JP5287566B2 - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、ピンホールおよびマイクロレンズを利用して共焦点効果を獲得するニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置に関する。

特開２００９−５３５７８号公報には、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置において、カバーガラスに基づく反射界面からの反射光を用いて自動合焦を行うための構成が開示されている。この構成では、対物レンズの焦点が反射界面に存在する場合にのみ、上記の反射光がニポウディスクのピンホールを通過する。このピンホールを通過した反射光の強度のピークを検索することにより反射界面の位置を検出し、自動合焦を可能としている。

特開２００９−５３５７８号公報

上記の共焦点顕微鏡装置では、ダイクロイックミラーで検焦光を反射させる構成を採用している。しかし、ダイクロイックミラーの透過波長における反射率は製造ロット等によるばらつきがあり、検焦光量が不安定になる。また、上記の共焦点顕微鏡装置では、観察光路内に検焦光を分離するための光学素子（ダイクロイックミラー）が挿入されるため、観察像の画質の低下を招くという問題がある。

本発明の目的は、観察像への悪影響がなく、安定した検焦光量を得ることができる共焦点顕微鏡装置を提供することにある。

本発明の共焦点顕微鏡装置は、ピンホールおよびマイクロレンズを利用して共焦点効果を獲得するニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置において、検焦光の反射光を前記ピンホールおよび前記マイクロレンズを順次、通過させる検焦光学系と、前記ピンホールを通過した観察光の光路を、前記観察光が前記マイクロレンズに到達する手前の位置で前記検焦光の反射光の光路から分離する分離手段と、前記検焦光学系を経由した前記検焦光の反射光の光量を検出する検出手段と、前記検出手段の検焦結果に応じて合焦を行う合焦装置と、を備えることを特徴とする。
この共焦点顕微鏡装置によれば、ピンホールおよびマイクロレンズを通過した検焦光の反射光の光量を検出するので、観察像への悪影響がなく、安定した検焦光量を得ることができる。

前記検焦光を前記マイクロレンズおよび前記ピンホールを順次、通過させ、試料に向けて照射する光路と、前記検焦光の反射光を戻す前記検焦光学系の光路とを互いに分離する分光手段を備えてもよい。

前記分光手段は偏光を利用して光路を分離してもよい。

前記検出手段は、有効画素領域が観察面の特定の領域に設定されるＣＣＤ素子を用いることで、ＣＣＤ素子の有効画素領域の位置に応じて、その領域に注目した合焦を行うことができる。

本発明の共焦点顕微鏡装置によれば、ピンホールおよびマイクロレンズを通過した検焦光の反射光の光量を検出するので、観察像への悪影響がなく、安定した検焦光量を得ることができる。

一実施形態の共焦点顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 対物レンズの焦点位置と受光器での光光量の関係を示す図。 検焦信号を検出する検出手段としてＣＣＤ素子を用いた構成例を示すブロック図。 観察像とＣＣＤ素子の有効画素領域との関係を示す図であり、（ａ）は有効画素領域を広くとった場合を示す図、（ｂ）および（ｃ）は有効画素領域を絞り込んだ場合を示す図。 光路の分離に偏光を利用した構成を示すブロック図。

以下、本発明による共焦点顕微鏡装置の一実施形態について説明する。

図１は本実施形態の共焦点顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。

図１に示すように、本実施形態の共焦点顕微鏡は、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置であり、共焦点スキャナ１と、対物レンズ３１を具備する蛍光顕微鏡３と、カメラ４とを備える。

共焦点スキャナ１は、アレイ状にピンホールが配置されたピンホールアレイディスク１１および同じパターンでマイクロレンズが配置されたマイクロレンズアレイディスク１２を備え、それらは連結ドラム１３で連結されるとともに、回転軸１４周りに一体的に回転可能とされている。ピンホールアレイディスク１１とマイクロレンズアレイディスク１２の間にはダイクロイックミラー１６が配置されている。ダイクロイックミラー１６は励起光束５１の波長を透過し、蛍光信号５２を反射させる特性を有する。

顕微鏡３は対物レンズ３１の焦点を調整する合焦装置３２を備える。後述するように、合焦装置３２は受光器２２の受光光量に基づいて対物レンズ３１の焦点を調整する。

次に、本実施形態の共焦点顕微鏡装置の動作について説明する。

励起光束５１はビームスプリッタ１５を透過し、マイクロレンズアレイディスク１２に照射される。ビームスプリッタ１５は入射光の９５％を透過し、５％を反射させる特性を有する。ビームスプリッタ１５を透過した励起光は、マイクロレンズアレイディスク１２に設けられた個々のマイクロレンズの作用によってダイクロイックミラー１６を透過した後、ピンホールアレイディスク１１の対応するピンホール上で焦点を結ぶ。

ピンホールアレイディスク１１を通過した励起光は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て、保持器６に保持された試料の焦点面上に焦点を結ぶ。

励起光を受けて、試料からは蛍光信号５２が発せられる。励起光により励起された蛍光信号５２は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て共焦点スキャナ１に戻り、ピンホールアレイディスク１１を通過し、ダイクロイックミラー１６で反射される。反射された蛍光信号５２はさらにリレーレンズ１７、バンドパスフィルタ１９、リレーレンズ２０を通過してカメラ４に導光される。このとき、バンドパスフィルタ１９は蛍光信号５２の大部分を透過させる。

ここで、マイクロレンズアレイディスク１２とピンホールアレイディスク１１を一体的に回転させると、ピンホールを通過する光が対応する焦点面上を走査し、さらに個々の蛍光は再び同じピンホールを通過した後に、カメラ４の撮像素子上を走査する。この動作によって焦点面の蛍光がカメラ４に投影されて観察が可能となる。また、この際に焦点面以外の光は、ピンホールをほとんど通過できないためにほとんどカメラ４に到達することができない。これによって、カメラ４は焦点面の光のみの共焦点画像を撮影することになる。

一方、保持器６により反射された検焦光の反射光５３は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て共焦点スキャナ１に戻り、ピンホールアレイディスク１１、ダイクロイックミラー１６、マイクロレンズアレイディスク１２を通過し、ビームスプリッタ１５においてその５％の光量が反射される。ビームスプリッタ１５で反射された検焦光の反射光５３は、バンドパスフィルタ２１を通過し、検出手段としての受光器２２に導光される。このとき、バンドパスフィルタ２１は反射光５３の大部分を透過させる。

なお、上記保持器６から受光器２２に至る検焦光の反射光５３の光路は検焦光学系を構成する。

図２は、対物レンズ３１の焦点位置と、受光器２２での受光光量の関係を示す図である。試料７は培養液７１に浸された状態で、保持器６を構成するカバーガラス６１上に置かれる。

図２に示すように、対物レンズ３１の焦点がカバーガラス６１の表面６１ａに合ったとき、反射光５３の受光光量が最も強くなる。焦点がずれれば、共焦点効果により反射光がピンホールアレイディスク１１のピンホールを通過できず、反射光の光量が急激に減少する。そして、対物レンズ３１の焦点がカバーガラス６１の裏面６１ｂに合った場合、反射光５３の受光光量が再び強くなる。このため、合焦装置３２によって対物レンズ３１の焦点を観察光軸方向に走査しつつ受光器２２の受光光量を取得し、光量のピークを検索することにより、対物レンズ３１がカバーグラス６１の表面６１ａあるいは裏面６１ｂに合焦した位置を検知できる。

したがって、カバーガラス６１の表面６１ａあるいは裏面６１ｂへの合焦状態を基準として、所定の距離だけ焦点を深くすることにより、対物レンズ３１を観察面へ合焦させることができる。例えば、図２の例では、カバーガラス６１の表面６１ａから観察面７２までの距離ｄ１またはカバーガラス６１の裏面６１ｂから観察面７２までの距離ｄ２だけ、焦点を移動させることで、観察面７２に合焦させることができる。

このように励起光を検焦光として使用することにより、観察と同時に合焦動作を行わせることができる。

図１に示すように、本実施形態では、励起光と検焦光とをビームスプリッタ１５により分光しているが、一般に、ビームスプリッタの反射率はばらつきが少なく安定しているため、安定した検焦信号を得ることができる。また、励起光と検焦光とを分光するための光学要素（ダイクロイックミラー等）を観察光路（ダイクロイックミラー１６からカメラ４までの間）に挿入する必要がなくなるため、蛍光信号の撮影画質が低下することを防止できる。

なお、上記実施形態では、検焦光として励起光を用いる例を示したが、他の波長の光を検焦光として用いてもよい。この場合、他の波長の光を励起光とともに試料に向けて照射することで、観察と同時に合焦動作を行わせることもできる。

図３は検焦信号を検出する検出手段としてＣＣＤ素子を用いた構成例を示すブロック図である。図３において、図１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図３の例では、図１の受光器２２に代えてＣＣＤ素子２３が用いられる。また、検焦光路中にリレーレンズ２４が挿入されている。

この場合、ビームスプリッタ１５で反射された検焦光の反射光５３は、バンドパスフィルタ２１、リレーレンズ２４を通過し、ＣＣＤ素子２３に導光される。このとき、バンドパスフィルタ２１は反射光５３の大部分を透過させる。

ＣＣＤ素子２３はその有効画素領域を自由に設定することが可能とされており、設定された有効画素領域における輝度値の平均値をアナログ信号あるいはデジタル信号として出力する。

図４は観察像とＣＣＤ素子２３の有効画素領域との関係を示す図である。

図４（ａ）の例では、ＣＣＤ素子２３の有効画素領域２３Ａをカメラ４による視野４Ａのほぼ全域にかかるように大きくとっている。この場合には、視野４Ａの全体に平均化された合焦を行うことができる。これに対し、図４（ｂ）および図４（ｃ）の場合には、ＣＣＤ素子２３の有効画素領域２３Ａを絞り込み、視野４Ａの一部の領域に設定している。これらの場合には、ＣＣＤ素子２３の有効画素領域２３Ａの位置に応じて、その領域に注目した合焦を行うことができる。

図５は光路の分離に偏光を利用した構成を示すブロック図である。図５において、図１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図５に示す構成では、図１におけるビームスプリッタ１５に代えて偏光ビームスプリッタ１５Ａを使用する。また、検焦光路上に１／４波長板２５を配置する。さらに、励起光５１として直線偏光の光を用いる。

直線偏光の励起光５１は、偏光ビームスプリッタ１５Ａおよび１／４波長板２５を介してマイクロレンズアレイディスク１２に照射される。偏光ビームスプリッタ１５Ａは励起光５１を透過する向きに設置され、偏光ビームスプリッタ１５Ａでは励起光５１の大部分が透過され、１／４波長板２５において励起光５１は円偏光となる。円偏光となった励起光５１は、マイクロレンズアレイディスク１２に設けられた個々のマイクロレンズの作用によってダイクロイックミラー１６を透過した後、ピンホールアレイディスク１１の対応するピンホール上で焦点を結ぶ。

ピンホールアレイディスク１１を通過した励起光は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て、保持器６に保持された試料の焦点面上に焦点を結ぶ。

励起光を受けて、試料からは蛍光信号５２が発せられる。励起光により励起された蛍光信号５２は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て共焦点スキャナ１に戻り、ピンホールアレイディスク１１を通過し、ダイクロイックミラー１６で反射される。反射された蛍光信号５２はさらにリレーレンズ１７、バンドパスフィルタ１９、リレーレンズ２０を通過してカメラ４に導光される。このとき、バンドパスフィルタ１９は蛍光信号５２の大部分を透過させる。

ここで、マイクロレンズアレイディスク１２とピンホールアレイディスク１１を一体的に回転させると、ピンホールを通過する光が対応する焦点面上を走査し、さらに個々の蛍光は再び同じピンホールを通過した後に、カメラ４の撮像素子上を走査する。この動作によって焦点面の蛍光がカメラ４に投影されて観察が可能となる。また、この際に焦点面以外の光は、ピンホールをほとんど通過できないためにほとんどカメラ４に到達することができない。これによって、カメラ４は焦点面の光のみの共焦点画像を撮影することになる。

一方、保持器６により反射された検焦光の反射光５３は、顕微鏡３の対物レンズ３１を経て共焦点スキャナ１に戻り、ピンホールアレイディスク１１、ダイクロイックミラー１６、マイクロレンズアレイディスク１２を通過する。さらに、反射光５３は１／４波長板２５により円偏光から直線偏光に変換される。このとき、直線偏光となった反射光５３の偏光方向は、共焦点スキャナ１に入射する励起光５１の偏光方向と直交しているため、反射光５３は偏光ビームスプリッタ１５Ａでそのほとんどが反射される。偏光ビームスプリッタ１５Ａで反射された検焦光の反射光５３は、バンドパスフィルタ２１を通過し、検出手段としての受光器２２に導光される。このとき、バンドパスフィルタ２１は反射光５３の大部分を透過させる。合焦動作の原理は、図１の構成と同様である。

図１の構成では、受光器２２に導光される光量は検焦光の反射光５３のうちの５％程度である。これに対し、図５の例では、反射光５３の光路を偏光ビームスプリッタ５１Ａによって励起光５１の光路から分離しているので、反射光５３の光量をほぼ１００％の比率で受光器２２に導くことができる。このため、Ｓ／Ｎ比の高い検焦信号を得ることができる。

以上説明したように、本発明の共焦点顕微鏡装置によれば、ピンホールおよびマイクロレンズを通過した検焦光の反射光の光量を検出するので、観察像への悪影響がなく、安定した検焦光量を得ることができる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ピンホールおよびマイクロレンズを利用して共焦点効果を獲得するニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。

１１ ピンホールアレイディスク（ピンホール）
１２ マイクロレンズアレイディスク（マイクロレンズ）
１５ ビームスプリッタ（分光手段）
１５Ａ 偏光ビームスプリッタ（分光手段）
２２ 受光器（検出手段）
２３ ＣＣＤ素子（検出手段）
６１ カバーガラス
６１ａ 表面
６１ｂ 裏面

Claims (4)

1. ピンホールおよびマイクロレンズを利用して共焦点効果を獲得するニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置において、
   検焦光の反射光を前記ピンホールおよび前記マイクロレンズを順次、通過させる検焦光学系と、
   前記ピンホールを通過した観察光の光路を、前記観察光が前記マイクロレンズに到達する手前の位置で前記検焦光の反射光の光路から分離する分離手段と、
   前記検焦光学系を経由した前記検焦光の反射光の光量を検出する検出手段と、
   前記検出手段の検焦結果に応じて合焦を行う合焦装置と、
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 前記検焦光を前記マイクロレンズおよび前記ピンホールを順次、通過させ、試料に向けて照射する光路と、前記検焦光の反射光を戻す前記検焦光学系の光路とを互いに分離する分光手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。
3. 前記分光手段は偏光を利用して光路を分離することを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置。
4. 前記検出手段は、有効画素領域が観察面の特定の領域に設定されるＣＣＤ素子を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡装置。