JP2007271979A

JP2007271979A - 生物顕微鏡

Info

Publication number: JP2007271979A
Application number: JP2006098091A
Authority: JP
Inventors: Kenta Mikuriya; 健太御厨; Koshi Kei; 虹之景; Yasunori Yokoyama; 耕徳横山; Naomichi Senda; 直道千田
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-10-18

Abstract

【課題】カバーガラスの裏側にある観察対象物への自動合焦、あるいは半自動合焦を可能とした生物顕微鏡を提供する。
【解決手段】焦点誤差検出光学系１０は、焦点誤差信号による焦点引込幅が、カバーガラス５２の表面５２ａおよび裏面５２ｂへの合焦を分離して検出可能な値となるような光学パラメータを有する。制御回路３は、焦点誤差検出光学系２０により得られる焦点誤差信号に基づいて、カバーガラス５２の裏面５２ｂを基準とする合焦位置に観察光学系１０の焦点ｆｃを位置づける。
【選択図】図１

Description

本発明は、焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する生物顕微鏡に関する。

顕微鏡の対物レンズをアクチュエータで駆動することで、自動的な合焦制御を実行する自動焦点装置が知られている。この装置では、顕微鏡の対物レンズの焦点位置からのずれを検出し、そのずれの検出信号に応じて圧電素子等のアクチュエータにより対物レンズを移動させ、合焦させている（特許文献１参照）。
特開平５−８８０７２号公報

このような自動焦点装置は、金属顕微鏡など、表面観察を行う場合に観察対象物の表面への自動合焦を可能とするものである。しかし、生物顕微鏡では、カバーガラスを介して観察対象物を観察するという特殊性がある。従来の自動合焦装置では、カバーガラスの表面への自動合焦は可能であっても、カバーガラスの内側に置かれた細胞等の観察対象物への自動合焦は不可能である。また、対物レンズとして油浸レンズを使用する場合には、カバーガラスと油との境界で光の反射が起こらず、カバーガラスの表面への合焦すら不可能となる。

本発明の目的は、カバーガラスの裏側にある観察対象物への自動合焦、あるいは半自動合焦を可能とした生物顕微鏡を提供することにある。

本発明の生物顕微鏡は、焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する生物顕微鏡であって、前記焦点誤差信号による焦点引込幅が、カバーガラスの表面および裏面への合焦を分離して検出可能な値となるような光学パラメータを有する焦点誤差検出光学系と、前記焦点誤差検出光学系により得られる前記焦点誤差信号に基づいて、前記カバーガラスの裏面を基準とする合焦位置に前記観察光学系の焦点を位置づける合焦手段と、を備えることを特徴とする。
この生物顕微鏡によれば、カバーガラスの裏面を基準とする合焦位置に観察光学系の焦点を位置づけるので、カバーガラスの裏側にある観察対象物への自動合焦、あるいは半自動合焦が可能となる。

前記合焦手段は、前記観察光学系の焦点を前記カバーガラスの裏面から所定量だけ深くすることで、前記観察光学系の焦点を前記合焦位置に位置づけてもよい。

前記焦点誤差検出光学系で検出される焦点と、前記観察光学系の焦点とが予め所定量だけずらされて設定され、前記合焦手段は、前記焦点誤差信号に従って前記カバーガラスの裏面に前記観察光学系の焦点を合わせることで、前記観察光学系の焦点を前記合焦位置に位置づけてもよい。

前記所定量の調整を受け付ける焦点調整手段を備えてもよい。

本発明の生物顕微鏡は、焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の自動合焦を行う生物顕微鏡であって、前記焦点誤差信号を得るための焦点誤差検出光を、前記試料に照射する焦点誤差検出用光源と、前記焦点誤差検出光学系に設けられ、前記試料側からの観察像の光を遮断するフィルタと、前記フィルタを経由した前記焦点誤差検出光を受光して焦点誤差信号を生成する焦点誤差信号生成手段と、を備えることを特徴とする。
この生物顕微鏡によれば、試料側からの観察像の光を遮断するフィルタを設け、このフィルタを経由した焦点誤差検出光を受光して焦点誤差信号を生成するので、正確な焦点誤差信号を得ることができる。

前記試料側からの光を前記観察像の光および前記焦点誤差検出光に分離し、それぞれ前記観察光学系および前記焦点誤差検出光学系に入射させる分離手段を備えてもよい。

前記焦点誤差検出光学系による焦点誤差検出方法として、非点収差法が用いられてもよい。

本発明の生物顕微鏡によれば、カバーガラスの裏面を基準とする合焦位置に観察光学系の焦点を位置づけるので、カバーガラスの裏側にある観察対象物への自動合焦、あるいは半自動合焦が可能となる。

本発明の生物顕微鏡によれば、試料側からの観察像の光を遮断するフィルタを設け、このフィルタを経由した焦点誤差検出光を受光して焦点誤差信号を生成するので、正確な焦点誤差信号を得ることができる。

以下、図１〜図５を参照して、本発明による生物顕微鏡の一実施形態について説明する。

図１は本実施形態の生物顕微鏡の構成を示すブロック図である。

図１に示すように、本実施形態の生物顕微鏡は、観察光学系１０および焦点誤差検出光学系２０を含んで構成される光学系１と、対物レンズ１１の位置を制御するための制御回路３と、観察光学系の焦点位置を調整する焦点調整手段としての焦点調整部４と、を備える。

光学系１は、試料５の近傍に配置される対物レンズ１１と、試料５側からの光を観察光および焦点誤差検出光に分離する分離手段としてのダイクロイックミラー１２と、ダイクロイックミラー１２を透過した観察光を受け付ける観察部１３と、観察部１３への焦点誤差検出光の入射を防止するためのフィルタ１４と、焦点誤差検出用光源としてのレーザダイオード２１と、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光を試料５に向けて通過させるレンズ群２２と、焦点誤差検出光の一部を折り曲げるハーフミラー２３と、試料５で反射されハーフミラー２３で折り曲げられた焦点誤差検出光を反射させるミラー２４と、焦点誤差検出光を受光する焦点誤差信号生成手段としての４分割フォトダイオード２５と、４分割フォトダイオード２５に入射する焦点誤差検出光のビーム形状を所定形状に成形するコリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７と、ダイクロイックミラー１２で折り曲げられた観察光を遮断するためのフィルタ２８と、を備える。

図１に示すように、対物レンズ１１は、アクチュエータ１６によりＺ方向(光軸方向)に移動可能とされている。アクチュエータ１６は制御回路３により制御される。

次に、本実施形態の生物顕微鏡の動作について説明する。

試料５からの観察光は、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４を介して観察部１３に入射し、観察部１３において試料５の観察像が得られる。これら、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４および観察部１３は、観察光学系１０を構成する。

一方、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光は、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８を通ってダイクロイックミラー１２により折り曲げられ、対物レンズ１１を介して試料５に照射される。試料５で反射された焦点誤差検出光は、対物レンズ１１を介してダイクロイックミラー１２に戻り、ここで折り曲げられてフィルタ２８に入射する。フィルタ２８を通過した焦点誤差検出光は、ハーフミラー２３、ミラー２４で折り返され、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過する。コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過した焦点誤差検出光は、４分割フォトダイオード２５で受光される。

これら、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８、ダイクロイックミラー１２、対物レンズ１１、ミラー２４、４分割フォトダイオード２５、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７は、焦点誤差検出光学系２０を構成する。

焦点誤差検出光学系２０に設けられたフィルタ２８は、ダイクロイックミラー１２により除去されきれなかった試料５の側からの観察光を遮断する。本実施形態では、フィルタ２８において観察光を遮断し、フィルタ２８を経由した焦点誤差検出光のみが４分割フォトダイオード２５に入射する。このため、４分割フォトダイオード２５において、観察光の影響を受けない正確な焦点誤差信号を生成することができる。また、観察光の影響を排除することで、焦点誤差検出の感度を向上させることができるので、試料５に照射する焦点誤差検出光の光量を低下させることができ、試料５が生細胞である場合などに、試料５への悪影響を防止できる。

コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７は、光軸（ｚ軸）と直交し、かつ互いに直交する２方向（ｘ方向、ｙ方向）について焦点距離を異ならせ、４分割フォトダイオード２５の受光量に基づく、非点収差法を用いた焦点誤差検出が可能となる。後述のように、焦点誤差検出光学系２０および制御回路３等は合焦手段として機能する。

図２は、４分割フォトダイオード２５に照射される焦点誤差検出光の投影形状を示しており、図２（ａ）は合焦時の形状、図２（ｂ）は焦点が遠い場合の形状、図２（ｃ）は焦点が近い場合の形状を、それぞれ示している。フォトダイオード２５の領域２５ａの出力レベルを「Ａ」、領域２５ｂの出力レベルを「Ｂ」、領域２５ｃの出力レベルを「Ｃ」、領域２５ｄの出力レベルを「Ｄ」とすると、「（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）」を演算することで、焦点誤差（フォーカスエラー）検出信号を得ることができる。いわゆる焦点誤差検出信号のＳ字カーブにおいて、信号強度が「０」の点で合焦状態が得られる。４分割フォトダイオード２５から出力された焦点誤差検出信号は、焦点調整部４を介して制御回路３に与えられる。なお、非点収差法による焦点誤差検出は周知の技術であるため、詳細説明は省略する。

図３（ａ）は、焦点誤差検出光学系２０により得られる焦点誤差検出信号を例示する図である。図３（ａ）に示すグラフにおいて、縦軸は焦点誤差検出信号の信号強度Ｅを、横軸は焦点位置Ｚをそれぞれ示している。

図３（ａ）に示す例では、矢印Ｐで示す位置と、矢印Ｑで示す位置において、それぞれ合焦状態が示される。図において、矢印Ｐと矢印Ｑとの間隔（Ｐ−Ｑ）が、カバーガラス５２の厚みに相当しており、ａ、ｂはそれぞれ、合焦動作における引込範囲（焦点引込幅）である。

図４は、観察光学系１０の合焦時の状態を示す図である。

図４（ａ）は、図３（ａ）における矢印Ｐでの合焦状態を示している。図４（ａ）では、細胞等の観察対象物５１の手前側（対物レンズ１１の側）に置かれたカバーガラス５２の表面５２ａに、観察光学系１０の焦点ｆｃが位置づけられている。

一方、図４（ｂ）は、図３（ａ）における矢印Ｑでの合焦状態を示している。図４（ｂ）では、カバーガラス５２の裏面５２ｂに、観察光学系１０の焦点ｆｃが位置づけられている。

図３（ａ）に示すように、本実施形態の生体顕微鏡によれば、カバーガラス５２の表面５２ａおよび裏面５２ｂへの合焦状態を示す焦点誤差検出信号のカーブが互いに分離するように、焦点誤差検出光学系２０の光学パラメータが定められている。したがって、カバーガラス５２の裏面５２ｂに正確に観察光学系１０を合焦させることが可能となる。なお、対物レンズ１１として、油浸レンズを用いる場合には、カバーガラス５２の表面５２ａへの合焦状態を示す焦点誤差検出信号のカーブは現れないが、裏面５２ｂへの合焦状態を示す焦点誤差検出信号のカーブを用いることで、カバーガラス５２の裏面５２ｂへの合焦は当然可能である。

ここで、カバーガラス５２の厚みは通常１７０μｍ程度である。したがって、焦点誤差検出光学系２０における焦点引込幅、すなわち焦点誤差検出信号のＳ字カーブによるフィードバック制御が可能な範囲の幅が、１７μｍ〜３４μｍの範囲となるように焦点誤差検出光学系２０の光学パラメータを定めるのが望ましい。焦点引込幅はカバーガラス５２の厚みの０．１倍〜０．２倍程度がよい。

これに対し、図３（ｂ）には、従来の顕微鏡を用いて試料５を観察する場合の焦点誤差検出信号が例示されている。この場合には、焦点引込幅とカバーガラス厚が同程度（約１倍）であるため、カバーガラス５２の裏面５２ｂへの合焦を示すカーブがカバーガラス５２の表面５２ａへの合焦を示す大振幅のカーブに吸収されてしまい、裏面５２ｂへの合焦状態を検出することができない。

次に、観察光学系１０を観察対象物５１に合焦させる手順について説明する。この手順は制御回路３により実行される。

本実施形態の生体顕微鏡では、最初に観察光学系１０の焦点ｆｃを、カバーガラス５２の裏面５２ｂに位置づける（図４（ｂ））。ここでは、制御回路３により焦点誤差検出信号に基づくフィードバック制御を実行し、アクチュエータ１６により対物レンズ１１をＺ軸に沿って駆動することで、焦点ｆｃをカバーガラス５２の裏面５２ｂに位置づける。この場合、例えば、対物レンズ１１をカバーガラス５２に近づけていき、カバーガラス５２の表面５２ａへの合焦の後、裏面５２ｂに合焦させるようにしてもよい。この方法によれば、２度目の合焦状態で、焦点ｆｃがカバーガラス５２の裏面５２ｂに位置づけられることになる。

次に、図４（ｂ）に示すように、対物レンズ１１をＺ軸に沿って予め定められたΔＺ（例えば、１〜１０μｍ程度）だけ押し込むことにより、焦点ｆｃを観察対象物５１に位置づける。制御回路３は、アクチュエータ１６により、対物レンズ１１を合焦位置からＺ軸に沿ってΔＺだけ駆動する。これにより、図５に示すように、焦点ｆｃが観察対象物５１に位置づけられる。

また、図１に示す焦点調整部４への目標値Ｖを入力することで、観察中の焦点ｆｃのフィードバック制御が可能となる。目標値Ｖとして、ΔＺに対応する焦点誤差検出信号値を焦点調整部４に与えればよい（図３（ａ）参照）。この場合、焦点誤差検出信号値が目標値Ｖに一致するように、制御回路３により合焦位置が常にフィードバック制御されるので、観察対象物５１の焦点が時間とともに変化する場合であっても、常に合焦状態を維持できる。

オペレータは観察像を確認しながら、焦点調整部４に入力する目標値Ｖを変更することができ、適切な目標値Ｖを入力することで、安定した観察像を得ることができる。

上記実施形態では、観察光学系１０の焦点ｆｃと、焦点誤差検出光学系２０の焦点とを完全に一致させている。このため、焦点調整部４に入力された目標値Ｖに従って、カバーガラス５２の裏面５２ｂからΔＺだけ観察光学系１０の焦点ｆｃを深くすることで、焦点ｆｃを観察対象物５１に位置づけている。しかし、焦点誤差検出光学系２０を用いて検出される焦点と、観察光学系１０の焦点とを予め所定量（例えば、ΔＺ）だけずらして設定しておき、焦点誤差信号に従ってカバーガラス５２の裏面５２ｂに焦点誤差検出光を合焦させることで、実際には観察光学系１０の焦点ｆｃが観察対象物５１に位置づけられるようにしてもよい。制御回路３により合焦位置を常にフィードバック制御すれば、観察対象物５１の焦点が時間とともに変化する場合であっても、常に合焦状態を維持できる。

焦点誤差検出光学系２０に、上記所定量を調整するための物理的な調整部分を設けることで、上記所定量を調整部分の調整代の中で光学的に変化させることが可能となる。例えば、コリメータレンズ２６、シリンドリカルレンズ２７、あるいは４分割フォトダイオード２５を光軸方向に移動可能とすることで、焦点誤差検出光学系２０で検出される合焦位置と、観察光学系１０の焦点ｆｃの実際の位置とのずれ量を光学的に調整することができる。

また、誤差検出光学系２０で検出される合焦位置と観察光学系１０の焦点ｆｃとの間の光学的なずれ量、および焦点調整部４に入力する目標値Ｖの両方を用いて、焦点ｆｃを調整してもよい。

なお、非点収差法は視野のパターン変化に強いため、生細胞を観察する場合のように観察対象物が移動する場合の自動合焦に適している。また、一般に、非点収差法は焦点誤差検出の感度が高く、焦点誤差検出光のレーザ強度が小さくて済むため、観察対象物への影響を低減できるとともに、観察像の品位を向上させることができる。ただし、本発明は非点収差法を用いない場合にも適用される。

以上説明したように、本発明の生物顕微鏡によれば、カバーガラスの裏面を基準とする合焦位置に観察光学系の焦点を位置づけるので、カバーガラスの裏側にある観察対象物への自動合焦、あるいは半自動合焦が可能となる。また、本発明の生物顕微鏡によれば、試料側からの観察像の光を遮断するフィルタを設け、このフィルタを経由した焦点誤差検出光を受光して焦点誤差信号を生成するので、正確な焦点誤差信号を得ることができる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する生物顕微鏡に対し、広く適用することができる。

本実施形態の生物顕微鏡の構成を示すブロック図。４分割フォトダイオードに照射される焦点誤差検出光の投影形状を示しており、（ａ）は合焦時の形状、（ｂ）は焦点が遠い場合の形状、（ｃ）は焦点が近い場合の形状を、それぞれ示す図。焦点誤差検出信号を例示する図であり、（ａ）は本実施形態の生物顕微鏡における例を、（ｂ）は従来の顕微鏡における例を、それぞれ示す図。観察光学系の合焦時の状態を示す図であり、（ａ）はカバーガラスの表面への合焦状態を、（ｂ）はカバーガラスの裏面への合焦状態を、それぞれ示す図。観察光学系が観察対象物に合焦した状態を示す図。

符号の説明

３制御回路（合焦手段）
４焦点調整部（焦点調整手段）
１０観察光学系
２０焦点誤差検出光学系（合焦手段）
２５４分割フォトダイオード（焦点誤差信号生成手段）
５１観察対象物
５２カバーガラス
５２ｂ裏面

Claims

焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する生物顕微鏡であって、
前記焦点誤差信号による焦点引込幅が、カバーガラスの表面および裏面への合焦を分離して検出可能な値となるような光学パラメータを有する焦点誤差検出光学系と、
前記焦点誤差検出光学系により得られる前記焦点誤差信号に基づいて、前記カバーガラスの裏面を基準とする合焦位置に前記観察光学系の焦点を位置づける合焦手段と、
を備えることを特徴とする生物顕微鏡。
前記焦点誤差検出光学系は、前記焦点引込幅が前記カバーガラス厚の０．１倍〜０．２倍の範囲となる光学パラメータを有することを特徴とする請求項１に記載の生物顕微鏡。
前記合焦手段は、前記観察光学系の焦点を前記カバーガラスの裏面から所定量だけ深くすることで、前記観察光学系の焦点を前記合焦位置に位置づけることを特徴とする請求項１または２に記載の生物顕微鏡。
前記焦点誤差検出光学系で検出される焦点と、前記観察光学系の焦点とが予め所定量だけずらされて設定され、
前記合焦手段は、前記焦点誤差信号に従って前記カバーガラスの裏面に前記観察光学系の焦点を合わせることで、前記観察光学系の焦点を前記合焦位置に位置づけることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生物顕微鏡。
前記所定量の調整を受け付ける焦点調整手段を備えることを特徴とする請求項３または４に記載の生物顕微鏡。
焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の自動合焦を行う生物顕微鏡であって、
前記焦点誤差信号を得るための焦点誤差検出光を、前記試料に照射する焦点誤差検出用光源と、
前記焦点誤差検出光学系に設けられ、前記試料側からの観察像の光を遮断するフィルタと、
前記フィルタを経由した前記焦点誤差検出光を受光して焦点誤差信号を生成する焦点誤差信号生成手段と、
を備えることを特徴とする生物顕微鏡。
前記試料側からの光を前記観察像の光および前記焦点誤差検出光に分離し、それぞれ前記観察光学系および前記焦点誤差検出光学系に入射させる分離手段を備えることを特徴とする請求項６に記載の生物顕微鏡。
前記焦点誤差検出光学系による焦点誤差検出方法として、非点収差法が用いられることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生物顕微鏡。