CN110082330A - 一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统。包括激光光镊拉曼光谱单元和多光子荧光成像单元，所述激光光镊拉曼光谱单元包括785nm半导体激光器、扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜、透镜（L3）、长通滤波片（EF）、拉曼光谱仪；所述多光子荧光成像单元包括飞秒激光器、XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜、半透半反镜（BS2）、荧光光谱仪、计算机、长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4）、第一带通滤色片、第二带通滤色片、第一光电倍增管、第二光电倍增管。本发明能够实现对生物单细胞样品进行拉曼光谱，多光子成像以及荧光光谱等多维度、多模式的检测分析。

Description

一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统
技术领域
本发明涉及一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统。
背景技术
传统激光光镊拉曼光谱技术是一种将激光光镊与共聚焦拉曼光谱技术相结合的产物，该技术能够保证在生理条件下捕获、操控、测量在悬浮状态下单个活性细胞并对其进行生物学分析研究，连续激光器波长选为 785nm 近红外激光，在此波段生物样品吸收系数较低，水的吸收率小于水溶液中细胞及其它生物样品的检测，而且相比于可见光其荧光背景较小；多光子显微成像技术作为一种发展迅速的非线性无标记成像方法，主要用飞秒脉冲激光器发出的激光进行照射，激发焦域内的荧光团发出自体荧光，该技术可用于实现生物样品的高空间分辨三维成像，生物组织的许多内源性成分在无须外加分子探针的情况就能产生较强的自体荧光，例如：弹力蛋白和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等都能够通过双光子激发产生自体荧光；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、血清素、色氨酸和多巴胺等能够通过三光子激发产生自体荧光。不同检测机制可以展示生物组织内源性不同成分的微结构，在实际应用中通常单独的采用激光光镊拉曼光谱技术或者多光子显微成像技术进行检测研究，若能够在光路设计上同时实现激光光镊拉曼光谱技术与多光子显微成像的联用技术，将能够更全面地反映生物组织的生理病理状态变化引起的组织或细胞中不同生化成分的改变，从而拓展激光光镊拉曼光谱技术与多光子显微成像技术在生物医学领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，该系统能够实现对生物单细胞样品进行拉曼光谱，多光子成像以及荧光光谱等多维度、多模式的检测分析。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，包括激光光镊拉曼光谱单元和多光子荧光成像单元，所述激光光镊拉曼光谱单元包括785nm半导体激光器、扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜、透镜（L3）、长通滤波片（EF）、拉曼光谱仪；所述多光子荧光成像单元包括飞秒激光器、XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜、半透半反镜（BS2）、荧光光谱仪、计算机、长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4）、第一带通滤波片、第二带通滤波片、第一光电倍增管（PMT1）、第二光电倍增管（PMT2）；785nm半导体激光器发出的激光通过扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜聚焦到待检测细胞样品上；激光光镊抓捕到的细胞样品产生的信号反向通过100倍倒置油镜物镜收集，再由双色分光镜（DM1）及长通滤波片（EF）入射到拉曼光谱仪上，由计算机显示检测样品的拉曼光谱；飞秒激光器发出的超连续脉冲激光通过XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜聚焦到被激光光镊捕获的待检测细胞样品上，激光与细胞样品产生的多光子信号反向通过正置显微镜收集，通过双色分光镜（DM3）反射，再经过半透半反镜（BS2）分成两路，一路反射到荧光光谱仪，由计算机显示细胞样品的荧光光谱信号；另一路分别经过长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4），而后分别经过第一带通滤波片、第一光电倍增管和第二带通滤波片、第二光电倍增管后，分别检测细胞样品的NADH三光子荧光和FAD双光子荧光信号，由计算机控制扫描成像。
在本发明一实施例中，所述激光光镊拉曼光谱单元还包括白光光源、双色分光镜（DM2）、反射镜（M1）、反射镜（M2）、反射镜（M3）、半透半反镜（BS1）、CCD面阵相机；白光光源发出的光经半透半反镜（BS1）、双色分光镜（DM2）、100倍倒置油镜物镜照射至待检测细胞样品上，785nm半导体激光器发出的激光在通过100倍倒置油镜物镜聚焦到待检测细胞样品上之前，还需先经过反射镜（M2）、反射镜（M3）、双色分光镜（DM2），所述反射镜（M1）设于带通滤波片（BP）与双色分光镜（DM1）之间。
在本发明一实施例中，所述反射镜（M1）、反射镜（M2）、反射镜（M3）、反射镜（M4）均为全反镜。
在本发明一实施例中，所述双色分光镜（DM1）满足可透过785nm并同时反射大于795nm的拉曼散射光。
在本发明一实施例中，所述双色分光镜（DM2）满足可透过波长小于700nm可见光信号，并同时反射波长大于750nm信号光。
在本发明一实施例中，所述双色分光镜（DM3）满足可透过1110±30nm脉冲激光，同时反射小于750nm的激发光源与检测细胞样品相互作用产生的多光子荧光发射信号。
在本发明一实施例中，所述双色分光镜（DM4）满足可反射波长小于500nm发射信号，可透过大于580nm发射光信号。
在本发明一实施例中，所述长通滤波片（EF）满足可透射大于795nm的拉曼散射信号。
在本发明一实施例中，所述第一带通滤色片、第二带通滤色片满足滤波范围分别为450±30nm、620±30nm。
在本发明一实施例中，所述飞秒激光器发出的超连续脉冲激光为1110±30nm超连续脉冲激光。
相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）激光光镊可以对水溶液中单个活性细胞进行稳定捕获，利用白光CCD可以在在电脑屏幕上实时监控捕获过程，且可以实现活性细胞拉曼光谱检测分析；
（2）利用拉曼光谱仪检测生物样本时采用芯径为50微米的单根光纤作为接收端，芯径为50微米的光纤接收端相当于一个50微米的针孔，从而实现类似“共聚焦”光路结构，能够实现对单细胞周围杂散光信号的屏蔽，从而使得光镊拉曼光谱系统能够获得高信噪比单细胞拉曼光谱；
（3）飞秒激光器产生的1110±30nm超连续脉冲激光能够高效激发NADH三光子荧光和FAD双光子荧光信号，并且在光路上能够对这两种多光子荧光信号分别进行独立光谱检测，且两者光谱没有重叠。能够实现NADH和FAD分别对应的3PEF和2PEF荧光信号高灵敏三维成像功能；
（4）利用荧光光谱仪在检测光路上能够对NADH和FAD分别对应的3PEF和2PEF荧光信号进行实时光谱检测，监控其对应荧光光谱变化。
附图说明
图1为本发明一实施例的构造示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案进行具体说明。
本发明提供了一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，包括激光光镊拉曼光谱单元和多光子荧光成像单元，所述激光光镊拉曼光谱单元包括785nm半导体激光器、扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜、透镜（L3）、长通滤波片（EF）、拉曼光谱仪；所述多光子荧光成像单元包括飞秒激光器、XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜、半透半反镜（BS2）、荧光光谱仪、计算机、长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4）、第一带通滤波片、第二带通滤波片、第一光电倍增管、第二光电倍增管。
如图1所示，(1)半导体激光器发出785nm的激光通过扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1），最后通过一个100倍倒置油镜，在100倍油镜焦点位置会形成力的势阱，能够实现对焦点处细胞的稳定捕获；激光光镊抓捕到的细胞样品产生的拉曼散射信号反向通过相同的油镜物镜收集，再由DM1及长通滤波片（EF）导入到拉曼光谱仪中，由计算机显示检测细胞样品的拉曼光谱，为方便实验操作，光镊抓捕、囚禁细胞过程通过一个摄像头连接的电脑屏幕进行实时的监控；(2)飞秒激光器发出的1110±30nm超连续脉冲激光通过XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、一个正置显微镜聚焦到被激光光镊捕获的细胞上,激光与检测细胞相互作用激发出的多光子信号反向通过相同的物镜收集，通过DM3反射，再经过半透半反镜（BS2）分成两路：一路反射到荧光光谱仪，由计算机显示检测样品的荧光光谱信号；另一路分别经过长通双色分光镜DM3、反射镜M4和两个光电倍增管PMT1、PMT2，分别检测细胞样品的NADH三光子（3PEF）荧光和FAD双光子（2PEF）荧光信号，由电脑控制扫描成像。
上述的激光光镊所选激光器激发785nm连续激光，短通双色分光镜DM1可透过激光器发出的入射光，同时反射激光器与检测样品相互作用产生的拉曼散射信号；
上述的多光子成像所用激光器是飞秒激光器，其激发1110±30nm的超连续脉冲激光；双色分光镜DM3可透过激光器发出的入射光，同时反射激光器与检测样品相互作用产生的多光子信号；
上述的飞秒激光器与二向分光镜间设有扫描镜组，3PEF和2PEF光电倍增管前分别放置带通滤波片1与滤波片2。
下面举一具体的实例，乳腺组织中细胞质的NADH与FAD传递着细胞新陈代谢的信息，且二者的荧光强度比率与组织的病理情况相关。因此，NADH和FAD荧光信号的探测及其在细胞内的含量分布对评估组织的新陈代谢与监控组织的病理情况十分重要。另外，不同的生化物质有不同的分子结构,具有不同的拉曼光谱特征,拉曼散射光谱技术可从物质的拉曼特征光谱来识别和区分不同的物质。细胞癌变以后一些生化成分可能会有所变化,例如组成蛋白质的各种氨基酸，脂类和糖,这些物质对应的拉曼光谱可能会发生变化。首先，利用激光光镊对单个乳腺癌活性细胞在水溶液状态下进行稳定捕获，选择激光器的激发波长785nm；双色分光镜（DM1）选择透射785nm的入射光，同时利用该束激光激发细胞拉曼散射信号，部分拉曼散射光沿着原光路返回到达DM1后，拉曼散射光由于波长较长被反射后经过透镜 L3 聚焦，经长通滤波片（EF）再次过滤纯化后利用光纤耦合器导入拉曼光谱仪中实现对拉曼光谱信号的采集；选择飞秒激光器的激发波长1110±30nm；双色分光镜（DM3）透射1110±30nm的超连续脉冲激光，脉冲激光经过正置物镜聚焦后激发被激光光镊捕获的细胞多光子荧光信号后，部分细胞多光子荧光信号沿着原光路返回经过DM3反射后，被光路上50/50半透半反镜BS2分两路：一路由荧光光谱仪收集，另一路分别经过长通双色分光镜DM3、反射镜M4和两个光电倍增管PMT1和PMT2，在两个光电倍增管前面分别设置有带通滤波片1和滤波片2，这样通过两个光电倍增管探测器就可以分别探测被光镊捕获细胞中NADH三光子荧光和FAD双光子荧光信号，最后在通过计算机图像处理获得这两种生化成分的高分辨三维荧光成像数据。
综上所述，本发明提供一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，该系统能够实现对水溶液中单个活细胞同时检测拉曼光谱、多光子成像以及荧光光谱的功能。利用激光光镊对活性细胞标本进行抓捕、固定，光谱仪探测细胞样品中不同生化成分的拉曼光谱，光电倍增管探测器对细胞样品中的NADH和FAD实现实时检测，从而直接获得样品的不同成分的拉曼光谱、荧光光谱以及NADH和FAD含量分布的多光子荧光图像，从而实现对样本的多维度、多模式快速检测。
在本发明的最佳实施例中，飞秒激光器的激发光波长应该是1110±30nm超连续脉冲激光，这样才能够避免来自生物细胞内源性NADH三光子荧光和FAD双光子荧光信号的相互重叠，从而获得细胞NADH和FAD不同成分的高对比度成像。
上述的双色分光镜DM1，应该满足可透过785nm并同时反射大于795nm的拉曼散射光。
上述的双色分光镜DM2，应该满足可透过波长小于700nm可见光信号，并同时反射波长大于750nm信号光。
上述的双色分光镜DM3，应该满足可透过1110±30nm脉冲激光，同时反射小于750nm的激发光源与检测细胞样品相互作用产生的多光子荧光发射信号。
上述的双色分光镜DM4，应该满足可反射波长小于500nm发射信号，可透过大于580nm发射光信号。
上述的长通滤色片EF，应该满足可透射大于795nm的拉曼散射信号。
上述的滤波片1和滤波片2，应该满足滤波范围分别为450±30nm和620±30nm.
上述反射镜M1、M2、M3、M4应该为全反镜。
本发明设计合理，构思巧妙，具有广阔的发展前景和较大的推广意义。
以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，包括激光光镊拉曼光谱单元和多光子荧光成像单元，所述激光光镊拉曼光谱单元包括785nm半导体激光器、扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜、透镜（L3）、长通滤波片（EF）、拉曼光谱仪；所述多光子荧光成像单元包括飞秒激光器、XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜、半透半反镜（BS2）、荧光光谱仪、计算机、长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4）、第一带通滤波片、第二带通滤波片、第一光电倍增管(PMT1)、第二光电倍增管(PMT2)；785nm半导体激光器发出的激光通过扩束器（L1 L2）、带通滤波片（BP）、双色分光镜（DM1）、100倍倒置油镜物镜聚焦到待检测细胞样品上；激光光镊抓捕到的细胞样品产生的信号反向通过100倍倒置油镜物镜收集，再由双色分光镜（DM1）及长通滤波片（EF）入射到拉曼光谱仪上，由计算机显示检测样品的拉曼光谱；飞秒激光器发出的超连续脉冲激光通过XY扫描镜组、双色分光镜（DM3）、正置显微镜聚焦到被激光光镊捕获的待检测细胞样品上，激光与细胞样品产生的多光子信号反向通过正置显微镜收集，通过双色分光镜（DM3）反射，再经过半透半反镜（BS2）分成两路，一路反射到荧光光谱仪，由计算机显示细胞样品的荧光光谱信号；另一路分别经过长通双色分光镜（DM4）、反射镜（M4），而后分别经过第一带通滤波片、第一光电倍增管和第二带通滤波片、第二光电倍增管后，分别检测细胞样品的NADH三光子荧光和FAD双光子荧光信号，由计算机控制扫描成像。
2.根据权利要求1所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述激光光镊拉曼光谱单元还包括白光光源、双色分光镜（DM2）、反射镜（M1）、反射镜（M2）、反射镜（M3）、半透半反镜（BS1）、CCD面阵相机；白光光源发出的光经半透半反镜（BS1）、双色分光镜（DM2）、100倍倒置油镜物镜照射至待检测细胞样品上，785nm半导体激光器发出的激光在通过100倍倒置油镜物镜聚焦到待检测细胞样品上之前，还需先经过反射镜（M2）、反射镜（M3）、双色分光镜（DM2），所述反射镜（M1）设于带通滤波片（BP）与双色分光镜（DM1）之间。
3.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述反射镜（M1）、反射镜（M2）、反射镜（M3）、反射镜（M4）均为全反镜。
4.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述双色分光镜（DM1）满足可透过785nm并同时反射大于795nm的拉曼散射光。
5.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述双色分光镜（DM2）满足可透过波长小于700nm可见光信号，并同时反射波长大于750nm信号光。
6.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述双色分光镜（DM3）满足可透过1110±30nm脉冲激光，同时反射小于750nm的激发光源与检测细胞样品相互作用产生的多光子荧光发射信号。
7.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述双色分光镜（DM4）满足可反射波长小于500nm发射信号，可透过大于580nm发射光信号。
8.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述长通滤波片（EF）满足可透射大于795nm的拉曼散射信号。
9.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述第一带通滤色片、第二带通滤色片满足滤波范围分别为450±30nm、620±30nm。
10.根据权利要求2所述的一种激光光镊拉曼光谱与多光子成像联用系统，其特征在于，所述飞秒激光器发出的超连续脉冲激光为1110±30nm超连续脉冲激光。
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