JP6035735B2

JP6035735B2 - 共焦点光スキャナおよび共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP6035735B2
Application number: JP2011279705A
Authority: JP
Inventors: 拓哉東
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: JP2013130684A

Description

本発明は、試料に照明光を走査させる共焦点光スキャナおよびこの共焦点光スキャナを備える共焦点顕微鏡に関するものである。

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光（照明光）を走査して試料を励起させて、試料から発生する蛍光を検出して観察を行う共焦点顕微鏡が従来から用いられている。共焦点顕微鏡には照明光を試料に走査するために共焦点光スキャナが具備されている。このような共焦点光スキャナの一例が特許文献１に開示されている。

ところで、観察対象としての試料には複数の情報が含まれている。例えば、共焦点顕微鏡を用いて試料を画像化したときに、試料には複数の波長成分の情報が含まれている。これを、波長成分ごとに分離して画像化を行う。そして、画像化した波長成分ごとの複数の画像情報を比較する。複数の画像情報は同時に取得されて、各画像情報の比較を行う。この種の光学的観測装置に関する技術が特許文献２に開示されている。

特許文献１で示される共焦点光スキャナは試料に照明光を走査させるための手段である。一方、特許文献２で示される光学的観測装置は試料の蛍光を複数の波長成分ごとの情報に分離して、複数の画像情報を同時に観察する手段である。よって、特許文献１の共焦点光スキャナと特許文献２の観測装置とは目的、構成および作用効果が異なる。

従って、共焦点画像を取得すると同時に、複数の画像情報を同時に観察するためには、共焦点光スキャナと光学的観測装置との両者を使用して共焦点顕微鏡を構成する。この共焦点顕微鏡の具体的一例を示しているのが図４である。

図４において、共焦点顕微鏡１０１は、光源装置１０２と共焦点光スキャナ１０３と対物レンズ１０４とディッシュ１０５と視野分割光学系１０６とカメラ１０７とを備えて構成している。光源装置１０２は観察対象としての試料Ｓを励起させる波長を持つ照明光Ｌを発振する。

共焦点光スキャナ１０３は照明光Ｌを試料Ｓに走査させるための手段であり、特許文献１の共焦点光スキャナに相当する。対物レンズ１０４はディッシュ１０５に搭載されている試料Ｓに照明光Ｌの焦点を結ばせる。試料Ｓに照明光Ｌの焦点が結ばれることにより、試料Ｓが励起されて蛍光する。この蛍光が戻り光Ｒとなる。

視野分割光学系１０６は、試料Ｓに含まれる複数の波長成分ごとの情報に分離して観察を行う特許文献２の光学的観測装置に相当する。この視野分割光学系１０６は共焦点光スキャナ１０３とは別個独立の装置として構成される。視野分割光学系１０６では、戻り光Ｒを２つの戻り光Ｒ１、Ｒ２に分離する。そして、戻り光Ｒ１、Ｒ２をカメラ１０７の異なる位置に結像させる。

共焦点光スキャナ１０３の詳細について説明する。この共焦点光スキャナ１０３は、光走査ユニット１１１とビームスプリッタ１１２と結像レンズ１１３とを備えて構成している。光走査ユニット１１１は照明光Ｌを試料Ｓに走査させるために設けており、ピンホールディスク１１４とモータ１１５とを備えて構成している。

ピンホールディスク１１４は円盤状の回転ディスクであり、多条且つ螺旋状に複数のピンホールを配列している。このピンホールを照明光Ｌおよび戻り光Ｒが通過することにより、焦点面以外の光を排除することができ、光軸方向に分解能の高い共焦点画像を生成することができる。モータ１１５はピンホールディスク１１４に回転力を付与する。

ビームスプリッタ１１２は波長によって透過と反射とを分けるダイクロイックミラーである。このビームスプリッタ１１２は照明光Ｌの波長の光を透過し、戻り光Ｒの波長の光を反射する光学特性を有している。結像レンズ１１３は戻り光Ｒを視野分割光学系１０６に結像させるレンズである。

視野分割光学系１０６について説明する。視野分割光学系１０６は、視野絞り１２１と第１リレーレンズ１２２と分光ミラー１２３と第１ミラー１２４と第２ミラー１２５と合流ミラー１２６と第２リレーレンズ１２７とを備えて構成している。

視野絞り１２１は結像レンズ１１３の結像面に配置されており、戻り光Ｒの視野を絞る。第１リレーレンズ１２２は視野絞り１２１により視野が絞られた戻り光Ｒをリレーするために設けている。分光ミラー１２３は所定未満の波長（短波長）の光を透過し、所定以上の波長（長波長）の光を反射するダイクロイックミラーである。

分光ミラー１２３により戻り光Ｒは第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とに分離される。第１戻り光Ｒ１（図中の実線）の光路に第１ミラー１２４を配置している。第２戻り光Ｒ２（図中の破線）の光路に第２ミラー１２５を配置している。そして、第１ミラー１２４により反射された第１戻り光Ｒ１と第２ミラー１２５により反射された第２戻り光Ｒ２とが合流する位置に合流ミラー１２６を設けている。

ただし、第１ミラー１２４と第２ミラー１２５との反射角度は調整がされており、合流ミラー１２６において第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２との光路は完全に同一にはならない。合流ミラー１２６により合流された第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とは第２リレーレンズ１２７によりカメラ１０７に結像される。

次に、動作について説明する。光源装置１０２より発振された照明光Ｌは共焦点光スキャナ１０３に入射する。このときに、モータ１１５は回転力を付与しており、ピンホールディスク１１４を高速回転させている。ピンホールディスク１１４には多条且つ螺旋状に多数のピンホールが配列されていることから、試料Ｓの所定領域に照明光Ｌが高速に走査される。

ピンホールディスク１１４を通過した照明光Ｌは対物レンズ１０４によりディッシュ１０５に搭載されている試料Ｓに焦点を結ぶ。これにより、試料Ｓが励起されて蛍光し、これが戻り光Ｒとなる。この戻り光Ｒは対物レンズ１０４によりピンホールディスク１１４のピンホールに集光して通過する。通過した戻り光Ｒはビームスプリッタ１１２に入射する。

ビームスプリッタ１１２は蛍光の波長を反射するため、戻り光Ｒは反射する。反射した戻り光Ｒは結像レンズ１１３により視野絞り１２１に結像する。視野絞り１２１は戻り光Ｒの視野を絞る。戻り光Ｒの像の視野を絞ることにより、カメラ１０７に第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２が受光されたときに、両者が重なり合わないようにする。

視野が絞られた戻り光Ｒは分光ミラー１２３で分光される。ここでは、戻り光Ｒは短波長の第１戻り光Ｒ１と長波長の第２戻り光Ｒ２とに分離される。短波長の第１戻り光Ｒ１は青色を主成分とした光になり、長波長の第２戻り光Ｒ２は赤色を主成分とした光になる。

第１戻り光Ｒ１は第１ミラー１２４により反射する。第２戻り光Ｒ２は第２ミラー１２５により反射する。そして、合流ミラー１２６により合流される。このとき、第１ミラー１２４の反射角および位置並びに第２ミラー１２５の反射角および位置を調整する。

合流ミラー１２６により第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とが合流する。このとき、第１ミラー１２４の反射角および位置並びに第２ミラー１２５の反射角および位置は、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２との光路が完全に同一とならないように調整している。

よって、第２リレーレンズ１２７により、第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２はカメラ１０７の受光領域に結像するが、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とでは結像位置が異なる。これにより、短波長の第１戻り光Ｒ１と長波長の第２戻り光Ｒ２とを分けて検出することができる。

前述したように、ピンホールディスク１１４を回転させることで、照明光Ｌは試料Ｓを走査されるため、第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２もカメラ１０７の受光領域に走査される。これにより、試料Ｓの波長成分ごとの情報を異なる画像情報として生成することができる。従って、波長成分ごとに異なる画像情報を比較観察することができるようになる。

米国特許第４，９２７，２５４号明細書特開平２−６１６１０号公報

前述したように、共焦点光スキャナ１０３と視野分割光学系１０６とは目的、構成および作用効果が全く異なる装置になる。従って、共焦点画像を生成し、且つ試料Ｓに含まれる複数の情報ごとに観察を行いたい場合には、共焦点光スキャナ１０３の後段側に視野分割光学系１０６を配置して、両装置を使用して、共焦点画像の生成および情報（波長成分）ごとの画像情報の生成を行う。

共焦点光スキャナ１０３が共焦点画像を取得することだけを目的とする場合には、共焦点光スキャナ１０３の戻り光Ｒの出力側にカメラ１０７を設ける。つまり、図４の視野絞り１２１の位置にカメラ１０７を配置する。そして、光走査ユニット１１１によりカメラ１０７に戻り光Ｒを走査させて、試料Ｓの画像生成を行う。

このときに、試料Ｓに含まれる複数の波長成分の情報ごとに観察を行う場合には、共焦点光スキャナ１０３の出射側に視野分割光学系１０６を配置する必要がある。共焦点画像を生成するだけの場合は、結像レンズ１１３の結像位置にカメラ１０７を配置させるが、前記の観察を行なう場合には、結像位置に視野分割光学系１０６を配置しなければならない。このため、視野分割光学系１０６で戻り光Ｒの像を中間像として結像させなければならない。

前記の観察を行なう場合には、カメラ１０７に結像する第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２との像が重ならないように視野を絞る必要がある。このため、結像レンズ１１３により結像される中間像としての結像位置に視野絞り１２１を配置している。

視野絞り１２１において中間像を形成した戻り光Ｒは第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とを分割する各光学系並びに一対の第１リレーレンズ１２２、第２リレーレンズ１２７によりリレーがされる。従って、中間像をこれらの光学系を介してカメラ１０７に結像させていることから、最終的にカメラ１０７に結像される第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２の光量損失が大きくなる。

この光量損失が大きくなることにより、カメラ１０７から得られる第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２の画像情報のＳ／Ｎ比が低下し、画質も劣化する。また、共焦点光スキャナ１０３と視野分割光学系１０６とをそれぞれ別個の装置として配置しており、共焦点光スキャナ１０３も視野分割光学系１０６もそれぞれ光学系となっていることから、光学系が複雑になり、また装置構成も大型になる。

図４に示すように、共焦点光スキャナ１０３と視野分割光学系１０６とを別個独立の装置として配置していることから、視野絞り１２１は視野分割光学系１０６に配置されている。つまり、視野を絞る対象は戻り光Ｒになる。この戻り光Ｒの視野を絞ることにより、カメラ６の受光領域における第１戻り光Ｒ１の像と第２戻り光Ｒ２の像とが重複しないようにすることができる。

このとき、視野を絞る対象となる光は戻り光Ｒであり、照明光Ｌではない。照明光Ｌは試料Ｓの撮像範囲内に照射することで、カメラ１０７により画像化を行うが、試料Ｓの撮像範囲外の部位に照明光Ｌが照射されることがある。当該部位に照明光Ｌが照射されると、光ダメージや退色が発生するという問題を生じる。

また、図４に示すように、視野分割光学系１０６に有限遠補正光学系を適用した場合、特に第１リレーレンズ１２２および第２リレーレンズ１２７に有限遠補正光学系を適用した場合、第１ミラー１２４および第２ミラー１２５の角度および位置を極めて高精度に光学的に調整しなければ、結像性能が大幅に低下する。これにより、生成される画像の劣化が著しくなる。

仮に、極めて高精度に光学的に調整をしたとしても、それでもなお色収差等を発生し、カメラ１０７に結像する第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２の結像性能が低下する。これにより、画質劣化を招来する。このため、視野分割光学系１０６の光学系の調整作業が著しく煩雑になるだけでなく、生成される画像情報が劣化する問題を生じる。

そこで、本発明は、共焦点光スキャナを用いて、試料に含まれる情報ごとに観察を行うことを可能にし、高画質な画像生成を行い、且つ試料に対するダメージを軽減し、光学系の調整を簡単にすることを目的とする。

以上の課題を解決するため、本発明の共焦点光スキャナは、試料に照射して前記試料を蛍光させる照明光を通過させる複数の開口部を有し、この開口部を通過した前記照明光を前記試料に走査させる光走査ユニットと、前記試料に含まれる複数の情報を前記蛍光の経路で前記情報ごとに分離させる光分離手段と、この光分離手段により分離された前記蛍光の光路を異なる位置で結像させるための光路変換手段と、分離された前記蛍光を合流させる光合流手段と、前記照明光の光路に設けられる前記照明光の視野を絞る視野絞り手段と、前記蛍光を平行光に変換するリレーレンズと、を備え、前記蛍光は結像を形成せずに前記リレーレンズを経由し、前記平行光として前記光分離手段に入射することを特徴とする。

この共焦点光スキャナによれば、共焦点画像を得ることができると共に、試料に含まれる複数の情報ごとに試料の観察を行うことができる。これにより、中間像をリレーさせる必要がないことから、光量損失を抑制することができ、高画質の画像生成を行うことができる。また、視野の絞りは照明光の段階で行うため、試料に対する観察対象以外の部位のダメージを低減できる。さらに、装置構成も単純化する。

また、前記視野絞り手段を、前記光走査ユニットから出射した前記照明光の光路のうち前記光走査ユニットに近接した位置に設けたことを特徴とする。

試料からの戻り光は対物レンズにより光走査ユニットに結像されるが、この結像位置に近接した位置に視野絞り手段を設けることができる。これにより、視野絞りの効果を高くすることができる。

また、前記視野絞り手段は、平行光となっている前記照明光の光束形状を細径化する光束形状変換手段であることを特徴とする。

照明光が平行光になっている段階で光束形状を細径化することで、視野を絞ることができる。照明光が平行光になっている位置であれば任意の位置に配置できることから、光束形状変換手段の配置の自由度が向上する。また、絞り羽根やビームエキスパンダ等の様々な光学部品を使用することができる。

また、前記光分離手段の前段および前記光合流手段の後段に無限遠補正光学系である一対のリレーレンズを備えていることを特徴とする。

無限遠補正光学系のリレーレンズを配置することで、光学系の調整が簡単になると共に、色収差等の問題を抑制することができるため、画像劣化を防止することができる。これにより、高画質の画像生成を行うことができる。

また、前記情報がＮ（Ｎは２以上の整数）個のときには、（Ｎ−１）個の前記光分離手段と（Ｎ−１）個の前記光合流手段とを備えていることを特徴とする。

観察する試料の情報が多い場合には、それに応じた光分離手段と光合流手段とを設けることで、多くの情報ごとの画像情報を得ることができ、各画像情報の比較を行うことができる。

また、前記光走査ユニットは、前記複数の開口部を多条且つ螺旋状に配列した開口部ディスクと、前記開口部に前記照明光を集光する集光素子を前記開口部と同じパターンで配列した集光ディスクと、前記開口部ディスクと前記集光ディスクとを一体的に回転させる回転モータと、を備えていることを特徴とする。

開口部ディスクの開口部と同一パターンの集光素子を配列した集光ディスクを用いることで、照明光を開口部に集光させることができ、Ｓ／Ｎ比に優れた高画質の画像生成を行うことができる。同時に、開口部ディスクおよび集光ディスクを高速回転させることで、高速に画像生成を行うことができる。

また、本発明の共焦点顕微鏡は、前述のうち何れか１つの共焦点光スキャナを有する共焦点顕微鏡であって、前記照明光を発振する光源と、前記共焦点光スキャナと、前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、前記蛍光を検出する検出部と、を備えていることを特徴とする。

前述した共焦点光スキャナは共焦点顕微鏡に使用することができる。視野分割光学系を使用していないことから、共焦点顕微鏡の光学構成を小型且つ単純化することができる。

本発明は、共焦点画像を得ることができると共に、試料に含まれる複数の情報ごとに試料の観察を行うことができる。これにより、中間像をリレーさせる必要がないことから、光量損失を抑制することができ、高画質の画像生成を行うことができる。また、視野の絞りは照明光の段階で行うため、試料に対する観察対象以外の部位のダメージを低減できる。さらに、装置構成も単純化する。

実施形態の顕微鏡装置の構成図である。変形例１の顕微鏡装置の構成図である。変形例２の顕微鏡装置の構成図である。従来の顕微鏡装置の構成図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。図１は本実施形態の共焦点顕微鏡１でる。共焦点顕微鏡１は蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料Ｓに照明光Ｌを照射して励起させて、蛍光させる。そして、この蛍光を戻り光Ｒとして観察することで、試料Ｓの観察を行う。図１の共焦点顕微鏡１は光源装置２と共焦点光スキャナ３と対物レンズ４とディッシュ５とカメラ６とを備えて構成している。

光源装置２は照明光Ｌを発振する。照明光Ｌは試料Ｓを励起させる波長を持つ光であり、例えばレーザ光を使用することができる。光源装置２から発振した照明光Ｌは平行光になっている。なお、光源装置２から発振する照明光Ｌは拡散光（または収束光）として、図示しないコリメートレンズを挿入して照明光Ｌを平行光にしてもよい。

共焦点光スキャナ３は照明光Ｌをディッシュ５に搭載されている試料Ｓに走査させて、共焦点画像を生成する。共焦点光スキャナ３は共焦点画像を生成するための機能だけでなく、従来技術で説明した視野分割光学系の機能も併せ持つ。対物レンズ４は共焦点光スキャナ３から出射した照明光Ｌを試料Ｓに焦点を結ばせる。カメラ６は蛍光（戻り光Ｒ）を検出する検出部であり、所定の受光領域を有している。受光された戻り光Ｒは光電変換されて、所定の画像処理を行うことで、試料Ｓの画像を生成する。

共焦点光スキャナ３は、光走査ユニット１１と視野絞り１２とビームスプリッタ１３と第１リレーレンズ１４と分光ミラー１５と第１ミラー１６と第２ミラー１７と合流ミラー１８と第２リレーレンズ１９とを有して構成している。また、光走査ユニット１１はピンホールディスク２０とモータ２１とを有して構成している。

光走査ユニット１１は照明光Ｌが入射する位置に配置されている。ピンホールディスク２０は複数のピンホール（開口部）を形成している開口部ディスクである。所謂ニポウディスク方式の共焦点光スキャナとしてピンホールディスク２０を用いる場合には、ピンホールディスク２０に形成されるピンホールは多条且つ螺旋状に配列される。勿論、ニポウディスク方式の共焦点光スキャナには限定されず、その場合にはピンホールの配列パターンは多条且つ螺旋状でなくてもよい。

ピンホールディスク２０に配列されるピンホールは開口部であり、照明光Ｌおよび戻り光Ｒを通過させる。開口部を通過した照明光Ｌおよび戻り光Ｒは試料Ｓの焦点面以外の光が排除される。これにより、光軸方向に分解能の高い共焦点画像を生成するための共焦点光スキャナとして使用することができる。

モータ２１はピンホールディスク２０に回転力を付与する回転モータであり、モータ２１の回転力によりピンホールディスク２０が回転する。これにより、試料Ｓの所定領域に照明光Ｌを走査させることができる。

光走査ユニット１１、特にピンホールディスク２０に近接した位置に視野絞り１２を配置している。視野絞り１２は照明光Ｌの視野の像を絞るために設けた視野絞り手段である。対物レンズ４の結像面はピンホールディスク２０になるため、視野絞り１２も結像面にできる限り近接した位置、つまりピンホールディスク２０に近接した位置に配置することが望ましい。

ビームスプリッタ１３は照明光Ｌの波長の光を透過し、戻り光Ｒの波長の光を反射する透過反射特性を持つ光学部品である。ビームスプリッタ１３としては主にダイクロイックミラーが適用される。従って、照明光Ｌはビームスプリッタ１３を透過するが、戻り光Ｒはビームスプリッタ１３で反射する。

ビームスプリッタ１３で反射した戻り光Ｒの光路に第１リレーレンズ１４を設けている。第１リレーレンズ１４に入射する戻り光Ｒは拡散光になっているが、第１リレーレンズ１４により平行光になる。つまり、第１リレーレンズ１４は無限遠補正光学系のレンズを使用している。そして、平行光となった戻り光Ｒが分光ミラー１５に入射する。

分光ミラー１５は戻り光Ｒを第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とに分離する光分離手段である。分光ミラー１５としては、波長に応じて透過と反射とを分けるダイクロイックミラーや偏光成分に応じて透過と反射とを分ける偏光ビームスプリッタ等を適用することができる。

図１において、第１戻り光Ｒ１は実線で示しており、第２戻り光Ｒ２は破線で示している。第１ミラー１６は直角或いはほぼ直角に第１戻り光Ｒ１を反射させ、第２ミラー１７は直角或いはほぼ直角に第２戻り光Ｒ２を反射させる。第１ミラー１６および第２ミラー１７は角度調整が可能になっており、第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２の反射方向を調整することができる。第１ミラー１６および第２ミラー１７は光路変換手段として機能する。

合流ミラー（合波ミラー）１８は第１戻り光Ｒ１を反射し、第２戻り光Ｒ２を透過する光学特性を有する光合流手段である。合流ミラーとしては、分光ミラー１５と同じく、波長に応じて透過と反射とを分けるダイクロイックミラーや偏光成分に応じて透過と反射とを分ける偏光ビームスプリッタ等を適用することができる。ただし、合流ミラー１８の透過反射特性は分光ミラー１５とは逆の透過反射特性を持つ。

第２リレーレンズ１９は合流ミラー１８で合流した第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とをカメラ６の受光領域に結像させる。第２リレーレンズ１９は無限遠補正光学系のレンズを使用しており、第１リレーレンズ１４と第２リレーレンズ１９とにより一対の無限遠補正光学系のリレーレンズを構成する。なお、ディッシュ５に搭載されている試料Ｓとピンホールディスク２０とカメラ６とは光学的に共役となる位置関係に配置している。

以上が構成である。次に、動作について説明する。試料Ｓには複数の情報が含まれている。例えば、波長成分ごとの情報や偏光成分ごとの情報等である。単一の戻り光Ｒをカメラ６に結像させると、複数の波長成分や偏光成分が含まれている試料Ｓの画像が生成される。そこで、波長成分や偏光成分ごとに分けて試料Ｓの画像生成を観察することで、波長成分ごと或いは偏光成分ごとの試料Ｓの画像情報を比較することができる。

以下においては、１つの試料Ｓの画像情報として、所定波長未満の短波長の画像情報（主に青色成分が多い画像情報）と所定波長以上の長波長の画像情報（主に赤色成分が多い画像情報）とを分離して、画像情報を生成する。短波長の画像情報（第１の画像情報）は第１の戻り光Ｒ１により生成され、長波長の画像情報（第２の画像情報）は第２の戻り光Ｒ３により生成される。

短波長の画像情報と長波長の画像情報とを分離するためには、通常、戻り光Ｒを分離する光分離光学系（図４の視野分割光学系に相当）が使用されるが、本実施形態では、光軸方向に高い分解能を持つ共焦点画像を生成するための共焦点光スキャナとしての機能に前記の光分離光学系の機能を追加している。以下、具体的に説明する。

まず、光源装置２から照明光Ｌを発振する。照明光Ｌは平行光として光走査ユニット１１に入射する。光走査ユニット１１ではモータ２１がピンホールディスク２０を高速回転させている。ピンホールディスク２０には多数のピンホールが多条且つ螺旋状に配列されており、ピンホールを照明光Ｌが通過することで、ディッシュ５に搭載されている試料Ｓに照明光Ｌが走査される。

ピンホールを通過した照明光Ｌは視野絞り１２により視野が絞られて、対物レンズ４に入射する。そして、対物レンズ４により試料Ｓに焦点を結ぶ。試料Ｓに焦点を結んだ照明光Ｌは視野絞り１２により視野が絞られている。従って、撮像範囲外の部位に照明光Ｌが照射されることはない。試料Ｓに照明光Ｌの焦点が結ばれることで、試料Ｓは蛍光する。この蛍光が戻り光Ｒとなる。戻り光Ｒは再び対物レンズ４に入射して、視野絞り１２を経由して、ピンホールを通過する。そして、ビームスプリッタ１３に入射する。

ビームスプリッタ１３は蛍光の波長を反射する。よって、戻り光Ｒはビームスプリッタ１３で反射する。反射した戻り光Ｒは拡散光となって第１リレーレンズ１４に入射して、平行光になる。この平行光となった戻り光Ｒが分光ミラー１５に入射する。

分光ミラー１５は前述した短波長の光を透過し、長波長の光を反射する反射透過特性を有している。これにより、戻り光Ｒは短波長の第１戻り光Ｒ１と長波長の第２戻り光Ｒ２とに分離される。このうち、第１戻り光Ｒ１は第１ミラー１６に入射し、第２戻り光Ｒ２は第２ミラー１７に入射する。

第１ミラー１６は第１戻り光Ｒ１をほぼ直角に反射し、第２ミラー１７は第２戻り光Ｒ２をほぼ直角に反射する。従って、合流ミラー１８で第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とは合流する。ただし、第１戻り光Ｒ１の光路と第２戻り光Ｒ２の光路とが完全に一致しないように、光路変換手段としての第１ミラー１６および第２ミラー１７の角度調整を行っている。

従って、第２リレーレンズ１９によりカメラ６に第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とが結像されるが、その結像位置は第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とで異なる位置になる。つまり、同時に試料Ｓを蛍光させて観察を行うときに、短波長の第１戻り光Ｒ１と長波長の第２戻り光Ｒ２とはカメラ６の受光領域の異なる位置に結像する。

これにより、カメラ６は第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とを個別的に検出することができる。そして、ピンホールディスク２０を回転させていることで、照明光Ｌは試料Ｓの所定領域を走査している。これに伴い、第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２もカメラ６の受光領域に走査される。

従って、走査された第１戻り光Ｒ１および第２戻り光Ｒ２に基づいて、所定の画像処理を行うことで、試料Ｓの画像生成を行うことができる。このとき、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とはカメラ６の受光領域の異なる位置に結像することから、第１戻り光Ｒ１に基づく画像情報（第１画像情報）と第２戻り光Ｒ２に基づく画像情報（第２画像情報）との２つの画像情報を取得することができる。

第１画像情報は試料Ｓの短波長の波長領域の画像情報であり、第２画像情報は試料Ｓの長波長の波長領域の画像情報である。従って、第１画像情報と第２画像情報とは異なる画像情報になる。これにより、第１画像情報と第２画像情報とを比較することが可能になる。

前述したように、本実施形態では、共焦点画像を生成するための共焦点光スキャナ３に、第１画像情報および第２画像情報を生成するための光分離光学系（図４の視野分割光学系に相当）の機能を持たせている。つまり、共焦点光スキャナ３の機能（光軸方向に高い分解能の共焦点画像を生成する機能）と光分離光学系の機能とを１つの共焦点光スキャナ３の装置で実現している。

図１に示すように、試料Ｓが蛍光した戻り光Ｒはビームスプリッタ１３で反射される。共焦点画像を生成するだけであれば、図４に示したようにビームスプリッタ１３で反射した戻り光Ｒの光路に結像レンズを配置する。そして、結像レンズによりカメラに戻り光Ｒを結像させる。これにより、共焦点画像を生成することができる。

ただし、本実施形態の共焦点光スキャナ３は光分離光学系の機能を有している。よって、結像レンズを用いることなく、ビームスプリッタ１３で反射した戻り光Ｒは第１リレーレンズ１４にそのまま入射させることができる。これにより、図４で示した結像レンズにより中間像を形成させる必要がなくなる。これは、光分離光学系を共焦点光スキャナ３の一部としているためである。

中間像を形成させる必要がなくなることから、中間像をリレーさせる必要がなくなる。このため、中間像をリレーさせる場合と比較して光量損失の低下を大幅に低減させることができる。これにより、カメラ６により生成される第１画像情報と第２画像情報との画像劣化を少なくすることができ、高画質の画像生成を行うことができる。

第１画像情報と第２画像情報とを取得するためには、カメラ６に結像される第１戻り光Ｒ１の像と第２戻り光Ｒ２の像とが重複しないようにしなければならない。このために、視野絞り１２を照明光Ｌの光路、ここでは対物レンズ４の結像面である光走査ユニット１１のピンホールディスク２０に近接した位置に配置している。

これにより、第１画像情報と第２画像情報とを明確に分けることができ、それぞれを高画質の画像情報として観察することができる。また、その比較を行うこともできる。つまり、正確な画像情報の比較を行うことができる。

本実施形態の共焦点光スキャナ３は共焦点光スキャナとして機能すると同時に、光分離光学系としても機能することは既に述べたとおりである。これにより、共焦点光スキャナと光分離光学系とを別個独立の装置として設けた場合と比較して、装置構成を大幅に小型且つ単純にすることができる。例えば、単なる共焦点光スキャナとして機能させる場合には、結像レンズは必須構成要素であるが、本実施形態の共焦点光スキャナ３はこれを省略することができる。従って、光学系の単純化を図ることができ、光学調整も容易になる。

そして、第１画像情報と第２画像情報とを明確に分けるために、視野絞り１２を設けているが、これを照明光Ｌの光路に設けている。このため、画像化を行う試料Ｓの撮像範囲外に照明光Ｌが照射されることがなく、試料Ｓに対する光ダメージや退色といった問題を回避することができる。

また、本実施形態では、第１リレーレンズ１４および第２リレーレンズ１９に無限遠補正光学系のレンズを使用している。これにより、第１ミラー１６および第２ミラー１７の角度調整を簡単に行うことができ、位置調整を行う必要はない。また、ミラーの角度調整を行ってもピントがずれることがない。従って、極めて簡単に光学調整を行うことができる。また、無限遠補正光学系のレンズを使用していることで、色収差等を抑制することができる。従って、第１画像情報および第２画像情報を高画質にすることができる。これにより、良好に画像情報の比較を行うことができる。

また、光走査ユニット１１のモータ２１がピンホールディスク２０を高速回転させることで、照明光Ｌは試料Ｓの所定範囲を高速に走査させることができ、これにより第１画像情報および第２画像情報を高速に生成することができる。

以上において、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とをカメラ６の受光領域の異なる位置に結像させるために、第１ミラー１６および第２ミラー１７の角度調整を行っていたが、第１ミラー１６または第２ミラー１７の何れかの角度調整を行うようにしてもよい。また、第１ミラー１６および第２ミラー１７の角度調整を行わず、光分離手段としての分光ミラー１５および／または光合流手段としての合流ミラー１８の角度調整を行うようにしてもよい。この場合は、光路変換手段は、光分離手段および／または光合流手段の角度調整を行う。

なお、ピンホールディスク２０は多条且つ螺旋状にピンホールを配列したものを例示したが、共焦点セクショニング効果を得ることができれば、ピンホールの共焦点開口は任意の形状とすることができる。例えば、複数のスリット開口が形成されたスリットディスクやトニーウィルソンディスク（エンコードを行うための輝度変調を利用したディスク）等を用いてもよい。

次に、変形例１について説明する。図２は、変形例１の共焦点顕微鏡１を示しており、前述した実施形態と異なっているのは、分光ミラーが第１分光ミラー３１と第２分光ミラー３２との２つを設けている点、同様に合流ミラーが第１合流ミラー３３と第２合流ミラー３４との２つを設けている点である。

本変形例１では、試料Ｓに含まれる３つの異なる波長成分の情報ごとに画像情報を生成する。ここでは、短波長、中間波長、長波長との３つの異なる波長に分解する。短波長は青色成分を主要成分とする波長であり、中間波長は緑色成分を主要成分とする波長であり、長波長は赤色成分を主要成分とする波長である。

試料Ｓに照明光Ｌを照射することにより戻り光Ｒが発生し、この戻り光Ｒは第１リレーレンズ１４から第１分光ミラー３１に入射する。第１分光ミラー３１は短波長の第１戻り光Ｒ１および中間波長の第３戻り光Ｒ３を透過し、長波長の第２戻り光Ｒ２を反射する。第２分光ミラー３２は短波長の第１戻り光Ｒ１を透過し、中間波長の第３戻り光Ｒ３を反射する。

第１分光ミラー３１および第２分光ミラー３２には、前記の透過反射特性を持つダイクロイックミラーを適用することができる。第１分光ミラー３１および第２分光ミラー３２により、戻り光Ｒは、短波長の第１戻り光Ｒ１、中間波長の第３戻り光Ｒ３、長波長の第２戻り光Ｒ２の３つの光に分離される。図２の実線は第１戻り光Ｒ１を示し、一点鎖線は第３戻り光Ｒ３を示し、二点鎖線は第２戻り光Ｒ２を示している。

長波長の第２戻り光Ｒ２は第２ミラー１７で反射する。そして、第１合流ミラー３３を透過する。中間波長の第３戻り光Ｒ３は第１合流ミラー３３で反射する。一方、短波長の第１戻り光Ｒ１は第１ミラー１６で反射して、第２合流ミラー３４で反射する。中間波長の第３戻り光Ｒ３および長波長の第２戻り光Ｒ２は第２合流ミラー３４を透過する。

第１合流ミラー３３および第２合流ミラー３４により、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２と第３戻り光Ｒ３とが合流する。第１合流ミラー３３および第２合流ミラー３４には前記のような反射透過特性を持つダイクロイックミラーを適用することができる。

このとき、第１ミラー１６と第２ミラー１７と第１分光ミラー３１（第２分光ミラー３２でもよい）との角度調整を行うことにより、第２合流ミラー３４で合流した第１戻り光Ｒ１、第２戻り光Ｒ２、第３戻り光Ｒ３は完全に同一の光路になることはなく、僅かに光路を異ならせるようにする。

これにより、第２リレーレンズ１９によりカメラ６に結像したときの第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２と第３戻り光Ｒ３との結像位置を異ならせることができる。このため、３つの異なる波長情報ごとに画像情報を生成することができる。このときに、照明光Ｌの光路に視野絞り１２を配置していることから、カメラ６の受光領域において第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２と第３戻り光Ｒ３とが重なり合うことがなくなる。従って、３つの異なる波長成分の情報ごとの画像情報の比較を行うことができる。

ここでは、波長によって戻り光Ｒを分離していたが、３つに分離していたが、４つ以上に分離してもよい。戻り光ＲをＮ（Ｎは２以上の整数）個の波長情報ごとの画像情報として取得する場合には、（Ｎ−１）個の分光ミラーと（Ｎ−１）個の合流ミラーとを設けるようにする。また、戻り光Ｒの分離は、波長成分ごとではなく、偏光成分ごとに分離してもよい。

従って、本変形例１では、前述した実施形態の効果を得ると同時に、３つ以上の波長成分や偏光成分の情報ごとに画像情報を生成することができ、これらを観察して比較することが可能になる。

次に、図３を参照して、変形例２について説明する。変形例２の共焦点顕微鏡１は前述した実施形態と同じく、戻り光Ｒを第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とに分離して、カメラ６の異なる位置に結像させる。図１の実施形態と異なるのは、視野絞り１２に代替して、照明絞り４１を設けている。また、光走査ユニット１１に集光ディスク４２を設けている。なお、カメラ６の位置が図１と異なっているが、これは合流ミラー１８の特性を変更しているためで、合流ミラー１８の特性を変更しなければ図１に示した位置にカメラ６を配置してもよい。

照明絞り４１は光源装置２から発振した照明光Ｌの光束形状を細径化する光束形状変換手段である。光源装置２から発振した照明光Ｌは平行光になっており、或いは図示しないコリメートレンズにより平行光になっており、この照明光Ｌの光路に照明絞り４１を配置する。

照明絞り４１は平行光の照明光Ｌの照明範囲を絞る機能を有している。つまり、照明絞り４１は実質的に視野絞りとして機能している。照明絞り４１としては絞り羽根やビームエキスパンダ等のように光束形状を変化させる機能を持つ部品を使用することができる。従って、照明絞り４１を通過することにより、照明光Ｌの光束形状は細径化する。この細径化した照明光Ｌは光走査ユニット１１に入射する。

光走査ユニット１１は、ピンホールディスク２０とモータ２１と集光ディスク４２とを有して構成している。集光ディスク４２はピンホールディスク２０と同じく円盤状の回転ディスクであり、ピンホールディスク２０と同じパターンで集光素子が多条且つ螺旋状に配列されている。そして、モータ２１は集光ディスク４２とピンホールディスク２０とを一体的に回転させる。

集光素子（マイクロレンズ）は、この集光素子に対応するピンホールに照明光Ｌを集光させる。そして、ピンホールを通過した照明光Ｌが対物レンズ４により試料Ｓで焦点を結ぶ。これにより、試料Ｓが励起されて蛍光して、戻り光Ｒが発生する。このとき、集光ディスク４２とピンホールディスク２０とは一体的に高速回転することから、照明光Ｌは試料Ｓの所定領域を高速に走査される。

試料Ｓの蛍光（戻り光Ｒ）は対物レンズ４、ピンホールディスク２０からビームスプリッタ１３に入射して、ビームスプリッタ１３により反射する。そして、戻り光Ｒは第１リレーレンズ１４により平行光となり、分光ミラー１５によって短波長の第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とに分離される。

第１戻り光Ｒ１は第１ミラー１６で反射して、第２戻り光Ｒ２は第２ミラー１７で反射する。本変形例２の合流ミラー１８は短波長の第１戻り光Ｒ１を透過し、長波長の第２戻り光Ｒ２を反射する特性を有している。従って、合流ミラー１８で第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とが合流して、第２リレーレンズ１９によりカメラ６に結像する。

前述した実施形態と同様に、第１ミラー１６および第２ミラー１７の角度調整を行うことで、第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とは異なる光路となることから、カメラ６の異なる位置に第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２とが結像する。これにより、試料Ｓの波長成分ごとの画像情報を取得できる。

変形例２では、照明絞り４１を視野絞り手段として使用している。照明絞り４１は照明光Ｌの光束形状を細径化する光束形状変換手段であり、視野絞りと同じ効果を得ることができる。つまり、カメラ６で結像する第１戻り光Ｒ１と第２戻り光Ｒ２との像が重なり合うことがなくなる。また、試料Ｓの撮像範囲外に照明光Ｌが照射されることによる試料Ｓの光ダメージや退色といった問題も生じない。

照明絞り４１は照明光Ｌが平行光となっている位置であれば、任意の位置に配置することが可能である。従って、照明絞り４１の配置に高い自由度を持たせることができる。そして、照明絞り４１としては絞り羽根やビームエキスパンダ等の種々の光学部品を選択できるため、部品の選択肢の幅も広がる。

また、変形例２では、光走査ユニット１１に集光ディスク４２を設けている。この集光ディスク４２に配列された集光素子により照明光Ｌが対応するピンホールで集光する。これにより、照明光Ｌの利用効率が向上し、良好なＳ／Ｎ比の共焦点画像を生成することができる。その他の効果は実施形態と同じである。

また、分光ミラー１５は短波長の光を透過し、長波長の光を反射する。同様に、合流ミラー１８も短波長の光を透過し、長波長の光を反射する。分光ミラー１５および合流ミラー１８は同じダイクロイックミラーを使用することができるため、異なる特性を持つダイクロイックミラーを用意する必要がなくなる。これは、偏光成分によって分離する場合も同様である。

以上において、光走査ユニット１１のピンホールディスク２０と集光ディスク４２とは試料Ｓを高速に走査して共焦点画像を生成することができれば、多条且つ螺旋状にピンホールと集光素子とを配列したものでなくてもよい。例えば、ピンホールディスク２０に集光素子とピンホールとを同一ディスク上に形成しているものであってもよい。

１共焦点顕微鏡
２光源装置
３共焦点光スキャナ
４対物レンズ
６カメラ
１１光走査ユニット
１２視野絞り
１３ビームスプリッタ
１４第１リレーレンズ
１５分光ミラー
１６第１ミラー
１７第２ミラー
１８合流ミラー
１９第２リレーレンズ
２０ピンホールディスク
３１第１分光ミラー
３２第２分光ミラー
３３第１合流ミラー
３４第２合流ミラー
４２集光ディスク
Ｌ照明光
Ｒ戻り光
Ｓ試料

Claims

試料に照射して前記試料を蛍光させる照明光を通過させる複数の開口部を有し、この開口部を通過した前記照明光を前記試料に走査させる光走査ユニットと、
前記試料に含まれる複数の情報を前記蛍光の経路で前記情報ごとに分離させる光分離手段と、
この光分離手段により分離された前記蛍光の光路を異なる位置で結像させるための光路変換手段と、
分離された前記蛍光を合流させる光合流手段と、
前記照明光の光路に設けられる前記照明光の視野を絞る視野絞り手段と、
前記蛍光を平行光に変換するリレーレンズと、
を備え、
前記蛍光は結像を形成せずに前記リレーレンズを経由し、前記平行光として前記光分離手段に入射することを特徴とする共焦点光スキャナ。
前記視野絞り手段を、前記光走査ユニットから出射した前記照明光の光路のうち前記光走査ユニットに近接した位置に設けたこと
を特徴とする請求項１記載の共焦点光スキャナ。
前記視野絞り手段は、平行光となっている前記照明光の光束形状を細径化する光束形状変換手段であること
を特徴とする請求項１記載の共焦点光スキャナ。
前記光分離手段の前段および前記光合流手段の後段に無限遠補正光学系である一対のリレーレンズを備えていること
を特徴とする請求項１乃至３のうち何れか１項に記載の共焦点光スキャナ。
前記情報がＮ（Ｎは２以上の整数）個のときには、（Ｎ−１）個の前記光分離手段と（Ｎ−１）個の前記光合流手段とを備えていること
を特徴とする請求項４記載の共焦点光スキャナ。
前記光走査ユニットは、
前記複数の開口部を多条且つ螺旋状に配列した開口部ディスクと、
前記開口部に前記照明光を集光する集光素子を前記開口部と同じパターンで配列した集光ディスクと、
前記開口部ディスクと前記集光ディスクとを一体的に回転させる回転モータと、
を備えていることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の共焦点光スキャナ。
請求項１乃至６の何れか１項に記載の共焦点光スキャナを有する共焦点顕微鏡であって、
前記照明光を発振する光源と、
前記共焦点光スキャナと、
前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、
前記蛍光を検出する検出部と、
を備えていることを特徴とする共焦点顕微鏡。