いコントラストの画像を得ることができるようになる。

移動機構と制御部とにより、第１のモードと第２モードとに切り替える。第１のモードでは微分干渉画像を得るような光学システムを構築でき、第２のモードでは蛍光画像を得るような光学システムを構築できるようになる。これにより、１つの顕微鏡装置で微分仮称画像と蛍光画像とを得ることができるようになる。

また、前記制御部に前記第１のモードが設定されたときには、前記光源からの前記照明光を前記試料に透過または反射し、前記試料からの戻り光を反射または透過するハーフミラーと、前記制御部に前記第２のモードが設定されたときには、前記光源からの前記照明光の波長を透過または反射し、前記試料の蛍光の波長を反射または透過するダイクロイックミラーと、を備え、前記移動機構は、前記制御部に前記第１のモードが設定されたときには、前記ハーフミラーを前記照明光の光路に挿入し、前記制御部に前記第２のモードが設定されたときには、前記ダイクロイックミラーを前記照明光の光路に挿入することを特徴とする。

ハーフミラーとダイクロイックミラーとを切り替えることで、微分干渉顕微鏡として使用する場合と蛍光顕微鏡として使用する場合とを簡単に切り替えることが可能になる。

また、前記試料の焦点の範囲内の光を通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記照明光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、を備えたことを特徴とする。

ピンホールディスクとレンズディスクとを回転部が一体的に回転させることにより、照明光を試料に走査させることができ、高速に画像生成を行うことができるようになる。

λ／４波長板を設けることで、２つの偏光の位相差がない場合に暗くなるクロスニコルについても、高いコントラストの画像を得ることができるようになる。

また、前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間に前記第２対物レンズの瞳位置をリレーする瞳リレーレンズ系を設けたことを特徴とする。

第２対物レンズと再帰反射光学系との間が近接しすぎている場合でも、瞳リレーレンズ系を設けることで、第２対物レンズの瞳位置に再帰反射光学系を設けることができ、且つ第２対物レンズと再帰反射光学系との間に所定の間隔を設けることができる。

本発明は、偏光分離素子により照明光を２つの偏光に分離して、再帰反射光学系で再帰反射することで２つの偏光を試料に２回透過させている。これにより、試料の離間した２点間を２回透過させることができ、位相差を２倍にすることができることから、高いコントラストの画像を得ることができる。また、移動機構を制御部が制御することにより、１つの顕微鏡装置で微分干渉画像と蛍光画像とを得ることができるようになる。

実施形態の微分干渉モードの顕微鏡装置の構成図である。ピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクの構成図である。実施形態の蛍光モードの顕微鏡装置の構成図である。変形例１の顕微鏡装置の構成図である。変形例２の微分干渉モードの顕微鏡装置の構成図である。変形例２の蛍光モードの顕微鏡装置の構成図である。変形例３の微分干渉モードの顕微鏡装置の構成図である。変形例３の蛍光モードの顕微鏡装置の構成図である。変形例４および５の第１対物レンズおよび第２対物レンズの図である。

以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は実施形態の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は走査光学系２と顕微鏡光学系３とを有して構成している。同図に示すように、走査光学系２は光源４とファイバ５とコリメートレンズ６とマイクロレンズディスク７とピンホールディスク８と連結ドラム９とモータ１０とハーフミラー１１ａと第１リレーレンズ１２とミラー１３と第２リレーレンズ１４とカメラ１５と制御部１６とモニタ１７とを有して構成している。

光源４はレーザ光Ｌを発振する光源である。レーザ光Ｌは観察対象である試料Ｓを観察するための照明光となる。ファイバ５は光ファイバであり、レーザ光Ｌを導光する。ファイバ５の出射側にはコリメートレンズ６が配置されており、ファイバ５から出射されたレーザ光Ｌはコリメートレンズ６で平行光になる。

コリメートレンズ６の前方にはマイクロレンズディスク７が配置されている。マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とは連結ドラム９により連結されており、連結ドラム９はモータ１０に接続されている。マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とは回転ディスクであり、モータ１０により回転力が連結ドラム９に付与されることで、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転する。

図２に示すように、ピンホールディスク８には多条（図中では４条）の螺旋状の多数のピンホール８Ｐを配列して形成している。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させる微小開口部である。マイクロレンズディスク７には、ピンホール８Ｐと同一パターンで多条の螺旋状の多数のマイクロレンズ７Ｍを配列して形成している。マイクロレンズ７Ｍは対応するピンホール８Ｐにレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。

図１および図２に示すように、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８との間にはハーフミラー１１ａを設けている。ハーフミラー１１ａは入射する光を透過と反射とに分ける光学素子である。ハーフミラー１１ａにより光が反射する位置に第１リレーレンズ１２を設けている。

この第１リレーレンズ１２によりリレーされた光はミラー１３で反射して第２リレーレンズ１４に導かれる。そして、この光は第２リレーレンズ１４によりカメラ１５に集光される。カメラ１５は受光した光を電気信号に変換して、制御部１６に出力する。制御部１６は顕微鏡装置１の全体を制御するコンピュータであり、カメラ１５から入力した電気信号に基づいて試料Ｓの画像を生成する。生成した画像はモニタ１７に表示する。

次に、顕微鏡光学系３について説明する。図１に示すように、顕微鏡光学系３は撮影レンズ１８とミラー１９と偏光子２０とウォラストンプリズム２１と第１対物レンズ２２とディッシュ２３と第２対物レンズ２４とコーナーキューブ２５とを有して構成している。

撮影レンズ１８はピンホール８Ｐを通過したレーザ光Ｌを平行光にする。この平行光はミラー１９で反射して偏光子２０に導かれる。偏光子２０は所定の偏光方向の直線偏光を生成する。ウォラストンプリズム２１は複屈折性を有する偏光分離素子であり、偏光子２０を通過した照明光を所定の開き角を持った２つの偏光に分離する。当該２つの偏光は相互に偏光方向が直交する。

このとき、偏光子２０が生成する偏光面はウォラストンプリズム２１の結晶の光学軸と４５度の傾きを持たせるようにする。これにより、ウォラストンプリズム２１により相互に直交する２つの偏光が所定の開き角で分離される。

ディッシュ２３は試料Ｓを搭載する搭載部である。ウォラストンプリズム２１で分離された２つの偏光（レーザ光Ｌ）は試料Ｓの微小に離間した２箇所で焦点を結ぶ。そして、試料Ｓを透過した２つの偏光は第２対物レンズ２４に導かれ、コーナーキューブ２５に集光する。コーナーキューブ２５は３枚のミラーを相互に直角に組み合わせて立方体を形成した再帰反射光学系である。これにより、２つの偏光は元の方向に反射（再帰反射）する。

ここで、ハーフミラー１１ａには第１移動機構が取り付けられている。また、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４およびコーナーキューブ２５には第２移動機構が取り付けられている。第１移動機構および第２移動機構により移動機構が構成される。第１移動機構はハーフミラー１１ａを図１の紙面に直交する方向に移動させる。

第１移動機構がハーフミラー１１ａをレーザ光Ｌの光路から移動させたときには、レーザ光Ｌの光路にはダイクロイックミラー１１ｂを位置させる。つまり、第１移動機構はレーザ光Ｌの光路（マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８との間）にハーフミラー１１ａとダイクロイックミラー１１ｂとの何れかを選択的に位置させる。ダイクロイックミラー１１ｂはレーザ光Ｌの波長の光を透過し、試料Ｓの蛍光の波長（レーザ光Ｌの波長より長い波長）を反射させる特性を有する光学素子である。

第２移動機構は、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４およびコーナーキューブ２５を図１の紙面に直交する方向或いはレーザ光Ｌの光路と直交する方向に移動させる。これにより、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４およびコーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路から退避させる。

第１移動機構および第２移動機構としては、各光学部品を移動させることができれば任意の移動手段を用いることができる。例えば、ハーフミラー１１ａ、ダイクロイックミラー１１ｂ、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５をクランプするクランプ機構にガイドレールを設けて、アクチュエータ等の駆動手段で移動させるようにしてもよい。

図３は、図１の状態から、第１移動機構および第２移動機構を動作させて、ダイクロイックミラー１１ｂをレーザ光Ｌの光路に位置させ、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４およびコーナーキューブ２５を退避させた状態を示している。

次に、動作について説明する。ここでは、微分干渉モード（第１のモード）と蛍光モード（第２のモード）との２つのモードが存在している。微分干渉モードは顕微鏡装置１を微分干渉顕微鏡として使用するモードである。つまり、細胞の形状等を観察するために、試料Ｓにレーザ光Ｌを透過させて観察する。蛍光モードは顕微鏡装置１を蛍光顕微鏡として使用するモードである。つまり、細胞の機能情報等を観察するために、試料Ｓにレーザ光Ｌを照射して、蛍光を観察する。

微分干渉モードと蛍光モードとの切り替えは、制御部１６が行う。つまり、コンピュータである制御部１６に微分干渉モードと蛍光モードとの何れかを設定する。この設定に基づいて、第１移動機構および第２移動機構が動作を行う。微分干渉モードを設定したときには、第１移動機構はハーフミラー１１ａをレーザ光Ｌの光路上に位置させる。また、第２移動機構は偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路上に位置させる。つまり、図１の構成となる。

一方、蛍光モードを設定したときは、第１移動機構はダイクロイックミラー１１ｂをレーザ光Ｌの光路上に位置させる。また、第２移動機構は偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路上から退避させる。つまり、図３の構成となる。

最初に、制御部１６に微分干渉モードを設定した場合について説明する。この場合には、第１移動機構はハーフミラー１１ａをレーザ光Ｌの光路上に位置させ、第２移動機構は偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路上に位置させる。

そして、光源４からレーザ光Ｌを発振させる。レーザ光Ｌはファイバ５に集光されて、ファイバ５の端部から広がりを持って出射される。このレーザ光Ｌはコリメートレンズ６によって、平行光に変換されて、マイクロレンズディスク７のマイクロレンズ７Ｍに入射する。

マイクロレンズ７Ｍは集光レンズの作用を有しており、レーザ光Ｌはハーフミラー１１ａを透過した後に、マイクロレンズ７Ｍに対応するピンホール８Ｐに焦点を結ぶ。ピンホール８Ｐは通過したレーザ光Ｌは撮影レンズ１８に入射する。撮影レンズ１８によりレーザ光Ｌはピンホール８Ｐの位置に対応する傾きを有する平行光に変換される。この平行光はミラー１９で反射して光路が９０度変換されて、偏光子２０に入射する。

偏光子２０はウォラストンプリズム２１の結晶の光学軸に対して４５度の傾きを有する偏光面となるような直線偏光にレーザ光Ｌを変換する。この直線偏光となったレーザ光Ｌがウォラストンプリズム２１に入射する。ウォラストンプリズム２１は結晶の複屈折から相互に振動方向が直交する２つの偏光に分離して、張り合わせ面でそれぞれ反対方向に屈折する。これにより、相互に直交する２つの偏光に分離されて、所定の開き角をもって進行する。図１では、２つの偏光の中心光軸を示しているが、実際には極めて小さい光のずれ（シア量）になっている。

ウォラストンプリズム２１により２つの偏光になったレーザ光Ｌは、第１対物レンズ２２によって光軸が相互に平行な状態で集光され、試料Ｓの焦点面でそれぞれ焦点を結ぶ。そして、試料Ｓを通過した２つの偏光は第２対物レンズ２４によって、それぞれの焦点位置に対応した傾きを有する平行光に変換される。なお、第１対物レンズ２２と第２対物レンズ２４の焦点面とは同じ位置になっている。

つまり、当該２つの偏光は、光軸中心に焦点がある場合は光軸に平行な平行光になり、光軸中心から焦点がずれるほど、光軸に対して傾きを持った平行光になる。平行光になった２つの偏光は、コーナーキューブ２５で入射方向と同じ方向に再帰反射する。従って、入射したときと同じ光路を辿って戻ることになり、再び第２対物レンズ２４に入射する。

そして、２つの偏光は第２対物レンズ２４によって再び試料Ｓの同じ箇所に焦点を結ぶ。その後、２つの偏光は同じ光路を戻り、第１対物レンズ２２によってウォラストンプリズム２１に導かれる。ウォラストンプリズム２１は偏光方向によって光を屈折させると共に、２つの偏光の進行方向が重なるように作用する。

また、ウォラストンプリズム２１を通過した光が偏光子２０に入射し、偏光子２０により２つの偏光が干渉を起こす。２つの偏光の光路に位相差を生じていない場合には２つの偏光は干渉によって強め合う。一方、２つの偏光の光路に位相差を生じている場合には２つの偏光は干渉する成分が少なくなり弱め合う。

２つの偏光は試料Ｓの微小に離間した２点で焦点を結ぶ。そして、この２点間に位相差を生じているか否かによって、光の強度が強くなるか弱くなるかが決定され、これによりコンストラストを生じるようになる。ここでは、２つの偏光に位相差がない場合に光の強度が明るく示されるオープンニコルの場合を示している。

偏光子２０を通過した光（戻り光Ｒとする）はミラー１９で反射して、撮影レンズ１８によってピンホール８Ｐに集光される。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させるため、カメラ１５により生成される画像は共焦点画像になる。ピンホール８Ｐを通過した戻り光Ｒはハーフミラー１１ａで反射する。

そして、ハーフミラー１１ａで反射した戻り光Ｒは第１リレーレンズ１２でリレーされて、ミラー１３で反射する。そして、第２リレーレンズ１４でカメラ１５に結像される。カメラ１５は結像された戻り光Ｒを電気信号に変換して、制御部１６に出力する。制御部１６では入力した電気信号に基づいて所定の画像処理を行う。

ここで、制御部１６はモータ１０を制御して回転力を付与する。これにより、連結ドラム９が回転して、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転する。マイクロレンズディスク７には多数のマイクロレンズ７Ｍが配列されており、ピンホールディスク８には同じパターンの多数のピンホール８Ｐが配列されている。

よって、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転させることで、図２に示すように、レーザ光Ｌが通過するピンホール８Ｐは回転に伴って順次変化する。これにより、レーザ光Ｌは試料Ｓの焦点面を水平面上に走査される。且つ、戻り光Ｒは再びピンホール８Ｐを通過した後にハーフミラー１１ａで反射して、カメラ１５の結像面上を走査される。

従って、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転させることで、試料Ｓの水平面方向にレーザ光Ｌを高速に走査することができる。これにより、カメラ１５は順次走査された戻り光Ｒの電気信号を出力するため、制御部１６は高速に試料Ｓの画像生成を行うことができる。そして、生成された試料Ｓの画像はモニタ１７に表示される。

このとき、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌおよびカメラ１５に結像される戻り光Ｒはピンホール８Ｐを通過している。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点内の光のみを通過させ、それ以外の光を通過させないため、カメラ１５に結像される戻り光Ｒは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみになる。これにより、深さ方向に高い分解能の共焦点画像が生成される。

従って、微分干渉モードでは、レーザ光Ｌをウォラストンプリズム２１により２つの偏光に分離して、試料Ｓに焦点を結ばせ、試料Ｓを通過した２つの偏光を第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５により再帰反射させている。これにより、２つの偏光は再び試料Ｓで焦点を結ぶ。つまり、２つの偏光は試料Ｓを２回透過する。

これにより、試料Ｓの離間した２点間に生じる位相差が２倍になる。位相差が２倍になった２つの偏光は偏光子２０で干渉して、戻り光Ｒとなってカメラ１５で結像する。従って、カメラ１５が検出する戻り光Ｒの位相差も２倍になっており、得られるコントラストが強調されている。

つまり、単に試料Ｓにレーザ光Ｌを２回透過させてその光の吸収の分布を観察するのではなく、位相差を検出する２つの偏光を試料Ｓに２回透過させているため、位相差を２倍にすることができる。従って、この２つの光路の位相差による光が強め合う部分と弱め合う部分とが明確に識別されるため、コントラストの良い画像を取得することができる。これにより、試料Ｓが細胞のように屈折率差が小さいような場合でも、高いコントラストの画像を得ることができるようになる。

以上が微分干渉モードである。細胞の機能情報を観察したい場合には、制御部１６を用いて蛍光モードに設定する。これにより、第１の移動機構はレーザ光Ｌの光路にダイクロイックミラー１１ｂを配置する。また、第２の移動機構は偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５を光路上から退避する。つまり、図３の構成になる。

この状態で、制御部１６は光源４からレーザ光Ｌを発振させる。このレーザ光Ｌはファイバ５、コリメートレンズ６を介してマイクロレンズディスク７のマイクロレンズ７Ｍにより集光される。ダイクロイックミラー１１ｂはレーザ光Ｌを透過させる特性を有しているため、レーザ光Ｌはダイクロイックミラー１１ｂを透過して、ピンホール８Ｐに焦点を結ぶ

そして、撮影レンズ１８により平行光にされて、ミラー１９で反射して、第１対物レンズ２２に入射する。第１対物レンズ２２に入射したレーザ光Ｌはディッシュ２３に搭載された試料Ｓに焦点を結ぶ。試料Ｓには蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されており、レーザ光Ｌは蛍光色素や蛍光タンパク等が反応する波長を有している。

よって、試料Ｓにレーザ光Ｌが焦点を結ぶことにより、試料Ｓが蛍光を発生する。この蛍光が戻り光Ｒとなる。戻り光Ｒは第１対物レンズ２２、ミラー１９、撮影レンズ１８を介して、ピンホールディスク８のピンホール８Ｐに焦点を結ぶ。そして、ピンホール８Ｐにより試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過して、ダイクロイックミラー１１ｂに入射する。これにより、生成される画像は共焦点画像になる。

ダイクロイックミラー１１ｂは蛍光（戻り光Ｒ）の波長を反射する。よって、反射した戻り光Ｒは第１リレーレンズ１２、ミラー１３、第２リレーレンズ１４を介して、カメラ１５に結像する。そして、カメラ１５に結像した戻り光Ｒが電気信号に変換されて制御部１６に出力される。

前述した場合と同様に、モータ１０を回転させることで、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転させる。これにより、試料Ｓにレーザ光Ｌを走査させることができ、高速に画像生成を行うことができる。

従って、制御部１６に蛍光モードを設定することで、蛍光画像を得ることができる。制御部１６に微分干渉モードと蛍光モードとの何れかを設定するだけで、第１移動機構と第２移動機構とが各光学部品を光路上から挿抜するように移動させるため、微分干渉顕微鏡と蛍光顕微鏡とを容易に切り替えることができるようになる。つまり、１つ（１台）の顕微鏡装置１を用いて、簡単な構成で且つ単純な動作で微分干渉画像と蛍光画像との両者の画像を得ることができるようになる。

以上において、第１移動機構は、ハーフミラー１１ａ（微分干渉モード）とダイクロイックミラー１１ｂ（蛍光モード）とを切り替えるように制御しているが、第１移動機構は切り替えを行わなくてもよい。つまり、ダイクロイックミラー１１ｂを固定的に配置し、微分干渉モードにおいてもダイクロイックミラー１１ｂを用いる。

ただし、この場合には、ダイクロイックミラー１１ｂはハーフミラーと同等の機能を有するものを用いる。つまり、ダイクロイックミラー１１ｂにおいて、所定の反射率と所定の透過率とを有するような波長帯域のレーザ光Ｌを発振するように光源４を選択するようにする。

また、コーナーキューブ２５は３枚のミラーを相互に直角に組み合わせて立方体を形成した光学系である。ミラーとしては、ガラスを研磨して全反射させるようにしたものを用いてもよく、反射膜を施したものを用いてもよい。要は、入射した光を入射方向に戻す再帰反射をするものであれば任意の光学素子を用いることができる。

また、ウォラストンプリズム２１はノマルスキープリズムでもよく、他の複屈折性を有する素子を用いてもよい。

また、ハーフミラー１１ａの代わりに偏光ビームスプリッタを用いて、ファラデーローテータ等を偏光子２０の手前に挿入することによって、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの偏光面を９０度変えて、効率良く光を回収するようにしてもよい。

また、カメラ１５の前段に試料Ｓの蛍光の波長成分のみを選択的に透過させる蛍光フィルタを挿入することが望ましい。

なお、図１においては、ウォラストンプリズム２１に入射する光が光軸に平行な光を示しているが、走査光学系２によって光軸に対して傾きを有する光が入射された場合にも、同様に光は２つの光路に分けられて焦点面の別の微小に離間した２点に集光されると共に、第２対物レンズ２４とコーナーキューブ２５との作用によって同じ光路を戻る。

次に、変形例１について説明する。図４は変形例１の顕微鏡装置１を示しており、前述した実施形態の顕微鏡装置１に対してλ／４波長板２６を追加している。λ／４波長板２６は偏光子２０とウォラストンプリズム２１との間に挿入している。その他の構成は実施形態と同じである。

実施形態は２つの偏光が試料Ｓを透過するときの位相差がないときに明るくなるオープンニコルであるが、本変形例１は２つの偏光が試料Ｓを透過するときの位相差がないときに暗くなるクロスニコルとなる。

本変形例１では、偏光子２０を透過したレーザ光Ｌはλ／４波長板２６に入射する。偏光子２０を透過したときにはレーザ光Ｌは直線偏光になっており、λ／４波長板２６の作用により、円偏光に変換される。このとき、ウォラストンプリズム２１の結晶の光学軸とレーザ光Ｌの偏光面とは４５度傾くように配置されている。

円偏光となったレーザ光Ｌはウォラストンプリズム２１により、結晶の複屈折性から相互に振動方向が直交する２つの直線偏光に分離して進み、貼り合わせ面でそれぞれ反対方向に屈折する。

これにより、ウォラストンプリズム２１を出射するときには、相互に振動方向が直交する２つの直線偏光に分離し、所定の開き角をもって分離して進行する。そして、第１対物レンズ２２、試料Ｓ、第２対物レンズ２４、コーナーキューブ２５と進み、再帰反射して、再びウォラストンプリズム２１に入射する。このときには、試料Ｓを２つの偏光が２回透過している。

そして、２つの偏光がウォラストンプリズム２１で重ね合わされたときに、２つの光路に位相差がない場合には、試料Ｓに入射するときとは逆方向に回転する円偏光となっている。この円偏光はλ／４波長板２６によって直線偏光へと変換されて、偏光子２０に入射する。

偏光子２０で２つの偏光が干渉したときは、相互に打ち消し合って通過する光はなくなる。従って、試料Ｓの微小に離間した２点の光路に位相差がない場合は光の強度が暗くなる。一方、２つの光路に位相差がある場合には、その位相差に応じて偏光状態が変化して、一部の光は偏光子２０を通過する。これにより、２つの偏光の光路に位相差を生じている場合には、光の強度が明るくなる。

なお、２つの偏光の位相差がない場合に、偏光子２０において光が打ち消しあって通過する光がなくなる理由は、戻り光Ｒの偏光面が偏光子２０の偏光面と９０度ずれており、偏光子２０を通過できないことからも説明することができる。

従って、本変形例１では、クロスニコルの場合についても、２つの偏光が試料Ｓを２回透過することで、位相差を２倍にすることができる。これにより、高いコントラストの画像を得ることができる。

この変形例１において、λ／４波長板２６の代わりに、ファラデーローテータ等を用いて偏光面を４５度回転させるようにしてもよい。この場合には、偏光子２０とウォラストンプリズム２１の光学軸とを同じ方向に配置し、ファラデーローテータによって偏光面を４５度回転させるようにする。

次に、第２変形例について説明する。本変形例２では、走査光学系２および顕微鏡光学系３の構成が実施形態と異なる。まず、走査光学系２について説明する。走査光学系２は光源３１とハーフミラー３２ａと走査光学ユニット３３と走査系瞳リレーレンズ３４と集束レンズ３５とピンホール３６と検出器３７と制御部１６とモニタ１７とを備えて構成している。制御部１６およびモニタ１７は実施形態と同じである。

また、顕微鏡光学系３は実施形態の構成に追加して、第１瞳リレーレンズ４１と第２瞳リレーレンズ４２とを追加している。第１瞳リレーレンズ４１と第２瞳リレーレンズ４２とにより瞳リレーレンズ系が構成され、当該瞳リレーレンズ系は第２対物レンズ２４とコーナーキューブ２５との間に設けられる。

実施形態と同様に、ハーフミラー３２ａには第１移動機構が取り付けられており、レーザ光Ｌの光路に対して、ハーフミラー３２ａとダイクロイックミラー３２ｂとを切り替えることが可能になっている。ダイクロイックミラー３２ｂを配置した場合を図６に示す。また、同図に示すように、第２移動機構により、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２、コーナーキューブ２５はレーザ光Ｌの光路から退避可能になっている。

以上の構成において、まず微分干渉モードについて説明する。制御部１６は微分干渉モードに設定する。これにより、第１移動機構はレーザ光Ｌの光路にハーフミラー３２ａを配置する。また、第２移動機構は、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２、コーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路に配置する。つまり、図５の構成になる。

光源３１からは平行光のレーザ光Ｌが発振される。このレーザ光Ｌはハーフミラー３２ａで反射して走査光学ユニット３３に導かれる。走査光学ユニット３３は１本の軸周りに回転可能な第１可変ミラー３３ａとこの第１可変ミラー３３ａの軸にほぼ直交する軸回りに回転可能な第２可変ミラー３３ｂとを備えている。

第１可変ミラー３３ａと第２可変ミラー３３ｂとにより試料Ｓの水平面方向にレーザ光Ｌが走査される。この走査光学ユニット３３を経た光が走査系瞳リレーレンズ３４から走査光学系２を出射し、顕微鏡光学系３の撮影レンズ１８に入射する。そして、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１を経ることにより、２つの偏光に分離される。

分離された２つの偏光は、第１対物レンズ２２によりディッシュ２３の試料Ｓに焦点を結ぶ。そして、２つの偏光は試料Ｓを透過して、第２対物レンズ２４から第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２の瞳リレーレンズ系によりコーナーキューブ２５まで導かれる。

そして、コーナーキューブ２５で再帰反射をして、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２、第２対物レンズ２４を経て、再び試料Ｓを透過する。これにより、２つの偏光は試料Ｓを２回透過する。そして、第１対物レンズ２２からウォラストンプリズム２１、偏光子２０に入射されて、２つの偏光は干渉する。

この干渉した戻り光Ｒはミラー１９で反射をして、撮影レンズ１８から走査系瞳リレーレンズ３４、走査光学ユニット３３を介して、ハーフミラー３２ａに入射する。そして、ハーフミラー３２ａを透過して、集束レンズ３５により検出器３７に収束する。このとき、ピンホール３６を光路上に設けており、このピンホール３６は第１対物レンズ２２の焦点と共役な位置関係に配置している。よって、戻り光Ｒのうち試料Ｓの焦点の範囲内のみの光が通過する。これにより、生成される画像は共焦点画像になる。

検出器３７は戻り光Ｒを電気信号に変換して、制御部１６に出力する。制御部１６は入力した電気信号に基づいて所定の画像処理を行い、試料Ｓの画像を生成する。このときの画像は、試料Ｓの微小に離間した２点の位相差に基づく微分干渉画像になり、位相差が２倍になっていることから、高いコントラストの画像になる。

ここで、第２対物レンズ２４の瞳位置は第２対物レンズ２４から非常に近い位置になる。第２対物レンズ２４を含むレンズの光学系は一般的に鏡胴内部に装着されることから、第２対物レンズ２４の瞳位置は鏡胴内部に位置することがある。コーナーキューブ２５は第２対物レンズ２４の瞳位置（後ろ側焦点位置）に配置することで最も高い光利用効率を得ることができるが、第２対物レンズ２４の瞳位置が鏡胴内部に位置するため、コーナーキューブを第２対物レンズ２４の瞳位置に配置することができない。

そこで、第２対物レンズ２４の瞳位置をリレーする第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２を設ける。これにより、第２対物レンズ２４の瞳位置がリレーされて、第２対物レンズ２４から離れた位置にあるコーナーキューブ２５付近にまで瞳位置をリレーすることができる。これにより、第２対物レンズ２４の瞳から出るほぼ全ての光が再帰反射によって再び第２対物レンズ２４に入射するため、高い光利用効率を得ることができる。

以上が微分干渉モードである。次に、蛍光モードについて説明する。制御部１６は蛍光モードを設定する。これにより、第１移動機構はハーフミラー３２ａからダイクロイックミラー３２ｂに切り替える。また、第２移動機構は、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２、コーナーキューブ２５をレーザ光Ｌの光路から退避する。つまり、図６の構成になる。

ダイクロイックミラー３２ｂは光源３１が発振するレーザ光Ｌの波長を反射し、試料Ｓの蛍光（レーザ光Ｌの波長より長い波長）を透過する光学特性を有している。よって、光源３１が発振したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー３２ｂで反射する。そして、レーザ光Ｌは、走査光学ユニット３３で走査されて、走査系瞳リレーレンズ３４、撮影レンズ１８、ミラー１９、第１対物レンズ２２を経て、試料Ｓに焦点を結ぶ。

試料Ｓはレーザ光Ｌにより蛍光して戻り光Ｒとなって、ダイクロイックミラー３２ｂにまで戻る。ダイクロイックミラー３２ｂは蛍光を透過するため、戻り光Ｒは透過して、集束レンズ３５、ピンホール３６を介して、検出器３７で検出される。この戻り光Ｒを検出することで、制御部１６は試料Ｓの蛍光画像を生成する。なお、検出器３７の前段には蛍光波長を選択する蛍光フィルタを配置することが望ましい。

従って、微分干渉モードと蛍光モードとを制御部１６で切り替えることで、簡単且つ単純に微分干渉画像と蛍光画像とを１つの顕微鏡装置で得ることができる。且つ、高いコントラストの画像を得ることができると共に、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２を配置することで、瞳位置をリレーすることができ、高い光利用効率を得ることができるようになる。

次に、第３変形例について説明する。変形例３の顕微鏡装置は顕微鏡光学系５０により構成されており、走査光学系を有していない。図７は変形例３の顕微鏡光学系５０を示している。

この顕微鏡光学系５０は光源５１と照明レンズ５２と波長選択フィルタ５３とハーフミラー５４ａと偏光子２０とウォラストンプリズム２１と第１対物レンズ２２とディッシュ２３と第２対物レンズ２４とテレセントリック結像レンズ５５と反射ミラー５６と撮影レンズ１８とカメラ５７とを有して構成している。このうち、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第１対物レンズ２２、ディッシュ２３、第２対物レンズ２４、撮影レンズ１８は実施系態と同じである。

ハーフミラー５４ａには第１移動機構が取り付けられており、ハーフミラー５４ａとダイクロイックミラー５４ｂとの何れか一方を選択することが可能になっている。また、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、テレセントリック結像レンズ５５、反射ミラー５６は第２移動機構により光路上から退避可能になっている。

図示しない制御部（実施形態の制御部１６に相当）は微分干渉モードと蛍光モードとを設定することが可能になっている。微分干渉モードを設定したときは、図７に示すように、ハーフミラー５４ａを選択し、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、テレセントリック結像レンズ５５、反射ミラー５６を光路上に配置する。

一方、制御部１６が蛍光モードを設定したときは、図８に示すように、ダイクロイックミラー５４ｂを選択し、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１、第２対物レンズ２４、テレセントリック結像レンズ５５、反射ミラー５６を光路上から退避させる。

最初に、微分干渉モードについて説明する。微分干渉モードに設定すると、図７に示した構成となるように、第１移動機構および第２移動機構が動作する。光源５１は照明光Ｌを発光する。そして、この照明光Ｌは照明レンズ５２により試料Ｓを均一に照明するように調節される。照明レンズ５２を通過した照明光Ｌは波長選択フィルタ５３を通過する。

波長選択フィルタ５３は試料Ｓに照射する波長成分のみを通過させる。波長選択フィルタ５３を通過した照明光Ｌはハーフミラー５４ａを透過する。そして、偏光子２０、ウォラストンプリズム２１により２つの偏光に分離される。分離された２つの偏光は第１対物レンズ２２によりディッシュ２３に搭載された試料Ｓの微小に離間した２点に焦点を結ぶ。

そして、試料Ｓを透過した２つの偏光は第２対物レンズ２４により集光した後に、テレセントリック結像レンズ５５により平行光となる。この平行光となった照明光Ｌは反射ミラー５６で反射して、再びテレセントリック結像レンズ５５、第２対物レンズ２４から試料Ｓを透過する。

これにより、２つの偏光は試料Ｓの微小に離間した２点を２回透過することになる。そして、第１対物レンズ２２からウォラストンプリズム２１、偏光子２０に入射して、干渉する。そして、干渉した２つの偏光が戻り光Ｒとなって、ハーフミラー５４ａで反射して、撮影レンズ１８によりカメラ５７に結像する。カメラ５７は結像した戻り光Ｒを電気信号に変換する。カメラ５７は図示しない制御部と接続されており、カメラ５７から入力する電気信号に基づいて画像処理を行う。これにより、微分干渉画像を生成することができる。

一方、蛍光モードを選択したときには、図８に示した構成となるように、第１移動機構および第２移動機構が動作する。光源５１から発光した照明光Ｌは照明レンズ５２で試料Ｓを均一に照明するように調節される。また、波長選択フィルタ５３により試料Ｓの蛍光を励起させる波長のみが選択される。そして、照明光Ｌはダイクロイックミラー５４ｂに入射する。

ダイクロイックミラー５４ｂは照明光Ｌの波長の光を透過し、試料Ｓの蛍光を反射させる光学特性を有している。よって、照明光Ｌは試料Ｓを透過する。そして、第１対物レンズ２２によりディッシュ２３に搭載された試料Ｓに焦点を結ぶ。これにより、試料Ｓは蛍光し、戻り光Ｒが発生する。

この戻り光Ｒは第１対物レンズ２２からダイクロイックミラー５４ｂに入射する。ダイクロイックミラー５４ｂに入射した戻り光Ｒは反射して、撮影レンズ１８によりカメラ５７に結像する。そして、カメラ５７に結像された戻り光Ｒを検出することで、蛍光画像が生成される。

本変形例３では、再帰反射光学系として、コーナーキューブを用いずに、テレセントリック結像レンズ５５と反射ミラー５６とを用いている。これにより、再帰反射光学系を実現することができる。

また、実施形態のときと比較して、共焦点画像を得ることができない。ただし、構成としては実施形態と比較して非常に単純になる。つまり、本変形例４のような構成でも、２つの偏光を試料Ｓに２回透過させることで、高いコントラストの画像を得ることができる。

また、制御部により第１移動機構および第２移動機構を制御して、１つの顕微鏡装置を用いて、簡単且つ単純に微分干渉画像と蛍光画像との２種類の画像を取得することができるようになる。なお、前述した実施形態と同様に、カメラ５７の前段に蛍光波長を選択する蛍光フィルタを配置することが望ましい。

次に、変形例４について説明する。図９ａ）は変形例４を示しており、この変形例４では、第１対物レンズ２２、ディッシュ２３、第２対物レンズ２４を示している。第１対物レンズ２２はドライ対物レンズを用いる。ここでは、２０倍のドライ対物レンズ、開口数０．７５、ワーキングディスタンス０．６ｍｍ程度のものを用いるものとするが、勿論これら以外の数値のものを用いてもよい。

第１対物レンズ２２のワーキングディスタンスは非常に短いため、第２対物レンズ２４に同様のドライ対物レンズを用いると、第１対物レンズ２２と第２対物レンズ２２との間に試料Ｓを搭載したディッシュ２３を配置することが困難になる。

そこで、第２対物レンズ２４には水浸対物レンズを用いる。水浸対物レンズとしては、例えば電気生理用の対物レンズでカバーガラスを必要としない水浸レンズを用いることが望ましい。例えば、４０倍水浸レンズ、開口数０．８、ワーキングディスタンスが３．３ｍｍ程度のものを用いることが望ましい。

このような水浸対物レンズを第２対物レンズ２４として用いることで、十分なワーキングディスタンスを確保することができ、試料Ｓを搭載したディッシュ２３を配置することが容易になる。また、試料Ｓが細胞の生物試料のような場合には、一般に培養液Ｗの中にあることが多いため、水浸対物レンズを用いると好適である。

次に、変形例５について説明する。図９ｂ）は変形例５を示しており、この変形例５では、第１対物レンズ２２、ディッシュ２３、第２対物レンズ２４を示している。変形例４と同様に、第１対物レンズ２２としては、倍率が２０倍、開口数が０．７５、ワーキングディスタンスが０．６ｍｍ程度のドライ対物レンズを用いるようにする。勿論、これら以外の数値のものを用いてもよい。

第２対物レンズ２４は微分干渉モードで使用するレーザ光Ｌの波長に最適に作用する対物レンズを用いる。つまり、微分干渉モードで使用される光源４が発振するレーザ光Ｌの波長の光についてのみ対物レンズとしての機能を果たすようなレンズを用いる。

一般的に、可視光の幅広い波長帯域に対応した対物レンズを使用する場合には、多数枚のレンズで構成されるために構造が複雑になる上、ワーキングディスタンスが短くなる。従って、ワーキングディスタンスが短い対物レンズを用いると、試料Ｓを搭載したディッシュ２３を配置することが困難になる。

そこで、第２対物レンズ２４は微分干渉モードで使用するレーザ光Ｌの波長に特化した対物レンズを用いる。これにより、特定の波長で対物レンズとしての機能を果たせばよいため、少ない枚数のレンズ、例えば１枚の非球面レンズ或いは２〜３枚の球面レンズで第２対物レンズ２４を実現することができる。

これにより、ワーキングディスタンスを十分に確保することができる。例えば、開口数が０．７、ワーキングディスタンスが２０ｍｍ程度の第２対物レンズ２４を使用することができる。従って、十分なワーキングディスタンスを確保できることから、試料Ｓを搭載したディッシュ２３を容易に配置することが可能になる。

１顕微鏡装置
２走査光学系
３顕微鏡光学系
４光源
６コリメートレンズ
７マイクロレンズディスク
８ピンホールディスク
９連結ドラム
１０モータ
１１ａハーフミラー
１１ｂダイクロイックミラー
１５カメラ
１６制御部
２０偏光子
２１ウォラストンプリズム
２２第１対物レンズ
２３ディッシュ
２４第２対物レンズ
２５コーナーキューブ
２６ λ／４波長板
３１光源
３２ａハーフミラー
３２ｂダイクロイックミラー
３３走査光学ユニット
４１第１瞳リレーレンズ
４２第２瞳リレーレンズ
Ｌレーザ光
Ｒ戻り光
Ｓ試料

Claims

試料に照射する照明光を発振する光源と、
前記照明光を偏光方向の異なる２つの偏光に分離する偏光分離素子と、
前記２つの偏光を前記試料の離間した２点に集光する第１対物レンズと、
前記試料を透過した前記２つの偏光を平行光に変換する第２対物レンズと、
この第２対物レンズを通過した前記２つの偏光を再帰反射させる再帰反射光学系と、
前記偏光分離素子に入射する前記照明光を直線偏光に変換し、前記再帰反射光学系で再帰反射して前記試料を透過した２つの偏光が干渉する偏光子と、
前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路から挿抜可能に移動する移動機構と、
第１のモードが設定されたときには前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路に挿入し、第２のモードが設定されたときには前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路から退避するように前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記移動機構は、前記偏光分離素子と前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系と前記偏光子とを前記照明光の光路と直交する方向に移動させ、
前記第１のモードおよび前記第２のモードのいずれが設定されていても、前記光源および前記第１対物レンズは同一の位置にあり、前記第２のモードが設定されているときに、前記第１対物レンズにより前記試料に前記照明光の焦点を結ぶことを特徴とする顕微鏡装置。
前記制御部に前記第１のモードが設定されたときには、前記光源からの前記照明光を前記試料に透過または反射し、前記試料からの戻り光を反射または透過するハーフミラーと、
前記制御部に前記第２のモードが設定されたときには、前記光源からの前記照明光の波長を透過または反射し、前記試料の蛍光の波長を反射または透過するダイクロイックミラーと、
を備え、
前記移動機構は、前記制御部に前記第１のモードが設定されたときには、前記ハーフミラーを前記照明光の光路に挿入し、前記制御部に前記第２のモードが設定されたときには、前記ダイクロイックミラーを前記照明光の光路に挿入すること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
前記試料の焦点の範囲内の光を通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記照明光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、
前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間に前記第２対物レンズの瞳位置をリレーする瞳リレーレンズ系を設けたこと
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。