WO2019244275A1 - 観察装置 - Google Patents

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WO2019244275A1
WO2019244275A1 PCT/JP2018/023455 JP2018023455W WO2019244275A1 WO 2019244275 A1 WO2019244275 A1 WO 2019244275A1 JP 2018023455 W JP2018023455 W JP 2018023455W WO 2019244275 A1 WO2019244275 A1 WO 2019244275A1
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WO
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objective lens
reflected light
focus
light intensity
observation device
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PCT/JP2018/023455
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豪 桝屋
忠雄 藪原
浩子 藤田
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Priority to JP2020525148A priority patent/JP7034280B2/ja
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    • G01N2201/063—Illuminating optical parts
    • G01N2201/0638—Refractive parts

Definitions

  • the present invention relates to an observation device.
  • Image imaging is known as a method for observing cells and the like in a sample solution with high sensitivity.
  • the observation by the image imaging method is performed using, for example, an optical microscope, a fluorescence microscope, a coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope, and a three-dimensional optical coherence tomography (OCT).
  • an optical microscope a fluorescence microscope, a coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope, and a three-dimensional optical coherence tomography (OCT).
  • CARS coherent anti-Stokes Raman scattering
  • OCT three-dimensional optical coherence tomography
  • the autofocus method is roughly classified into two methods. One is an image method for calculating a focus position from the contrast of a microscope image, and the other is an optical method for irradiating a sample container with light such as a laser and calculating the focus position from reflected light.
  • image-based autofocus a plurality of microscope images are acquired, the position where the contrast is maximized is calculated, and autofocus is performed.
  • This method requires a program or device for calculating the contrast of a plurality of microscope images at high speed in order to perform autofocus at high speed, and it was difficult in principle to improve the autofocus speed.
  • this method requires an observation target capable of obtaining contrast, and when observing extremely dilute cells, autofocus cannot be performed.
  • the interface between the sample container and the sample solution is irradiated with light such as a laser, and the autofocus is performed based on information of one or several scalar amounts such as the position and phase of light reflected from the interface. I do. Therefore, for example, when acquiring an image of several hundred thousand pixels, the amount of calculation is several hundred thousand times smaller than that of the image method, and high-speed autofocus can be performed.
  • the reflected light of the light applied to the bottom surface of the sample container is reflected light from the boundary between the inner bottom surface of the sample container and the sample liquid, or the outer bottom surface of the sample container.
  • the detection range of the autofocus position needs to be wide, and the reflected light from the boundary between the outside bottom surface of the sample container and air must be completely excluded.
  • Patent Literature 1 discloses a method in which an anti-reflection film is provided on an outer bottom surface of a sample container and light reflected from a boundary surface between the outer bottom surface of the sample container and air is excluded. Have been.
  • Patent Document 2 discloses that reflected light from the boundary between the inner bottom surface of the sample container and the sample liquid and reflected light from the boundary surface between the outer bottom surface of the sample container and air are detected, and respective peak positions are detected.
  • a method for calculating the position of the boundary between the inner bottom surface of the sample container and the sample liquid based on the above and performing autofocusing is disclosed.
  • the present invention provides an observation device that uniquely performs high-precision autofocus on a focus position.
  • a first aspect of the observation device is a holding device that holds the sample container in an observation device that captures an image of a focus position in a sample container containing a sample liquid.
  • An optical system that captures an image of the focus position, and an arithmetic unit that controls the optical system, wherein the optical system is configured to control an objective lens disposed below the sample container,
  • An objective lens actuator that is driven in the axial direction, an irradiation unit that irradiates light to the bottom surface of the sample container, a detection unit that detects the intensity of reflected light of the reflected light of the light, and a reflection surface where the intensity of the reflected light has a peak
  • a focus control unit that focuses the objective lens; and a count unit that counts the reflection surface, wherein the focus control unit controls the peak of the reflected light intensity.
  • the objective lens actuator is driven to focus the reflection surface, and the counting unit counts the reflection surface when the focus control unit focuses the reflection surface.
  • the computing device determines whether or not the focus is at the focus position based on the count value, and when the focus is at the focus position, captures an image with the optical system.
  • the objective lens actuator is driven when the focus is not at the focus position.
  • a second aspect of the observation device is an observation device that captures an image of a focus position in a sample container in which a sample liquid is stored, wherein a holding unit that holds the sample container, An optical system that captures an image, and an arithmetic device that controls the optical system, the optical system includes an objective lens disposed below the sample container, and an objective that scans the objective lens in an optical axis direction.
  • a lens actuator an irradiating unit that irradiates the bottom surface of the sample container with light, a detecting unit that detects a reflected light intensity of the reflected light of the light, and a focus of the objective lens on a reflecting surface that indicates the peak of the reflected light intensity And a reflected light intensity determination unit that determines the position of the focal point based on the intensity distribution of the reflected light, wherein the focus control unit
  • the objective lens actuator is driven to focus the focus on the reflection surface, and the reflected light intensity determination unit determines that the focus is based on the intensity distribution of the reflected light. It is determined whether or not the focus position is correct, the arithmetic device causes the optical system to perform imaging when the focus is correct to the focus position, and when the focus is not correct to the focus position. And driving the objective lens actuator.
  • autofocus can be uniquely performed with high accuracy at the focus position.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view illustrating a configuration of an observation device 1 according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • 5 is a flowchart illustrating an observation method according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a graph showing an example of a reflected light intensity distribution when a focal point 201 of an objective lens 202 is scanned from below a sample holding unit 101 to above.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the second embodiment.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the second embodiment.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the second embodiment.
  • 9 is a schematic diagram showing the operation of the observation device 1 according to the second embodiment.
  • 9 is a flowchart illustrating an observation method according to the second embodiment.
  • 5 is a graph showing an example of a reflected light intensity distribution when the focal point 201 of the objective lens 202 is continuously scanned downward from within the sample liquid 102.
  • the embodiment of the present invention relates to an observation apparatus and an observation method for automatically capturing a microscope image of a focus position in a sample container containing a sample solution containing cells and fine particles by autofocus.
  • the “focus position” is a position where observation is performed in the sample container, and refers to a region from the inner bottom surface of the sample container to an upper portion of 20 ⁇ m.
  • autofocus refers to a process of automatically adjusting the focus of the objective lens to the focus position.
  • the “connection” of each component does not necessarily need to be physically connected by a wiring or the like, and includes a wireless connection.
  • an XYZ rectangular coordinate system is set.
  • a predetermined direction in the horizontal plane is defined as an X direction
  • a direction orthogonal to the X direction in the horizontal plane is defined as a Y direction
  • a direction orthogonal to each of the X and Y directions is defined as a Z direction.
  • the Z direction is parallel to the optical axis direction of the objective lens.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing the configuration of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • the observation device 1 includes an imaging unit 200 (optical system), an XY stage 300 (holding unit), and a control PC 400 (arithmetic device).
  • the XY stage 300 holds the sample container 100.
  • the sample container 100 is a container having a plurality of sample holding units 101 in which a sample liquid 102 containing an observation target such as cells or fine particles is stored.
  • a sample container 100 as shown in FIG. 1, a 96-well microtiter plate having 96 sample holding portions 101, a 384-well plate, a 1536-well plate, or the like can be used.
  • the XY stage 300 is configured to be able to drive the sample container 100 on a plane (XY plane) perpendicular to the optical axis direction (Z direction) of the objective lens 202 of the imaging unit 200. Note that, instead of driving the sample container 100 by the XY stage 300, the imaging unit 200 may be driven in the XY plane. That is, the sample container 100 and the imaging unit 200 are configured to relatively move in the XY plane.
  • the imaging unit 200 is an optical system of an inverted microscope, and includes an objective lens 202, an objective lens actuator 203, a camera 204, an imaging lens 205, an autofocus unit 206, a focus control unit 207, and a count disposed below the sample container 100.
  • the objective lens actuator 203 drives the objective lens 202 in the optical axis direction according to an instruction from the focus control unit 207 or the control PC 400.
  • the position of the sample container 100 may be fixed and the objective lens actuator 203 may be driven in three axial directions (XYZ directions).
  • the imaging lens 205 forms an image incident through the objective lens 202 on the camera 204.
  • the camera 204 converts an image formed on the sensor unit of the camera 204 by the imaging lens 205 into an electric signal, and captures the converted signal as a microscope image.
  • the imaging unit 200 includes an adjustment mechanism for driving the imaging lens 205 or the camera 204 in order to finely adjust the surface on which the image is formed on the camera 204 to an arbitrary position within the focus position.
  • the adjustment mechanism may be, for example, an actuator connected to the control PC 400 or the focus control unit 207.
  • the adjusting mechanism drives the imaging lens 205 or the camera 204 such that, for example, after the focal point 201 of the objective lens 202 is adjusted to the inner bottom surface 103, an image above the inner bottom surface 103 is formed on the camera 204.
  • the autofocus unit 206 includes an irradiation unit that irradiates the bottom surface of the sample holding unit 101 with light such as a laser, and a photodetector that detects reflected light from the sample holding unit 101, Obtain a signal for performing autofocus.
  • the irradiation unit irradiates the bottom surface of the sample holding unit 101 with light through the objective lens 202 in parallel with the optical axis direction of the objective lens 202. Note that the bottom surface of the sample holding unit 101 may be irradiated with light obliquely to the optical axis direction without passing through the objective lens 202.
  • the photodetector keeps detecting the reflected light while the objective lens actuator 203 is being driven.
  • the light detector is a sensor such as a photodiode, for example.
  • the photodetector may include an amplifier that amplifies the detection signal of the reflected light.
  • the light detection unit transmits the detection signal to the focus control unit 207 and the reflected light intensity determination unit 209 as a reflected light intensity distribution.
  • FIG. 4 is a graph illustrating an example of the reflected light intensity distribution when the focal point 201 of the objective lens 202 is scanned from below the sample holding unit 101 to above.
  • the reflected light intensity is determined when the focal point 201 of the objective lens 202 is aligned with the reflection surface of the sample holding unit 101, that is, the boundary surface between the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101 and the sample liquid 102, Alternatively, a peak is shown when the focus 201 is focused on the boundary surface between the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101 and the air.
  • the focus control unit 207 receives the reflected light intensity distribution from the autofocus unit 206, determines whether the focus 201 is focused on the reflection surface where the peak of the reflected light intensity is the peak, and accurately focuses the focus 201 on the reflection surface. Thus, the objective lens actuator 203 is driven. When the peak of the reflected light intensity is detected, the focus control unit 207 switches the driving direction of the objective lens actuator 203, and accurately focuses the focal point 201 of the objective lens 202 on the reflection surface at low speed.
  • the autofocus method can be adopted as the autofocus method by the autofocus unit 206 and the focus control unit 207, and examples thereof include a laser interference method (phase difference method), an astigmatism method, and a pattern projection method.
  • the laser interference method is a method of performing autofocus based on a phase difference between incident light irradiated by an irradiation unit and reflected light.
  • the pattern projection method is a method of irradiating a pattern instead of a laser beam and performing auto-focusing based on a phase difference from the pattern from a reflection surface.
  • the counting unit 208 counts the reflection surface, and transmits the count value to the control PC 400.
  • the reflected light intensity determination unit 209 determines the presence or absence of the sample liquid 102 in the sample holding unit 101 based on the reflected light intensity at the peak of the reflected light intensity distribution.
  • the reflected light intensity is determined by the difference between the refractive indices of the two substances forming the interface. Since the reflectance increases as the difference in the refractive index increases, the intensity of the reflected light at the boundary surface (outer bottom surface 104) between the resin forming the sample container 100 and the air is higher than that of the resin forming the sample container 100 and the sample liquid. It becomes larger than the boundary surface with 102 (the inner bottom surface 103).
  • the reflected light intensity at the inner bottom surface 103 is equal to or higher than the reflected light intensity at the outer bottom surface 104 as shown by a dotted line in FIG.
  • the reflected light intensity at the inner bottom surface 103 is about half the reflected light intensity when the sample liquid 102 is not present.
  • the reflected light intensity determination unit 209 stores a threshold value of the reflected light intensity for determining that the sample liquid 102 does not exist in the sample holding unit 101 in advance, and stores the threshold value and the reflected light intensity at the inner bottom surface 103. The presence or absence of the sample liquid 102 may be determined by comparing. Since the refractive index changes when the material of the sample container 100 changes, the threshold value of the reflected light intensity when the sample liquid 102 does not exist may be changed depending on the material of the sample container 100.
  • the reflected light intensity determination unit 209 determines whether the position of the focal point 201 of the objective lens 202 is in the sample liquid 102 or in the resin on the bottom surface of the sample holding unit 101 based on the height of the baseline of the reflected light intensity distribution. And whether it is in the air. As shown in FIG. 4, the reflected light intensity varies depending on the position of the focal point 201. When the focal point 201 is in the air, the baseline of the reflected light intensity is the lowest, and when the focal point 201 is in the sample liquid 102, the baseline of the reflected light intensity is the highest.
  • the reflected light intensity determination unit 209 stores the range of the reflected light intensity for each position of the focal point 201 in advance, and can determine the position of the focal point 201 by referring to the range of the reflected light intensity.
  • the first range is the reflected light intensity when the focal point 201 is located in the sample liquid 102
  • the second range is the reflected light intensity when the focal point 201 is located in the resin on the bottom surface of the sample holding unit 101.
  • the reflected light intensity determination unit 209 determines the reflection surface indicating the reflected light intensity peak based on the height of the baseline immediately before the peak of the reflected light intensity distribution is detected and the driving direction of the objective lens actuator 203. It is determined whether it is a boundary between the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101 and the sample liquid 102 or a boundary between the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101 and the air.
  • the control PC 400 is connected to the autofocus unit 206, the focus control unit 207, the count unit 208, the reflected light intensity determination unit 209, the camera 204, and the XY stage 300, and controls these units.
  • a PLC control device or a control board may be used as the control PC 400.
  • the control PC 400 receives the count value from the count unit 208 and determines whether the reflection surface is the boundary surface (focus position) between the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101 and the sample liquid 102 based on the count value, It is determined whether it is a boundary surface between the outer bottom surface 104 of the portion 101 and the air.
  • the control PC 400 determines that the reflection surface is a boundary surface between the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101 and the sample liquid 102
  • the control PC 400 transmits an instruction for imaging the focus position to the camera 204.
  • the control PC 400 determines that the reflection surface is the boundary surface between the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101 and the air
  • the control PC 400 transmits an instruction to the objective lens actuator 203 to drive the objective lens 202.
  • the control PC 400 may include a display unit that displays an image formed on the camera 204, a GUI screen for inputting a user's instruction, a state of each component of the observation device 1, a result of various determinations, and the like. .
  • FIGS. 2A to 2E and FIG. 2A to 2E are schematic diagrams showing the operation of the observation device 1 according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating the observation method according to the present embodiment. 2A to 2E, the control PC 400 is not shown.
  • a method of continuously capturing the focus positions of the plurality of sample holding units 101 will be described.
  • the user places the sample container 100 on the XY stage 300 in advance, inputs an operation start instruction to the control PC 400, and starts the autofocus operation of the observation device 1.
  • the irradiation unit of the autofocus unit 206 starts irradiating light to the bottom surface of the first sample holding unit 101
  • the light detection unit of the autofocus unit 206 starts detection of reflected light.
  • the light detection unit transmits the detection signal to the focus control unit 207 as a reflected light intensity distribution.
  • FIG. 2A shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is located below the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101.
  • the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 downward to return the objective lens 202 to the lower end origin.
  • the user previously adjusts the position of the lower end origin such that the focal point 201 of the objective lens 202 is located below the outer bottom surface 104.
  • the count of the counting unit 208 is 0.
  • step S2 the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 upward to scan the focal point 201 of the objective lens 202.
  • step S3 while driving the objective lens actuator 203, the control PC 400 determines whether it is within the drive range of the objective lens actuator 203 or has reached the upper limit of the drive range. When it is within the drive range of the objective lens actuator 203, the control PC 400 continues to drive the objective lens actuator 203. If the upper limit of the drive range of the objective lens actuator 203 has been reached, the process returns to step S1, and the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 downward to return to the lower end origin.
  • step S4 while driving the objective lens actuator 203 upward, the focus control unit 207 determines the presence or absence of a reflected light intensity peak based on the reflected light intensity distribution received from the photodetector. If no peak of the reflected light intensity is detected, the process returns to step S2.
  • FIG. 2B shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is aligned with the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101.
  • the focal point 201 of the objective lens 202 is aligned with the outer bottom surface 104 of the sample holder 101
  • the reflected light intensity shows a peak as shown in FIG.
  • the focus control unit 207 drives the objective lens actuator 203 to accurately focus on the outer bottom surface 104 in step S5. This is because the objective lens actuator 203 is driven even when it is detected that the reflected light intensity has peaked, so that the focal point 201 of the objective lens 202 has moved upward from the outer bottom surface 104. It is.
  • the counting unit 208 adds 1 to the count and transmits the count value to the control PC 400.
  • the outer bottom surface 104 is a reflection surface on which the focus 201 is focused only for the first time after the start of the autofocus operation, and thus the count becomes 1.
  • step S6 the control PC 400 determines from the count value whether the reflecting surface in focus 201 is the outer bottom surface 104 or the inner bottom surface 103. As shown in FIG. 2B, when the count is 1, the outer bottom surface 104 is in focus 201. In this case, the control PC 400 returns to step S2, drives the objective lens actuator 203 upward again, and scans the focal point 201 upward.
  • FIG. 2C shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 has been moved above the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101. After that, steps S3 and S4 are performed.
  • FIG. 2D shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is aligned with the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101.
  • the focal point 201 of the objective lens 202 is aligned with the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101
  • the reflected light intensity shows a peak as shown in FIG.
  • the focus control unit 207 drives the objective lens actuator 203 to accurately focus on the inner bottom surface 103. This is because the focus 201 of the objective lens 202 has moved upward from the inner bottom surface 103 because the objective lens actuator 203 is driven even when it is detected that the reflected light intensity has peaked. It is.
  • the counting unit 208 After setting the focal point 201 to the inner bottom surface 103, the counting unit 208 adds 1 to the count and transmits the count value to the control PC 400.
  • the inner bottom surface 103 is a reflection surface on which the focus 201 is focused for the second time after the start of the autofocus operation, and thus the count is 2.
  • step S6 the control PC 400 determines whether the reflection surface in focus 201 is the outer bottom surface 104 or the inner bottom surface 103 based on the count value.
  • the control PC 400 transmits an instruction to the reflected light intensity determination unit 209, and the reflected light intensity determination unit 209 determines the presence or absence of the sample liquid 102 in the sample holding unit 101 from the reflected light intensity on the inner bottom surface 103. .
  • the reflected light intensity determination unit 209 stores a threshold value of the reflected light intensity for determining that the sample liquid 102 does not exist in the sample holding unit 101 in advance, and stores the threshold value and the reflected light intensity at the inner bottom surface 103. Are compared, the presence or absence of the sample liquid 102 is determined.
  • the control PC 400 transmits an instruction to the camera 204, and the camera 204 captures a microscope image at the focus position.
  • the control PC 400 transmits an instruction to the adjusting mechanism, and finely adjusts the position of the camera 204 or the imaging lens 205 so that an image above the focal point 201 of the objective lens 202 is formed on the camera 204.
  • the reflected light intensity determination unit 209 transmits the result to the control PC 400 in step S9. At this time, the control PC 400 may display on the display unit that there is no sample liquid 102 as a warning.
  • step S10 the control PC 400 determines whether or not the sample holding unit 101 that has observed is the last sample holding unit 101. By storing the number of sample holding units 101 in the control PC 400 in advance, it may be determined whether the sample holding unit 101 is the last sample holding unit 101 or not. When the sample holding unit 101 that has performed the observation is the last sample holding unit 101 (Yes), the control PC 400 ends the observation.
  • step S11 the control PC 400 drives the XY stage 300 to move the next sample holding unit 101 to above the objective lens 202. Move.
  • step S12 the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 downward to move the focal point 201 downward by a predetermined distance.
  • the distance for moving the focal point 201 is smaller than the thickness of the bottom surface of the sample holding unit 101.
  • the thickness of the bottom surface of the sample holding unit 101 and the distance for driving the objective lens actuator 203 downward in step S12 are stored in the control PC 400 in advance.
  • step S4 when the peak of the reflected light intensity is detected, in step S5, the focus control unit 207 drives the objective lens actuator 203 to accurately focus on the reflecting surface.
  • step S12 since the focal point 201 was moved downward by a distance smaller than the thickness of the bottom surface of the sample holding unit 101, as shown in FIG. is there. Therefore, in observation of the second and subsequent sample holding units 101, the counting unit 208 does not perform counting. Therefore, the count value remains at 2.
  • the control PC 400 determines in step S6 that the focus 201 is on the inner bottom surface 103 because the count is 2, and performs the steps from step S7 onward in the same manner as described above. As described above, steps S2 to S12 (FIGS. 2C and 2D) are repeated for all the second and subsequent sample holding units 101, and the observation is completed.
  • FIG. 2E shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is located above the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101.
  • the position of the focal point 201 may be below the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101. Therefore, after step S11 and step S12, the reflected light intensity determination unit 209 preferably determines the position of the focal point 201 based on the height of the baseline of the reflected light intensity distribution.
  • control PC 400 When the position of the focal point 201 is below the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101, the control PC 400 resets the count of the counting unit 208 and performs steps S2 to S10 in the same manner as the first sample holding unit 101. Perform and observe.
  • the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 to the upper end of the driving range, and from the reflected light intensity distribution, determines that there is no reflecting surface. Confirm. Thereafter, the control PC 400 resets the count of the counting unit 208, returns to step S1, returns the objective lens actuator 203 to the lower end origin, and performs steps S2 to S10 in the same manner as the first sample holding unit 101. , Make observations.
  • the reflection surface is counted by the counting unit 208 only in the first sample holding unit 101 has been described, but every time the observation of one sample holding unit 101 ends.
  • a method of resetting the count and counting the reflection surface in observation of all the sample holding units 101 can be adopted.
  • the states shown in FIGS. 2C and 2D are repeated, and when the count is 1, the control PC 400 determines that the focus 201 is on the inner bottom surface 103. judge.
  • the focal point 201 of the objective lens 202 is scanned upward from below the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101, but a configuration in which scanning is performed from above the inner bottom surface 103 is adopted.
  • the autofocus operation can be started from the state shown in FIG. 2E.
  • the reflection surface on which the peak of the reflected light intensity is first detected after the start of the autofocus operation is the inner bottom surface 103 as shown in FIG. 2C. Therefore, when the count by the counting unit 208 is 1, the control PC 400 determines that the focal point 201 is in focus on the inner bottom surface 103, and causes the camera 204 to image the focus position.
  • the reflection surface on which the peak of the reflected light intensity is detected is counted, and the focal point 201 of the objective lens 202 is shifted to the inner bottom surface 103 (focus position) by the count value. Is adopted to determine whether or not it is suitable. As a result, autofocus to the focus position can be uniquely performed with high accuracy.
  • the present embodiment has a configuration in which the presence or absence of the sample liquid 102 in the sample holding unit 101 is determined, so that an erroneous test result output due to a human error can be prevented.
  • FIGS. 5A to 5D are schematic views showing the operation of the observation device 1 according to the second embodiment. 5A to 5D, illustration of the control PC 400 is omitted.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating the observation method according to the present embodiment.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the reflected light intensity distribution when the focal point 201 of the objective lens 202 is continuously scanned downward from within the sample liquid 102.
  • the counting by the counting unit 208 is not performed, the reflected light intensity determination unit 209 determines the position of the focal point 201 to perform autofocus, and the focal point 201 of the objective lens 202 is sampled.
  • the second embodiment is different from the first embodiment in that scanning is performed from above the inside bottom surface 103 of the holding unit 101 to below.
  • the user places the sample container 100 on the XY stage 300 in advance, inputs an operation start instruction to the control PC 400, and starts the autofocus operation of the observation device 1.
  • the irradiation unit of the autofocus unit 206 starts irradiating light to the bottom surface of the first sample holding unit 101
  • the light detection unit of the autofocus unit 206 starts detection of reflected light.
  • the light detection unit transmits the detected reflected light to the focus control unit 207 and the reflected light intensity determination unit 209 as a reflected light intensity distribution.
  • FIG. 5A shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is located above the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101.
  • the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 upward to return the objective lens 202 to the upper end origin.
  • the user previously adjusts the position of the upper end origin such that the focal point 201 of the objective lens 202 is located above the inner bottom surface 103.
  • step S22 the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 downward to scan the focal point 201 of the objective lens 202.
  • step S23 based on the reflected light intensity distribution received from the light detection unit of the autofocus unit 206, the reflected light intensity determination unit 209 sets the focal point 201 of the objective lens 202 in the sample liquid 102, on the bottom surface of the sample holding unit 101, It is determined whether the resin is located in the resin or in the air. As shown in FIG. 7, the reflected light intensity varies depending on the position of the focal point 201. When the focal point 201 is in the air, the baseline of the reflected light intensity is the lowest, and when the focal point 201 is in the sample liquid 102, the baseline of the reflected light intensity is the highest.
  • the reflected light intensity determination unit 209 stores the range of the reflected light intensity for each position of the focal point 201 in advance, and determines the position of the focal point 201 by referring to the range of the reflected light intensity. As shown in FIG. 7, immediately after the start of the autofocus operation, the focal point 201 is located in the sample liquid 102, and therefore, the baseline of the reflected light intensity is the highest.
  • the reflected light intensity determination unit 209 transmits the determined position of the focal point 201 to the control PC 400.
  • the position of the focal point 201 of the objective lens 202 may be determined by the control PC 400 from an image acquired by the camera 204.
  • step S24 the control PC 400 determines the driving direction of the objective lens actuator 203 based on the position of the focal point 201 determined by the reflected light intensity determination unit 209 or the image obtained by the camera 204.
  • the control PC 400 continues to drive the objective lens actuator 203 downward.
  • the control PC 400 switches the driving direction of the objective lens actuator 203 and drives it upward.
  • step S25 while driving the objective lens actuator 203, the control PC 400 determines whether it is within the drive range of the objective lens actuator 203 or has reached the lower limit of the drive range. When it is within the drive range of the objective lens actuator 203, the control PC 400 continues to drive the objective lens actuator 203. When the lower limit of the drive range of the objective lens actuator 203 has been reached, the process returns to step S22, and the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 upward to return to the upper end origin, and then drives downward.
  • step S26 the focus control unit 207 determines the presence or absence of a reflected light intensity peak while driving the objective lens actuator 203, based on the reflected light intensity distribution received from the photodetector. If no peak of the reflected light intensity is detected, the process returns to step S23.
  • the reflected light intensity determination unit 209 determines the position of the focal point 201 from the height of the baseline immediately before the peak is detected, based on the reflected light intensity distribution, It is determined whether the detected peak is due to the inner bottom surface 103 or the outer bottom surface 104. When it is determined from the height of the baseline immediately before the peak that the focal point 201 is located in the sample liquid 102, the detected peak is determined to be due to the inner bottom surface 103 because the objective lens actuator 203 is driven downward. I do.
  • the detected peak is shifted to the inner bottom surface because the objective lens actuator 203 is driven upward. 103 is determined.
  • the detected peak is determined to be due to the outer bottom surface 104 because the objective lens actuator 203 is driving upward. If it is determined that the detected peak is due to the outer bottom surface 104, the process returns to step S23.
  • the focus control unit 207 drives the objective lens actuator 203 to accurately focus on the inner bottom surface 103 in step S27. This is because the objective lens actuator 203 is driven even when it is detected that the reflected light intensity has peaked, so that the focal point 201 of the objective lens 202 has moved below the inner bottom surface 103. It is.
  • FIG. 5B shows a state where the focus 201 of the objective lens 202 is focused on the inner bottom surface 103 of the sample holding unit 101.
  • the focus control unit 207 transmits an instruction to the reflected light intensity determination unit 209.
  • the reflected light intensity determination unit 209 determines the presence or absence of the sample liquid 102 in the sample holding unit 101 from the reflected light intensity on the inner bottom surface 103.
  • the reflected light intensity determination unit 209 stores a threshold value of the reflected light intensity for determining that the sample liquid 102 does not exist in the sample holding unit 101 in advance, and stores the threshold value and the reflected light intensity at the inner bottom surface 103. Are compared, the presence or absence of the sample liquid 102 is determined.
  • the reflected light intensity determination unit 209 transmits the result to the control PC 400.
  • the control PC 400 transmits an instruction to the camera 204, and the camera 204 captures a microscope image at the focus position.
  • the control PC 400 transmits an instruction to the adjusting mechanism, and finely adjusts the position of the camera 204 or the imaging lens 205 so that an image above the focal point 201 of the objective lens 202 is formed on the camera 204.
  • the reflected light intensity determination unit 209 transmits the result to the control PC 400 in step S30.
  • the control PC 400 may display a warning that there is no sample liquid 102 on the display unit.
  • step S31 the control PC 400 determines whether or not the observed sample holding unit 101 is the last sample holding unit 101. By storing the number of sample holding units 101 in the control PC 400 in advance, it may be determined whether or not the sample holding unit 101 is the last sample holding unit 101. When the sample holding unit 101 that has performed the observation is the last sample holding unit 101 (Yes), the control PC 400 ends the observation.
  • step S32 the control PC 400 drives the XY stage 300 to move the next sample holding unit 101 above the objective lens 202. Moving.
  • step S33 the control PC 400 drives the objective lens actuator 203 upward to move the focal point 201 upward by a predetermined distance.
  • the distance for moving the focal point 201 is smaller than the height of the sample liquid 102.
  • the height of the sample liquid 102 and the distance for driving the objective lens actuator 203 upward in step S33 are stored in the control PC 400 in advance. Thereby, as shown in FIG. 5A, when starting the autofocus of the second and subsequent sample holding units 101, the focal point 201 is located in the sample liquid 102.
  • the second and subsequent sample holding units 101 also perform steps S23 to S33 in the same manner as described above.
  • FIG. 5C shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is located in the resin on the bottom surface of the sample holding unit 101.
  • FIG. 5D shows a state where the focal point 201 of the objective lens 202 is located below the outer bottom surface 104 of the sample holding unit 101.
  • step S32 and step S33 even when the focal point 201 is not located in the sample liquid 102, the process returns to step S23.
  • observation method in the present embodiment can be implemented in combination with the first embodiment.
  • steps S23 and S24 of the present embodiment may be performed between steps S3 and S4 of the first embodiment.
  • the drive direction of the objective lens actuator 203 is determined by determining the position of the focal point 201 of the objective lens 202 from the reflected light intensity distribution, and the inner bottom surface 103 (focus The focus 201 is adjusted to the position (position).
  • the present embodiment has a configuration in which the presence or absence of the sample liquid 102 in the sample holding unit 101 is determined, so that an erroneous test result output due to a human error can be prevented.
  • REFERENCE SIGNS LIST 100 sample container 101 sample holding unit 102 sample liquid 103 inner bottom surface 104 outer bottom surface 200 imaging unit 201 focal point 202 objective lens 203 objective lens actuator 204 camera 205 imaging lens 206 autofocus unit 207 focus control unit 208 counting unit 209 reflected light intensity determination unit 300 XY stage 400 control PC

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Abstract

サンプル容器内のフォーカス位置の画像を撮像する観察装置において、サンプル容器を保持する保持部と、フォーカス位置の画像を撮像する光学系と、光学系を制御する演算装置とを備える。光学系は、サンプル容器の下方に配置される対物レンズと、対物レンズアクチュエータと、サンプル容器の底面に光を照射する照射部と、反射光強度を検出する検出部と、反射光強度のピークを示す反射面に対物レンズの焦点を合わせるフォーカス制御部と、反射面のカウントを行うカウント部とを有する。フォーカス制御部は、反射光強度のピークが検出された場合、対物レンズアクチュエータを駆動して、反射面に焦点を合わせ、カウント部は、フォーカス制御部により反射面に焦点を合わせた場合、反射面のカウントを行い、演算装置は、カウントの値に基づいて、焦点がフォーカス位置に合っているか否かを判定し、焦点がフォーカス位置に合っている場合に光学系に撮像を行わせる。

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関する。
　細胞などの顕微鏡画像を取得する場合、一般に細胞はサンプル液に懸濁され、サンプル液は透明なサンプル容器に収容される。このため、対物レンズがサンプル容器の下方に配置される倒立顕微鏡が一般に用いられている。
　サンプル液中の細胞などを高感度に観察する方法として、画像イメージング法が知られている。画像イメージング法による観察は、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡、３次元光干渉断層計（ＯＣＴ）を用いて行われる。
　従来、画像イメージング法を採用した観察装置において、高速かつ高精度なオートフォーカスを行うことが要求されている。オートフォーカス方式には、大きく分けて２つの方式がある。一つは、顕微鏡画像のコントラストからフォーカス位置を算出する画像方式であり、もう一つは、レーザーなどの光をサンプル容器に照射し、反射光からフォーカス位置を算出する光学方式である。
　画像方式のオートフォーカスにおいては、複数枚の顕微鏡画像を取得してコントラストが最大となる位置を算出し、オートフォーカスを行う。本方式は、高速にオートフォーカスを行うには、複数枚の顕微鏡画像のコントラストを高速に計算するプログラムやデバイスが必要となり、原理的にオートフォーカス速度を向上させることが困難であった。また、本方式は、コントラストが得られる観察対象が必要であり、極端に希薄な細胞を観察する場合、オートフォーカスを行うことができなかった。
　一方、光学方式のオートフォーカスにおいては、サンプル容器とサンプル液との境界面にレーザーなどの光を照射し、境界面からの反射光の位置や位相など、１又は数スカラー量の情報からオートフォーカスを行う。従って、例えば数十万ピクセルの画像を取得する場合は、画像方式と比較して数十万分の一の計算量となり、高速なオートフォーカスを実施できる。
　倒立顕微鏡に搭載される光学方式のオートフォーカスにおいて、サンプル容器底面に照射される光の反射光は、サンプル容器の内側底面とサンプル液との境界面からの反射光、あるいはサンプル容器の外側底面と空気との境界面からの反射光の２つが存在する。そのため、オートフォーカス位置の検出範囲を限定し、サンプル容器の内側底面とサンプル液との境界面からの反射光のみを検出する方法が採用されていた。しかし、サンプル容器が樹脂形成品の場合、形成誤差が大きく、オートフォーカス位置の検出範囲を広く取る必要があり、サンプル容器の外側底面と空気との境界面からの反射光を完全に除外することはできなかった。
　このような課題を解決する方法として、例えば特許文献１には、サンプル容器の外側底面に反射防止膜を付け、サンプル容器の外側底面と空気との境界面からの反射光を除外する方法が開示されている。
　また、特許文献２には、サンプル容器の内側底面とサンプル液との境界面からの反射光と、サンプル容器の外側底面と空気との境界面からの反射光とを検出し、それぞれのピーク位置に基づいて、サンプル容器の内側底面とサンプル液との境界面の位置を算出し、オートフォーカスを行う方法が開示されている。
特開２００８－２６７８４２号公報 特表２０１７－１８７４３６号公報
　しかしながら、特許文献１のように反射防止膜をサンプル容器に取り付けるには、取り付ける面が平滑であることが重要であるものの、樹脂形成品であるサンプル容器の底面は、湾曲していたり、傷が存在したりすることがある。これにより、反射防止膜を設けたとしてもオートフォーカス精度が十分に得られないという課題がある。
　また、特許文献２の方式においては、サンプル容器の底面の厚さ及び形成誤差をも含むように、オートフォーカス位置の検出範囲を広く設定する必要があり、オートフォーカスの精度が十分に得られないという課題がある。
　そこで、本発明は、フォーカス位置へ一意的に高精度のオートフォーカスを実施する観察装置を提供する。
　上記の課題を解決するため、本発明に係る観察装置の第１の態様は、サンプル液が収容されるサンプル容器内のフォーカス位置の画像を撮像する観察装置において、前記サンプル容器を保持する保持部と、前記フォーカス位置の画像を撮像する光学系と、前記光学系を制御する演算装置と、を備え、前記光学系は、前記サンプル容器の下方に配置される対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に駆動させる対物レンズアクチュエータと、前記サンプル容器の底面に光を照射する照射部と、前記光の反射光の反射光強度を検出する検出部と、前記反射光強度がピークを示す反射面に前記対物レンズの焦点を合わせるフォーカス制御部と、前記反射面のカウントを行うカウント部と、を有し、前記フォーカス制御部は、前記反射光強度のピークが検出された場合、前記対物レンズアクチュエータを駆動して、前記反射面に前記焦点を合わせ、前記カウント部は、前記フォーカス制御部により前記反射面に前記焦点を合わせた場合、前記反射面のカウントを行い、前記演算装置は、前記カウントの値に基づいて、前記焦点が前記フォーカス位置に合っているか否かを判定し、前記焦点が前記フォーカス位置に合っている場合に前記光学系に撮像を行わせ、前記焦点が前記フォーカス位置に合っていない場合に、前記対物レンズアクチュエータを駆動することを特徴とする。
　また、本発明に係る観察装置の第２の態様は、サンプル液が収容されるサンプル容器内のフォーカス位置の画像を撮像する観察装置において、前記サンプル容器を保持する保持部と、前記フォーカス位置の画像を撮像する光学系と、前記光学系を制御する演算装置と、を備え、前記光学系は、前記サンプル容器の下方に配置される対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に走査させる対物レンズアクチュエータと、前記サンプル容器の底面に光を照射する照射部と、前記光の反射光の反射光強度を検出する検出部と、前記反射光強度のピークを示す反射面に前記対物レンズの焦点を合わせるフォーカス制御部と、前記反射光の強度分布に基づいて、前記焦点の位置を判定する反射光強度判定部と、を有し、前記フォーカス制御部は、前記反射光強度のピークが検出された場合、前記対物レンズアクチュエータを駆動して、前記反射面に前記焦点を合わせ、前記反射光強度判定部は、前記反射光の強度分布に基づいて、前記焦点が前記フォーカス位置に合っているか否かを判定し、前記演算装置は、前記焦点が前記フォーカス位置に合っている場合に前記光学系に撮像を行わせ、前記焦点が前記フォーカス位置に合っていない場合に、前記対物レンズアクチュエータを駆動することを特徴とする。
　本発明によれば、フォーカス位置へ一意的に高精度のオートフォーカスを実施できる。
　本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
第１の実施形態に係る観察装置１の構成を示す概略斜視図。 第１の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第１の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第１の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第１の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第１の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第１の実施形態に係る観察方法を示すフローチャート。 対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１の下方から上方へ走査した場合の反射光強度分布の一例を示すグラフ。 第２の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第２の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第２の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第２の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図。 第２の実施形態に係る観察方法を示すフローチャート。 対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル液１０２中から下方へ走査し続けた場合の反射光強度分布の一例を示すグラフ。
　以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、図面は本発明の原理に則った具体的な実施形態を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
　本発明の実施形態は、細胞や微粒子を含むサンプル液を収容するサンプル容器内のフォーカス位置の顕微鏡画像をオートフォーカスによって自動的に撮像する観察装置及び観察方法に関する。本明細書において「フォーカス位置」とは、サンプル容器内において観察がなされる位置であり、サンプル容器の内側底面からその上部２０μｍまでの領域をいう。また、「オートフォーカス」とは、対物レンズの焦点を自動的にフォーカス位置に合わせる処理をいう。
　本明細書において、各構成要素の「接続」とは、必ずしも物理的に配線等で接続されている必要はなく、無線による接続も含まれる。
　以下の説明においては、ＸＹＺ直交座標系を設定する。水平面内の所定方向をＸ方向、水平面内においてＸ方向と直交する方向をＹ方向、Ｘ方向及びＹ方向のそれぞれに直交する方向（すなわち鉛直方向）をＺ方向とする。Ｚ方向は、対物レンズの光軸方向と平行である。
　［第１の実施形態］
　（１）観察装置
　第１の実施形態に係る観察装置を図１に沿って説明する。図１は、第１の実施形態に係る観察装置１の構成を示す概略斜視図である。図１に示すように、観察装置１は、撮像ユニット２００（光学系）、ＸＹステージ３００（保持部）、制御ＰＣ４００（演算装置）を備える。
　ＸＹステージ３００は、サンプル容器１００を保持する。サンプル容器１００は、細胞や微粒子などの観察対象を含むサンプル液１０２が収容されるサンプル保持部１０１を複数有する容器である。サンプル容器１００として、図１に示すように、サンプル保持部１０１を９６個有する９６ウェルマイクロタイタープレートや、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートなどを用いることができる。
　ＸＹステージ３００は、撮像ユニット２００の対物レンズ２０２の光軸方向（Ｚ方向）と直角となる平面（ＸＹ平面）においてサンプル容器１００を駆動可能に構成される。なお、ＸＹステージ３００によりサンプル容器１００を駆動させる代わりに、撮像ユニット２００をＸＹ平面に駆動させる構成とすることもできる。すなわち、サンプル容器１００及び撮像ユニット２００は、ＸＹ平面において相対的に移動するよう構成される。
　撮像ユニット２００は、倒立顕微鏡の光学系であり、サンプル容器１００の下方に配置される対物レンズ２０２、対物レンズアクチュエータ２０３、カメラ２０４、結像レンズ２０５、オートフォーカスユニット２０６、フォーカス制御部２０７、カウント部２０８、反射光強度判定部２０９を備える。
　対物レンズアクチュエータ２０３は、フォーカス制御部２０７又は制御ＰＣ４００からの指示に従い、対物レンズ２０２を光軸方向に駆動する。なお、観察装置１において、ＸＹステージ３００を設ける代わりに、サンプル容器１００の位置を固定して、対物レンズアクチュエータ２０３が三軸方向（ＸＹＺ方向）に駆動する構成とすることもできる。
　結像レンズ２０５は、対物レンズ２０２を介して入射した像をカメラ２０４に結像する。
　カメラ２０４は、結像レンズ２０５によりカメラ２０４のセンサ部に結像された像を電気信号に変換し、顕微鏡画像として撮像する。
　図示は省略しているが、撮像ユニット２００は、カメラ２０４に結像する面をフォーカス位置内の任意の位置に微調節するため、結像レンズ２０５又はカメラ２０４を駆動する調節機構を備える。調節機構は、例えば制御ＰＣ４００又はフォーカス制御部２０７に接続されるアクチュエータとすることができる。調節機構は、例えば、対物レンズ２０２の焦点２０１を内側底面１０３に合わせた後、内側底面１０３より上方をカメラ２０４に結像するように、結像レンズ２０５又はカメラ２０４を駆動する。
　オートフォーカスユニット２０６は、図示は省略しているが、レーザー等の光をサンプル保持部１０１の底面に照射する照射部と、サンプル保持部１０１からの反射光を検出する光検出器とを備え、オートフォーカスを行なうための信号を取得する。
　照射部は、対物レンズ２０２の光軸方向に平行に、対物レンズ２０２を通してサンプル保持部１０１の底面に光を照射する。なお、対物レンズ２０２を通さずに、サンプル保持部１０１の底面に対し、光軸方向に対し斜め方向から光を照射する構成としてもよい。
　光検出器は、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動中に反射光を検出し続ける。光検出器は、例えばフォトダイオード等のセンサである。光検出器は、反射光の検出信号を増幅する増幅器を備えていてもよい。光検出部は、検出信号を反射光強度分布としてフォーカス制御部２０７及び反射光強度判定部２０９へ送信する。
　光検出器により検出される反射光の強度分布は、図４に例示される。図４は、対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１の下方から上方へ走査した場合の反射光強度分布の一例を示すグラフである。図４に示すように、反射光強度は、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の反射面に合った場合、すなわち、サンプル保持部１０１の内側底面１０３とサンプル液１０２との境界面、あるいはサンプル保持部１０１の外側底面１０４と空気との境界面に焦点２０１が合った場合に、ピークを示す。
　フォーカス制御部２０７は、オートフォーカスユニット２０６から反射光強度分布を受信し、反射光強度のピークが頂点となる反射面に焦点２０１が合っているかを判定し、反射面に正確に焦点２０１を合わせるように、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動させる。フォーカス制御部２０７は、反射光強度のピークが検出されたら、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動方向を切り替え、低速で対物レンズ２０２の焦点２０１を反射面に正確に合わせる。
　なお、オートフォーカスユニット２０６及びフォーカス制御部２０７によるオートフォーカス方式として、他の方式を採用することもでき、例えば、レーザー干渉法（位相差法）、非点収差法、パターン投影法などが挙げられる。レーザー干渉法は、照射部が照射した入射光と、その反射光との位相差に基づいてオートフォーカスを行う方式である。パターン投影法は、レーザー光の代わりにパターンを照射し、反射面からのパターンとの位相差に基づいてオートフォーカスを行う方式である。
　カウント部２０８は、フォーカス制御部２０７により対物レンズ２０２の焦点２０１を反射面に合わせたら、反射面のカウントを行い、カウントの値を制御ＰＣ４００へ送信する。
　反射光強度判定部２０９は、反射光強度分布のピークにおける反射光強度に基づいて、サンプル保持部１０１内のサンプル液１０２の有無を判定する。反射光強度は、境界面を形成する２つの物質の屈折率の差によって決定される。屈折率の差が大きいほど反射率は大きくなるため、サンプル容器１００を形成する樹脂と空気との境界面（外側底面１０４）における反射光強度の方が、サンプル容器１００を形成する樹脂とサンプル液１０２との境界面（内側底面１０３）よりも大きくなる。従って、サンプル液１０２が存在しない場合、図４において点線で示すように、内側底面１０３における反射光強度は、外側底面１０４における反射光強度と同程度あるいはそれ以上となる。サンプル液１０２が存在する場合、図４において実線で示すように、内側底面１０３における反射光強度は、サンプル液１０２が存在しない場合の反射光強度の半分程度となる。反射光強度判定部２０９は、予め、サンプル保持部１０１内にサンプル液１０２が存在しないと判定するための反射光強度の閾値を記憶しておき、該閾値と、内側底面１０３における反射光強度とを比較することにより、サンプル液１０２の有無を判定してもよい。なお、サンプル容器１００の材質が変わると、屈折率が変わるため、サンプル容器１００の材質によって、サンプル液１０２が存在しない場合の反射光強度の閾値を変更してもよい。
　また、反射光強度判定部２０９は、反射光強度分布のベースラインの高さから、対物レンズ２０２の焦点２０１の位置が、サンプル液１０２中であるか、サンプル保持部１０１の底面の樹脂中であるか、空気中のいずれであるかを判定する。図４に示すように、焦点２０１の位置によって、反射光強度が異なる。焦点２０１が空気中にある場合、反射光強度のベースラインは最も低く、焦点２０１がサンプル液１０２中にある場合、反射光強度のベースラインは最も高くなる。反射光強度判定部２０９は、予め焦点２０１の位置ごとの反射光強度の範囲を記憶しておき、反射光強度の範囲を参照することにより、焦点２０１の位置を判定することができる。例えば、焦点２０１がサンプル液１０２中に位置する場合の反射光強度を第１の範囲とし、焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂中に位置する場合の反射光強度を第２の範囲とし、焦点２０１が空気中に位置する場合の反射光強度を第３の範囲と設定しておき、検出された反射光の強度が第１の範囲にある場合、焦点２０１はサンプル液１０２中に位置すると判断する。
　さらに、反射光強度判定部２０９は、反射光強度分布のピークが検出される直前のベースラインの高さと、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動方向とに基づいて、反射光強度のピークを示す反射面がサンプル保持部１０１の内側底面１０３とサンプル液１０２との境界面であるか、サンプル保持部１０１の外側底面１０４と空気との境界面であるかを判定する。
　制御ＰＣ４００は、オートフォーカスユニット２０６、フォーカス制御部２０７、カウント部２０８、反射光強度判定部２０９、カメラ２０４、ＸＹステージ３００に接続され、これらを制御する。制御ＰＣ４００として、ＰＬＣ制御装置や制御基板などを用いても良い。
　制御ＰＣ４００は、カウント部２０８からカウントの値を受信して、カウントの値から、反射面がサンプル保持部１０１の内側底面１０３とサンプル液１０２との境界面（フォーカス位置）であるか、サンプル保持部１０１の外側底面１０４と空気との境界面であるかを判定する。制御ＰＣ４００は、反射面がサンプル保持部１０１の内側底面１０３とサンプル液１０２との境界面であると判定した場合は、フォーカス位置の撮像を行うための指示をカメラ２０４に送信する。制御ＰＣ４００は、反射面がサンプル保持部１０１の外側底面１０４と空気との境界面であると判定した場合は、対物レンズアクチュエータ２０３に指示を送信して、対物レンズ２０２を駆動する。
　制御ＰＣ４００は、カメラ２０４に結像された像や、ユーザーによる指示を入力するためのＧＵＩ画面、観察装置１の各構成の状態、各種判定の結果等を表示する表示部を備えていてもよい。
　（２）観察方法
　次に、第１の実施形態に係る観察方法について、図２Ａ～２Ｅ及び図３に沿って説明する。図２Ａ～２Ｅは、本実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図である。図３は、本実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。なお、図２Ａ～２Ｅにおいて、制御ＰＣ４００の図示を省略している。以下において、複数のサンプル保持部１０１のフォーカス位置を連続で撮像する方法を説明する。
　予め、ユーザーは、サンプル容器１００をＸＹステージ３００に設置し、制御ＰＣ４００へ動作開始の指示を入力して、観察装置１のオートフォーカス動作をスタートさせる。ここで、オートフォーカスユニット２０６の照射部は、１つ目のサンプル保持部１０１の底面へ光の照射を開始し、オートフォーカスユニット２０６の光検出部は、反射光の検出を開始する。光検出部は、検出信号を反射光強度分布としてフォーカス制御部２０７へ送信する。
　図２Ａは、サンプル保持部１０１の外側底面１０４の下方に対物レンズ２０２の焦点２０１が位置する状態を示している。まず、ステップＳ１において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を下方へ駆動させ、対物レンズ２０２を下端原点へ復帰させる。図２Ａに示すように、ユーザーは、予め、対物レンズ２０２の焦点２０１が外側底面１０４よりも下に位置するように下端原点の位置を調整しておく。なお、このとき、カウント部２０８のカウントは０である。
　ステップＳ２において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を上方へ駆動して、対物レンズ２０２の焦点２０１を走査する。
　ステップＳ３において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動している間、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲内であるか、駆動範囲の上限に達したかを判定する。対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲内である場合には、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動を続行する。対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲の上限に達した場合は、ステップＳ１に戻り、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を下方へ駆動して下端原点へ復帰させる。
　ステップＳ４において、フォーカス制御部２０７は、対物レンズアクチュエータ２０３を上方へ駆動している間、光検出器から受信した反射光強度分布に基づいて、反射光強度のピークの有無を判定する。反射光強度のピークが検出されない場合、ステップＳ２へ戻る。
　図２Ｂは、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の外側底面１０４に合った状態を示している。対物レンズ２０２の焦点２０１が、サンプル保持部１０１の外側底面１０４に合った場合、図４に示すように、反射光強度がピークを示す。ステップＳ４において、反射光強度のピークが検出された場合、ステップＳ５において、フォーカス制御部２０７は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動して、外側底面１０４に正確に焦点２０１を合わせる。これは、反射光強度がピークとなったことを検出した際にも対物レンズアクチュエータ２０３は駆動しているため、対物レンズ２０２の焦点２０１は、外側底面１０４より上方へ移動してしまっているためである。
　フォーカス制御部２０７により焦点２０１を外側底面１０４に正確に合わせた後、カウント部２０８は、カウントに１を加算し、カウントの値を制御ＰＣ４００へ送信する。図２Ｂに示すように、外側底面１０４は、オートフォーカス動作を開始してから初めて焦点２０１が合う反射面であるため、カウントは１となる。
　ステップＳ６において、制御ＰＣ４００は、カウントの値から、焦点２０１が合っている反射面が外側底面１０４か内側底面１０３かを判定する。図２Ｂに示すように、カウントが１の場合、外側底面１０４に焦点２０１が合っている。この場合、制御ＰＣ４００は、ステップＳ２に戻り、再び対物レンズアクチュエータ２０３を上方に駆動させ、焦点２０１を上方へ走査する。図２Ｃは、対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１の外側底面１０４の上方へ移動させた状態を示している。その後、ステップＳ３及びＳ４を行う。
　図２Ｄは、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の内側底面１０３に合った状態を示している。対物レンズ２０２の焦点２０１が、サンプル保持部１０１の内側底面１０３に合った場合、図４に示すように、反射光強度がピークを示す。このとき、ステップＳ５において、フォーカス制御部２０７は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動して、内側底面１０３に正確に焦点２０１を合わせる。これは、反射光強度がピークとなったことを検出した際にも対物レンズアクチュエータ２０３は駆動しているため、対物レンズ２０２の焦点２０１は、内側底面１０３より上方へ移動してしまっているためである。
　焦点２０１を内側底面１０３に合わせた後、カウント部２０８は、カウントに１を加算し、カウントの値を制御ＰＣ４００へ送信する。図２Ｄに示すように、内側底面１０３は、オートフォーカス動作を開始してから２回目に焦点２０１が合う反射面であるため、カウントは２となる。
　ステップＳ６において、制御ＰＣ４００は、カウントの値に基づいて、焦点２０１が合っている反射面が外側底面１０４か内側底面１０３かを判定する。
　カウントが２の場合、図２Ｄに示すように、内側底面１０３に焦点２０１が合っている。この場合、制御ＰＣ４００は、反射光強度判定部２０９に指示を送信し、反射光強度判定部２０９は、内側底面１０３における反射光強度から、サンプル保持部１０１内のサンプル液１０２の有無を判定する。反射光強度判定部２０９は、予め、サンプル保持部１０１内にサンプル液１０２が存在しないと判定するための反射光強度の閾値を記憶しておき、該閾値と、内側底面１０３における反射光強度とを比較することにより、サンプル液１０２の有無を判定する。
　サンプル液１０２が存在する場合、反射光強度判定部２０９は、制御ＰＣ４００に結果を送信する。その後、ステップＳ８において、制御ＰＣ４００は、カメラ２０４に指示を送信し、カメラ２０４は、フォーカス位置の顕微鏡画像を撮像する。ここで、サンプル液１０２中の細胞に厚みがある場合、顕微鏡画像のピントが合わない可能性がある。従って、制御ＰＣ４００は、調節機構に指示を送信し、対物レンズ２０２の焦点２０１より上方がカメラ２０４に結像されるように、カメラ２０４又は結像レンズ２０５の位置を微調整する。
　サンプル液１０２が存在しない場合、反射光強度判定部２０９は、ステップＳ９において、制御ＰＣ４００に結果を送信する。このとき制御ＰＣ４００は、サンプル液１０２が無いことを警告として表示部に表示してもよい。
　ステップＳ８又はＳ９の後、ステップＳ１０において、制御ＰＣ４００は、観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１であるか否かを判定する。予め制御ＰＣ４００にサンプル保持部１０１の数を記憶させておくことで、最後のサンプル保持部１０１であるか否かを判定するようにしてもよい。観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１である場合（Ｙｅｓ）、制御ＰＣ４００は、観察を終了する。
　観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１でない場合（Ｎｏ）、ステップＳ１１において、制御ＰＣ４００は、ＸＹステージ３００を駆動して、次のサンプル保持部１０１を対物レンズ２０２の上方へ移動させる。
　ステップＳ１２において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を下方に駆動して、焦点２０１を所定の距離だけ下方に移動させる。このとき焦点２０１を移動させる距離は、サンプル保持部１０１の底面の厚みより小さいことが好ましい。サンプル保持部１０１の底面の厚みや、ステップＳ１２において対物レンズアクチュエータ２０３を下方へ駆動させる距離は、予め制御ＰＣ４００に記憶させておく。これにより、図２Ｃに示すように、２つ目以降のサンプル保持部１０１のオートフォーカスを開始する際は、焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂中に位置する。
　その後、ステップＳ２に戻り、上記と同様にステップＳ２及びステップＳ３を行う。ステップＳ４において、フォーカス制御部２０７は、反射光強度のピークが検出された場合、ステップＳ５において、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動して、反射面に正確に焦点２０１を合わせる。上述のステップＳ１２において、サンプル保持部１０１の底面の厚みより小さい距離だけ焦点２０１を下方に移動させたため、図２Ｄに示すように、反射光強度のピークを示した反射面は、内側底面１０３である。従って、２つ目以降のサンプル保持部１０１の観察においては、カウント部２０８はカウントを行わない。よって、カウントの値は２のままである。
　制御ＰＣ４００は、ステップＳ６において、カウントが２であるため、焦点２０１が内側底面１０３に合っていると判定し、ステップＳ７以降のステップを上記と同様に行う。以上のように、２つ目以降のサンプル保持部１０１すべてについて、ステップＳ２～Ｓ１２（図２Ｃ及び２Ｄ）を繰り返し、観察を終了する。
　なお、サンプル保持部１０１の底面の厚さのばらつきが大きい場合、上述のステップＳ１１及びステップＳ１２において次のサンプル保持部１０１に移動し、焦点２０１を所定の距離だけ下方に移動させた際に、焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂中に位置しない場合がある。図２Ｅは、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の内側底面１０３の上方に位置する状態を示している。また、図２Ａに示すように、焦点２０１の位置がサンプル保持部１０１の外側底面１０４の下方となる場合もある。従って、ステップＳ１１及びステップＳ１２の後に、反射光強度判定部２０９は、反射光強度分布のベースラインの高さに基づいて焦点２０１の位置を判定することが好ましい。
　焦点２０１の位置がサンプル保持部１０１の外側底面１０４の下方となった場合は、制御ＰＣ４００は、カウント部２０８のカウントをリセットし、１つ目のサンプル保持部１０１と同様にステップＳ２～Ｓ１０を実施して、観察を行う。
　焦点２０１の位置がサンプル保持部１０１の内側底面１０３の上方となった場合は、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動範囲の上端まで駆動し、反射光強度分布から、反射面が無いことを確認する。その後、制御ＰＣ４００は、カウント部２０８のカウントをリセットしてステップＳ１に戻り、対物レンズアクチュエータ２０３を下端原点へ復帰させ、１つ目のサンプル保持部１０１と同様にステップＳ２～Ｓ１０を実施して、観察を行う。
　以上のように、本実施形態における観察方法において、１つ目のサンプル保持部１０１のみにおいてカウント部２０８による反射面のカウントを行う例を説明したが、１つのサンプル保持部１０１の観察が終わるたびにカウントをリセットし、すべてのサンプル保持部１０１の観察において反射面をカウントする方法を採用することもできる。この場合、２つ目以降のサンプル保持部１０１においては、図２Ｃ及び図２Ｄに示す状態が繰り返されることとなり、制御ＰＣ４００は、カウントが１の場合に焦点２０１が内側底面１０３に合っていると判定する。
　また、本実施形態における観察方法において、対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１の外側底面１０４の下方から上方へ走査させる例を説明したが、内側底面１０３の上方から走査する構成を採用することもできる。すなわち、図２Ｅに示す状態からオートフォーカス動作を開始することもできる。この場合、オートフォーカス動作を開始して最初に反射光強度のピークが検出される反射面は、図２Ｃに示すように、内側底面１０３となる。従って、制御ＰＣ４００は、カウント部２０８によるカウントが１の場合に、焦点２０１が内側底面１０３に合っていると判定し、カメラ２０４にフォーカス位置の撮像を行わせる。
　（３）技術的効果
　以上のように、本実施形態は、反射光強度のピークが検出される反射面をカウントし、カウントの値により、対物レンズ２０２の焦点２０１が内側底面１０３（フォーカス位置）に合っているかを判定する構成を採用している。これにより、フォーカス位置へのオートフォーカスを一意的に高精度に行うことができる。また、本実施形態は、サンプル保持部１０１内のサンプル液１０２の有無を判定する構成を有することにより、人為的エラーによる誤った検査結果の出力を防止することができる。
　［第２の実施形態］
　（１）観察装置
　第２の実施形態に係る観察装置として、第１の実施形態に係る観察装置１と同様のものを使用することができるため、説明を省略する。
　（２）観察方法
　第２の実施形態に係る観察方法について、図５Ａ～５Ｄ、図６及び図７に沿って説明する。図５Ａ～５Ｄは、第２の実施形態に係る観察装置１の動作を示す概略図である。なお、図５Ａ～５Ｄにおいて、制御ＰＣ４００の図示を省略している。図６は、本実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。図７は、対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル液１０２中から下方へ走査し続けた場合の反射光強度分布の一例を示すグラフである。第２の実施形態に係る観察方法は、カウント部２０８によるカウントを行わず、反射光強度判定部２０９により焦点２０１の位置を判定してオートフォーカスを行う点、及び対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１の内側底面１０３の上方から下方へ走査する点で、第１の実施形態と異なる。
　予め、ユーザーは、サンプル容器１００をＸＹステージ３００に設置し、制御ＰＣ４００へ動作開始の指示を入力して、観察装置１のオートフォーカス動作をスタートさせる。ここで、オートフォーカスユニット２０６の照射部は、１つ目のサンプル保持部１０１の底面へ光の照射を開始し、オートフォーカスユニット２０６の光検出部は、反射光の検出を開始する。光検出部は、検出した反射光を反射光強度分布としてフォーカス制御部２０７及び反射光強度判定部２０９へ送信する。
　図５Ａは、サンプル保持部１０１の内側底面１０３の上方に対物レンズ２０２の焦点２０１が位置する状態を示している。まず、ステップＳ２１において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を上方へ駆動させ、対物レンズ２０２を上端原点へ復帰させる。図５Ａに示すように、ユーザーは、予め、対物レンズ２０２の焦点２０１が内側底面１０３よりも上に位置するように上端原点の位置を調整しておく。
　ステップＳ２２において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を下方へ駆動して、対物レンズ２０２の焦点２０１を走査する。
　ステップＳ２３において、反射光強度判定部２０９は、オートフォーカスユニット２０６の光検出部から受信した反射光強度分布に基づいて、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル液１０２中、サンプル保持部１０１の底面の樹脂中、空気中のいずれに位置しているかを判定する。図７に示すように、焦点２０１の位置によって、反射光強度が異なる。焦点２０１が空気中にある場合、反射光強度のベースラインは最も低く、焦点２０１がサンプル液１０２中にある場合、反射光強度のベースラインは最も高くなる。反射光強度判定部２０９は、予め焦点２０１の位置ごとの反射光強度の範囲を記憶しておき、反射光強度の範囲を参照することにより、焦点２０１の位置を判定する。図７に示すように、オートフォーカス動作を開始した直後は、焦点２０１がサンプル液１０２中に位置するため、反射光強度のベースラインは最も高い。反射光強度判定部２０９は、判定した焦点２０１の位置を制御ＰＣ４００へ送信する。なお、対物レンズ２０２の焦点２０１の位置は、カメラ２０４が取得する画像から、制御ＰＣ４００が判定してもよい。
　ステップＳ２４において、制御ＰＣ４００は、反射光強度判定部２０９により、又はカメラ２０４により取得される画像により判定された焦点２０１の位置に基づいて、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動方向を決定する。焦点２０１がサンプル液１０２中に位置する場合、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を下方へ駆動させ続ける。焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂中又は空気中に位置する場合、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動方向を切り替え、上方へ駆動させる。
　ステップＳ２５において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動している間、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲内であるか、駆動範囲の下限に達したかを判定する。対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲内である場合には、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３の駆動を続行する。対物レンズアクチュエータ２０３の駆動範囲の下限に達した場合は、ステップＳ２２に戻り、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を上方へ駆動して上端原点へ復帰させた後、下方へ駆動する。
　ステップＳ２６において、フォーカス制御部２０７は、光検出器から受信した反射光強度分布に基づいて、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動している間、反射光強度のピークの有無を判定する。反射光強度のピークが検出されない場合、ステップＳ２３に戻る。
　反射光強度のピークが検出された場合、反射光強度判定部２０９は、反射光強度分布に基づいて、ピークが検出される直前のベースラインの高さから、焦点２０１の位置を判定して、検出されたピークが内側底面１０３によるものか、外側底面１０４によるものかを判定する。ピーク直前のベースラインの高さから、焦点２０１がサンプル液１０２中に位置すると判定される場合、対物レンズアクチュエータ２０３は下方へ駆動しているため、検出されたピークは内側底面１０３によるものと判定する。ピーク直前のベースラインの高さから、焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂中に位置すると判定される場合、対物レンズアクチュエータ２０３は上方へ駆動しているため、検出されたピークは内側底面１０３によるものと判定する。ピーク直前のベースラインの高さから、焦点２０１が空気中に位置すると判定される場合、対物レンズアクチュエータ２０３は上方へ駆動しているため、検出されたピークは外側底面１０４によるものと判定する。検出されたピークが外側底面１０４によるものであると判定した場合、ステップＳ２３に戻る。
　内側底面１０３による反射光強度のピークが検出された場合、ステップＳ２７において、フォーカス制御部２０７は、対物レンズアクチュエータ２０３を駆動して、内側底面１０３に正確に焦点２０１を合わせる。これは、反射光強度がピークとなったことを検出した際にも対物レンズアクチュエータ２０３は駆動しているため、対物レンズ２０２の焦点２０１は、内側底面１０３より下方へ移動してしまっているためである。図５Ｂは、サンプル保持部１０１の内側底面１０３の上方に対物レンズ２０２の焦点２０１が合った状態を示している。
　焦点２０１を内側底面１０３に合わせた後、ステップＳ２８において、フォーカス制御部２０７は、反射光強度判定部２０９に指示を送信する。このとき、反射光強度判定部２０９は、内側底面１０３における反射光強度から、サンプル保持部１０１内のサンプル液１０２の有無を判定する。反射光強度判定部２０９は、予め、サンプル保持部１０１内にサンプル液１０２が存在しないと判定するための反射光強度の閾値を記憶しておき、該閾値と、内側底面１０３における反射光強度とを比較することにより、サンプル液１０２の有無を判定する。
　サンプル液１０２が存在する場合、反射光強度判定部２０９は、制御ＰＣ４００に結果を送信する。ステップＳ２９において、制御ＰＣ４００は、カメラ２０４に指示を送信し、カメラ２０４は、フォーカス位置の顕微鏡画像を撮像する。ここで、サンプル液１０２中の細胞に厚みがある場合、顕微鏡画像のピントが合わない可能性がある。従って、制御ＰＣ４００は、調節機構に指示を送信し、対物レンズ２０２の焦点２０１より上方がカメラ２０４に結像されるように、カメラ２０４又は結像レンズ２０５の位置を微調整する。
　サンプル液１０２が存在しない場合、反射光強度判定部２０９は、ステップＳ３０において、制御ＰＣ４００に結果を送信する。制御ＰＣ４００は、サンプル液１０２が無いことを警告として表示部に表示してもよい。
　ステップＳ２９又はＳ３０の後、ステップＳ３１において、制御ＰＣ４００は、観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１であるか否かを判定する。予め、制御ＰＣ４００に、サンプル保持部１０１の数を記憶させておくことで、最後のサンプル保持部１０１であるか否かを判定するようにしてもよい。観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１である場合（Ｙｅｓ）、制御ＰＣ４００は、観察を終了する。
　観察を行ったサンプル保持部１０１が最後のサンプル保持部１０１でない場合（Ｎｏ）、ステップＳ３２において、制御ＰＣ４００は、ＸＹステージ３００を駆動して、次のサンプル保持部１０１を対物レンズ２０２の上方へ移動する。
　ステップＳ３３において、制御ＰＣ４００は、対物レンズアクチュエータ２０３を上方に駆動して、焦点２０１を所定の距離だけ上方に移動させる。このとき焦点２０１を移動させる距離は、サンプル液１０２の高さより小さいことが好ましい。サンプル液１０２の高さや、ステップＳ３３において対物レンズアクチュエータ２０３を上方へ駆動させる距離は、予め制御ＰＣ４００に記憶させておく。これにより、図５Ａに示すように、２つ目以降のサンプル保持部１０１のオートフォーカスを開始する際は、焦点２０１がサンプル液１０２中に位置する。
　その後、ステップＳ２３に戻り、２つ目以降のサンプル保持部１０１においても上記と同様に、ステップＳ２３～Ｓ３３を行う。
　なお、サンプル容器１００の底面の厚さのばらつきが大きい場合、上述のステップＳ３２及びステップＳ３３において次のサンプル保持部１０１に移動し、焦点２０１を所定の距離だけ上方に移動させた際に、焦点２０１の位置がサンプル保持部１０１の底面の樹脂内、あるいは外側底面１０４の下方となる場合がある。図５Ｃは、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の底面の樹脂内に位置する状態を示している。図５Ｄは、対物レンズ２０２の焦点２０１がサンプル保持部１０１の外側底面１０４の下方に位置する状態を示している。
　このように、ステップＳ３２及びステップＳ３３の後に、焦点２０１がサンプル液１０２中に位置しない場合においても、ステップＳ２３に戻る。
　以上のように、本実施形態における観察方法において、対物レンズ２０２の焦点２０１をサンプル保持部１０１のサンプル液１０２中から下方へ走査させる例を説明したが、外側底面１０４の下方から焦点２０１を走査する構成を採用することもできる。
　また、本実施形態における観察方法は、第１の実施形態と組み合わせて実施することもできる。例えば、第１の実施形態のステップＳ３とステップＳ４の間に、本実施形態のステップＳ２３及びステップＳ２４を行ってもよい。
　（３）技術的効果
　以上のように、本実施形態は、反射光強度分布から、対物レンズ２０２の焦点２０１の位置を判定して対物レンズアクチュエータ２０３の駆動方向を決定し、内側底面１０３（フォーカス位置）に焦点２０１を合わせる構成を採用している。これにより、フォーカス位置へのオートフォーカスを一意的に高精度に行うことができる。また、本実施形態は、サンプル保持部１０１内のサンプル液１０２の有無を判定する構成を有することにより、人為的エラーによる誤った検査結果の出力を防止することができる。
１００…サンプル容器
１０１…サンプル保持部
１０２…サンプル液
１０３…内側底面
１０４…外側底面
２００…撮像ユニット
２０１…焦点
２０２…対物レンズ
２０３…対物レンズアクチュエータ
２０４…カメラ
２０５…結像レンズ
２０６…オートフォーカスユニット
２０７…フォーカス制御部
２０８…カウント部
２０９…反射光強度判定部
３００…ＸＹステージ
４００…制御ＰＣ

Claims (18)

  1. 　サンプル液が収容されるサンプル容器内のフォーカス位置の画像を撮像する観察装置において、
    　前記サンプル容器を保持する保持部と、
    　前記フォーカス位置の画像を撮像する光学系と、
    　前記光学系を制御する演算装置と、を備え、
    　前記光学系は、
    　前記サンプル容器の下方に配置される対物レンズと、
    　前記対物レンズを光軸方向に駆動させる対物レンズアクチュエータと、
    　前記サンプル容器の底面に光を照射する照射部と、
    　前記光の反射光の反射光強度を検出する検出部と、
    　前記反射光強度がピークを示す反射面に前記対物レンズの焦点を合わせるフォーカス制御部と、
    　前記反射面のカウントを行うカウント部と、を有し、
    　前記フォーカス制御部は、前記反射光強度のピークが検出された場合、前記対物レンズアクチュエータを駆動して、前記反射面に前記焦点を合わせ、
    　前記カウント部は、前記フォーカス制御部により前記反射面に前記焦点を合わせた場合、前記反射面のカウントを行い、
    　前記演算装置は、前記カウントの値に基づいて、前記焦点が前記フォーカス位置に合っているか否かを判定し、
    　前記焦点が前記フォーカス位置に合っている場合に前記光学系に撮像を行わせ、前記焦点が前記フォーカス位置に合っていない場合に、前記対物レンズアクチュエータを駆動することを特徴とする観察装置。
  2. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記反射光の強度分布に基づいて、前記焦点の位置を判定する反射光強度判定部をさらに備えることを特徴とする観察装置。
  3. 　請求項２に記載の観察装置において、
    　前記反射光強度判定部は、前記演算装置により、前記焦点が前記フォーカス位置に合っていると判定された場合に、前記ピークにおける前記反射光強度に基づいて、前記サンプル容器内に前記サンプル液が存在するか否かを判定することを特徴とする観察装置。
  4. 　請求項２に記載の観察装置において、
    　前記演算装置は、前記反射光強度判定部により判定される前記対物レンズの前記焦点の位置に基づいて、前記対物レンズアクチュエータの駆動方向を決定することを特徴とする観察装置。
  5. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記光学系は、前記フォーカス位置の像を撮像するカメラと、前記カメラに前記フォーカス位置の像を結像させる結像レンズと、をさらに備え、
    　前記演算装置は、前記カメラの画像から、前記対物レンズの前記焦点の位置を判定することを特徴とする観察装置。
  6. 　請求項５に記載の観察装置において、
    　前記演算装置は、前記カメラの画像から判定される前記対物レンズの前記焦点の位置に基づいて、前記対物レンズアクチュエータの駆動方向を決定することを特徴とする観察装置。
  7. 　請求項５に記載の観察装置において、
    　前記カメラ又は前記結像レンズを駆動して、前記カメラに結像される前記フォーカス位置の像を調節する調節機構をさらに備えることを特徴とする観察装置。
  8. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記対物レンズアクチュエータは、前記対物レンズの前記焦点が前記サンプル容器の底面の下方に位置する状態から駆動を開始して上方へ駆動し、
    　前記演算装置は、前記カウントが２の場合に前記焦点が前記フォーカス位置に合っていると判定することを特徴とする観察装置。
  9. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記対物レンズアクチュエータは、前記対物レンズの前記焦点が前記サンプル液内に位置する状態から駆動を開始して下方へ駆動し、
    　前記演算装置は、前記カウントが１の場合に前記焦点が前記フォーカス位置に合っていると判定することを特徴とする観察装置。
  10. 　サンプル液が収容されるサンプル容器内のフォーカス位置の画像を撮像する観察装置において、
    　前記サンプル容器を保持する保持部と、
    　前記フォーカス位置の画像を撮像する光学系と、
    　前記光学系を制御する演算装置と、を備え、
    　前記光学系は、
    　前記サンプル容器の下方に配置される対物レンズと、
    　前記対物レンズを光軸方向に走査させる対物レンズアクチュエータと、
    　前記サンプル容器の底面に光を照射する照射部と、
    　前記光の反射光の反射光強度を検出する検出部と、
    　前記反射光強度のピークを示す反射面に前記対物レンズの焦点を合わせるフォーカス制御部と、
    　前記反射光の強度分布に基づいて、前記焦点の位置を判定する反射光強度判定部と、を有し、
    　前記フォーカス制御部は、前記反射光強度のピークが検出された場合、前記対物レンズアクチュエータを駆動して、前記反射面に前記焦点を合わせ、
    　前記反射光強度判定部は、前記反射光の強度分布に基づいて、前記焦点が前記フォーカス位置に合っているか否かを判定し、
    　前記演算装置は、前記焦点が前記フォーカス位置に合っている場合に前記光学系に撮像を行わせ、前記焦点が前記フォーカス位置に合っていない場合に、前記対物レンズアクチュエータを駆動することを特徴とする観察装置。
  11. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記演算装置は、前記反射光強度判定部により判定される前記対物レンズの前記焦点の位置に基づいて、前記対物レンズアクチュエータの駆動方向を決定することを特徴とする観察装置。
  12. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記反射光強度判定部は、前記反射光強度のピークが検出される直前の前記焦点の位置が前記サンプル液中であり、且つ前記対物レンズアクチュエータが下方へ駆動している場合、又は前記反射光強度のピークが検出される直前の前記焦点の位置が前記サンプル容器の底面内であり、前記対物レンズアクチュエータが上方へ駆動している場合に、前記ピークにおいて前記焦点が前記フォーカス位置に合っていると判定することを特徴とする観察装置。
  13. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記反射光強度判定部は、前記焦点が前記フォーカス位置に合っている場合に、前記ピークにおける前記反射光強度に基づいて、前記サンプル容器内に前記サンプル液が存在するか否かを判定することを特徴とする観察装置。
  14. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記光学系は、前記フォーカス位置の像を撮像するカメラと、前記カメラに前記フォーカス位置の像を結像させる結像レンズと、をさらに備え、
    　前記演算装置は、前記カメラの画像から、前記対物レンズの前記焦点の位置を判定することを特徴とする観察装置。
  15. 　請求項１４に記載の観察装置において、
    　前記演算装置は、前記カメラの画像から判定される前記対物レンズの前記焦点の位置に基づいて、前記対物レンズアクチュエータの駆動方向を決定することを特徴とする観察装置。
  16. 　請求項１４に記載の観察装置において、
    　前記カメラ又は前記結像レンズを駆動して、前記カメラに結像される前記フォーカス位置の像を調節する調節機構をさらに備えることを特徴とする観察装置。
  17. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記対物レンズアクチュエータは、前記対物レンズの前記焦点が前記サンプル容器の底面の下方に位置する状態から駆動を開始し、上方へ駆動することを特徴とする観察装置。
  18. 　請求項１０に記載の観察装置において、
    　前記対物レンズアクチュエータは、前記対物レンズの前記焦点が前記サンプル液内に位置する状態から駆動を開始し、下方へ駆動することを特徴とする観察装置。
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