JP4185711B2 - 複数の光源を備えた顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の光源を備えた顕微鏡に関し、より詳しくは、対物レンズと、これに隣接して配置され、該対物レンズとの間に平行光線を生成するレンズとを備えた顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、対物レンズと、これに隣接して配置され、該対物レンズとの間に平行光線を生成するレンズとを備えた顕微鏡が知れており、このような対物レンズを経た光線は対物レンズでは結像しないで、無限遠の平行光線として、対物レンズに隣接して配置された結像レンズに入り、この結像レンズによって中間像を結ぶ光学システムは無限遠補正光学系と呼ばれている。また、必要により、対物レンズと結像レンズとの間にハーフミラー等を挿入する場合もある。
【０００３】
このような無限遠補正光学系を利用した顕微鏡の例として、特開平１１−１４９０７号公報は、光源と白色光源を備えたカラーレーザ走査顕微鏡を開示している。このカラーレーザ顕微鏡は、光源を含む共焦点（コンフォーカル）光学系と、白色光源を含む非コンフォーカル光学系とが、一つの無限遠補正光学系を共用するようになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
複数の光源の波長が大きく異なる場合、一般的に、通常のレンズの屈折率は波長によって大きく変化することから、波長によって異なる像を結ぶ。つまり、色収差が発生する。色収差には、横の色収差（倍率色収差）と、縦の色収差（軸上色収差）とが存在する。
【０００５】
例えば、カラーコンフォーカル顕微鏡において、非コンフォーカルモードの画面、すなわち、白色光源からの光（白色光）を試料に照射したときに得られる画面（例えば、金属顕微鏡にＣＣＤカメラを取り付けたときの画面）と、コンフォーカルモード、すなわち、白色光源に多く含まれる波長とは大きく異なる波長を持つ光源からの光を試料に照射したときに得られる画面（例えば、紫外線レーザ顕微鏡の画面）とは、軸上色収差のために、二つの画面はどちらか一方の画面が焦点外になってしまうので、高い解像度と良好な色再現性とを両立することのできるカラー画面を得ることができない。
【０００６】
これに対して、複数の光源の波長領域において色収差補正が良好な無限遠補正光学系レンズを用いることが考えられるが、色収差補正が良好なレンズを用いたとしても改善効果は限定的であり、完全に良好な画面を得ることは実際上難しいだけでなく、このようなレンズは一般的に高価であり、このことは顕微鏡のコストアップ要因になる。また、色収差以外の収差（例えば、波面収差）についても、複数の光源の波長領域において収差補正が良好な無限遠補正光学系レンズを得ることは困難であり、かりに、このようなレンズを採用することは顕微鏡の製造コストが大幅に上昇してしまう。
【０００７】
本発明の目的は、無限遠補正光学系を使用して収差の少ない良好な画面又は像を得ることのできる複数の光源を備えた顕微鏡を提供することにある。
【０００８】
本発明の更なる目的は、無限遠補正光学系を使用して収差の少ない良好な画面又は像を得ることのできる複数の光源を備えた、非コンフォーカルモードを具備するコンフォーカル顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、複数の光学系が共通の対物レンズを共用し、この共通対物レンズと無限遠補正光学系レンズとの組み合わせを使用して、収差の少ない良好な画面又は像を得ながら、試料にレーザ光を照射することのできるレーザ照射顕微鏡を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かかる技術的課題は、本発明によれば、
対物レンズを共用する第１、第２の２つの光学系を含み、これら第１、第２の光学系が、夫々、光源を有する顕微鏡であって、
前記第１光学系が、
単色光を放射する第１光源と、
該第１光源から放射される単色光を偏向させ、当該単色光により試料を一次元的又は二次元的に走査するための走査装置と、
該走査装置により偏向された前記単色光を受けるリレーレンズと、
前記対物レンズと協働して無限遠補正光学系を構成し且つ前記リレーレンズからの前記単色光が前記対物レンズを通って前記試料に集光するように配置される第１結像レンズと、
前記試料からの前記単色光による応答光を前記対物レンズ、前記第１結像レンズ、前記リレーレンズ、前記走査装置を介して受けて該応答光を集光する第２結像レンズと、
前記第２結像レンズからの前記応答光を受光する第１受光手段とを有するコンフォーカル光学系であり、
前記第２光学系が、
前記単色光とは波長の異なる色情報用照明光を放射する第２光源と、
前記対物レンズと協働して無限遠補正光学系を構成する第３結像レンズと、
試料からの応答光を受光する二次元固体撮像素子を有する第２受光手段とを有し、
前記第２光源からの色情報用照明光が、前記対物レンズを通って試料に集光すると共に、該試料からの応答光が前記第３結像レンズを通って前記第２受光手段に入射する非コンフォーカル光学系であり、
前記第１受光手段からの輝度情報と前記第２受光手段からの色情報に基づいて、カラー映像用の信号を得るカラー映像信号作成手段を更に有することを特徴とする複数の光源を備えた顕微鏡を提供することにより達成される。
【００１２】
【発明の作用及び効果】
本発明によれば、コンフォーカル光学系と非コンフォーカル光学系とを有し、各々が光源を備えた顕微鏡において、対物レンズを共用すると共に、個々に無限遠補正光学系レンズ結像を具備すると共に、第１光学系の走査装置と対物レンズとの間に、リレーレンズと第１結像レンズとを配置することで、各々の無限遠補正光学系結像レンズを各光源が放射する光に適合するように選定することにより収差の少ない良好な画面又は像を得ることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面にしたがって説明する。
【００１４】
第１の実施形態（図１〜図３）
図１において、コンフォーカル走査顕微鏡（レーザ顕微鏡）１００は、レーザ光学系（第１光学系）１と、白色光光学系（第２光学系）２とを備えている。
【００１５】
レーザ光学系１
レーザ光学系１は、試料ｗの深度に関する情報を検出できる共焦点光学系で、可視領域又は赤外線領域或いは紫外線領域のレーザ光Ｌ１を出射する光源１０を有する。光源１０は単色光を出射する高輝度ランプであってもよい。
【００１６】
レーザ光源１０の光軸上には、光源１０側から、順に、第１のコリメートレンズ１１、偏光ビームスプリッタ１２、1/4波長板１３、二次元走査装置１４、リレーレンズ１５、レンズ１６、対物レンズ１７が配設されている。対物レンズ１７と、これに隣接して配置されたレンズ１６は第１の無限遠補正光学系を構成する。以下、対物レンズ１７と組み合わされて無限遠補正光学系を構成する結像レンズを無限遠補正光学系結像レンズと呼ぶ。
【００１７】
対物レンズ１７の焦点位置の付近には、試料ステージ３０が配設されており、対物レンズ１７はレーザ光Ｌ１を試料ｗの表面に集光させる。前述の二次元走査装置１４は、例えば２枚のガルバノミラーから構成され、レーザ光Ｌ１を偏向させることで、試料ｗへの集光位置を試料ｗの表面に沿って二次元的（Ｘ方向及び／又はＹ方向）に走査させる。
【００１８】
なお、試料ステージ３０は、ステージ制御回路４０によりＺ方向（上下方向）に駆動制御され、Ｘ、Ｙ方向については手動ハンドルで移動可能となっている。
【００１９】
試料ｗで反射されたレーザ光（応答光）Ｌ１は、レーザ入射光と同じ経路をたどって、対物レンズ１７、該対物レンズ１７と対をなす第１無限遠光学系結像レンズ１６を通って中間像を形成し、次いで、リレーレンズ１５を通り、再び、二次元走査装置１４を介して1/4波長板１３および偏光ビームスプリッタ１２を透過し、結像レンズ１８に向かう。応答光つまり反射光であるレーザ光Ｌ１は、結像レンズ１８を通り、この結像レンズ１８で集光されてピンホールを有する光絞り部１９ａを通り、光絞り部１９ａを通過したレーザ光Ｌ１は第１受光素子１９ｂに入射する。第１受光素子１９ｂは、たとえばフォトマルチプライヤまたはフォトダイオードなどで構成され、入射したレーザ光Ｌ１を光電変換して、アナログ光量信号を、出力アンプおよびゲイン制御回路（図示せず）を介して第１Ａ／Ｄコンバータ４１に出力する。
【００２０】
つぎに、レーザ光学系１によって得られる輝度情報について説明する。
【００２１】
前述の光絞り部１９ａは、結像レンズ１８の焦点位置に配設されており、一方、光絞り部１９ａのピンホールは極めて微小であるから、レーザ光Ｌ１が試料ｗ上で焦点を結ぶと、その反射光Ｌ１が、結像レンズ１８によって光絞り部１９ａのピンホールで結像し、第１受光素子１９ｂに入射する受光光量が著しく大きくなり、逆に、レーザ光Ｌ１が試料ｗ上で焦点を結んでいないと、その反射光Ｌ１は、光絞り部１９ａのピンホールを殆ど通過しないので、第１受光素子１９ｂの受光光量が著しく小さくなる。したがって、レーザ光学系１による撮像領域（走査領域）のうち、焦点の合った部分（合焦点の撮像単位）について明るい映像が得られ、一方、それ以外の高さの部分については暗い映像が得られる。なお、レーザ光学系１は、単色光としてレーザ光Ｌ１を用いた共焦点光学系であり、特に、光源１０からの光の波長が短いほど分解能に優れた輝度情報を得ることができる。
【００２２】
白色光光学系２
白色光光学系２は、白色光（色情報用の照明光）Ｌ２を出射する白色光源２０を光源としている。白色光源２０の光軸上には、レンズ２１、第１のハーフミラー２２および前記対物レンズ１７が配設されており、前記第１のハーフミラー２２において２つの光学系１、２の光軸が合致するように白色光光学系２が配設されている。したがって、白色光Ｌ２は、レーザ光Ｌ１の走査領域を包含した状態で集光される。
【００２３】
試料ｗで反射された白色光（応答光）Ｌ２は、白色入射光と同じ経路をたどって対物レンズ１７を通り、次いで第１のハーフミラー２２で反射され、更に、第２のハーフミラー２３で反射され、そして、この反射光は、対物レンズ１７と組み合わされて第２の無限遠補正光学系を作る結像レンズ２４を通り、この無限遠補正光学系結像レンズ２４によってカラーＣＣＤ（第２受光素子）２５の表面で結像する。すなわち、カラーＣＣＤ２５は、光絞り部１９ａと共役ないし共役に近い位置に配設されている。なお、カラーＣＣＤ２５で撮像された画像は、アナログの色情報として、ＣＣＤ駆動回路４３に読み出されて第２Ａ／Ｄコンバータ４２に出力される。
【００２４】
なお、無限遠補正光学系を構成する対物レンズ１７とレンズ２４とは、無限遠補正光学系ユニットとして市販されており、この市販の無限遠補正光学系ユニットを採用してもよい。市販の無限遠補正光学系ユニットは、一般的に、可視光に適合するように設計されている。
【００２５】
つぎに、後述するカラー共焦点画像モードにおいて作動する図２のカラー映像信号作成手段５について説明する。
【００２６】
カラー映像信号作成手段５は、第１受光素子１９ｂからの輝度情報と、カラーＣＣＤ２５からの色情報とを組み合わせて、カラー映像用のデジタル信号ｒo、ｇo、ｂoを作成するものである。前記カラー映像信号作成手段５は、第１および第２領域回路５１、５２と、輝度変換回路５３などを備えている。ここに、輝度情報とは、色彩を含まない輝度に関する情報をいい、「色情報」とは、たとえば色差信号のように、色の強度のバランスに関する情報をいう。
【００２７】
前記第１および第２領域回路５１、５２は、図３に示すように、それぞれ、レーザ光学系１および白色光光学系２の撮像領域Ａ１、Ａ２の所定の共通部分を映像領域ＡOとして選択し、選択した部分についてデジタル信号を出力する。すなわち、図２の第１領域回路５１は、前記映像領域ＡOについて、カラーＣＣＤ２５の各画素に対応した分解能で輝度信号ｉを輝度用メモリＭiに記憶させる。一方、前記第２領域回路５２は、前記映像領域ＡOについて、各画素ごとに赤、緑、青の色強度信号ｒm、ｇm、ｂmを第１色強度メモリＭr1、Ｍg1、Ｍb1に記憶させる。なお、色強度信号とは、三原色についての輝度（強度）を含む信号をいう。
【００２８】
前記輝度変換回路５３は、下記の演算式(1)、(2)、(3)にしたがって、各画素についての前記色強度信号ｒm、ｇm、ｂmの輝度情報を、輝度信号ｉの輝度情報に置換して、変換色強度信号ｒo、ｇo、ｂoを求め、該信号を第２色強度メモリＭr2、Ｍg2、Ｍb2に記憶させるものである。
【００２９】
Ｒo＝Ｉ・Ｒm／（Ｒm＋Ｇm＋Ｂm） ・・・（1）
Ｇo＝Ｉ・Ｇm／（Ｒm＋Ｇm＋Ｂm） ・・・（2）
Ｂo＝Ｉ・Ｂm／（Ｒm＋Ｇm＋Ｂm） ・・・（3）
【００３０】
ここに、Ｉは輝度信号ｉの輝度であり；
Ｒm、ｇm、ｂmは色強度信号ｒm、ｇm、ｂmの輝度（強度）であり；
Ｒo、Ｇo、Ｂoは変換色強度信号ｒo、ｇo、ｂoの輝度（強度）である。
【００３１】
なお、第１および第２色強度メモリＭr1〜Ｍb1、Ｍr2〜Ｍb2は、カラーＣＣＤ２５のうち前述の映像領域Ａoの部分の画素に対応した記憶部を有している。
【００３２】
このようにして得られた変換色強度信号ｒo、ｇo、ｂoは、カラーＣＣＤ２５からの色情報のうちの輝度情報を、第１受光素子１９ｂからの輝度情報に置換した信号となる。前記変換色強度信号ｒo、ｇo、ｂoは、前記第２色強度メモリＭr2、Ｍg2、Ｍb2から読み出されて、Ｄ／Ａコンバータ６０に出力され、更に、加算器６１において同期信号ａが付加されて、アナログの複合カラー映像信号ｃとなる。該複合カラー映像信号ｃはモニタ６２に出力されて、試料ｗの映像が映し出される。
【００３３】
第２の実施形態（図４）
前記第１の実施形態では、試料ｗの表面および第１受光素子１９ｂにおいて点状に集光するレーザ光Ｌ１を用いたが、試料ｗの表面および第１受光素子１９ｂにおいて線状に集光するライン単色光つまりラインレーザ光Ｌ１を用いてもよい。すなわち、図４に示す第２の実施形態のレーザ顕微鏡２００のように、レーザ光Ｌ１に代えてＹ方向に長いラインレーザ光Ｌ１を用いると共に、点状の第１受光素子１９ｂに代えてＹ方向に長い一次元ＣＣＤ１９Ａを用い、更に、二次元走査装置１４に代えて一次元走査装置１４Ａを用いる。この場合、図４(b)のように、ラインレーザ光Ｌ１が試料ｗの表面で集光した際の長手方向に直交する方向に、ラインレーザ光Ｌ１を走査する。なお、光絞り部１９ａはスリット状（溝状）にする。
【００３４】
第３の実施形態（図５）
前記第１、第２の実施形態では、図１のレーザ光学系１の第１受光素子１９ｂの前方に光絞り部１９ａを設けたが、該光絞り部１９ａは必ずしも設ける必要はない。
【００３５】
たとえば、図５に示す第３の実施形態のレーザ顕微鏡３００のように、結像レンズ１８の焦点の位置に白黒用の一次元ＣＣＤ１９Ａを設けてもよい。この場合、第１の一次元走査装置１４Ａを第１のコリメートレンズ１１と偏光ビームスプリッタ１２の間に設け、第２の一次元走査装置１４Ｂを1/4波長板１３とリレーレンズ１５との間に設けるのがよい。
【００３６】
第４の実施形態（図６）
図６は、第４の実施形態としてのレーザ照射顕微鏡又はレーザリペア顕微鏡４００を示す。レーザ照射顕微鏡又はレーザリペア顕微鏡４００は、白色光光学系４０２を有し、この白色光光学系４０２は、白色光（色情報用の照明光）Ｌ２を出射する白色光源２０を含み、白色光源２０の光軸上には、レンズ２１、第１のハーフミラー２２および対物レンズ１７が配設されており、第１のハーフミラー２２で反射された白色光が対物レンズ１７によって試料ｗに集光される。
【００３７】
試料ｗで反射された白色光（応答光）Ｌ２は、白色入射光と同じ経路をたどって対物レンズ１７を通り、次いで、第１のハーフミラー２２で反射され、更に、第１のハーフミラー２２と第２コリメートルレンズ２１との間に配置された第２のハーフミラー２３で反射され、そして、白色光に適した焦点距離を有する無限遠補正光学系結像レンズ２４を通ってカラーＣＣＤ（第２受光素子）２５の表面で結像する。
【００３８】
この顕微鏡４００のレーザ光学系４０１は、レーザ光Ｌ１を出射する光源１１０を有する。光源１１０の光軸上には、光源１１０側から、順に、リレーレンズ１５、第１無限遠光学系レンズ１６、対物レンズ１７が配設されている。上述した第１のハーフミラー２２は、第１無限遠光学系の結像レンズ１６と対物レンズ１７との間に配置され、この第１のハーフミラー２２において２つの光学系４０１、４０２の光軸が合致する。レーザ光Ｌ１は、対物レンズ１７を通って試料ｗの表面に集光される。
【００３９】
すなわち、レーザ照射顕微鏡又はレーザリペア顕微鏡４００は、白色光源２０による試料ｗの観察と同時に、試料ｗにレーザを照射することより、試料ｗを加工又は修復したり、レーザトラップ（レーザにより生物組織の一部を引き寄せるピンセットの役割）を行うことができる。
【００４０】
この顕微鏡４００に採用されるレーザの出力及び波長は、用途に応じて選択される。例えば、加工又は修復用であればYAGなどの高出力レーザを用いればよく、トラップ用であれば、小出力のＮe−Ｈeレーザを用いればよい。
【００４１】
以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、前記第１〜第３の各実施形態では、例えば、図１の第２光学系２において、ダイクロイックミラーを使用して反射光Ｌ２を３原色に分解し、これらの３原色の反射光を３つの白黒映像用の二次元ＣＣＤに入射させてもよい。また、光学系は異なるが、第２受光素子としてカラーラインＣＣＤや、３つの白黒映像用のラインＣＣＤ（赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）用）や、回転するＲＧＢフィルタを前面に設けたラインＣＣＤを用いることもでき、また、３つの点受光素子（Ｒ、Ｇ、Ｂ用）を用いることもできる。なお、これらの場合において、白色応答光を走査する走査装置は、レーザ光Ｌ１を走査する走査装置と兼用又は一部を兼用することもできる。
【００４２】
また、第２受光素子としては、カラーＣＣＤの他にＭＯＳ型などの他の固体撮像素子や複数の撮像管を組み合わせたテレビカメラなどを用いることもできる。
【００４３】
ところで、図１を参照して説明した第１実施形態では、レーザ光Ｌ１および白色光Ｌ２の反射光を、それぞれ、第１受光素子１９ｂおよびカラーＣＣＤ２５に受光させることとしたが、第２、第３の実施態様も含めて、試料ｗを透過した透過光や、また、レーザ光１を励起光として試料に照射した時に励起される蛍光を、励起光を遮断するフィルタを通過させ、その光を第１受光素子に受光させるものであってもよい。
【００４４】
また、第１〜第３の実施形態では、色彩を光の三原色に分解したが、補色系（黄、シアン、緑）に分解してもよい。また、色情報として色差信号や、ＣＩＥＬＡＢ（Ｌ＊ａ＊ｂ＊）表色系信号を用いてもよい。
【００４５】
また、図１などを参照して説明したコンフォーカル顕微鏡は、前述したように反射型であってよいが、透過型であってもよく、また、蛍光を用いた顕微鏡であってもよく、また、非コンフォーカルモード兼コンフォーカルモード用の光源として、紫外線領域、可視領域、赤外線領域の波長の複数の光源や単色光を放射する光源（典型的な例として高輝度ランプ）を備えたものであってもよい。
【００４６】
また、コンフォーカル顕微鏡は、図１に例示したように共焦点（コンフォーカル）光学系１が単一であってよいが複数であってもよい。具体的な例としては、輝度情報を得るための光源としてＲＧＢの３つの光源を具備し、各光源毎に独立した無限遠補正光学系レンズを配置して、これら無限遠補正光学系レンズと共通の対物レンズとで、各光源毎の無限遠補正光学系を構成するようにしてもよいし、一組の対物レンズと無限遠補正光学系レンズをＲＧＢの３つの光源が共用するようしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態の走査顕微鏡の概略構成図である。
【図２】ブロック図である。
【図３】撮像領域を示す平面図である。
【図４】第２の実施の形態の走査顕微鏡の概略構成図である。
【図５】第３の実施の形態の走査顕微鏡の概略構成図である。
【図６】第４の実施の形態のレーザ照射顕微鏡又はレーザリペア顕微鏡の概略構成図である。
【符号の説明】
１ 第１光学系
２ 第２光学系
１６ 結像レンズ（第１）
１７ 無限遠補正光学系対物レンズ
１８ 結像レンズ（第２）
１９ｂ 第１受光素子
２０ 色情報用の照明光（白色光源）
２４ 結像レンズ（第３）
２５ 第２受光素子
Ｌ１ レーザ光
Ｌ２ 白色照明光

Claims (1)

1. 対物レンズを共用する第１、第２の２つの光学系を含み、これら第１、第２の光学系が、夫々、光源を有する顕微鏡であって、
   前記第１光学系が、
   単色光を放射する第１光源と、
   該第１光源から放射される単色光を偏向させ、当該単色光により試料を一次元的又は二次元的に走査するための走査装置と、
   該走査装置により偏向された前記単色光を受けるリレーレンズと、
   前記対物レンズと協働して無限遠補正光学系を構成し且つ前記リレーレンズからの前記単色光が前記対物レンズを通って前記試料に集光するように配置される第１結像レンズと、
   前記試料からの前記単色光による応答光を前記対物レンズ、前記第１結像レンズ、前記リレーレンズ、前記走査装置を介して受けて該応答光を集光する第２結像レンズと、
   前記第２結像レンズからの前記応答光を受光する第１受光手段とを有するコンフォーカル光学系であり、
   前記第２光学系が、
   前記単色光とは波長の異なる色情報用照明光を放射する第２光源と、
   前記対物レンズと協働して無限遠補正光学系を構成する第３結像レンズと、
   試料からの応答光を受光する二次元固体撮像素子を有する第２受光手段とを有し、
   前記第２光源からの色情報用照明光が、前記対物レンズを通って試料に集光すると共に、該試料からの応答光が前記第３結像レンズを通って前記第２受光手段に入射する非コンフォーカル光学系であり、
   前記第１受光手段からの輝度情報と前記第２受光手段からの色情報とに基づいて、カラー映像用の信号を得るカラー映像信号作成手段を更に有することを特徴とする複数の光源を備えた顕微鏡。

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